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Asociación del polimorfismo del gen de la Interleuquina 1B y los genotipos
vacA y cagA de Helicobacter pylori con la aparición de enfermedades
gastroduodenales.
Lizeth Carolina Córdoba Camacho
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de
Microbióloga Industrial
Bacterióloga
Pontificia Universidad Javeriana
Facultad de Ciencias
Carrera de Microbiología Industrial
Carrera de Bacteriología
Bogotá D. C.
2013
Asociación del polimorfismo del gen de la Interleuquina 1B y los genotipos vacA y
cagA de Helicobacter pylori con la aparición de enfermedades gastroduodenales.
Lizeth Carolina Córdoba Camacho
Ingrid Schuler Ph.D Janeth Arias Palacios M.Sc-M.Ed
Decana Académica Directora Carrera Microbiología
Facultad de Ciencias
NOTA DE ADVERTENCIA
“La Universidad no se hace
responsable por los conceptos
emitidos por sus alumnos en sus
trabajos de tesis. Solo velara por que
no se publique nada contrario al
dogma y a la moral católica y porque
las tesis no contengan ataques
personales contra persona alguna,
antes bien se vea en ellas el anhelo de
buscar la verdad y la justicia”
Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de
julio de 1946.
INDICE GENERAL
Capítulo 1. RESUMEN
Capítulo 2. INTRODUCCIÓN
Capítulo 3. JUSTIFICACIÓN Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Capítulo 4. MARCO TEORICO
4.1 Helicobacter pylori
4.2 Prevalencia
4.3 Patogénesis
4.4 Citotoxina Asociada al Gen A (cagA)
4.5 Citotoxina vacuolizante Vac A
4.6 Papel de la IL-1B en la respuesta Inmune del Huésped a H.pylori
Capítulo 5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo general
5.2 Objetivos específicos
Capítulo 6. METODOLOGÍA
6.1 Diseño del Estudio
6.2 Población y Muestra
6.2.1 Población universo
6.2.2 Población de estudio
6.2.3 Descriptores de la población de estudio
6.2.4 Criterios de inclusión de pacientes
6.2.5 Criterios de exclusión de pacientes
6.3 Tamaño de la muestra
6.4 Variables
6.5 Datos y análisis estadístico
6.6 Procedimiento
6.6.1 Obtención de muestras
6.6.2 Transporte de las muestras
6.6.3 Procedimiento microbiológico
6.6.4 Procedimiento molecular
6.6.4.1 Genotipificación de cagA y vacA de Helicobacter pylori
6.6.4.2 Determinación del gen IL-1B por PCR y secuenciación
Capítulo 7. RESULTADOS
7.1 Características generales de la población de estudio.
7.1.1 Distribución de pacientes de acuerdo al resultado de Helicobacter pylori.
7.1.2 Distribución de pacientes según resultado de histopatología
7.1.3 Distribución de pacientes según resultado de secuenciación del gen IL-1B
7.1.4 Asociación entre la infección por H. pylori y el polimorfismo -31 del gen de la
IL-1B
7.2 Distribución de genotipos de virulencia de H. pylori
7.2.1 Distribución gen cagA
7.2.2 Distribución gen vacA.
7.3 Asociación de los genes cagA, vacA e IL 1B en los aislamientos obtenidos.
7.4 Asociación de los genes cagA, vacA s1m1 e IL 1B.
Capítulo 8. DISCUSIÓN
9. CONCLUSIONES
10. RECOMENDACIONES
11. BIBLIOGRAFIA
12. ANEXOS
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Prueba de Urea.
Figura 2. Morfología macroscópica H pylori.
Figura 3. Coloración de Gram H. pylori.
Figura 4. Prueba Oxidasa.
Figura 5. Prueba Catalasa.
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a la amplificación del
gen IL-1B
Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a la amplificación del
gen cagA.
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a la amplificación del
gen vacAs1/s2.
Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a la amplificación del
gen vacAm1.
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a la amplificación del
gen vacAm2.
INDICE DE TABLAS
Tabla1. Variables del estudio definidas, escala y unidad de medición
Tabla 2. Protocolos del laboratorio de Microbiología de la Universidad Javeriana
para la amplificación de los genes cagA y vacA de H. pylori por medio de la técnica
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Tabla 3. Cebadores utilizados y condiciones para la amplificación de los genes
cagA y vacA de Helicobacter pylori por medio de la técnica de reacción en cadena
de la polimerasa (PCR).
Tabla 4. Protocolos del laboratorio de Microbiología de la Universidad Javeriana
para la amplificación del gen de IL-1B por medio de la técnica Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR).
Tabla 5. Cebadores utilizados y condiciones para la amplificación del gen de la IL-
1B por medio de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Tabla 6 Distribución de pacientes según género de acuerdo al resultado de
histopatología para Helicobacter pylori.
Tabla 7. Comparación de resultado obtenido para Helicobacter pylori en
histopatología y cultivo.
Tabla 8. Distribución de los pacientes según resultado de histopatología
Tabla 9. Distribución de pacientes por género según resultado de secuenciación
del gen Il-1B.
Tabla 10. Asociación entre la presencia de H. pylori en cultivo y el polimorfismo-31
del gen IL-1B.
Tabla 11. Asociación entre la presencia de H. pylori en resultado de histopatología
y el polimorfismo -31 del gen de la IL-1B
Tabla 12. Relación entre el polimorfismo -31 IL-1B y la presencia de H. pylori en
resultado de histopatología y cultivo.
Tabla 13. Presencia del gen cagA en aislamientos de H. pylori obtenidos a partir
de biopsias gástricas.
Tabla 14. Relación del polimorfismo -31 del gen de la IL-1B y el genotipo de
virulencia de H. pylori cagA con la aparición de enfermedades gastroduodenales.
Tabla 15. Presencia del gen vacA y determinación de los alelos más frecuentes de
aislamientos de H. pylori obtenidos a partir de biopsias gástricas.
Tabla 16. Asociación del polimorfismo -31 del gen de la IL-1B y el genotipo de
virulencia de H. pylori vacA s1m1 con la aparición de enfermedades
gastroduodenales.
Tabla 17. Relación entre los genes cagA, vacA, el polimorfismo CC del gen IL 1B
y la patología en los aislamientos obtenidos.
Tabla 18. Relación entre los genes cagA, vacA, el polimorfismo CT del gen IL 1B y
la patología en los aislamientos obtenidos.
Tabla 19. Relación entre los genes cagA, vacA, el polimorfismo TT del gen IL 1B y
la patología en los aislamientos obtenidos.
Tabla 20. Asociación del polimorfismo -31 del gen de la IL-1B y el genotipo de
virulencia de H. pylori cagA y vacA con la aparición de enfermedades
gastroduodenales.
Tabla 21. Relación del polimorfismo -31 del gen de la IL-1B y el genotipo de
virulencia de H. pylori cagA positivo y vacA s1m1 positivo
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo A. Agar Brucella.
Anexo B. Caldo Brucella.
Anexo C. Isovitalex (BD)
Anexo D. Suplemento selectivo para H.pylori (DENT) (OXOID)
Anexo E. Caldo urea (Prueba de ureasa)
Anexo F. DNAzol
AGRADECIMIENTOS
A Dios por regalarme la oportunidad Al Laboratorio de Microbiología Especial de la Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá-Colombia, por brindarme los recursos y el conocimiento para realizar este proyecto.
A la clínica Fundadores, Bogotá-Colombia y a los pacientes que colaboraron en la realización de este trabajo.
A la Dra. Alba Alicia Trespalacios por el arsenal de conocimientos ofrecidos.
Al Dr. William Otero por sus infinitas ilustraciones impartidas.
A la Dra. Marcela Mercado por su colaboración.
A la Dra. Azucena Arévalo por su paciencia durante todo el proyecto.
A Jenny Ávila, Milena Sánchez, Carolina González, Paola Betancourt y a todos los integrantes del grupo de investigación del Laboratorio de Microbiología Especial.
A mis amigos por su apoyo.
A mis padres Gonzalo Córdoba, Esperanza Camacho y a mis hermanos Gonzalo Andrés y Natalia por su paciencia, amor y preocupación.
A mi sobrino Juan Andrés Sáenz Córdoba por ser mi ruta de escape.
Este logro se lo dedico a Dios, a mis
padres y a mis hermanos por su
preocupación y apoyo…. Y en forma
muy especial a Juan Andrés Sáenz
Córdoba por inspirarme a que se sienta
orgulloso de su tía.
1. RESUMEN
La carcinogénesis gástrica es una patología que depende de múltiples factores
que intervienen en su desarrollo, entre estos se encuentra la infección por H. pylori
y el proceso inflamatorio que este microorganismo desencadena, el cual depende
de la virulencia de la cepa infectante, que está dada por ciertos genes bacterianos
como vacA y cagA que codifican proteínas citotóxicas para las células epiteliales
gástricas, ocasionando daño en la mucosa gástrica y lesiones consideradas como
pre cancerígenas; al ingresar al individuo, el microorganismo estimula la respuesta
inmunológica mediada por citoquinas, entre las que se encuentra la IL-1β, que
tiene un efecto directo sobre la inhibición de la secreción gástrica cuando es
secretada; esta proteína es codificada por el gen IL-1B, que es altamente
polimórfico en la población, de lo cual se ha demostrado que el polimorfismo -31
IL-1B causa un aumento exagerado en los niveles de IL-1 β secretados ante un
proceso inflamatorio, lo que causaría una inhibición de la secreción gástrica
(Hipoclorhidria) y por ende la atrofia del tejido epitelial, lo que puede ser
considerado como lesiones precancerígenas, es por esto que con este estudio, se
buscó determinar la relación entre el polimorfismo de la interleuquina 1B y el
genotipo vacA y cagA de Helicobacter pylori con la aparición de enfermedades
gastroduodenales por medio de la técnica de reacción en cadena de la polimerasa
y secuenciación de los fragmentos amplificados, obteniendo un resultado de
genotipificación de cagA positivo del 68,6% de las cepas aisladas y una frecuencia
predominante de vacA s1m1 (50%), también se obtuvo un porcentaje elevado de
individuos con polimorfismo CT (47,8%), seguido de los polimorfismos CC y TT,
ambos con el mismo porcentaje en la población (26,1%), de los cuales el
predominante está relacionado con la aparición de gastritis crónica en los
pacientes evaluados y con un alto riesgo de desarrollo de patologías más severas.
Se realizó la correlación entre los datos más relevantes del estudio, demostrando
que no hay relación estadísticamente significativa entre la presencia del
polimorfismo de IL-1B y la colonización de cepas cagA positivas, también se pudo
determinar que existe una relación estadísticamente significativa entre el
polimorfismo del gen IL-1B y la colonización por cepas vacA s1m1, también se
demostró que no hay asociación estadísticamente significativa entre la
colonización por cepas cagA positivo vacA s1m1 y la presencia del polimorfismo
IL-1B.
Palabras clave
Helicobacter pylori, Il-1 B, vacA, cagA.
2. INTRODUCCION
Helicobacter pylori (H. pylori) es un bacilo Gram negativo, microaerofílico (80% N2,
15% CO2 y 5% O2), (1) que coloniza la mucosa gástrica humana
desencadenando un proceso inflamatorio primario conocido como gastritis activa,
patología que puede preceder al desarrollo de lesiones más severas (2) razón por
la cual la Organización Mundial de la Salud en 1994 le otorgó el título a este
patógeno como agente carcinogénico de tipo 1 (3) por su asociación con el riesgo
de desarrollo de cáncer gástrico en los pacientes infectados, malignidad con alto
impacto en salud pública, ya que se trata de la segunda causa de muerte en
Colombia por cáncer y en el mundo es considerada la cuarta neoplasia más
común con más de un millón de muertes al año (4) Sin embargo el rumbo, la
severidad y la evolución de la infección por H. pylori no se encuentra limitada
únicamente a la presencia del microorganismo en el huésped, ya que, aunque el
50% de la población mundial es positiva para este microorganismo solamente una
porción (1-2%) de las personas infectadas progresa a cáncer gástrico (4), Se trata
de un proceso multifactorial en el cual se ven involucrados otros parámetros que
promueven diferentes consecuencias o desenlaces a partir de la infección, entre
los que se encuentran: virulencia de la cepa infectante, factores medio
ambientales, dieta, edad, sexo, nivel de acidez gástrica (5) y respuesta
inmunológica del individuo (7), este último factor es considerado clave en el
proceso de defensa ante una infección, debido a que este es heterogéneo entre
individuos y depende de la susceptibilidad genética del afectado. Este proceso
inflamatorio está regulado por genes codificantes para citoquinas proinflamatorias
como los de la familia de la interleuquina 1 (IL-1), compuesta por los genes IL-1A e
IL-1B, que codifican para las proteínas IL-1α e IL-1ß respectivamente, ambas con
participación activa en la regulación de la respuesta inflamatoria por H. pylori, (6,
7, 10) por lo cual, si se presenta una alteración como polimorfismos puntuales en
el gen, se va a ver reflejado como un cambio en la secuencia de la citoquina
producida, razón por la cual variaría la susceptibilidad genética de un individuo a
desarrollar carcinogénesis gástrica; en el caso de la IL-1ß, la secreción de esta
citoquina en presencia de infección va a depender de la presencia o ausencia de
polimorfismo -31 de la región promotora de su gen codificante IL-1B (Localizado
en el brazo largo del cromosoma 2 (2q21) (9), ya que en presencia de este cambio
se produce un aumento en la producción de la proteína, que naturalmente actúa
inhibiendo la secreción gástrica del medio, pero en este caso particular, se va a
marcar de manera exagerada esta inhibición, produciendo hipoclorhidria crónica y
por consiguiente un aumento en el pH del estómago que sumado a la infiltración
epitelial de polimorfonucleares (Factor desencadenante de daño oxidativo en el
lugar del reclutamiento de leucocitos), puede producir gastritis atrófica y si el
proceso inflamatorio continúa y la citotoxicidad no es eliminada, se presentarían
alteraciones más graves como adenocarcinoma gástrico o un linfoma tipo MALT
gástrico.
Además de la predisposición genética del huésped (Polimorfismo del gen de la
interleuquina 1B), existen factores intrínsecos de la virulencia de ciertas cepas de
H. pylori, que son considerados como factores de riesgo para el desarrollo de
malignidades gástricas, como los genes bacterianos vacA y cagA codificantes de
las citotoxinas que llevan su mismo nombre: CagA y VacA respectivamente
(1,4,10), es por esto que el objetivo del presente trabajo fue determinar la relación
del polimorfismo -31 de la interleuquina-1B y los genotipos vacA y cagA de
Helicobacter pylori con la aparición de enfermedades gastroduodenales, por medio
de la técnica Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en pacientes que
ingresaron a endoscopia de vías digestivas altas a la unidad de gastroenterología
de la Clínica Fundadores de Bogotá, entre agosto de 2012 y abril de 2013
3. JUSTIFICACION Y PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El cáncer gástrico en Colombia es considerada la segunda causa de muerte por
cáncer anualmente, con una tasa de 10,2 casos por cada 100000 habitantes y la
causante de más de un millón de muertes al año en el mundo, posicionándose
como la cuarta neoplasia más común (12); este proceso de carcinogénesis
gástrico ha sido asociado principalmente a la presencia de H. pylori
(Microorganismo calificado como agente carcinogénico de tipo 1 por la
Organización Mundial de la Salud en 1994) (3) en el individuo que la presenta, sin
embargo el desarrollo de esta patología es multifactorial, se ha evidenciado que la
presencia de este microorganismo no es causante único de este desenlace, se
debe tener en cuenta la virulencia de la cepa infectante, igualmente, el entorno
medioambiental donde habite el sujeto afectado y la predisposición genética
relacionada con su sistema inmunológico, lo que explicaría porque aunque el 50%
de la población mundial es positiva para H. pylori, la evolución de una infección a
patologías más severas y otras formas distintas de presentación de la enfermedad
no es la misma para todos los organismos infectados y solamente una porción (1-
2%) de las personas infectadas progresa a cáncer gástrico (13,14), de allí radica la
importancia de utilizar los factores mencionados como marcadores
epidemiológicos de riesgo para el desarrollo a futuro de complicaciones gástricas,
razones por las cuales con este trabajo se quiso estudiar si existe asociación entre
el polimorfismo del gen de la interleuquina 1B humana, y el genotipo de las
citotoxinas vacA y cagA de H. pylori con la aparición de enfermedades
gastroduodenales.
4. MARCO TEORICO REFERENTES CONCEPTUALES
4.1 Helicobacter pylori
Helicobacter pylori (H. pylori) fue reportado por primera vez por Barry Marshall y
Robin Warren en el 1982 como un bacilo Gram negativo usualmente espiralado,
(1) aunque puede encontrarse en forma cocoide, es motil por la presencia de 4 a 6
flagelos polares y su tamaño oscila entre los 2 a 4 μm de largo y de 0.5 a 1 μm de
ancho, este microorganismo se encuentra clasificado dentro de la subdivisión
Proteobacteria, orden Campylobacteriales y familia Helicobacteraceae (15) sus
requerimientos de crecimiento están ligados a los niveles de oxígeno y
temperatura del ambiente, al ser una bacteria microaerofílica con baja tolerancia al
oxígeno, requiere 80% de N2, 15% de CO2 y 5% O2 (2) y una temperatura de
desarrollo que varía entre los 34°C y 40°C, siendo 37°C su temperatura óptima de
crecimiento. Es considerado neutrófilo, ya que su crecimiento solamente ocurre en
un rango de pH entre 5.5 y 8.0, sin embargo sobrevive a exposiciones breves en
pH ácido, por lo cual es capaz de colonizar la mucosa gástrica, se caracteriza por
ser ureasa, oxidasa y catalasa positivo (En la mayoría de casos), utiliza la glucosa
como fuente de carbono, crece en medios de cultivo suplementados con
aminoácidos como arginina, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina y
valina. Ha sido encontrado en saliva, reflujo gástrico y heces, por lo cual se
considera que la transmisión es directa de humano a humano, vía oral-oral o fecal-
oral, como la ruta de infección más adecuada, (1), aunque existe evidencia de la
presencia de DNA de H. pylori en fuentes acuáticas, sin embargo, el
microorganismo no es cultivable a partir de aguas, por lo que se deduciría que se
trata de DNA desnudo o microorganismos no viables, lo que hace casi indiscutible
que la forma principal de transmisión es de humano-humano.
4.2 Prevalencia
La prevalencia de H. pylori abarca muchas regiones alrededor del mundo, el 50%
de la población es positiva para este microorganismo (4) (1), generalmente en
países industrializados, la prevalencia es menor al 40%, siendo mayor en los
adultos y ancianos que en los niños y adolescentes, la aparición de infección está
ligada al nivel socioeconómico de la población (16,21) lo que quiere decir que en
relación con la calidad de vida de países industrializados durante el periodo de
infancia, donde es usual adquirir el microorganismo, la prevalencia va
descendiendo, ya que se reducen las posibilidades de infección por las
condiciones higiénicas y terapéuticas al alcance de la población, en contraste con
los países en vía de desarrollo, en donde, la tasa de infección por H. pylori se
incrementa rápidamente en los primeros años de vida de la población. (15)
4.3 Patogénesis
H. pylori entra al organismo por vía oral, (1) en donde se encuentra con un
inhibidor natural para la mayoría de microorganismos, el pH gástrico (pH 2), sin
embargo, este microorganismo sobrevive a este ambiente tan hostil por medio de
la modificación del entorno ácido, lo logra al cambiar la polaridad de su membrana
estableciendo un potencial positivo, marcando la permeabilidad selectiva, es decir,
disminuyendo la entrada de aniones, haciendo más positivo el interior del
microorganismo, evitando la entrada de H+, este mecanismo le permite
permanecer bajo la mucosa gástrica, mientras se moviliza rápidamente gracias a
la presencia de 4 a 6 flagelos polares hacia una zona con un pH más neutro ya
que si permanece por mucho tiempo bajo ambientes tan ácidos, pierde su
motilidad, (15) por otra parte este arsenal es complementado por la presencia de
altos niveles de enzima ureasa, la cual hidroliza la urea que entra al
microorganismo por medio de un canal pH dependiente, convirtiéndola en amonio
y carbamato, el cual, de manera espontánea se descompone en otra molécula de
amonio y dióxido de carbono, de tal forma que el pH inicialmente ácido se va
elevando a expensas del amonio liberado, el cual a su vez produce daño de las
células epiteliales, ya que se trata de un compuesto citotóxico, una vez se localiza
en el epitelio gástrico, H. pylori se adhiere al mismo mediante adhesinas, proteínas
cuyo rol es fundamental en la patogenicidad del microorganismo. (15)
4.4 Citotoxina Asociada al Gen A (cagA)
El gen cagA, hace parte de la isla de patogenicidad llamada cag-PAI con un
tamaño de 40 kB, que cuenta con 31 genes (4), su presencia en el
microorganismo es variable, aproximadamente en el 50 al 70% de las cepas lo
presentan y siempre es expresado, este gen codifica la proteína CagA, que toma
su nombre por su gen codificante (Citotoxina asociada al gen A), se trata de una
proteína con una masa aproximada de 140kDa, altamente inmunógena, la cual es
introducida a las células del tejido infectado produciendo un cambio en su
morfología por degeneración y posteriormente apoptosis (18-19). Esta proteína se
asocia generalmente con la aparición de gastritis activa debido a que los pacientes
infectados con cepas cagA positivas, presentan una respuesta inflamatoria mayor,
lo que aumenta el riesgo de un desenlace sintomático en poblaciones
occidentales, con lesiones que han sido consideradas como pre malignas y
predecederas a la aparición de ulceración péptica, atrofia, metaplasia intestinal y
cáncer gástrico. (8) caso contrario de poblaciones en áreas orientales.
La proteína CagA y el gen cagA son indicadores de la presencia de la isla de
patogenicidad cag PAI, la cual codifica 18 proteínas que sirven de soporte para el
sistema de secreción de tipo IV, este simula un sistema inyectable capaz de
penetrar las células epiteliales gástricas, lo que facilita la translocación de CagA,
(1) una vez introducida, puede interactuar de 2 maneras, la primera, dependiente
de fosforilación, involucra los motivos EPIYA de esta proteína, estos son
fosforilados para interactuar con moléculas como la Tirosín fosfatasa (SHP-2) a la
cual se une, lo que desencadena un cambio en la morfología de la célula epitelial
afectada por activación de factores de transcripción involucrados en el control del
ciclo celular y la apoptosis. Un aspecto importante que ha sido asociado al
aumento en el riesgo de padecer cáncer gástrico, es el número de motivos EPIYA,
ya que la cantidad de fosforilación de CagA está asociada con el número de estas
repeticiones, por ende, con el daño a producir. La segunda forma de interacción,
es independiente de fosforilación, en donde CagA se une a proteínas como Grb2,
E-caderina, etc, lo que produce perdida de la polaridad celular. (15)
4.5 Citotoxina vacuolizante VacA
El gen vacA está presente en todas las cepas de H. pylori, compuesto por dos
regiones variables: s y m; la región s, llamada secuencia señal, codifica para el
péptido señal, el cual se compone, por varias subregiones: s1a, s1b, s1c y s2, la
región m, es conocida como región media, se divide en las secuencias m1 y m2;
estas permiten caracterizar la secuencia del gen, con lo que se ha evidenciado
que ciertas secuencias de la variable s (s1a, s1b, s1c y s2) y otras de la variable m
(m1 y m2) del gen vacA varían entre las cepas de H. pylori, aunque la presencia
de este gen es indicador del microorganismo, su expresión varía notablemente
entre especies, aproximadamente el 50% de las cepas de H. Pylori secretan VacA,
una proteína de 140-kDa, altamente inmunógena que actúa como citotoxina
responsable de la formación de vacuolas en las células epiteliales gástricas del
individuo afectado, esta proteína tiene un papel fundamental en la patogénesis de
la úlcera péptica y el cáncer gástrico ya que media la formación de poros en las
membranas mitocondrial y citoplasmática disminuyendo la permeabilidad celular y
desencadenando un proceso de destrucción del epitelio gástrico (4,20) por la
liberación de urea y aniones al exterior desde la célula afectada, sin embargo, la
actividad vacuolizante es diferente entre cepas, debido a la heterogeneidad de la
secuencia en las regiones m y s dentro del gen vacA, se han considerado a las
cepas con genotipo vacA s1m1 como el subtipo más patógeno en poblaciones
occidentales (20); Otra forma en la que actúa VacA al entrar al citosol es la acción
apoptótica desencadenada por la acumulación de la misma en la membrana
interna mitocondrial que activa canales mitocondriales endógenos.
4.6 Papel de la IL-1B en la respuesta Inmune del Huésped a H.pylori
La familia de la IL-1B, incluye 3 genes diferentes, la IL-1A, la IL-1B, y el
antagonista del receptor de la IL-1 (IL-1Ra), que codifican polipéptidos que llevan
su mismo nombre, así, el gen de la IL-1A codifica la IL-1α y el gen de la IL-1B,
codifica la IL-1β, esta última, es un producto proteico reconocido por su potente
acción pro inflamatoria, producida principalmente por monocitos, macrófagos,
fibroblastos y células dendríticas, cuya función principal es mediar reacciones
inflamatorias agudas y crónicas por medio del incremento en la expresión de
factores de adhesión en células endoteliales, lo que produce un aumento en la
extravasación y migración de leucocitos a las regiones de infección, también tiene
acción inhibitoria sobre la producción de secreción ácida por las células parietales
gástricas, por lo cual se altera la producción del pH ácido que caracteriza al
estómago. (21,22,23,24,25)
El proceso inflamatorio agudo y crónico inducido por la infección de H. pylori,
produce IL-1 β, una citoquina que potencia la respuesta inmune y produce
hipoclorhidria, lo que permite que las bacterias sensibles al pH colonicen el
estómago, estas oportunistas comienzan el proceso de conversión de los nitratos
ingeridos en compuestos nitrosos altamente carcinogénicos, igualmente, la
hipoclorhidria prolongada activa la producción de gastrina, un factor implicado en
procesos de crecimiento celular alterado y transformación neoplásica, también se
ha evidenciado que la inflamación prolongada causa un exceso de producción de
radicales libres lo que desencadena una oxidación de lípidos y daño a nivel de
DNA. (9). Se han observado variaciones a nivel poblacional en la producción y
funcionalidad de la IL-1β, esto se debe a que el gen de la IL-1B es altamente
polimórfico. Por medio de secuenciación genómica, se conocen tres distintas
transiciones polimórficas en el gen codificante IL-1B de tipo Single-Nucleotide
Polymorphism (SNP), fenómeno en el cual ocurre un cambio en una única base
nitrogenada por otra; estos polimorfismos conocidos se encuentran en las
posiciones -31 y -511 y +3954 bp desde el inicio de la región
transcripcional.(2,24,30)
En el caso específico de los individuos que presentan genotipo con polimorfismo -
31C, existe un cambio de timina por citosina en la posición -31 de la región
promotora, ocasionando una perturbación en la expresión del producto proteico,
es decir en la transcripción de la citoquina, lo que desencadena una
sobreexpresión en estos pacientes de la IL-1β, la cual inhibe la secreción de ácido
gástrico por las células parietales (Hipoclorhidria) causando cambios histológicos
en la mucosa gástrica, atrofia y lesiones precancerosas en respuesta a infección
por H. pylori.(31)
Siendo esta la base de la asociación entre este polimorfismo y el desarrollo de
diversas patologías como la gastritis crónica, ulceras gastroduodenales, cáncer
gástrico y linfoma del tejido linfoide asociado a mucosa (MALT) (28, 29) Diversos
estudios han mostrado diferentes conclusiones acerca del polimorfismo -31 del
gen de la IL-1B y la expresión de su proteína, Bang-Shun et al. 2011 exponen que
los genotipos IL-1B-31CT, IL-1B-31CC and IL-1B-31CT/CC, eran comunes en los
pacientes con cáncer gástrico que en los controles libres de cáncer, estos
hallazgos concuerdan con los reportados previamente. (16,17)
Sin embargo, existe evidencia que argumenta que el polimorfismo del gen de la IL-
1B depende de las diferentes etnias, de acuerdo con la evolución de las distintas
poblaciones (30, 31)
Por esto en pacientes con antecedentes personales o familiares de enfermedades
gastroduodenales, es clave realizar la determinación y caracterización de la
posición -31 del gen de la interleuquina 1B, como patrón de riesgo del paciente
para susceptibilidad a enfermedades gastroduodenales.
5. OBJETIVOS
5.1 Objetivo General
Determinar la relación del polimorfismo de la interleuquina 1B y el genotipo
vacA y cagA de Helicobacter pylori con la aparición de enfermedades
gastroduodenales.
5.2 Objetivos Específicos
Evaluar el polimorfismo del gen de la interleuquina 1B.
Evaluar el genotipo para las citotoxinas bacterianas vacA y cagA de
Helicobacter pylori.
Determinar la asociación del polimorfismo del gen de la interleuquina 1B,
los genotipos de las citotoxinas bacterianas vacA y cagA de Helicobacter
pylori y la aparición de enfermedades gastroduodenales.
6. METODOLOGIA
El presente estudio cumplió con los requerimientos del comité de ética del
departamento de Microbiología de la Facultad de Ciencias de la Pontificia
Universidad Javeriana y la unidad de gastroenterología de la Clínica Fundadores
de Bogotá.
6.1 Diseño del Estudio
El presente estudio es un estudio descriptivo de corte transversal para identificar
los genotipos de virulencia de Helicobacter pylori aislados de pacientes que
asistieron a endoscopia de vías digestivas altas y la determinación del
polimorfismo -31 del gen de la IL-1B humana de los mismos.
6.2 Población y Muestra
6.2.1 Población Universo
Pacientes que ingresaron a endoscopia de vías digestivas altas a la unidad de
gastroenterología de la Clínica Fundadores de Bogotá, previo consentimiento
informado, entre agosto de 2012 y abril de 2013.
6.2.2 Población de estudio
Aislamientos clínicos de H. pylori y ADN obtenido a partir de biopsias gástricas de
pacientes que ingresaron a endoscopia de vías digestivas altas en la unidad de
gastroenterología de la Clínica Fundadores de Bogotá, previo consentimiento
informado, entre agosto de 2012 y abril de 2013.
6.2.3 Descripción de la población de estudio
Aislamientos clínicos de H. pylori y ADN extraído a partir de biopsias gástricas de
pacientes que cumplían con los parámetros establecidos para su inclusión en el
estudio que asistieron a endoscopia de vías digestivas altas en la unidad de
gastroenterología de la Clínica Fundadores de Bogotá durante el periodo
comprendido entre agosto de 2012 y abril de 2013, conservadas en caldo Brucella
® (BD) (Anexo B) con glicerol al 20% hasta su posterior procesamiento en el
laboratorio del grupo de enfermedades infecciosas de la Pontificia Universidad
Javeriana.
6.2.4 Criterios de inclusión de pacientes
En el presente estudio se incluyeron los pacientes que cumplieran con las
siguientes características de inclusión:
Pacientes de ambos sexos
Pacientes con edad entre 19 y 70 años.
Pacientes que presentaron síntomas dispépticos o de reflujo gastroesofágico
Pacientes con reporte de histopatología.
Pacientes sin tratamiento previo contra H. pylori en el mes anterior a la
endoscopia.
Pacientes no tratados con medicamentos antiácidos.
6.2.5 Criterios de exclusión de pacientes
En el presente estudio se excluyeron pacientes que:
Pacientes que no cumplieran con el rango de edad establecido (Entre 19 y 70
años)
Pacientes que estuvieran en tratamiento para la erradicación de H. pylori
Pacientes que estuvieran siendo tratados con medicamentos antiácidos.
Pacientes que presentaran enfermedades como insuficiencia renal crónica,
insuficiencia cardiaca descompensada, insuficiencia respiratoria, tumores,
enfermedades malignas
Pacientes mujeres en estado de embarazo o lactancia.
Pacientes mujeres en etapa reproductiva sin método de planificación sexual.
6.3 Tamaño de muestra
El tamaño de muestra fue definido por la cantidad de pacientes que cumplieron
con los requisitos previamente mencionados que ingresaron a endoscopia
digestiva alta en el periodo comprendido de estudio, un total de 46 pacientes.
6.4 Variables
Para determinar la frecuencia de los genotipos de virulencia cagA y vacA de H.
pylori en los pacientes que ingresaron al estudio se determinaron las variables
presentadas en la tabla No 1.
Tabla No 1: Variables del estudio definidas, escala y unidad de medición.
Variable Tipo de variable
Escala Unidad de medición
Genotipo de virulencia H. pylori
cagA Independiente Nominal Presente/Ausente
vacA s1 Independiente Nominal Presente/Ausente
vacA s2 Independiente Nominal Presente/Ausente
vacA m1 Independiente Nominal Presente/Ausente
vacA m2 Independiente Nominal Presente/Ausente
Pacientes Edad Independiente Razón Años
Genero Independiente Nominal Femenino/Masculino
Cultivo Dependiente Nominal Presente/Ausente
Ureasa Dependiente Nominal Positiva/Negativa
Histología- Patología diagnosticada
Dependiente Nominal Reporte enfermedad.
Polimorfismo CC Nominal Presente/Ausente
CT Nominal Presente/Ausente
TT Nominal Presente/Ausente
6.5 Datos y análisis estadístico
Los pacientes que cumplieron con los criterios de inclusión del estudio leyeron y
firmaron el consentimiento informado y se les solicitó información y datos
personales que fue consignada en un formato único de recolección.
6.6 Procedimiento
6.6.1 Obtención de muestras
Se evaluaron los pacientes que ingresaron a endoscopia digestiva en la Clínica
Fundadores de Bogotá durante el periodo comprendido entre agosto de 2012 y
mayo de 2013, se incluyeron personas que cumplían con los criterios de inclusión
del estudio, todos ellos firmaron el consentimiento informado donde se explicaba
de manera detallada el estudio.
Durante el periodo comprendido para la captación de individuos, ingresaron al
estudio 46 pacientes, a cada uno de los cuales se le asignó un número único
dentro del estudio, comenzando desde el 01 hasta el 46, todos ellos fueron
sometidos a endoscopia digestiva alta, que fue realizada por el médico encargado,
a cada uno de ellos se le tomaron cuatro biopsias del antro gástrico y tres biopsias
del cuerpo gástrico, una de las biopsias proveniente del antro fue sometida a
prueba de ureasa rápida en caldo urea (Anexo E).
6.6.2 Transporte de las muestras
Las biopsias gástricas restantes (Tres biopsias de cuerpo y tres de antro) fueron
transportadas en cadena de frio de 2 a 8°C en crioviales con 500 μl de caldo
Brucella® (BD) con glicerol (Invitrogen) al 20%, hasta el laboratorio del grupo de
enfermedades infecciosas de la Pontificia Universidad Javeriana.
6.6.3 Procedimiento microbiológico
Las biopsias gástricas transportadas al laboratorio fueron procesadas de la
siguiente manera: dos biopsias de antro y dos de cuerpo fueron conservadas en el
mismo medio de transporte bajo una temperatura de -80°C, una biopsia de antro y
una de cuerpo fueron activadas mediante la maceración de las mismas con la
ayuda de un aplicador de madera estéril tratado con carbón activado (1%) el
producto resultante de cada biopsia fue sembrado en diferentes cajas de Petri con
agar Brucella suplementado con sangre de caballo (5%) enriquecido con Isovitalex
(Anexo C) y suplemento antibiótico DENT (Anexo D) con el fin de lograr el
aislamiento del microorganismo, las cajas fueron adecuadamente marcadas con el
número del paciente y el lugar de toma de la toma de la biopsia (Antro o cuerpo),
una vez sembradas, se incubaron a una temperatura de 37ºC con una atmósfera
de 11% de CO2 por tres días. Posteriormente, fueron revisadas las cajas de Petri
y se procedió así: Las cajas con ausencia de crecimiento microbiano fueron
incubadas de nuevo, las cajas con colonias sospechosas que mostraran
morfología típica de H. pylori (Pequeñas, puntiformes, translúcidas) fueron
examinadas macroscópicamente y se les realizó coloración de Gram, prueba de
ureasa, catalasa y oxidasa para la identificación y confirmación del
microorganismo, se realizó una resiembra de las mismas para la obtención de
colonias puras y se llevaron a incubar bajo las condiciones ya mencionadas.
6.6.4 Procedimiento molecular
6.6.4.1 Genotipificación de cagA y vacA de Helicobacter pylori
Una vez cumplido el tiempo de incubación, de cada caja confirmada fue tomada
una porción de las colonias crecidas, las cuales fueron introducidas en agua de
extracción para lograr una posterior recuperación de ADN bacteriano, producto
con el cual se realizó una identificación de los genotipos cag A y vac A de H. pylori
para cada individuo por medio de la técnica reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). La extracción de DNA se realizó mediante el protocolo de DNA zol (Anexo
F). El ADN extraído de cada muestra fue utilizado para la amplificación de los
genes bacterianos caga, vacA s1/s2 y vacA m1/m2, este procedimiento se realizó
de acuerdo a los protocolos del laboratorio de Microbiología de la Universidad
Javeriana (Tabla 2) y utilizando los cebadores de la tabla 3.
Tabla 2. Protocolos del laboratorio de Microbiología de la Universidad Javeriana para la amplificación de los genes cagA y vacA de H. pylori por medio de la técnica reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Reactivo Volumen
Agua 3,5 µl
Cebadores F/R 0,25µl
Taq polimerasa (Greentaq) 5µl
DNA 1µl
Volumen final de la reacción 10µl
Tabla 3. Cebadores utilizados y condiciones para la amplificación de los
genes cagA y vacA de H. pylori por medio de la técnica de reacción en cadena
de la polimerasa (PCR).
Gen Cebador Forward/Reverse Tamaño fragmento
(pb)
Denaturación inicial
Denaturación Hibridación Extensión Extensión final
No de ciclos
cagA
TTG ACC AAC AAC CAC AAA CCG AAG
CTT CCC TTA ATT GCG AGA TTC C
183
94°C-9 min
95°C-30 seg
50°C-45 seg
72°C-45 seg
72°C-5 min
40
vacA
s1
ATG GAA ATA CAA CAA ACA CAC
CTG CTT GAA TGC GCC AAA C
259
95°C-2 min
95°C-30 seg
52°C-30 seg
72°C-30 seg
72°C-5 min
40
vacA
s2
ATG GAA ATA CAA CAA ACA CAC
CTG CTT GAA TGC GCC AAA C
286
95°C-2 min
95°C-30 seg
52°C-30 seg
72°C-30 seg
72°C-5 min
40
vacA m1
GGT CAA AAT GCG GTC ATG G
CCA TTG GTA CCT GTA GAA AC
290
95°C-2 min
94°C-30 seg
52°C-30 seg
72°C-30 seg
72°C-5 min
40
vacA m2
GGA GCC CCA GGA AAC ATT G
CAT AAC TAG CGC CTT GCA C
352
95°C-2 min
94°C-30 seg
52°C-30 seg
72°C-30 seg
72°C-5 min
40
Posteriormente se confirmó el tamaño de los segmentos amplificados mediante
electroforesis en gel de agarosa (2%) revelados con Cyber, se añadió 5μl de
producto de cada muestra por pozo y se comparó con un patrón de peso
molecular de 100 pb-1kpb, las condiciones del corrido electroforético fueron 60
Voltios por 60 min, una vez transcurrido este tiempo, el gel se reveló bajo luz UV
mediante un fotodocumentador.
6.6.4.2 Determinación del gen IL-1B por PCR
A partir de los viales de caldo Brucella con glicerol al 20% conservados a -80°C
correspondientes a las biopsias de antro tomadas de cada paciente, se realizó la
genotipificación del gen IL-1B mediante la extracción de DNA de cada muestra,
por medio del kit Qiagen, al ADN obtenido, se le realizó la amplificación del gen de
la IL-1B por medio de la técnica reacción en cadena de la polimerasa (PCR), este
procedimiento se realizó de acuerdo a los protocolos del laboratorio de
Microbiología de la Universidad Javeriana (Tabla 4) y utilizando los cebadores y
condiciones de la tabla 5 .
Tabla 4. Protocolos del laboratorio de Microbiología de la Universidad Javeriana
para la amplificación del gen de la IL-1B por medio de la técnica Reacción en Cadena
de la Polimerasa (PCR).
Reactivo Volumen
Agua 17,25µl
Cebadores F/R 1,25µl
Taq polimerasa (Greentaq) 25µl
DNA 5µl
Volumen final de la reacción 50µl
Tabla 5. Cebadores utilizados y condiciones para la amplificación del gen de la IL-1B por medio de la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).
Gen Cebador Forward/Reverse Tamaño fragmento
(pb)
Denaturación inicial
Denaturación Hibridación Extensión Extensión final
No de ciclos
IL-1B TGGCATTGATCTGGTTCATA
GTTTAGGAATCTTCCCACTT
307 94°C-5 min 94°C-1min 57,5°C-1min 72°C-1min 72°C-7min 35
Para la confirmación del tamaño de los segmentos amplificados, se realizó una
electroforesis en gel de agarosa (2%) revelados con Cyber, se añadió 5μl de
producto de cada muestra por pozo y se comparó con un patrón de peso
molecular de 100 pb-1kpb, las condiciones del corrido electroforético fueron 60
Voltios por 60 min, una vez transcurrido este tiempo, el gel se reveló bajo luz UV
mediante un fotodocumentador. El producto amplificado restante (45μl) fue
enviado a MacroGen Corea para su secuenciación, estas fueron analizadas en
busca del polimorfismo IL-1B -31 por medio del programa BlastN, se realizó el
alineamiento con la secuencia del gen de la IL-1B con número de acceso al Gen
Bank No. AY137079.
7. RESULTADOS
Los resultados obtenidos en el presente estudio incluyen las características
generales de la población evaluada, la determinación del polimorfismo del gen de
la Il-1B de todos los individuos y la evaluación de los genotipos de virulencia de H.
pylori aislados.
7.1 Características generales de la población de estudio.
A partir de los 46 pacientes, 13 (27,6%) hombres y 33 (70,2%) mujeres, con edad
promedio de 53,6 (± 12,4) y 45,7 (±12,6) respectivamente, que asistieron a
endoscopia digestiva en el servicio de gastroenterología de la Clínica Fundadores
de Bogotá durante el periodo comprendido entre agosto de 2012 y abril de 2013,
que ingresaron al estudio por cumplir los criterios de inclusión, se obtuvieron 37
aislamientos de H. pylori pertenecientes a biopsia de cuerpo y antro gástrico de 25
pacientes que fueron catalogados como positivos para este microorganismo por
cumplir las siguientes características: Biopsia gástrica con prueba de ureasa
positiva (Figura 1), recuperación por aislamiento de colonias presuntivas de H.
pylori (Figura 2) y pruebas bioquímicas confirmatorias positivas: Bacilos Gram
negativos en forma de espiral (Figura 3), oxidasa (Figura 4) y catalasa positivas
(Figura 5).
Figura 1. Prueba de Urea. A: control
negativo B: control positivo.
Figura 2. Morfología macroscópica H
pylori. Crecimiento de colonias
pequeñas puntiformes y translúcidas en
medio Brucella suplementado con
sangre de caballo 5%.
Figura 3. Coloración de Gram H. pylori.
Presencia de Bacilos Gram negativos
(100x)
Figura 4. Prueba Oxidasa. A: control
negativo B: control positivo.
Figura 5. Prueba Catalasa.
A: control positivo. B: control negativo
A. B.
A.
A. B.
B.
7.1.1 Distribución de pacientes de acuerdo al resultado de Helicobacter
pylori.
Se realizó la determinación del porcentaje de pacientes positivos por género
según el resultado de histopatología (Estándar de oro) para Helicobacter pylori.
(Tabla 6), estos resultados se compararon con los obtenidos por el método de
cultivo microbiológico (Tabla 7), en donde se encontró una discrepancia de
resultados entre ambas metodologías, ya que 7 de los resultados proporcionados
por patología fueron negativos para la presencia de H. pylori en tejidos de biopsias
gástricas, mientras que los resultados arrojados por cultivo microbiológico fueron
todo lo contrario, encontrándose crecimiento del microorganismo y por ende
reportándose como positivos a estos individuos.
Tabla 6 Distribución de pacientes según género de acuerdo al resultado de
histopatología para Helicobacter pylori.
Genero Total
Femenino Masculino
Biopsia
Negativa Recuento 13 5 18
% del total 28,3% 10,9% 39,1%
Positiva Recuento 20 8 28
% del total 43,5% 17,4% 60,9%
Total Recuento 33 13 46
% dentro de biopsia 71,7% 28,3% 100,0%
Tabla 7. Comparación de resultado obtenido para Helicobacter pylori en
histopatología y cultivo.
Biopsia Total
Negativa Positiva
Cultivo
Negativo Recuento 11 7 18
% del total 23,9% 15,2% 39,1%
positivo Recuento 7 21 28
% del total 15,2% 45,7% 60,9%
Total Recuento 18 28 46
% del total 39,1% 60,9% 100,0%
7.1.2 Distribución de pacientes según resultado de histopatología. Las biopsias gástricas obtenidas de los 46 pacientes que ingresaron al estudio
fueron sometidas a análisis de histopatología por laboratorios de referencia de la
Clinica fundadores Bogotá, a partir de los cuales se observó que el diagnóstico
más frecuente en hombres y mujeres fue gastritis crónica (75,1%) ya que se
presentó en 35 casos de 46. (Tabla 8)
Tabla 8. Distribución de los pacientes según resultado de histopatología
Patología
Esofagitis sin patología
Gastritis crónica
Ulcera duodenal
hiperplasia y metaplasia
Total
Genero
Femenino
Recuento 1 28 2 2 33
% del total
2,2% 60,9% 4,3% 4,3% 71,7%
Masculino
Recuento 0 7 2 4 13
% del total
0,0% 15,2% 4,3% 8,7% 28,3%
Total
Recuento 1 35 4 6 46
% del total
2,2% 76,1% 8,7% 13,0% 100,0%
7.1.3 Distribución de pacientes según resultado de secuenciación del gen Il-
1B
La confirmación del tamaño de los segmentos amplificados del gen IL-1B (307pb)
a partir de biopsias gástricas de los pacientes en el estudio se observa en la figura
6.
Figura 6. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a la amplificación del gen IL-1B Primer carril: Patrón de peso molecular 100 pb-1kpb. Segundo carril: Blanco de la prueba. Demás carriles: Amplificación positiva gen IL-1B a partir de biopsias gástricas de pacientes. El tamaño del fragmento representado por la banda marcada corresponde a un peso de 307 pb.
Del producto amplificado enviado a MacroGen Corea para secuenciación, se hizo
un análisis con el programa Blastn en busca del polimorfismo IL-1B -31, por
medio del alineamiento con la secuencia del gen de la IL-1B con número de
acceso al Gen Bank No. AY137079, los resultados son descritos en la tabla 9, en
donde se observa que el polimorfismo más frecuente dentro de la población total
evaluada fue CT con un total de 22 casos entre 46 lo que corresponde a un
porcentaje de 47,8%, los genotipos CC y CT obtuvieron el mismo porcentaje
dentro de la población evaluada es decir 26,1%.
307 pb
IL-1B
Tabla 9. Distribución de pacientes por género según resultado de
secuenciación del gen Il-1B
Polimorfismo Total
CC CT TT
Genero
Femenino Recuento 10 18 5 33
% del total 21,7% 39,1% 10,9% 71,7%
Masculino Recuento 2 4 7 13
% del total 4,3% 8,7% 15,2% 28,3%
Total Recuento 12 22 12 46
% del total 26,1% 47,8% 26,1% 100,0%
7.1.4 Asociación entre la infección por H. pylori y el polimorfismo -31 del gen
de la IL-1B
Los datos de pacientes positivos y negativos en cultivo para H. pylori fueron
contrastados con los hallazgos de alelo y genotipo del gen de la IL-1B, los
resultados son mostrados en la tabla 10, en donde se evidencia que el
polimorfismo CT es el que más casos reportados de cultivo positivo presentó
(54,5%). Se realizó la misma comparación con los datos reportados por
histopatología y los polimorfismos de IL-1B encontrados, los cuales se resumen en
la tabla 11, en donde se observa un predominio de aislamientos positivos de
Helicobacter pylori en los pacientes que poseían el polimorfismo CT (54,5%).
Tabla 10. Asociación entre la presencia de H. pylori en cultivo y el
polimorfismo -31 del gen de la IL-1B
Polimorfismo Total
CC CT TT
Cultivo
Negativo Recuento 2 10 6 18
% del total 4,3% 21,7% 13,0% 39,1%
positivo Recuento 10 12 6 28
% del total 21,7% 26,1% 13,0% 60,9%
Total Recuento 12 22 12 46
% del total 26,1% 47,8% 26,1% 100,0%
Tabla 11. Asociación entre la presencia de H. pylori en resultado de histopatología y el polimorfismo -31 del gen de la IL-1B
Polimorfismo Total
CC CT TT
Biopsia
Negativa Recuento 4 10 4 18
% del total 8,7% 21,7% 8,7% 39,1%
Positiva Recuento 8 12 8 28
% del total 17,4% 26,1% 17,4% 60,9%
Total Recuento 12 22 12 46
% del total 26,1% 47,8% 26,1% 100,0%
Debido a que en las dos metodologías (Cultivo e histopatología) existían datos no
concordantes en la positividad para H. pylori en los individuos, se realizó un
constructo con los datos recogidos de ambas técnicas, en donde no se excluía
ningún dato positivos para H. pylori, estos resultados fueron contrastados con los
polimorfismos encontrados en la población evaluada (Tabla 12), en donde
continúa el predominio de positividad para el microorganismo en la población con
polimorfismo CT.
Tabla 12. Relación entre el polimorfismo -31 de la IL-1B y la presencia de H.
pylori en resultado de histopatología y cultivo.
Polimorfismo Total
CC CT TT
Cultivo+
Biopsia
Negativo Recuento 1 6 4 11
% del total 2,2% 13,0% 8,7% 23,9%
Positivo Recuento 11 16 8 35
% del total 23,9% 34,8% 17,4% 76,1%
Total Recuento 12 22 12 46
% del total 26,1% 47,8% 26,1% 100,0%
7.2 Distribución de genotipos de virulencia de H. pylori
7.2.1 Distribución gen cagA
Se encontró el gen cagA en el 35% de los casos (tabla 13), esta determinación se
logró mediante electroforesis en gel de agarosa, en donde el tamaño del
fragmento a evaluar (gen cagA) fue de 183 pb (figura 7), estos resultados fueron
confrontados con los obtenidos en los reportes de histopatología y polimorfismo de
la población (Tabla 14) en donde se observó que la mayoría (19/28) de los casos
con patología reportada presentaba una cepa infectante cagA positiva, este
resultado se encontró aumentado a expensas principalmente de los pacientes con
gastritis crónica (15/28); de los cuales 9/15 tenían polimorfismo del gen IL-1B.
Tabla 13. Presencia del gen cagA en aislamientos de H. pylori obtenidos a partir de biopsias gástricas.
Genotipo
cagA
Antro (%) Cuerpo (%) Total (%)
Positivo 11 (31,4%) 13 (37,1%) 24 (68,6%)
Negativo 6 (17,1%) 5 (14,3%) 11 (31,4%)
Total 17 (48,6%) 18 (51,4%) 35 (100 %)
Figura 7. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a la amplificación del gen cagA. Primer carril: Patrón de peso molecular 100 pb-1kpb. Segundo carril: Blanco de la prueba. Tercer carril: Control positivo (H. pylori NCTC 11637). Demás carriles: Amplificación positiva y negativa para el gen cagA de H. pylori aislado a partir de biopsias gástricas de pacientes positivos para este microorganismo. El tamaño del fragmento representado por la banda marcada corresponde a un peso de 183 pb.
Tabla 14. Relación del polimorfismo -31 del gen de la IL-1B y el
genotipo de virulencia de Helicobacter pylori cagA con la aparición de
enfermedades gastroduodenales.
Recuento
Patología Virulencia cagA Total
cagA
Negativo
cagA
Positivo
Sin patología esofagitis Polimorfismo CT/TT 0 1 1
Total 0 1 1
Gastritis crónica Polimorfismo
CC 3 6 9
CT/TT 5 9 14
Total 8 15 23
Ulcera duodenal Polimorfismo CT/TT 1 1 2
Total 1 1 2
Hiperplasia y metaplasia Polimorfismo
CC 0 1 1
CT/TT 0 1 1
Total 0 2 2
Total Polimorfismo
CC 3 7 10
CT/TT 6 12 18
Total 9 19 28
183 pb
cagA
7.2.2 Distribución gen vacA.
Se realizó genotipificación para los alelos vacA s1/s2 y vacA m1/m2 para
determinar las combinaciones que presentaba la población de estudio, siendo
genotipo vacA s1m1 el más frecuente (50%) (Tabla 15), los tamaños de
amplificación se pueden observar en las figuras 8 ,9 y 10, estos resultados fueron
confrontados con los obtenidos en los reportes de histopatología y polimorfismo de
la población (Tabla 16), en donde se encuentra que la mayoría (15/28) de los
casos con patología reportada presentaba una cepa infectante vacA s1m1, se
muestra también un aumento de los pacientes con padecimiento de gastritis
crónica positivos para la cepa mencionada (13/15), de los cuales 6/15 tenían
polimorfismo del gen IL-1B.
Tabla 15. Presencia del gen vacA y determinación de los alelos más frecuentes
de aislamientos de H. pylori obtenidos a partir de biopsias gástricas.
Genotipo vacA Antro (%) Cuerpo (%) Total (%)
vacA s1m1 11 (27,5%) 9 (22,5%) 20 (50%)
vacA s1m2 4 (10%) 4 (10%) 12 (30%)
vacA s2m1 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
vacA s2m2 5 (12,5%) 7 (17,5%) 12 (30%)
Total 20 (50%) 20 (50%) 40 (100%)
Figura 8. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a la amplificación del gen vacAs1/s2. Primer carril: Patrón de peso molecular. Segundo carril: Blanco de la prueba. Tercer carril: Control positivo (H. pylori NCTC 11637). Demás carriles: Amplificación positiva y negativa para los alelos del gen vacAs1/s2 de H. pylori aislado a partir de biopsias gástricas de pacientes positivos para este microorganismo. El tamaño del fragmento representado por la banda marcada corresponde a un peso de 259 pb para el alelo vacA s1 y 286 pb para el alelo vacA s2
vacA s1 vacA s2
259 pb
286 pb
Figura 9. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a la amplificación del gen vacAm1. Primer carril: Patrón de peso molecular. Segundo carril: Blanco de la prueba. Tercer carril: Control positivo (H. pylori NCTC 11637). Demás carriles: Amplificación positiva y negativa para el alelo del gen vacAm1 de H. pylori aislado a partir de biopsias gástricas de pacientes positivos para este microorganismo. El tamaño del fragmento representado por la banda marcada corresponde a un peso de 290 pb
Figura 10. Electroforesis en gel de agarosa correspondiente a la amplificación del gen vacAm2. Primer carril: Patrón de peso molecular. Segundo carril: Blanco de la prueba. Tercer carril: Control (H. pylori NCTC 11637). Demás carriles: Amplificación positiva y negativa para el alelo del gen vacAm2 de H. pylori aislado a partir de biopsias gástricas de pacientes positivos para este microorganismo. El tamaño del fragmento representado por la banda marcada corresponde a un peso de 352 pb
290 pb
vacA m1
352 pb
vacA m2
Tabla 16. Asociación del polimorfismo -31 del gen de la IL-1B y el genotipo de
virulencia de Helicobacter pylori vacA s1m1 con la aparición de enfermedades
gastroduodenales.
Tabla de contingencia polimorf2 * virulenciaS1M1 * patologia2
Recuento
Patología Virulencia vacAs1m1 Total
vacAs1m1 Negativo
vacAs1m1 Positivo
Sin patología esofagitis Polimorfismo CT/TT 1 0 1
Total 1 0 1
Gastritis crónica Polimorfismo
CC 2 7 9
CT/TT 8 6 14
Total 10 13 23
Ulcera duodenal Polimorfismo CT/TT 2 0 2
Total 2 0 2
Hiperplasia y metaplasia Polimorfismo
CC 0 1 1
CT/TT 0 1 1
Total 0 2 2
Total Polimorfismo
CC 2 8 10
CT/TT 11 7 18
Total 13 15 28
7.3 Asociación de los genes cagA, vacA e IL 1B en los aislamientos
obtenidos.
La asociación entre las variantes CC, CT, TT de IL-1B -31 y las distintas
patologías se describen en las tablas 17,18,19 respectivamente, estas tablas
proporcionaron los datos suficientes para evidenciar que las cepa con mayor
frecuencia encontradas en los aislamientos clínicos fueron las positivas para el
gen cagA y vacA s1m1 , razón por la cual se realizó un compendio de los datos
mencionados, que son mostrados en la tabla 20, en donde se evidencia que la
cepa considerada como la más virulenta fue encontrada en 11 de 23 casos de
gastritis crónica, de las cuales 6 de 11 tienen el polimorfismo, también se
evidencia la presencia de 2 casos de patologías más severas (Metaplasia e
hiperplasia), positivos para esta cepa virulenta, sin embargo, un paciente no
presenta polimorfismo, mientras que el restante si.
Tabla 17. Relación entre los genes cagA, vacA, el polimorfismo CC del gen IL 1B y la patología en los aislamientos obtenidos.
Polimorfismo Patología Total
Gastritis
crónica
Hiperplasia y
metaplasia
CC
Virulencia
cepa
cagA+vacA s1m1
Recuento 5 1 6
% del total 50,0% 10,0% 60,0%
cagA+vacA s1m2 Recuento 1 0 1
% del total 10,0% 0,0% 10,0%
cagA-vacA s1m1 Recuento 2 0 2
% del total 20,0% 0,0% 20,0%
cagA-vacA s1m2 Recuento 1 0 1
% del total 10,0% 0,0% 10,0%
Total Recuento 9 1 10
% del total 90,0% 10,0% 100,0%
Tabla 18. Relación entre los genes cagA, vacA, el polimorfismo CT del gen IL 1B y la patología en los aislamientos obtenidos.
Polimorfismo Patología Total
Sin patología
Esofagitis
Gastritis crónica Hiperplasia y metaplasia
CT
Virulencia cepa
cagA+vacA s1m1
Recuento 0 5 1 6
% del total 0,0% 41,7% 8,3% 50,0%
cagA+vacA
s1m2
Recuento 1 3 0 4
% del total 8,3% 25,0% 0,0% 33,3%
cagA-vacA s2m2
Recuento 0 2 0 2
% del total 0,0% 16,7% 0,0% 16,7%
Total
Recuento 1 10 1 12
% del total 8,3% 83,3% 8,3% 100,0%
Tabla 19. Relación entre los genes cagA, vacA, el polimorfismo TT del gen IL 1B y la patología en los aislamientos obtenidos.
Polimorfismo Patología Total
Gastritis crónica Úlcera duodenal
TT
Virulencia cepa
cagA+vacA s1m1
Recuento 1 0 1
% del total 16,7% 0,0% 16,7%
cagA+vacA s1m2
Recuento 0 1 1
% del total 0,0% 16,7% 16,7%
cagA-vacA s2m2
Recuento 3 1 4
% del total 50,0% 16,7% 66,7%
Total Recuento 4 2 6
% del total 66,7% 33,3% 100,0%
Tabla 20. Asociación del polimorfismo -31 del gen de la IL-1B y el
genotipo de virulencia de Helicobacter pylori cagA y vacA con la
aparición de enfermedades gastroduodenales.
Tabla de contingencia polimorf2 * patologia2 * virucags1m1
Recuento
Virulencia cag vacs1m1 Patología Total
Sin patología
esofagitis
Gastritis
crónica
Ulcera Hiperplasia y
metaplasia
cagA Negativo vacAs1m1
Negativo
Polimorfismo CC 0 4 0
0 4
CT/TT 1 8 2 0
11
Total 1 12 2 0
15
cagA Positivo vacAs1m1
Positivo
Polimorfismo CC
0 5
0 1 6
CT/TT 0
6 0
1 7
Total 0
11 0
2 13
Total Polimorfismo
CC 0 9 0 1 10
CT/TT 1 14 2 1 18
Total 1 23 2 2 28
7.4 Asociación de los genes cagA, vacA s1m1 e IL 1B.
Debido a que los datos más relevantes en este estudio fueron la determinación de
cagA, vacA s1m1 y la presencia o ausencia de polimorfismo IL-1B, se realizó una
tabla consenso (Tabla 21) con los datos obtenidos, en donde se demuestra que no
hay relación estadísticamente significativa entre la presencia del polimorfismo de
IL-1B y la colonización de cepas cagA positivas, también se pudo determinar que
existe una relación estadísticamente significativa entre el polimorfismo del gen IL-
1B y la colonización por cepas vacA s1m1. Con estos resultados se quiso
determinar si existía un efecto sinérgico entre estas dos variables, por lo cual, se
realizó la asociación de colonización de cepas cagA positivo vacA s1m1 con la
presencia del polimorfismo IL-1B, encontrando la no existencia de relación
estadísticamente significativa.
Tabla 21. Relación del polimorfismo -31 del gen de la IL-1B y el genotipo de
virulencia de Helicobacter pylori cagA positivo y vacA s1m1 positivo
Polimorfismo cagA NS vacA s1m1 NS cagA positivo vacA
s1m1
NS
Negativo Positivo 0.856 Negativo Positivo 0.037 Negativo Positivo 0.283
CC 3 7 2 8 4 6
CT/TT 6 12 11 7 11 7
8. DISCUSIÓN
Helicobacter pylori ha sido asociado a la aparición de enfermedades
gastroduodenales con posible desenlace en carcinogénesis gástrica, hecho que
plantea la importancia en la búsqueda de marcadores tanto bacterianos como
humanos que permitan identificar a los individuos con mayor riesgo de desarrollar
enfermedades severas causadas por este microorganismo que sustenta una alta
prevalencia (80%) en la población adulta colombiana, por lo cual en este estudio
se realizó la determinación de la asociación de componentes bacterianos (genes
cagA y vacA) y humanos (polimorfismo -31 de IL-1B) con el desarrollo de
enfermedades gastroduodenales, esto se logró mediante el diagnóstico de
infección por H. pylori, el cual fue confirmado en todos los pacientes por medio de
tres metodologías: Prueba de ureasa, activación de las biopsias gástricas en
medio de cultivo Brucella suplementado con sangre de caballo 5% y análisis
histopatológico; a partir de las derivaciones obtenidas en cada prueba, se
encontraron discrepancias en los resultados de positividad para H. pylori, ya que
24/46 pacientes fueron positivos para la prueba de ureasa, sin embargo a 3/24 de
estos pacientes no fue posible la recuperación microbiológica del microorganismo,
por lo cual fue necesaria la extracción de posible ADN bacteriano a partir de las
biopsias obtenidas a las cuales se les realizó la amplificación de genes
marcadores de H. pylori (cagA y vacA) obteniendo resultados que indicaban la
presencia del microorganismo; caso contrario del estudio en donde se encontraron
4/22 pacientes con prueba de ureasa negativa pero con recuperación del
microorganismo en medio de cultivo, los cuales fueron incluidos como positivos
para H. pylori. También se encontraron diferencias entre los resultados
proporcionados por patología en donde se evaluó la presencia o ausencia de H.
pylori en tejidos de biopsias gástricas y los reportes hechos por el laboratorio de
microbiología de la Universidad Javeriana (Tabla 6 y 7), en donde se evidenciaron
7 casos positivos en el estudio que fueron reportados como negativos en el
documento de histopatología y 7 casos negativos para el laboratorio que fueron
considerados positivos en el análisis histopatológico (Tabla 7), mostrando una
falencia en la concordancia de las pruebas, observación que se opone a lo
reportado por Opavski N, et al. 2007, en donde se señala que para la
determinación de la presencia o ausencia del microorganismo se puede utilizar
cualquiera de las tres pruebas mencionadas. (34)
La genotipificación del gen vacA (Tabla 14) fue vacA s1m1 20 (50%) vacA s2m2
12 (30%) vacA s1m212 (30%) y vacA s2m10 (0%). Resultado predominante por el
genotipo vacA s1m1 concordando con los resultados encontrados por Yamaoka et
al. 1999 (33) en donde se evaluaron los genotipos de H. pylori en 4 poblaciones
diferentes (Japón, Corea, Estados Unidos y Colombia), sin embargo, este
resultado difiere del reportado por Araya et al. 2004 (32) y Cittelly et al. 2002 (35),
en donde el genotipo vacA más frecuente fue el s2/m2, lo que demuestra la
heterogeneidad en la frecuencia de las cepas circulantes del microorganismo
alrededor del mundo.
El gen cagA se amplificó en el 68,6% (24/46) de los casos con infección por H.
pylori (Tabla 13) estos datos positivos predominantes se correlacionaron con los
reportados por Cogo et al. 2011 (36), en el que el 92 % (36/39) de las muestras
analizadas fueron positivas para el gen cagA, con Yamaoka et al. 1999 en donde
se reporta una predominancia de aislamientos clínicos positivos para el gen cagA
en las 4 regiones evaluadas (Japón, Corea, Estados Unidos y Colombia), con
Cittelly et al. 2002, en donde se revela la frecuencia aumentada de genotipos cagA
positivos por la positividad en el 63,7% (86/135) de los casos evaluados.
Respecto al resultado de histopatología obtenido (Tabla 8), se evidenció un
predominio de gastritis crónica activa en 26/46 (56,5%) de los individuos
analizados, resultado que se relaciona con la frecuencia aumentada de genotipo
cagA positivos, sin embargo, es importante resaltar que cagA por sí solo no es
marcador de complicaciones a otras enfermedades más severas, debido a que la
virulencia real de la cepa infectante depende de organización dentro del islote de
patogenicidad (PAI) y de la ausencia de modificaciones en esta, la presencia de
cagA positivo en una cepa infectante, suele estar ligada a la presencia del alelo
vacA s1, (37), caso que se evidenció en este estudio además del alelo
acompañante vacA m1, considerado como la combinación más citotóxica y
encontrada en mayor frecuencia en patologías avanzadas como cáncer gástrico y
úlcera péptica, lo que se podría interpretar como marcador de riesgo ante la
posible complicación de gastritis no atrófica a patologías más graves. (35), Cogo
et al. 2011 (36) exponen que el alelo vacA s1 en comparación con el vacA s2 se
encuentra con mayor prevalencia en enfermedades gastroduodenales más
severas como ulcera péptica, ya que induce la secreción activa de niveles más
altos de citotoxinas por lo cual se consideran cepas más virulentas, sin embargo,
este estudio difiere de lo anterior, ya que únicamente 2/46 pacientes presentaron
esta patología, uno de ellos sin la presencia del microorganismo y el otro con
genotipo diferente al mencionado, sin embargo esto expone la posibilidad de
riesgo aumentado en los pacientes con presencia de cepa vacA s1m1 (50%) a
padecer a futuro patologías más graves en comparación con los portadores de
cepas vacA s2m2, ya que la región que codifica para vacA s1, se reconoce por ser
altamente activa en comparación con la región vacA s2 y m2, la cual codifica una
proteína con un sitio diferente de clivaje del péptido señal , lo que genera una
inhibición de la vacuolización (37)
Respecto a los resultados obtenidos en cuanto al factor del riesgo del polimorfismo
-31 del gen IL-1B, se evidenció que existe dentro de los pacientes participantes en
el estudio, un porcentaje elevado con polimorfismo CT (47,8%), seguido de los
polimorfismos CC y TT, ambos con el mismo porcentaje en la población (26,1%),
dentro de la población con polimorfismo CT. (Tabla 9), estos datos concuerdan
con los reportados por Montealegre et al. 2008, en donde en una población
también colombiana hubo predominio del 60,6% de heterocigotos (CT) seguido de
los genotipos CC y TT que obtuvieron frecuencias inferiores, de 26,8% y 12,7%
respectivamente y con Alpízar et al. 2005 (41), estudio en Costa Rica en donde
reportan una frecuencia mayor del genotipo CT (50%), seguida de CC (27%) y por
ultimo TT (23%); y con Mansour et al. 2006 (40) en cuyo estudio también
predominó el polimorfismo CT con un porcentaje de 50,8% en una población árabe
evaluada, seguida de TT con un porcentaje de 26.3%, resultado con el que difiere
este estudio. A pesar de esto, la relevancia de estos datos está dada por reportes
en los que se menciona que este tipo de polimorfismos en la posición -31 de la
región promotora del gen IL-1B, está asociado con mayor secreción de citoquina,
lo que va a desencadenar una disminución en la producción de ácido que conduce
al desarrollo de atrofia gástrica y cáncer gástrico (38); estos resultados difieren
con las frecuencias encontradas por Palli et al. 2005 (39) en una población
italiana, en donde la frecuencia más alta de polimorfismo está dada por la variedad
TT con un 45,4% dentro de la misma, seguida de la variación CT con un 43,8% y
por último la ausencia de polimorfismo CC con un valor de 10,8% dentro de la
población.
Es importante resaltar el resultado de infección por H. pylori, respecto a los
polimorfismos encontrados, ya que se evidenció un predominio de infección por el
microorganismo del 45,7% en el polimorfismo CT respecto a los polimorfismos CC
y TT con porcentajes de positividad para H. pylori de 31,4% y 22,9%
respectivamente (Tabla 12)
En la relación entre los genes cagA, vacA, el polimorfismo CC del gen IL 1B y la
patología en los aislamientos obtenidos se observaron pacientes con gastritis
crónica, hiperplasia y metaplasia únicamente, entre estos, es de suma importancia
señalar la presencia de una cepa con genotipo cagA+ vacA s1m1 (considerado el
más virulento) recuperada a partir de un aislamiento clínico proveniente de un
paciente con diagnóstico de Hiperplasia y metaplasia, al asociarla con la aparición
de patologías más severas, lo que indica una alarma para los pacientes con el
mismo polimorfismo que cursan actualmente una gastritis crónica con presencia
del microorganismo con la misma capacidad de virulencia (83,3%) (Tabla 15), Lo
mismo ocurre con la relación del polimorfismo CT y las otras variantes reportadas
en la tabla 16. En donde se observa la presencia de un individuo con la patología
más severa reportada en este caso y con el genotipo más virulento de cepa
infectante de H. pylori, sin embargo, en este caso se añade el factor de riesgo
asociado a la hipoclorhidria provocada por la secreción exagerada de IL-1b al
medio, causado por el cambio de un nucleótido (Timina por citosina) en uno de los
alelos de la región promotora de IL-1B del individuo, razón por la cual entrarían
como individuos más expuestos a aparición de metaplasia e hiperplasia, los 5
pacientes que presentaron el mismo polimorfismo y cepa infectante pero con una
patología que puede ser considerada previa para la aparición de otras más graves,
sin embargo, Montealegre et al. 2008, exponen que no hay relación
estadísticamente significativa entre la presencia de alguno de los polimorfismos y
el grado de alteración del tejido gástrico y sugieren que la región polimórfica -31,
no representaría un indicador de riesgo en la aparición y desarrollo de patologías
severas.
Respecto a la relación del polimorfismo -31 del gen de la IL-1B y el genotipo de
virulencia de Helicobacter pylori cagA positivo y vacA s1m1 positivo (Tabla 21) se
evidenció que no hay relación estadísticamente significativa entre la presencia del
polimorfismo de IL-1B y la colonización de cepas cagA positivas, ya que
solamente hay estudios reportados en los que se evalúa la presencia o no del
microorganismo frente a los distintos polimorfismos, sin tocar la variable de la
genotipificación del microorganismo. También se estableció que existe una
relación estadísticamente significativa entre el polimorfismo del gen IL-1B y la
colonización por cepas vacA s1m1. La unión de estas variables permitió
establecer que no existe una relación estadísticamente significativa entre la
presencia del polimorfismo IL-1B y la colonización de cepas que cumplieran con
ambas condiciones, que fueran cagA positivo y vacA s1m1, resultado que no pudo
ser confrontado por la literatura revisada, debido a que en ninguno se establece la
relación entre el genotipo más virulento de H. pylori (cagA positivo vacA s1m1) y la
aparición de polimorfismo en la región promotora del gen IL-1B, sin embargo en
este estudio (Tabla 20), se puede inferir que la variable del polimorfismo -31 IL-1B
puede ser independiente en la aparición o no de enfermedades más severas como
hiperplasias o metaplasias, debido a que se observó que en todo el estudio hubo
únicamente 2 pacientes con este tipo de patología, de los cuales solo uno
presentaba polimorfismo, sin embargo, ambos se encontraban infectados por una
cepa con virulencia cagA positiva y vacA s1m1.
9. CONCLUSIONES
Se evaluó la secuencia del gen de la IL-1B de los pacientes que ingresaron al
estudio, en busca del polimorfismo -31, encontrando un mayor porcentaje (47,8%)
del tipo CT, también se determinó el genotipo para las citotoxinas bacterianas
vacA y cagA de Helicobacter pylori de los aislamientos clínicos genotipo,
resultando el genotipo cagA positivo en el 68,6% de los aislamientos y el genotipo
vacA s1m1 como el más frecuente, encontrado en el 50% de las cepas aisladas.
Se realizó la correlación entre los datos más relevantes del estudio, demostrando
que no hay relación estadísticamente significativa entre la presencia del
polimorfismo de IL-1B y la colonización de cepas cagA positivas, también se pudo
determinar que existe una relación estadísticamente significativa entre el
polimorfismo del gen IL-1B y la colonización por cepas vacA s1m1, también se
demostró que no hay asociación estadísticamente significativa entre la
colonización por cepas cagA positivo vacA s1m1 y la presencia del polimorfismo
IL-1B.
10. RECOMENDACIONES
Teniendo en cuenta que los genes de virulencia pueden usarse como marcadores
de riesgo de enfermedades gastroduodenales severas, se recomienda realizar una
evaluación más específica de los determinantes de riesgo como los subtipos del
gen vacA de la región señal s1a, s1b, s1c y de la región media m1a, m1b, m2a y
m2b.
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12. ANEXOS
ANEXO A. Agar Brucella
Caseína digerida por enzimas pancreáticas 10.0 g
Tejido animal digerido por enzimas pépticas 10.0 g
Dextrosa 1.0 g
Extracto de Levadura 2.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Bisulfito sodio 0.1 g
Agar 15 g
Suspender 43 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Mezcle bien. Caliente
agitando frecuentemente y hierva durante 1 minuto para disolver completamente el
polvo. Autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
ANEXO B. Caldo Brucella (BBL)
Caseína digerida por enzimas pancreáticas 10.0 g
Tejido animal digerido por enzimas pépticas 10.0 g
Dextrosa 1.0 g
Extracto de Levadura 2.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Bisulfito sodio 0.1 g
Suspender 43 g del polvo en 1 litro de agua purificada. Mezcle bien. Caliente
agitando frecuentemente y hierva durante 1 minuto para disolver completamente el
polvo. Autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
ANEXO C. Isovitalex (BD)
Suplemento enriquecido que se usa como aditivo para los medios de cultivo de
microorganismos nutricionalmente exigentes.
Adenina Sulfato 10.0g
Acido p-aminobenzoico 13mg
Cocarboxilasa 2.0mg
L-Cisteina HCL 25.9 g
L-Cisteina 1.1g
Nicotinamina Adenina
Dinucleótico
0,25mg
Nitrato Férrico 0.02g
L-Glutamina 10g
Guanina HCL 0.03g
Tiamina HCL 3.0mg
Vitamina B12 0.01g
Dextrosa 100g
Tiamina pirofosfato 0,1g
Preparación: El liofilizado se reconstituye con 10 ml del diluyente acompañante
con jeringa estéril y se agita la solución hasta homogenización completa. Se
agrega 2ml por cada 500ml de medio.
ANEXO D. Suplemento selectivo para H.pylori (DENT) (OXOID)
Vancomicina 5.0mg
Trimetropim 2.5mg
Cefsulodin 2.5mg
Anfotericina B 2.5mg
Preparación: El liofilizado se reconstituye con 2 ml de agua destilada estéril y se
agregan 2ml por cada 500ml de medio.
ANEXO E. Caldo urea (Prueba de ureasa)
Suspender 1 gramo de Urea (Sigma) en 10 mL de agua destilada estéril. A parte,
suspender 0.001 gramos de rojo de fenol en 10 mL de agua destilada estéril. Para
10 mL de solución de urea, agregar 1 mL de la solución de rojo de fenol. (Rojo de
fenol 0.01%)
PH 6.9 amarillo
PH 8.2 rojo
ANEXO F. DNA zol:
Es una solución lisadora, cuyo proceso de lisis se fundamenta en el uso de
detergente-guanidina que permite la precipitación selectiva del DNA de la célula
lisada. Durante la obtención de DNA la muestra biológica es lisada en 1ml de DNA
zol, se centrifuga (10.000 r.p.m. por 10 minutos) y el sobrenadante es transferido
a un tubo Eppendorf estéril en donde se le añaden 500ul de etanol al 100% por 15
minutos a -70ºC, con el fin de precipitar el DNA, se centrifuga (4.000 r.p.m. por 3
minutos), se descarta el sobrenadante y el precipitado es sometido a 2 lavados
con etanol (75%), después se espera a que se evapore el etanol y se procede a
agregar 500-1000ul de (NaOH 8mM) sobre el ADN obtenido.
