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ATIVIDADE BIOCIDA DE Annona coriacea MART 1841 SOBRE O VETOR Rhodnius neglectus LENT 1954
(HEMIPTERA: REDUVIIDAE).
ÂNGELA PINHEIRO CARNEIRO
Dissertação apresentada à Universidade do Estado de Mato Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais para obtenção do título de Mestre.
CÁCERES
MATO GROSSO, BRASIL 2010
1
ÂNGELA PINHEIRO CARNEIRO
ATIVIDADE BIOCIDA DE Annona coriacea MART 1841 SOBRE O VETOR Rhodnius neglectus LENT 1954 (HEMIPTERA:
REDUVIIDAE).
Dissertação apresentada à Universidade do Estado de Mato Grosso, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Ciências Ambientais para obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Profª. Drª. Mônica Josene Barbosa Pereira.
CÁCERES MATO GROSSO, BRASIL
2010
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ÂNGELA PINHEIRO CARNEIRO
Atividade biocida de Annona coriacea (Mart, 1841) sobre o vetor
Rhodnius neglectus (Lent, 1954) (Hemiptera: Reduviidae).
Essa dissertação foi julgada e aprovada como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Ciências Ambientais. Cáceres-MT, 18 de Março de 2010.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________________________ Profª. Drª. Carla Galbiati
Universidade do Estado de Mato Grosso - UNEMAT __________________________________________________________________
Profª. Drª. Liléia Gonçalves Diotaiuti Fundação Oswaldo Cruz, René Rachou – FIOCRUZ
________________________________________________________________ Profª. Drª. Mônica Josene Barbosa Pereira
Universidade do Estado de Mato Grosso - UNEMAT (Orientadora)
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DEDICATÓRIA
Dedico esta conquista aos meus pais, Benedito M. Carneiro e Mª. Rosangela P.
Carneiro que sempre me instruíram com todo amor e carinho. Aqui está uma
importante parte da minha trajetória que dedico a vocês. Obrigada pela
compreensão e apoio.
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AGRADECIMENTOS Muitas pessoas contribuíram para a realização desta pesquisa, pessoas que foram
essenciais, indispensáveis, sendo a primeira, Jeová Deus, que sem sua mão
protetora nada é possível.
Agradeço a minha orientadora Mônica J. B. Pereira pela orientação e apoio
durante todo o mestrado, sem dúvida o conhecimento passado foi
importantíssimo.
Aos professores do mestrado, em especial a Carla Galbiati que sempre esteve
disposta a ajudar com as análises estatísticas da dissertação, discussão dos
resultados e com a disponibilização de materiais, a professora Célia e a Áurea que
também disponibilizaram materiais.
Agradeço a todos os funcionários e pesquisadores da Fundação Oswaldo Cruz,
Instituto René Rachou de Belo Horizonte, em especial a Drª. Liléia Diotaiuti e
Angélica que possibilitaram a realização do estágio com triatomíneos, ao
Ademilson que me ensinou todas as técnicas de criação de triatomíneos e a
Grasielle Caldas pelas experiências, materiais e todo o apoio fornecido até a
conclusão da minha dissertação.
Não posso deixar de agradecer as pessoas queridas que estiveram todos os dias
comigo no laboratório, ajudando de inúmeras formas, ao Elderson que foi
voluntário desde o início da minha pesquisa, e agora bolsista, a Kelly pela
companhia em longos dias de trabalho, aos meus amigos do mestrado pelo apoio
e encorajamento, em especial ao Wilkinson (Kiwi) por sua generosidade e afeto,
tendo sempre palavras encorajadoras, muito obrigada.
Aos meus novos e queridos amigos que tive o privilégio de ter em meu caminho,
Rosália, Arlene, Hébia, Laura, Lilian e João.
Ao Josdemar e sua esposa Elaine, mestrandos e colegas, por inúmeras vezes ter
me socorrido e auxiliado com a parte experimental da dissertação.
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ÍNDICE
Página
Lista de tabelas ....................................................................................... 6
Lista de figuras ........................................................................................ 7
Resumo .................................................................................................... 8
Abstract .................................................................................................... 10
Introdução geral ....................................................................................... 11
Referências............................................................................................... 18
I. Efeito biocida do extrato de Annona coriacea Mart 1841 sobre ovos e
ninfas recém-eclodidas do vetor da doença de Chagas Rhodnius
neglectus Lent 1954 (Hemiptera: Reduviidae)..........................................
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II. Efeito biocida do extrato de Annona coriacea Mart 1841 sobre ninfas
de 4º e 5º estádios e adultos do vetor Rhodnius neglectus Lent 1954
(Hemiptera: Reduviidae)...........................................................................
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Considerações finais................................................................................. 61
6
LISTA DE TABELAS
Página
I. Efeito biocida do extrato de Annona coriacea Mart 1841 sobre ovos e ninfas recém-eclodidas do vetor da doença de Chagas Rhodnius neglectus Lent 1954 (Hemiptera, Reduviidae).
Tabela I - Comparação entre as médias do número de ovos não eclodidos de Rhodnius neglectus nos dois métodos de aplicação, tópica e de contato, em diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea. Tabela II – Porcentagem de ninfas que não sobreviveram aos testes em diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea nos métodos de aplicação tópica e de contato. II. Efeito biocida do extrato de Annona coriacea Mart 1841 sobre ninfas de 4º e 5º estádios e adultos do vetor Rhodnius neglectus Lent 1954 (Hemiptera: Reduviidae). Tabela I – Número de mortos e porcentagem da mortalidade de ninfas de 4º e 5º estádios de Rhodnius neglectus em diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea, ao final dos 28 dias de observação (Teste de Tukey). Tabela II – Efeito das concentrações (%) do extrato de Annona coriacea sobre ninfas de 4º e 5º estádios de Rhodnius neglectus, ao final dos 28 dias de observação. Tabela III – Número de mortos, porcentagem da mortalidade, fecundidade e fertilidade de adultos de Rhodnius neglectus em diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea, após 28 dias.
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LISTA DE FIGURAS
Página
I. Efeito biocida do extrato de Annona coriacea Mart 1841 sobre ovos e ninfas recém-eclodidas do vetor da doença de Chagas Rhodnius neglectus Lent 1954 (Hemiptera, Reduviidae). Figura 1- Número de ovos não eclodidos de Rhodnius neglectus quando submetidos a dois métodos de aplicação, tópico e de contato, em função das diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea (mg/ml) (métodos de aplicação p= 0,001; concentrações p= 0,003, GL= 39). Figura 2. Proporção de ninfas mortas ao final dos 30 dias de observação, nos dois métodos de aplicação, tópico e de contato, do extrato de Annona coriacea (mg/ml) sobre ovos de Rhodnius neglectus (p= 0,034, GL= 1, 39). II. Efeito biocida do extrato de Annona coriacea Mart 1841 sobre ninfas de 4º e 5º estádios e adultos do vetor Rhodnius neglectus Lent 1954 (Hemiptera: Reduviidae). Figura 1. Número de ninfas mortas do 4º estádio de Rhodnius neglectus sob o efeito de diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea, durante 28 dias de observação. As concentrações foram identificadas por letras; a: 25mg/ml, b: 50mg/ml, c: 100mg/ml, d: 200mg/ml e o controle. Figura 2. Número de ninfas mortas do 5º estádio de Rhodnius neglectus sob o efeito de diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea, durante 28 dias de observação. As concentrações foram identificadas por letras e agrupadas apartir das médias que não diferiram entre si, a: controle, 25mg/ml e 50mg/ml, c: 100mg/ml, d: 200mg/ml. Figura 3. Número de adultos mortos de Rhodnius neglectus sob o efeito de diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea, durante 28 dias de observação. As concentrações foram identificadas por letras; a: 25mg/ml, b: 50 mg/ml, c: 100mg/ml, d: 200 mg/ml e o controle.
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RESUMO CARNEIRO, Ângela Pinheiro. Atividade biocida de Annona coriacea
Mart 1841 sobre o vetor Rhodnius neglectus Lent 1954 (Hemiptera: Reduviidae). Cáceres: UNEMAT, 2010. 70p. (Dissertação – Mestrado em Ciências Ambientais)1.
A doença de Chagas ainda representa um importante agravo para a Saúde Pública nos países da América Latina, sendo o principal método de controle o uso de inseticidas sintéticos contra os vetores. Apesar da eficiência dos modernos piretróides, indesejáveis problemas surgem como a contaminação ambiental e a resistência do vetor aos inseticidas. Diante dessa problemática, pesquisas com produtos botânicos constituem uma alternativa viável no controle vetorial. Portanto, a presente pesquisa teve como objetivo avaliar a atividade biocida de diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea sobre ovos, ninfas e adultos de Rhodnius neglectus. No bioensaio ovicida, para os métodos de aplicação tópica e de contato, foram utilizadas as concentrações de 0, 25, 50, 100 e 200mg/ml de extrato/solvente de A. coriacea. Foram utilizados 10 ovos por repetição, para cada teste em quatro repetições. Para os bioensaios com ninfas de 4º e 5º estádios e adultos, foram utilizadas as mesmas concentrações do teste ovicida, sendo 10 ninfas e 10 adultos para cada tratamento, com três repetições para ninfas e quatro repetições para os adultos. Foi aplicado 1µl de cada concentração no abdomen das ninfas e 5 µl para os insetos adultos. As avaliações de mortalidade foram observadas nos períodos de 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 e 28 dias. No teste com ovos de R. neglectus, o extrato inibiu a eclosão no método tópico (p= 0,003, GL= 1, 39) e interrompeu o desenvolvimento das ninfas recém-eclodidas no método de contato (p= 0,034, GL= 1, 39). Quanto ao teste ninficida, observou-se uma mortalidade maior para as ninfas de 4º estádio, onde as concentrações apresentaram diferenças significativas entre si (p= 0,006, GL= 4, 119) e os diferentes dias de observações influenciaram na mortalidade (p= 0,001, GL= 1, 119), ocorrendo mortalidade com crescimento gradual em função das concentrações e dos dias de observação. A mortalidade de ninfas do 5º estádio também foi diferente em função das concentrações (p= 0,028, GL= 1, 119) e dos dias de observação (p= 0,001, GL= 2, 115). No ensaio com insetos adultos a mortalidade de 90 a 100% nas concentrações testadas, apresentando diferenças estatísticas entre si (p= 0,01, GL= 1, 159). Os efeitos de deterrencia alimentar e alterações morfológicas em ninfas de 4º e 5º estádios também foram observados com resultados significativos, sendo a capacidade de oviposição e a eclosão dos ovos interrompida pela ação do extrato nos adultos. Desta forma, o extrato de A. coriacea apresentou resultados promissores, pois inibiu a eclosão dos ovos, interrompeu o desenvolvimento de ninfas do 1º estádio, causou expressiva mortalidade em ninfas do 4º estádio e nos adultos, alterando o desenvolvimento
1Professora Orientadora: Mônica Josene Barbosa Pereira – UNEMAT.
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de ninfas do 5º estádio de R. neglectus por meio de alterações morfológicas e deterrência alimentar. Palavras-chave: Ação adulticida, ação ninficida, ação ovicida, Annonacea, extrato vegetal.
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ABSTRACT
CARNEIRO, Ângela Pinheiro. Biocidal activity of Annona coriacea Mart 1841 on the Rhodnius neglectus control Lent 1954 (Hemiptera: Reduviidae). Cáceres: UNEMAT, 2009. 70p. (Dissertation – Master in Environmental Science)2.
Chagas disease still represents a considerable problem for public health in Latin America, where the main method of controlling it’s to use synthetic insecticides against the vector. Despite the efficiency of modern pyrethroids, undesirable problems arise as environmental contamination and vector resistance to insecticides. Given this problem, botanical products research are a viable alternative to vector control. Therefore, this study aims to assess the biocidal activity of different concentrations of the Annona coriacea extract on eggs, nymphs and adults of Rhodnius neglectus. Bioassay on eggs, for methods of topical application and contact, we used 0, 25, 50, 100 and 200mg/ml concentrations of the A. coriacea extract / solvent. We used 10 eggs per replicate for each test in four observations. For bioassays with nymphs of 4th and 5th stages and adults, we used the same concentrations of the test on eggs, 10 nymphs for each treatment, with three replications for nymphs and four replications for adults. Were applied 1μl of each concentration on abdomen of nymphs and applied 5μl for adults. Assessments of mortality were observed at 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 and 28 days. In the test with R. neglectus eggs, the extract inhibited the hatching in the topical method (p= 0.003, DF= 1, 39) and interrupted the development of newly hatched nymphs in the contact method (p= 0.034, DF= 1, 39). The ninficid test, there was a higher mortality for 4th instar nymphs, where concentrations showed significant differences between them (p= 0.006, DF= 4, 119) and different days of observations influenced mortality (p= 0.001, GL= 1, 119), with mortality occurring with gradual growth in function of concentration and days of observation. The mortality of 5th stage nymphs, was also different depending on the concentrations (p= 0.028, DF= 1, 119) and days of observation (p= 0.001, DF= 2, 115). In the bioassay with adults insects was observed mortality rate of 90 to 100% at 25, 50, 100 and 200mg/ml concentrations, showing statistical differences between them (p= 0.01, DF= 1, 159). The effects of feeding deterrence and morphological changes in 4th and 5th stages nymphs were also observed with significant results, like the oviposition ability and hatching eggs affected by the extract action in adults. Thus, the A. coriacea extract showed promising results, being able to inhibit egg hatching, stop the development of 1st stage nymphs, high mortality in 4th stage nymphs and adults and change the life cycle of 5th stage nymphs of R. Neglected by morphological changes and feeding deterrence. Keywords: adulticidal action, ninficid action, ovicidal action, Annona coriacea, plant extract.
2Major Teacher: Mônica Josene Barbosa Pereira – UNEMAT.
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INTRODUÇÃO GERAL
A doença de Chagas ou Tripanossomíase Americana é uma enfermidade
parasitária crônica causada pelo protozoário flagelado Trypanosoma cruzi Chagas
1909 (Kinetoplastida: Trypanosomatidae), considerada pela Organização Mundial
da Saúde como um agravo a saúde pública do Continente Americano do ponto de
vista econômico e social (WORLD BANK, 1993; MARSDEN, 1997).
A infecção chagásica é conhecida com maior precisão no cone sul e
Venezuela (SILVEIRA, 2000). Estima-se que aproximadamente 16 a 18 milhões
de pessoas são infectadas pela doença e mais de 90 milhões vivem em áreas de
risco. No Brasil, a doença acomete cerca de 3 milhões de pessoas (JURBERG et
al., 2002; SCHOFIELD et al., 2006).
A causa mais comum de infecção do T. cruzi ao homem ocorre quando há
contato com as fezes contaminadas dos vetores, vulgarmente conhecidos como
barbeiros (ROCHA et al., 2004). Estes contraem o T. cruzi após sugar o sangue
de mamíferos contaminados, adquirindo formas flageladas do protozoário que se
desenvolvem em todo o seu aparelho digestivo. Durante o processo de
alimentação ocorre aumento de líquido em seu organismo. Em conseqüência, o
inseto rapidamente excreta parte desse líquido na urina e nas fezes liberando
junto tripomastigotas metacíclicos, altamente infectantes para o homem
(STEINDEL et al., 2005). Os parasitas podem invadir o organismo e iniciar a
infecção se entrarem em contato com mucosas ou com lesões da pele, podendo
invadir células dos mais variados tecidos (coração, fígado, sistema nervoso ou
células brancas do sangue), nas quais se reproduzem rápida e intensamente
(MARCONDES, 2001; LUNARDELLI et al., 2007).
A doença de Chagas Humana se manifesta em duas fases distintas, a fase
aguda e a fase crônica. A fase aguda corresponde à fase inicial da
tripanossomíase americana no hospedeiro vertebrado, tratando-se basicamente
de uma infecção generalizada pelo T. cruzi (DIAS, 2004). Os aspectos mais
característicos da fase aguda são o chagoma (inchaço na região da picada) e o
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sinal de Romaña, inchaço das pálpebras, que ficam quase totalmente fechadas,
surgindo de 4 a 6 dias após o contato do barbeiro com a sua vítima (REY, 2001).
Os tripanosomas eliminados pelo barbeiro são introduzidos nos tecidos da região
onde ocorreu a picada, determinando uma inflamação que marca a "porta de
entrada" da doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1989).
Devido os sintomas da fase aguda causarem apenas leves incômodos,
muitas vezes passando despercebidos, se manifestam muitos anos depois na fase
crônica, quando o coração já está gravemente comprometido (MINISTÉRIO DA
SAÚDE, 2005). Os tripanosomas multiplicam-se, lesionando o miocárdio e, menos
intensamente, o pericárdio, o endocárdio e as arteríolas coronárias, podendo
atingir o fígado, os sistemas nervoso e linfático. O indivíduo infectado pode
apresentar diversas manifestações clínicas, como falta de ar, tonturas, taquicardia,
braquicardia e inchaço nas pernas (ARGOLO et al., 2008).
Tecnicamente, os desafios da doença de Chagas no Brasil prendem-se ao
cuidado dos já infectados pela parasitose, à qualidade do sistema de saúde
(bancos de sangue e transplantes) e principalmente ao controle de vetores com
potencial de domiciliação (DIAS, 2001). A transmissão vetorial continua sendo a
maior fonte de disseminação da doença de Chagas Humana em nível continental,
tornando-se o mecanismo primário de difusão dessa endemia (SILVEIRA e
RESENDE, 1994).
Os triatomíneos têm desenvolvimento hemimetábolo, isto é, da eclosão do
ovo até a fase adulta passam por cinco estádios ninfais, durante os quais se
alimentam e crescem através de fontes sanguíneas de aves, mamíferos, répteis
ou hemolinfa de invertebrados (GIRÓN et al., 1997). Em geral são insetos lentos,
pouco agressivos e de pouca mobilidade. Podem viver tanto em ambiente silvestre
como em domicílios e peridomicílios, alguns sendo exclusivamente silvestres
(LOROSA et al., 2003). Apresentam longevidade de aproximadamente dois anos,
chegam a fase adulta com cerca de 183 dias de vida, começando a ovipositar
depois de 15 dias, produzindo em média de 110 a 240 ovos/fêmea, dependendo
da espécie (PELLI et al., 2007; ARGOLO et al., 2008). O período de oviposição
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corresponde a aproximadamente 86,42% do tempo da fase adulta nas fêmeas,
estas vivem cerca de 500 dias e os machos 284 dias (SOUZA et al., 1978).
São conhecidas 140 espécies de triatomíneos, com mais de 50% destas
naturalmente infectadas pelo T. cruzi. Devido a uniformidade fisiológica, pode-se
dizer, que todas são capazes de infectar-se e transmitir o T. cruzi (SCHOFIELD e
GALVÃO, 2009).
A subfamília Triatominae é composta por 17 gêneros, entre eles o gênero
Rhodnius Stal 1859, que contém espécies de importância epidemiológica como
vetores da doença de Chagas (SCHOFIELD, 2000).
A espécie Rhodnius neglectus Lent 1954 (Hemiptera, Reduviidae,
Triatominae) está amplamente distribuída no Brasil, sendo registrada sua
ocorrência nos estados do Maranhão, Piauí, Tocantins, Pernambuco, Goiás,
Bahia, Minas Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, São Paulo e Paraná
(CARCAVALLO et al., 1998). Em Mato Grosso, esta espécie encontra-se
distribuída desde o Cerrado até a região de Mata Amazônica, prevalecendo em
regiões de transição entre estes dois biomas. A ocorrência de R. neglectus é
registrada em 10 municípios, entre estes, o município de Cáceres (COVSAM,
2007).
Populações dessa espécie ocorrem freqüentemente em palmeiras do
gênero Attalea Humboldt Bonpland e Kunth 1816, Acrocomia Martius 1824 e
Mauritia Linnaeus 1782, mas podem ser encontradas em ninhos de pássaros da
família Furnariidae e gênero Phacellodomus Reichenbach 1853, e de mamíferos
como Didelphis Linnaeus 1758 (CARCAVALLO et al., 1998; GURGEL-
GONÇALVES et al., 2004). Porém, a invasão de R. neglectus ao peridomicílio e
ao intradomicílio já tem sido observado em alguns estados brasileiros
(RODRIGUES et al., 2009).
Considerando a distribuição atual da domiciliação triatomínica no Brasil,
pode-se verificar sua associação aos espaços abertos, que são considerados
como naturais e artificiais (FORATTINI, 1982). Os primeiros estão essencialmente
situados nos domínios paisagísticos das caatingas e dos cerrados, totalmente
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incluídos em território brasileiro. Os outros são os originados da ação antrópica,
resultando em expansão da paisagem aberta principalmente em virtude da
devastação da cobertura florestal (FORATTINI, 2006).
Visto a necessidade do controle vetorial da doença de Chagas, em toda a
América Latina o uso de inseticidas sintéticos é o principal método de controle,
devido a inexistência de vacinas imunizantes para a população (SILVEIRA e
REZENDE, 1994).
Inicialmente os inseticidas utilizados no controle vetorial eram em especial o
Diclorodifeniltricloroetano (DDT) e o Hexaclorociclo-hexano (BHC), os mais
conhecidos entre os organoclorados, sendo consideradas as substâncias
sintéticas mais utilizadas no século XX no controle de vetores de doenças e
pragas agrícolas. O uso destas substâncias foi proibido pelo alto índice de
intoxicação, onde os sintomas nos seres humanos são cloracnes na pele, dores
de cabeça, tonturas, convulsões, insuficiência respiratória e até a morte,
dependendo do tempo de exposição e a dose aplicada (D’AMATO et al., 2002).
Com a proibição dos organoclorados, outras substâncias químicas como
hidrocarbonetos clorados, organofosforados, carbamatos e piretróides sintéticos
começaram a ser utilizadas pelos programas de saúde (D’AMATO et al., 2002).
Atualmente os piretróides sintéticos são adotados pelos programas de
controle vetorial por possuir maior estabilidade e maior atividade inseticida do que
os iniciais organoclorados (COURA, 1993; OLIVEIRA FILHO et al., 2000).
Apesar das vantagens apresentadas pelos piretróides em relação a outros
inseticidas, os mesmos cuidados devem ser tomados para sua utilização, já que
podem exercer nos vertebrados efeitos neurotóxicos e cardiotóxicos (SANTOS et
al., 2007). Os piretróides apresentam como sítio de ação as proteínas do canal de
sódio que atuam na membrana nervosa de tal forma a manter os canais de sódio
abertos, causando a despolarização dos neurônios, penetrando rapidamente no
sistema nervoso, onde a irritabilidade do inseto é aumentada e seguida de
paralisia (efeito Knockdown) e morte (WHO, 1999).
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Os inseticidas piretróides são foto-degradáveis tanto em água quanto no
solo, dependendo da exposição a luz (WHO, 2002). No entanto, a degradação dos
piretróides como permetrina, cipermetrina, deltametrina entre outros, não
impossibilita que os mesmos estejam presentes como resíduos em alimentos e no
meio ambiente, visto que são cumulativos (SANSINE, 2002).
Mesmo havendo uma boa aceitação desses produtos no controle vetorial,
com as campanhas contínuas deste a década de 80, observa-se o aparecimento
de insetos resistentes (ALZOGARAY, 2003; VASSENA e PICOLLO, 2003).
A resistência a um inseticida se manifesta pela diminuição da mortalidade
em uma população submetida a um constante tratamento químico. Isto ocorre com
o predomínio de indivíduos que toleram doses letais sobre indivíduos chamados
sensíveis nas primeiras aplicações do produto, ocasionando seleção nas
populações (OLIVEIRA FILHO, 1984).
Além da resistência dos vetores é importante ressaltar que o mecanismo de
controle químico pode causar efeitos tóxicos ao homem, a outros mamíferos, e ao
meio ambiente, como poluição de lençóis freáticos, águas superficiais e até
mesmo na fauna aquática (D’AMATO et al., 2002), indicando a necessidade do
desenvolvimento de novas alternativas para o controle dos triatomíneos.
A partir da década de 80, um novo estímulo surgiu com o estudo fitoquímico
de plantas promissoras portadoras de compostos biocidas ativos, vistos os
aspectos negativos dos inseticidas sintéticos (ALVES, 2007). Entre os efeitos, já
foram constatados deterrência alimentar, atraso no desenvolvimento e mortalidade
dos insetos. Dessa forma, os extratos vegetais surgem como um possível método
de controle alternativo sobre vetores e pragas (COSTA et al., 2004).
Atualmente, entre as plantas com ação biocida, a meliácea Azadirachta
indica Juss, conhecida por nim, o cinamomo (Melia azedarach L. 1793), os
catiguás (Trichilia spp P. Browne 1756), a pimenta-do-reino (Piper nigrum L.),
assim como espécies das famílias Annonaceae, Asteraceae, Cannellaceae,
Labiateae e Rutaceae são consideradas como promissores vegetais para o futuro
desenvolvimento de novos compostos tóxicos no controle de vetores como os
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triatomíneos dos gêneros Triatoma Laporte 1832 e Rhodnius Stal 1859. Estes
vegetais têm sido investigados em relação aos seus princípios ativos e efeitos
sobre várias espécies de insetos (SIDDIQUI et al., 2000; COSTA et al., 2004;
COELHO et al., 2006; DOLAN et al., 2007).
Alguns estudos demonstraram atividades inseticida e repelente de extratos
ou óleos essenciais de algumas plantas. Em triatomíneos foi observado efeito
repelente de M. azedarach em T. infestans (ROJAS DE ARIAS e SCHMEDA-
HIRSCHMANN, 1988; VALLADARES et al., 1999) enquanto que Achyrocline
satureioides Lam. causou mortalidade de T. infestans tratados topicamente
(ROJAS DE ARIAS et al., 1995).
Fournet et al. (1996) também observaram que a aplicação tópica de óleos
essenciais de Minthostachys andina Britton causaram mortalidade em T. infestans
e R. neglectus assim como o óleo de Hedeoma mandoniana Wedd também
apresentou esse efeito nas mesmas espécies de vetores (VILASECA et al., 2004).
Entre estes exemplos de vegetais com ação biocida existem diversas espécies de
plantas a serem estudadas, exigindo maiores pesquisas na área.
A família Annonaceae é um exemplo de plantas do Cerrado Central que
está sendo pesquisada devido a presença de uma nova classe de substâncias
naturais bioativas.
O gênero Annona Linnaeus 1753 compreende cerca de 120 gêneros
relatados na América Central e do Sul, África, Ásia e Austrália (COSTA et al.,
2006). Investigações químicas e farmacológicas das espécies deste gênero têm
indicado a presença de importantes compostos bioativos, revelando a presença de
alcalóides, acetogeninas de anonáceas e lignóides, com comprovada ação
inseticida sobre vetores de doenças (ALALI et al., 1999; BOAVENTURA, 2003;
NASCIMENTO et al., 2006).
Trabalhos realizados no combate a vetores com extratos vegetais de
anonáceas têm apresentado bons resultados quanto a mortalidade dos insetos,
assim como Schmeda-Hisrchmann e Rojas de Arias (1992) testaram o efeito
inseticida de Annona reticulata em ninfas de R. neglectus, Bobadilla (2005) o
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efeito larvicida de Annona muricata Linnaeus em Aedes aegypti e Luna (2006) o
efeito das folhas de A. muricata sobre o caramujo Biomphalaria glabrata Say 1818
e larvas de A. aegypti.
Diante desta contextualização, esta pesquisa propôs avaliar a atividade
inseticida da espécie Annona coriacea Mart 1841, sobre o barbeiro R. neglectus,
nas seguintes fases de desenvolvimento: ovo, ninfas de quarto e quinto estádios e
adultos, como uma nova alternativa de combate vetorial à doença de Chagas,
sendo organizada em dois artigos.
O primeiro artigo intitulado “Efeito biocida do extrato de Annona coriacea
Mart 1841 sobre ovos do vetor Rhodnius neglectus Lent 1954 (Hemiptera,
Reduviidae)”, que teve como objetivo verificar a ação ovicida em diferentes
concentrações, através dos métodos de aplicação tópica e de contato.
O segundo artigo intitulado “Efeito biocida do extrato de Annona coriacea
Mart 1841 sobre ninfas de 4º e 5º estádios e adultos do vetor Rhodnius neglectus
Lent 1954 (Hemiptera, Reduviidae)”, cujo objetivo foi testar os efeitos ninficida e
adulticida de A. coriacea sobre o desenvolvimento de R. neglectus.
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Efeito biocida do extrato de Annona coriacea Mart 1841 sobre ovos e ninfas recém-eclodidas do vetor da doença de Chagas Rhodnius neglectus Lent
1954 (Hemiptera, Reduviidae).
[Preparado de acordo com as normas da Revista Brasileira de Entomologia]
Ângela Pinheiro Carneiro1, Mônica Josene Barbosa Pereira2, Carla Galbiati3
1Mestranda do Programa de Pós-Graduação, Mestrado em Ciências Ambientais, Universidade do
Estado de Mato Grosso, Cáceres-MT. Endereço eletrônico: [email protected].
2Docente do Programa de Pós-Graduação, Mestrado em Ciências Ambientais, Universidade do
Estado de Mato Grosso. UNEMAT – Campus Universitário de Tangará da Serra. Rodovia MT 358,
Km 7. Bairro Aeroporto. Caixa Postal: 287. Tangará da Serra- MT, CEP 78300-000. Endereço
eletrônico: [email protected].
3Docente do Programa de Pós-Graduação, Mestrado em Ciências Ambientais, Universidade do
Estado de Mato Grosso. UNEMAT – Campus Universitário de Cáceres. Av. Tancredo Neves, 1095,
Cavalhada 2. Cáceres-MT, CEP 78200-000. Endereço eletrônico: [email protected].
RESUMO. Os bioensaios foram conduzidos a fim de avaliar a atividade biocida do
extrato de sementes de Annona coriacea sobre ovos e ninfas recém-eclodidas do
vetor Rhodnius neglectus através de dois métodos de aplicação, tópica e de
contato. Foram avaliadas as concentrações de 25, 50, 100 e 200mg/ml de
extrato/solução juntamente com o controle água em DMSO (2%). O delineamento
utilizado foi inteiramente casualizado com quatro repetições, sendo selecionados
10 ovos com 1 dia de idade para cada repetição. No método de aplicação tópica,
os ovos foram tratados após serem distribuídos sobre as placas de Petri forradas
com papel filtro, enquanto que no método de aplicação de contato, o papel filtro foi
tratado 60 minutos antes de receber os ovos. O extrato de A. coriacea inibiu a
eclosão dos ovos em até 90% por meio da aplicação tópica. No método de contato
ocorreu mortalidade de até 96,6% de ninfas eclodidas na maior concentração,
possivelmente após o contato com o resíduo do extrato no papel impregnado.
Sendo assim, conclui-se que o extrato de A. coriacea apresentou atividade biocida
24
sobre ovos e ninfas de primeiro estádio de R. neglectus, sendo o método de
aplicação tópica eficiente para inibir a eclosão dos ovos e o método de contato
suficiente para impedir o desenvolvimento das ninfas eclodidas.
PALAVRAS-CHAVE: ação biocida, aplicação de contato, aplicação tópica, extrato
vegetal, triatomíneos.
ABSTRACT. The bioassays were conducted to assess the biocidal activity of
Annona coriacea seed extract on eggs and newly hatched nymphs of the vector
Rhodnius neglectus by two application methods, topical and contact. We evaluated
the 25, 50, 100 and 200mg/ml concentrations of extract / solution with the water
control in DMSO (2%). The design was completely randomized with four
replications, being used 10 eggs with 1 day of age for each repetition. In the topical
application method, the eggs were treated after they were distributed on Petri
dishes with filter paper, while the contact application method, the filter paper was
treated 60 minutes before receiving eggs. The A. coriacea extract inhibited the
hatching of eggs up to 90% through topical application method. In the contact
method deaths occurred up to 96.9% of nymphs at the highest concentration,
possibly after the contact with the impregnated paper extract residue. Therefore, it
is concluded that the A. coriacea extract showed biocidal activity on eggs and R.
neglectus first stage nymphs, being the topical application method effective in
inhibiting the eggs hatch and the contact method enough to prevent the nymphs
development.
KEYWORDS: biocidal action, contact application method, topical application
method, plant extract, triatomines.
Inicialmente, os recursos aplicados no controle dos triatomíneos vetores da
doença de Chagas eram aqueles disponibilizados pelo programa de combate a
malária tendo como recurso chave o uso de inseticidas organoclorados como o
DDT e o BHC (Dias 2000). Atualmente, o emprego dos modernos piretróides do
25
grupo alfa-ciano é utilizado em larga escala para o controle vetorial (Rassi et al.
2003).
A metodologia de controle vetorial da doença de Chagas no Brasil prioriza a
borrifação das unidades domiciliares infestadas, mas este controle é dificultado
pela capacidade de reinfestação das casas pelos triatomíneos (Diotaiuti et al.
2000).
Dias (1958) indicou que a reinfestação dos locais tratados poderia
acontecer a partir de ovos oriundos da geração que recebeu o tratamento
inseticida, sendo os ovos mais resistentes a tais produtos. Freitas et al. (1960) em
sua pesquisa já demonstravam o problema gerado pelo uso excessivo de
inseticidas, apontando grande dificuldade no controle de ovos de triatomíneos,
quando expostos a ação de químicos como o BHC, o Dieldrin e o Rhodiatox.
Diante dos problemas gerados pelo uso indiscriminado dos inseticidas,
como a contaminação do meio ambiente, as possíveis intoxicações humanas e a
seleção de indivíduos resistentes (Caldas et al. 2000) é indispensável o estudo de
novas alternativas para o controle dos vetores da doença de Chagas.
Estudos com extratos vegetais que apresentam atividade biocida têm sido
estudados como uma importante alternativa para o controle vetorial, apontando
vantagens como o menor desenvolvimento de insetos resistentes e menor
toxicidade a população (Valladares et al. 1999; Costa et al. 2004).
Coelho et al. (2009) avaliou a atividade inseticida dos extratos vegetais de
35 espécies diferentes, em ninfas do primeiro estádio de Dipetalogaster maxima
Uhler 1894 (Hemiptera: Reduviidae), entre essas espécies, Annona crassiflora
Mart, Cardiopetalum calophyllum Schltdl, Duguetia furfuracea A. St. Hil, Xylopia
aromatica Mart, todas da família Annonaceae.
Em virtude da importância e das limitações para o controle vetorial na
Saúde Pública, essa pesquisa teve como objetivo verificar a atividade biocida do
extrato de Annona coriacea sobre ovos e ninfas recém-eclodidas do vetor da
doença de Chagas Rhodnius neglectus, sob dois métodos de aplicação, tópica e
de contato.
26
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta dos frutos de anonácea e local de preparação do extrato. A coleta dos
frutos foi realizada em área de cerrado Stricto sensu na Fazenda Três Rios,
localizada no município de Nova Marilândia/MT (14º 23’S e 57º 42’ W) com altitude
de 467m. O processo de preparação do extrato foi realizado nos Laboratórios de
Entomologia e Química Geral da Universidade do Estado de Mato Grosso
(UNEMAT), Campus Tangará da Serra.
Preparo dos extratos. As sementes foram dessecadas em estufa com circulação
de ar a 40ºC por 72 horas. Após esse período as sementes foram trituradas, em
moinho tipo faca, até a obtenção de um pó. Os extratos de sementes de A.
coriacea foram obtidos através da adição de 500g do pó da semente com 1.500ml
de solvente, sendo utilizado o solvente etanol no preparo do extrato. As
suspensões foram filtradas em funil Büchner. Os solventes foram evaporados em
rotavapor até adquirirem a estabilidade da massa, obtendo o extrato bruto
etanólico. Este extrato apresentou um rendimento final equivalente a 30g.
Procedência dos insetos e local de desenvolvimento dos bioensaios. Os
insetos, R. neglectus, obtidos para o início da colônia foram doados pelo
Laboratório de Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas (LATEC),
Centro de Pesquisas René Rachou (CpqRR)/Fundação Oswaldo Cruz
(FIOCRUZ), Belo Horizonte - MG. A criação e o desenvolvimento dos bioensaios
foram conduzidos no Laboratório de Interação Inseto/Planta, no Centro de
Limnologia, Biodiversidade e Etnobiologia do Pantanal (CELBE), da Universidade
do Estado de Mato Grosso, UNEMAT, Campus de Cáceres.
Criação do vetor. Os insetos foram acondicionados em frascos transparentes de
polietileno, devidamente identificados, com a abertura vedada com tecido de
algodão fino, com fundo recoberto com folhas de papel filtro para a retenção da
umidade produzida pelas fezes e urina. A criação foi mantida em estufa tipo
B.O.D, com temperatura de 28±1°C, 60 a 70% UR e fotoperíodo de 12 horas
conforme Shmeda-Hirshmann & Arias de Rojas (1992). A alimentação foi
27
oferecida semanalmente por um período de 30 minutos, utilizando galinhas (Gallus
galus) imobilizadas com o auxílio de uma placa de madeira.
Bioensaios. Foram conduzidos conforme a metodologia de Rodrigues et al.
(2002) e Ferrero et al. (2006) com algumas adequações. Placas de Petri com
11,5cm de diâmetro e 0,5 cm de altura foram utilizadas. Como solubilizante
utilizou-se DMSO (Dimetilsulfóxido) a 2% e água. As concentrações testadas
foram 25, 50, 100 e 200mg/ml e o controle (DMSO em água), as quais
apresentavam um aspecto oleoso. Os bioensaios foram realizados em quatro
repetições e mantidos em ambiente controlado com temperatura de 28±1°C, 60 a
70% UR e fotoperíodo de 12 horas. A avaliação da eclosão dos ovos foi efetuada
diariamente por um período de 30 dias.
Método de aplicação tópica. Foi realizado em delineamento inteiramente
casualizado, com 10 ovos com 1 dia de idade para cada repetição. As placas de
Petri foram devidamente forradas com papel filtro e após a distribuição dos ovos,
borrifadas com 1 ml de cada concentração (Rodrigues et al. 2002). Após a
borrifação as placas foram fechadas com uma tampa de algodão fino e vedadas
com fita adesiva para a evaporação do extrato. Os ovos foram mantidos durante
todo o período de teste na placa inicial do bioensaio.
Método de aplicação de contato. Foi utilizada a mesma metodologia do método
de aplicação tópica, no entanto, as placas de Petri foram forradas e borrifadas
com 1 ml de cada concentração e após 60 minutos de secagem, os ovos foram
distribuídos no interior das placas (Rodrigues et al. 2002; Ferrero et al. 2006).
Assim como no bioensaio anterior, os ovos ficaram em contato com o papel
impregnado até o final do teste, 30 dias.
Avaliação da mortalidade dos períodos embrionário e pós-embrionário. No
decorrer dos bioensaios os ovos eram classificados como ovos não eclodidos e
ovos eclodidos. As ninfas recém-eclodidas foram classificadas como: a) ninfa
consegue emergir, mas não sobrevive até o final dos bioensaios, 30 dias; b) ninfa
sobrevivente ao teste, quando sobrevive até o término do teste.
28
A ninfa recém-eclodida permanecia na placa de Petri tratada até o momento da
leitura seguinte, que ocorria todos os dias no mesmo horário durante os
bioensaios, e se ainda viva, era transferida para outra placa forrada com o mesmo
tipo de papel, porém, livre de qualquer tratamento. As ninfas eram observadas a
cada 24 horas. Após cinco dias de permanência com vida, era oferecido o primeiro
repasto sanguíneo, sendo realizado semanalmente durante 30 minutos (Rodrigues
et al. 2002).
Análise Estatística. Os resultados foram submetidos a análise de covariância
(ANCOVA), através da Distribuição de Poisson com correção de sobredispersão,
visto que os dados são de contagem. Para a análise dos ovos não eclodidos em
função das concentrações do extrato a variável resposta foi o número de ovos não
eclodidos e as variáveis exploratórias método de aplicação (x1), concentração do
extrato (x2) e interação (x1:x2).
A avaliação da mortalidade das ninfas recém-eclodidas após entrarem em contato
com os resíduos do extrato foi realizada por meio de ANCOVA, através da
Distribuição Binomial com correção de sobredispersão, visto que o número de
ninfas sobreviventes foi diferente para cada tratamento. A variável resposta foi
proporção de ninfas mortas e as variáveis exploratórias método de aplicação (x1)
e concentrações do extrato (x2). As médias foram comparadas pelo teste de
Tukey (p<0,05), utilizando-se o programa R version 2.9.0.
RESULTADOS
Período Embrionário. O número de ovos não eclodidos nos dois métodos de
aplicação apresentou diferenças estatísticas aos efeitos das diferentes
concentrações do extrato de A. coriacea (p= 0,003, GL= 1, 39) e dos métodos de
aplicação (p= 0,001, GL= 1, 39) (Figura 1).
As concentrações de 100 e 200mg/ml apresentaram ação ovicida através
do método da aplicação tópica, sendo estas concentrações equivalentes uma a
outra. A concentração de 200mg/ml apresentou diferenças significativas entre as
29
médias de ovos não eclodidos com as concentrações de 25 e 50mg/ml, enquanto
que a concentração de 100mg/ml diferiu estatisticamente apenas de 25mg/ml e
50mg/ml (Tabela I).
No bioensaio de aplicação de contato a concentração de 200mg/ml diferiu
estatisticamente das concentrações de 25, 50, 100mg/ml em relação aos números
de ovos não eclodidos. Enquanto as concentrações de 100 e de 200mg/ml
diferiram de todas as outras. A concentração de 50mg/ml foi estatisticamente
semelhante a 25mg/ml e ambas diferiram do controle (Tabela I). Portanto, as duas
maiores concentrações apresentaram os melhores resultados de inibição de
eclosão. Mesmo assim, esse efeito não interrompeu completamente o
desenvolvimento do embrião como no método de aplicação tópica, visto que neste
método a inibição foi maior (Tabela I).
Período Pós-embrionário. Ao analisar o período pós-embrionário, observa-se
que a proporção de ninfas mortas nos dois métodos de aplicação, não apresentou
diferenças significativas em função das concentrações (p= 0,220, GL=1, 39) e não
ocorreu interação entre as variáveis concentrações e métodos de aplicação (p=
0,214, GL=1, 39).
Quando avaliada a proporção de ninfas mortas em função dos métodos de
aplicação do extrato sobre os ovos nota-se que houve diferença entre eles (p=
0,034, GL= 1, 39) (Figura 2). Este efeito possivelmente ocorreu devido a diferença
existente entre as concentrações de 25mg/ml nos dois métodos, visto que o
método de contato apresentou mortalidade de 88,2% (Tabela II) enquanto que no
método de aplicação tópica a mortalidade foi de apenas 6,2% (Tabela II). Na
Figura 2 observa-se que a proporção de ninfas mortas ao final dos experimentos
apresentou maior relevância quando aplicado o extrato de A. coriacea por meio do
método de contato, visto que a capacidade de interromper o desenvolvimento
evolutivo das ninfas foi maior no método de contato do que no de aplicação tópica.
A mortalidade de ninfas recém eclodidas no método de aplicação tópica foi
de 85, 90 e 100% para as concentrações de 50, 100 e 200mg/ml, respectivamente
30
(Tabela II). Entretanto, no método de contato, a mortalidade foi de 91,6%, 95,6% e
96,6% para as mesmas concentrações (Tabela II).
Vale ressaltar que em ambos os métodos de aplicação em todas as
concentrações as ninfas-eclodidas não conseguiram realizar o primeiro repasto
sanguíneo oferecido semanalmente durante os 30 dias de observação.
DISCUSSÃO
Na presente pesquisa foi observado que a ação de interromper o
desenvolvimento do embrião ainda no interior do ovo foi visivelmente mais efetiva
quando a aplicação do inseticida foi direta sobre o exocorion, ou seja, no método
de aplicação tópica, assim como constatado por Rodrigues et al. (2002) na
avaliação com diferentes piretróides sobre Panstrongylus megistus Burmeister
1835 e Triatoma sordida Stal 1859. Portanto, os resultados com A. coriacea sobre
os ovos de R. neglectus sugerem ser a aplicação tópica, a melhor via de ação
para evitar a eclosão das ninfas.
O extrato etanólico de A. coriacea apresentou resultados positivos, inibindo
a eclosão dos ovos de R. neglectus em até 90%, por meio do método de ação
tópica. Tal resultado é importante visto que se espera a inibição de no mínimo
75% de eclosão dos ovos, para considerar o produto como um efetivo ovicida
(Picollo & Zerba 1997).
Laurent et al. (1997) obteve 100% de inibição da eclosão dos ovos de
Triatoma infestans Klug 1834, por meio da aplicação dos óleos essenciais das
espécies Eryngium sp. L, Tagetes pusilla Kunth, Tagetes minuta L, Mentha
arvensis L, Minthostachys andina Brett, Minthostachys mollis Griseb e Foeniculum
vulgare P. Mill.
Parra-Henao et al. (2007) observaram que o extrato de A. muricata não
apresentou ação ovicida sobre ovos de Rhodnius prolixus Stal 1859 e Rhodnius
pallescens Barber 1932, no entanto, registraram a inibição da eclosão destes
triatomíneos em apenas 10% dos ovos com o extrato de Ricinus communis L. e
31
25% com o extrato de Melia azedarach L. 1753. Valladares et al. (1999) também
não obtiveram resultados efetivos para inibição da eclosão com o extrato de M.
azedarach sobre ovos de T. infestans, ou seja, M. azedarach não pode ser
considerada um efetivo ovicida.
Nota-se também nesta pesquisa que as ninfas eclodidas, exceto no
controle, não realizaram o primeiro repasto sanguíneo em ambos os métodos
testados, indicando que o extrato de A. coriacea causou um possível efeito de
deterrência alimentar nas ninfas de primeiro estádio, contribuindo desta forma
para a mortalidade das mesmas nos dois métodos de aplicação, que
apresentaram o máximo de 10% de sobreviventes, semelhantes aos obtidos por
Rodrigues et al. (2002) com piretróides em que menos de 10% das ninfas
sobreviveram a ambos os métodos de aplicação.
Mesmo apresentando eclosão completa dos ovos de R. neglectus, o
desenvolvimento evolutivo do vetor foi interrompido quando a ninfa recém-eclodida
entrou em contato com os possíveis resíduos da aplicação. Esse resultado é
importante, pois indica que o extrato de A. coriacea possui efeito residual
suficiente para impedir a sobrevivência das ninfas. Dias (1965) obteve essa
mesma constatação ao observar o efeito do inseticida BHC sobre ninfas recém-
eclodidas de P. megistus e T. infestans, concluindo que estas morrem
rapidamente após o contato com a superfície tratada, devido a suscetibilidade ao
inseticida.
Laurent et al. (1997) avaliaram a ação Baccharis latifolia e Baccharis sp.
sobre ninfas recém-eclodidas de T. infestans, com mortalidade de 80 e 60%
respectivamente, resultados estes inferiores aos obtidos com A. coriacea para a
mortalidade de ninfas que atingiram 100 e 96,6% nas aplicações tópica e contato,
respectivamente (Tabela II).
Na presente pesquisa com o extrato de A. coriacea, a inibição da eclosão
dos ovos, possivelmente se deu pela penetração do extrato pelo opérculo e
orifícios dos ovos onde ocorre permeabilidade, visto que a mortalidade do embrião
incidiu ainda no seu interior, conforme explica Dias (1965) em resultados
32
semelhantes com BHC. No método de aplicação de contato, a possível exposição
aos papéis impregnados foi suficiente para inibir a eclosão de alguns ovos,
havendo grande mortalidade das ninfas recém-eclodidas, apresentando-se assim,
suscetíveis a ação letal de A. coriacea.
Ressalta-se que através do efeito de deterrência alimentar observado em
todas as ninfas eclodidas nos dois métodos de aplicação, o ciclo da doença é
interrompido, não havendo infecção nem transmissão do agente etiológico, visto
que as ninfas não se alimentaram, sendo este um fator imprescindível para a
transmissão da doença de Chagas (Galvão 2003; Rocha et al. 2004).
É importante ressaltar que os triatomíneos em geral vivem em esconderijos,
como frestas de árvores, madeiras e pedras, dificultando o acesso do tratamento
vetorial, sendo o método de aplicação de contato conveniente para aqueles
insetos que venham a ovipositar em uma superfície tratada e consequentemente
as ninfas eclodidas entrem em contato com os resíduos do extrato, morrendo.
Portanto, considera-se que o extrato de A. coriacea apresentou efeito
ovicida, sendo o método tópico o mais eficiente para a inibição da eclosão dos
ovos e o método de contato indicado para impedir o desenvolvimento de ninfas do
1º estádio, em todas as concentrações testadas.
Pesquisas a fim de investigar os compostos ativos que agem sobre o
embrião e ninfas recém-eclodidas mostram-se necessárias para o melhor
conhecimento da ação do extrato de A. coriacea.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Professora Doutora Liléia Diotaiuti e a toda a sua equipe do
Centro de Pesquisas René Rachou (CpqRR) / Fundação Oswaldo Cruz
(FIOCRUZ), Belo Horizonte – MG.
33
REFERÊNCIAS
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35
Figura 1- Número de ovos não eclodidos de Rhodnius neglectus quando
submetidos a dois métodos de aplicação, tópico e de contato, em função das
diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea (mg/ml) (métodos de
aplicação p= 0,001; concentrações p= 0,003, GL= 39).
36
Tabela I - Comparação entre as médias do número de ovos não eclodidos de
Rhodnius neglectus nos dois métodos de aplicação, tópica e de contato, em
diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea.
Concentração Ovos não eclodidos (n)
mg/ml Método de aplicação
tópica
Método de aplicação
de contato
Total
Controle 1 a 1 a 40
25 8 b 6 b 40
50 20 bc 4 b 40
100 30 cd 17 c 40
200 36 d 10 d 40
Obs.: Valores seguidos da mesma letra na coluna não apresentam diferença
significativa entre si ao nível de 5% de probabilidade.
37
Figura 2. Proporção de ninfas mortas ao final dos 30 dias de observação, nos dois
métodos de aplicação, tópico e de contato, do extrato de Annona coriacea (mg/ml)
sobre ovos de Rhodnius neglectus (p= 0,034, GL= 1, 39).
38
Tabela II – Porcentagem de ninfas que não sobreviveram aos testes em diferentes
concentrações do extrato de Annona coriacea nos métodos de aplicação tópica e
de contato.
Concentração Método de aplicação
tópica
Método de aplicação de
contato
mg/ml
Ninfas
mortas (%)
Total de ninfas
sobreviventes
(n)
Ninfas
mortas (%)
Total de ninfas
sobreviventes
(n)
Controle 0 39 0 39
25 6,2 32 88,2 33
50 85 19 91,6 31
100 90 14 95,6 23
200 100 5 96,6 30
39
Efeito biocida do extrato de Annona coriacea Mart 1841 sobre ninfas de 4º e
5º estádios e adultos do vetor Rhodnius neglectus Lent 1954 (Hemiptera,
Reduviidae).
[Preparado de acordo com as normas da Revista Brasileira de Entomologia]
Ângela Pinheiro Carneiro1, Mônica Josene Barbosa Pereira2
1Mestranda do Programa de Pós-Graduação, Mestrado em Ciências Ambientais, Universidade do
Estado de Mato Grosso, Cáceres-MT. Endereço eletrônico: [email protected].
2Docente do Programa de Pós-Graduação, Mestrado em Ciências Ambientais, Universidade do
Estado de Mato Grosso, Cáceres-MT. Rodovia MT 358, Km 7. Bairro Aeroporto. Caixa Postal: 287.
Tangará da Serra- MT, CEP 78300-000. Endereço eletrônico: [email protected].
RESUMO. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade biocida do extrato
de Annona coriacea sobre ninfas e adultos de Rhodnius neglectus. Foram
avaliadas as concentrações de 25, 50, 100 e 200mg/ml de extrato/solvente de A.
coriacea, juntamente com o controle, água em DMSO (2%). Foi utilizado o
delineamento inteiramente casualizado com três repetições para o bioensaio com
ninfas e quatro repetições para adultos, sendo usadas 10 ninfas e 10 adultos (5
machos e 5 fêmeas), para cada tratamento. A ação do extrato foi registrada em
diferentes exposições de tempo, 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 e 28 dias, para ambos
bioensaios. A partir dos resultados obtidos, observou-se que o extrato de A.
coriacea foi capaz de interromper o desenvolvimento de ninfas e adultos de R.
neglectus, com mortalidade de 90%, 36% e 100%, respectivamente, nas maiores
concentrações. Observou-se também, inibição do processo de ecdise em ninfas,
redução da capacidade reprodutiva de fêmeas, deterrência alimentar e alterações
morfológicas em ninfas e adultos. Conclui-se que o extrato de A. coriacea
apresentou ação ninficida e adulticida sobre R. neglectus.
PALAVRAS-CHAVE: Annona coriacea, ação ninficida, ação adulticida, extrato
vegetal, triatomíneos.
40
ABSTRACT. The objective of this study was to evaluate the biocidal activity of the
Annona coriacea extract on Rhodnius neglectus nymphs and adults. We evaluated
the 25, 50, 100 and 200mg/ml concentrations of the extract / solvent, together with
the control, water in DMSO (2%). We used a completely randomized design with
three replications for the bioassay with nymphs and four repetitions for adults, and
used 10 nymphs and 10 adults (5 males and 5 females) for each treatment. The
extract action was recorded at different exposure time, 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 and 28
days for both bioassays. From the results obtained showed that the A. coriacea
extract was able to interrupt the development of the nymphs and R. neglectus
adults, with mortality in more than 90%, 36% and 100%, respectively, in the
highest concentrations. There was also inhibition of moulting in nymphs, reduced
reproductive capacity of females, feeding deterrence and morphological changes in
nymphs and adults. It is concluded that the A. coriacea extract presented ninficid
and adulticidal action on R. neglectus
KEYWORDS: Annona coriacea, ninficid action, adulticidal action, plant extract,
triatomines.
A doença de Chagas, primitivamente identificada como enzootia, passou a
se constituir um problema de saúde pública apartir da domiciliação dos vetores
(Silveira & Rezende 1994). As espécies transmissoras do protozoário
Trypanosoma cruzi Chagas 1909, agente etiológico da doença, são insetos
hematófagos com desenvolvimento hemimetábolo, pertencentes aos gêneros
Triatoma Laporte 1832, Rhodnius Stal 1859 e Panstrongylus Berg 1879
(Hemiptera: Reduviidae), que são os vetores de maior importância epidemiológica
(Steindel et al. 2005).
A hematofagia é essencial para o crescimento, ecdise e reprodução nos
triatomíneos (Rocha et al. 2004; Tartarotti et al. 2004). O repasto sangüíneo
seguido da defecação é uma das características biológicas que apresenta maior
impacto e importância na epidemiologia da doença de Chagas, momento em que
o vetor pode infectar-se ou transmitir o T. cruzi (Galvão 2003; Rocha et al. 2004).
41
Atualmente a eliminação da transmissão vetorial da doença de Chagas é
assumida como prioridade nos países da América Latina através do emprego
regular e sistematizado de inseticidas de ação residual nas habitações infestadas
(Villela et al. 2005).
No Brasil os inseticidas mais utilizados no controle de triatomíneos foram os
piretróides deltametrina, ciflutrina, lambdacialotrina e cipermetrina, sendo a alfa-
cipermetrina utilizada atualmente (Oliveira Filho et al. 2000). Apesar da eficiência
do método de controle químico, o uso prolongado destes inseticidas vem sendo
discutido, devido a possibilidade de desenvolvimento de resistência dos
triatomíneos, além da toxidade ao homem (Dias 1997; Dias 2001; WHO 2002).
No intuito de reduzir os problemas enfrentados com os inseticidas
sintéticos, o uso de produtos vegetais apresenta-se como uma alternativa para o
controle vetorial da doença de Chagas (Costa et al. 2004).
Espécies vegetais são apontadas como promissoras no controle de vetores,
podendo causar mortalidade dos insetos, inibição do crescimento, interrupção do
processo de ecdise, alongamento da fase, deformações de ninfas e adultos,
redução na longevidade, fecundidade e fertilidade dos adultos (Schmeda-
Hirschmann & Rojas de Arias 1992; Fournet et al. 1996; Valladares et al. 1999;
Bobadilla et al. 2005; Coelho et al. 2006; Costa et al. 2006).
Espécies da família Annonaceae têm demonstrado ação biocida sobre
triatomíneos, assim como constatado por Schmeda-Hisrchmann & Rojas de Arias
(1992) ao testarem o efeito inseticida de Annona reticulata L. em ninfas de
Rhodnius neglectus Lent 1954 e Parra-Henao et al. (2007) ao avaliarem o efeito de
Annona muricata L. sobre ninfas de 4º estádio de Rhodnius prolixus Stal 1859 e
Rhodnius pallescens Barber 1932.
Diante da necessidade de novas estratégias para o controle triatomínico,
esta pesquisa teve como objetivo avaliar a atividade ninficida e adulticida da
espécie Annona coriacea Mart 1841 sob o vetor da doença de Chagas, R.
neglectus.
42
MATERIAL E MÉTODOS
Preparação dos Extratos. A coleta dos frutos foi realizada em área de cerrado
stricto sensu na Fazenda Três Rios, localizada no município de Nova
Marilândia/MT (14º 23’S e 57º 42’ W) com altitude de 467m. O processo de
preparação do extrato foi realizado nos Laboratórios de Entomologia e Química
Geral da Universidade do Estado de Mato Grosso - UNEMAT, Campus Tangará
da Serra. Para a secagem das sementes, estas foram colocadas em estufa com
circulação de ar a 40 ºC por 72 horas. Após esse processo, as sementes foram
moídas, até a obtenção de um pó. O extrato das sementes de A. coriacea foi
obtido através da adição de 500g do pó da semente com 1.500ml de solvente
etanol. As suspensões foram filtradas em funil Büchner e o solvente foi evaporado
em rotavapor até adquirirem a estabilidade de massa. O extrato bruto apresentou
um rendimento final de 30g. Para solubilizar o extrato foi utilizado Dimetilsulfóxido
(DMSO) a 20%.
Manutenção e Criação de Rhodnius neglectus. A criação e desenvolvimento
dos experimentos foram conduzidos no Laboratório de Interação Inseto/Planta, no
Centro de Limnologia, Biodiversidade e Etnobiologia do Pantanal (CELBE), da
Universidade do Estado de Mato Grosso, UNEMAT, Campus de Cáceres. Os
insetos obtidos para o início da colônia foram doados pelo Laboratório de
Triatomíneos e Epidemiologia da Doença de Chagas (LATEC), Centro de
Pesquisas René Rachou (CpqRR) / Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ), Belo
Horizonte - MG. Os insetos foram acondicionados em frascos transparentes de
polietileno, devidamente identificados, com fundo recoberto com folhas de papel
filtro. A abertura dos frascos foi vedada com pano de algodão fino fixado por
esparadrapo e elásticos. Os potes foram mantidos em uma estufa incubadora tipo
B.O.D, com temperatura de 28±1°C e 60 a 70% de Umidade Relativa e
fotoperíodo de 12 horas conforme sugerido por Shmeda-Hirshmann & Arias de
Rojas (1992). A alimentação foi oferecida semanalmente por 30 minutos utilizando
galinhas (Gallus galus) imobilizadas.
43
Bioensaios de ação ninficida. Foram realizadas aplicações do extrato etanólico
em ninfas de 4º e 5º estádios de R. neglectus com quinze a vinte dias de vida,
alimentadas 7 dias antes de receberem os tratamentos, as ninfas que não se
alimentaram foram descartadas do teste. As ninfas de 5º estádio são
recomendadas pela Organização Mundial da Saúde para testes laboratoriais
devido ser o estádio evolutivo que apresenta maior resistência a compostos
químicos (WHO 2002) e as ninfas de 4º estádio as mais utilizadas por
pesquisadores em testes com extratos vegetais (Coelho et al. 2006). Os
bioensaios foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado, as
concentrações testadas foram de 25, 50, 100 e 200mg/ml e o controle (DMSO em
água), com três réplicas, sendo cada repetição composta por dez ninfas. A
quantidade de solução aplicada nos tergitos abdominais de cada ninfa foi de 1µl,
conforme metodologia proposta por Shmeda-Hirshmann & Arias de Rojas (1992) e
Coelho et al. (2006). A ação do extrato foi observada em diferentes exposições de
tempo a fim de avaliar a mortalidade, sendo os períodos de 1, 2, 3, 4, 7, 14, 21 e
28 dias, conforme recomendado por Coelho et al. (2006).
Bioensaios de ação adulticida. Foram realizadas aplicações do extrato etanólico
em adultos de R. neglectus seguindo o mesmo protocolo do bioensaio anterior
(WHO 2002). Cada grupo experimental foi composto por 5 machos e 5 fêmeas de
R. neglectus. O bioensaio foi conduzido em delineamento inteiramente
casualizado com quatro réplicas. A quantidade de solução aplicada no abdômen
de cada inseto foi de 5µl. As concentrações testadas e o tempo de ação do extrato
foram os mesmos avaliados para ninfas.
Critério de Mortalidade e avaliação do repasto. Para qualificar os insetos
afetados pelo extrato foi adotado o critério de mortalidade segundo WHO (2002),
considerando morto o inseto que colocado sobre papel de filtro não apresentasse
atividade locomotora própria. Foram registradas também, as alterações
morfológicas, a deterrência alimentar, a inibição de ecdise, a fecundidade das
fêmeas e a fertilidade dos ovos nas diferentes concentrações durante 28 dias de
44
teste. A fonte alimentar foi oferecida, no oitavo dia de teste, para não ocorrer à
possibilidade de morte por falta de alimento.
Para avaliar os insetos que realizaram o repasto sanguíneo, foi observado se
estes introduziam a probócide na fonte alimentar e se ocorria aumento do volume
abdominal dos insetos.
Análise Estatística. Os dados dos experimentos foram submetidos à ANOVA
com Distribuição de Poisson com correção para sobredispersão devido todas as
amostras se tratarem de dados de contagem. As médias das concentrações do
extrato foram comparadas pelo teste de Tukey (p<0,05), utilizando-se o programa
R version 2.9.0. Para a análise da mortalidade em função da concentração do
extrato e dos dias após aplicação, foi realizada uma análise de covariância, sendo
a variável resposta a proporção de ninfas mortas e as variáveis exploratórias dias
após aplicação (x1), concentração do extrato (x2) e interação (x1:x2).
RESULTADOS
Efeito das concentrações de A. coriacea sobre ninfas de 4º estádio de
R. neglectus. Quando analisado o efeito das diferentes concentrações sobre a
mortalidade das ninfas do 4º estádio, observa-se que o efeito do extrato de A.
coriacea é estatisticamente significativo para as diferentes concentrações (p=
0,006, GL= 4, 119) e para os dias de observação (p= 0,001, GL= 1, 119) (Figura
1).
As concentrações de 100 e 200mg/ml apresentaram os maiores números
de ninfas mortas, não diferindo estatisticamente entre si, com mortalidade de 80 e
93,3%, respectivamente (Tabela I). As concentrações de 25mg/ml e 50mg/ml
apresentarem valores inferiores de mortalidade, diferindo estatisticamente das
concentrações de 100 e 200mg/ml. Todas as concentrações, exceto a de
25mg/ml, diferiram do tratamento controle (Tabela I).
É importante notar que na concentração de 50mg/ml a mortalidade
aumentou discretamente no decorrer dos dias, sem grandes variações,
45
diferentemente das ninfas da concentração de 25mg/ml cujos insetos começaram
a morrer a partir do 14º dia de teste. Pode-se ver essa relação quando analisada a
interação das retas de 25 e 50mg/ml próximo aos 25 dias de observação (Figura
1). Essa interação, possivelmente ocorreu, visto que as médias da mortalidade,
não diferiram para as concentrações de 25 e 50mg/ml (Tabela I).
As alterações morfológicas como abdômen e probócide irregular, pernas e
antenas deformadas ocorreram principalmente nas concentrações de 25 e
50mg/ml, com porcentagem de 36,6 e 20%, respectivamente, enquanto que nas
demais concentrações apenas 3,3% dos indivíduos apresentaram modificações
em sua morfologia (Tabela II). Grande parte das alterações ocorreu ainda no
estádio de teste, ou seja, em ninfas de 4º estádio, sendo que os indivíduos que
conseguiram realizar a troca de muda para ninfas de 5º também apresentaram
anormalidades morfológicas, principalmente na probócide. Os insetos que
morreram apresentaram aspecto de desidratação bastante visível.
Quando avaliado o processo de ecdise, apenas uma pequena porcentagem
conseguiu realizar a ecdise, 26,6% na concentração de 25mg/ml e 3,3% nas
concentrações de 50 e 200mg/ml. Vale salientar que somente 3,3%, o equivalente
a um indivíduo, conseguiu realizar o repasto sanguíneo nas concentrações
citadas, evidenciando o efeito deterrente em ninfas de 4º estádio (Tabela II).
Efeito das concentrações de A. coriacea sobre ninfas de 5º estádio de R.
neglectus. Ao observar a mortalidade de ninfas de 5º estádio em função das
variáveis exploratórias, pode-se dizer que o número de indivíduos mortos
apresentou diferenças significativas em função das concentrações testadas (p=
0,028, GL= 1, 119) e dos dias de observação (p= 0,001, GL= 2, 115). Portanto o
número de indivíduos mortos foi maior conforme o aumento das concentrações e
com o tempo de exposição das ninfas ao extrato (Figura 2).
Nas concentrações de 100 e 200mg/ml observa-se significante mortalidade
desde os primeiros dias de teste até o final das observações, demonstrando a
eficácia do extrato vegetal quanto a sua toxicidade nas maiores concentrações e
no decorrer dos dias de observação (Figura 2).
46
Ao comparar as médias do número de indivíduos mortos, os tratamentos de
100 e 200mg/ml não diferiram ente si, assim como nas concentrações de 25 e
50mg/ml não diferiram do controle (Tabela I).
Em todas as concentrações testadas o extrato de A. coriacea provocou
alterações morfológicas no aparelho bucal, nas pernas, antenas e no abdômen em
20 a 40% dos indivíduos testados. Essas deformações constituíam de probócides
levantadas ou entortadas, pernas encurvadas em formado de arco, antenas
quebradiças e abdômen com formatos irregulares apresentando reentrâncias nos
tergitos abdominais. Como conseqüência observa-se que a maioria dos insetos
não conseguiu realizar a ecdise, e todas as ninfas testadas apresentaram
deterrência alimentar para todas as concentrações de A. coriacea (Tabela II).
Quando se observa os resultados da mortalidade nos testes com ninfas de
4º e 5º estádios nota-se que mesmo nas maiores concentrações, 100 e 200mg/ml,
a porcentagem de indivíduos de 5º estádio mortos, 26,6 e 36,6%, foi inferior aos
resultados obtidos com ninfas de 4º estádio, 80 e 93,3%, respectivamente (Tabela
I).
Efeito das concentrações de A. coriacea em adultos de R. neglectus. O efeito
das diferentes concentrações sobre a mortalidade dos insetos adultos foi
observado, constatando que o extrato de A. coriacea foi estatisticamente
significativo para as diferentes concentrações (p= 0,01, GL= 1, 159), dias de
observações (p= 0,002, GL= 4, 159) e interação entre as variáveis exploratórias
(p= 0,007, GL= 4, 159) (Figura 3).
Ao analisar as médias do número de mortos em relação às diferentes
concentrações, observa-se que as concentrações de 25, 50, 100 e 200mg/ml não
diferiram entre si, mas apenas quando comparadas com o controle (Tabela III).
Assim, pode-se dizer que a menor concentração, 25mg/ml, causou mortalidade
equivalente as maiores concentrações, matando 90% dos adultos, enquanto que
100 e 200mg/ml mataram 100% dos insetos, explicando assim, a interação entre
as concentrações (Tabela III).
47
No decorrer dos 28 dias de teste ocorreram diferenças na mortalidade de
insetos referentes às concentrações. A concentração de 25mg/ml apresentou um
crescimento constante da mortalidade até o final do experimento, enquanto que as
concentrações de 50, 100 e 200mg/ml proporcionaram maior mortalidade no início
do teste (Figura 3).
Na avaliação da fecundidade, durante o período de 28 dias, todas as
concentrações apresentaram médias distintas do controle, exceto a concentração
de 25mg/ml, sendo a concentração de 50mg/ml diferente estatisticamente de
todas as concentrações, enquanto as médias de 100 e 200mg/ml foram
semelhantes entre si. Com o aumento das concentrações ocorreu redução da
fecundidade (Tabela III).
A fertilidade dos ovos na concentração de 25mg/ml foi diferente
estatisticamente das médias de 50, 100 e 200mg/ml, enquanto que 50 mg/ml
diferiu de todas as concentrações, sendo que 100 e 200mg/ml não diferiram entre
si. Assim como na fecundidade, na fertilidade também houve redução com o
aumento das concentrações (Tabela III).
Observa-se que a fertilidade e fecundidade mostraram resultados distintos
nas diferentes concentrações, sendo as maiores concentrações, 100 e 200mg/ml
as que apresentaram menor oviposição, 67 e 45 ovos, e eclosão de apenas 16,4 e
13,3% de ovos, respectivamente (Tabela III).
Nota-se que desde a menor concentração, 25mg/ml, até a maior, 200mg/ml,
o extrato de A. coriacea foi capaz de inibir a alimentação em 100% dos insetos
adultos, sendo que estes não conseguiram detectar a fonte sanguínea no ato do
repasto sanguíneo (Tabela III). Somente os insetos do grupo controle
alimentaram-se normalmente.
DISCUSSÃO
Na presente pesquisa, os resultados obtidos com a aplicação tópica do
extrato de A. coriacea destacou-se como uma ferramenta promissora ao controle
48
vetorial da espécie R. neglectus, apresentando efeitos positivos para todas as
concentrações testadas, pois como já mencionado por Costa et al. (2004) os
efeitos dos extratos vegetais, não são aqueles vinculados apenas a causar
mortalidade, mas também interrupção do ciclo de desenvolvimento do inseto.
Além da mortalidade significativa, efeitos como deterrência alimentar, interrupção
do processo de ecdise, alterações morfológicas, interferência na fecundidade e
fertilidade foram observados nos testes com ninfas de 4º e 5º estádios e adultos
de R. neglectus.
O extrato de A. coriacea causou a mortalidade de 33,3% das ninfas de 4º
estádio de R. neglectus na concentração de 50mg/ml, resultados semelhantes aos
obtidos por Schmeda-Hirschman & Rojas de Arias (1992) com A. reticulata,
causando mortalidade de 35% das ninfas desta mesma espécie. Alves (2007) ao
avaliar a atividade inseticida de algumas espécies do cerrado, registrou uma
variação na mortalidade de 12,5 a 42,5% para Rhodnius milesi Carcavallo, Rocha,
Galvão & Jurberg. Assim como Fournet et al. (1996) em pesquisas com
Minsthostachys andina Brett a mortalidade variou de 30 a 50% em Triatoma
infestans Klug 1834 e R. neglectus. Vilaseca et al. (2004) analisou a atividade
inseticida de Hedeoma mandoniana Wedd no controle de T. infestans e R.
neglectus apresentando 33,3% de mortalidade.
Parra-Henao et al. (2007) também avaliou o efeito tóxico de espécies
vegetais, sendo Annona muricata L. a espécie que apresentou maior mortalidade,
de 56% na concentração de 70% ou 70mg/ml sobre ninfas de 4º. Na literatura não
há publicações que discorram sobre a toxidade da espécie A. coriacea sobre
triatomíneos, mas a atividade inseticida é explicada pelo gênero Annona possuir
moléculas ativas, entre elas as acetogeninas que apresentam várias atividades
biológicas, entre elas, a inseticida (Nascimento et al. 2003).
O extrato de A. coriacea foi eficiente para inibir o processo de ecdise em R.
neglectus, diferente dos resultados obtidos com A. reticulata por Schmeda-
Hirschman & Rojas de Arias (1992) que não observaram nenhum alteração no
processo de ecdise, sobre ninfas de 4º estádio de R. neglectus. No entanto, esses
49
mesmos autores ao avaliarem as espécies Mangifera indica L., Spilanthes sp.,
Tagetes erecta L., Mintostachys sp., Salvia cardiophylla Benth, Cassia sp., Senna
occidentalis e Melia azederach L. verificaram que as mesmas inibiram a ecdise
com taxas variando entre 22,2% e 33,3%.
Apesar de todas as pesquisas apresentadas indicarem os efeitos de
extratos vegetais em ninfas do 4º estádio, o presente trabalho também realizou
testes com ninfas de 5º estádio, visto ser o mais recomendado pela WHO (2002)
devido a maior resistência deste estádio evolutivo.
Os resultados de mortalidade obtidos com adultos de R. neglectus foram
semelhante a aqueles obtidos por Lima et al. (1992), com suspensão aquosa de
Hexaclorociclohexano (HCH), registrando mortalidade de 100% dos insetos
adultos e ninfas de 5º estádio, sendo as ninfas de 5º estádio mais resistentes ao
inseticida, morrendo somente após vários dias de exposição.
As alterações ou anormalidades morfológicas observadas tanto em ninfas
do 4º como do 5º estádio de R. neglectus, provavelmente estão relacionadas com
a deterrência alimentar ocasionada pelo extrato, causando a deficiência nutricional
nas ninfas, conforme relatado por Costa et al. 2004, para extratos vegetais em
geral. Mesmo sofrendo maior mortalidade, as ninfas de 4º estádio apresentaram
menores alterações morfológicas do que as ninfas de 5º estádio. Assim, pode-se
concluir que ninfas de 5º estádio foram mais suscetíveis ao efeito bioativo
causador de alterações morfológicas, mesmo apresentando maior resistência
quanto ao efeito tóxico do extrato, exigindo assim maiores estudos quanto aos
princípios ativos de A. coriacea.
A ação deterrente do extrato de A. coriacea em todas as concentrações,
impediu ninfas de 4º e 5º estádios e adultos de realizarem o repasto sanguíneo. A
efetiva alimentação seguida da defecação é considerada de suma importância
para completar o ciclo de desenvolvimento da doença, sendo assim, não havendo
repasto sanguíneo não há infecção, nem tampouco a transmissão do agente
etiológico da doença de Chagas (Garcia & Azambuja 2004; Tartarotti et al. 2004).
50
O efeito deterrente ou anti-alimentar também pode ser ocasionado devido a
compostos ativos de A. coriacea que dificultam o desenvolvimento normal do
inseto, provocando deformações que os impossibilitam de completar o
desenvolvimento evolutivo, assim como definido por Cabral (1999) e observado
nos dois experimentos com A. coriacea em ninfas de 4º e 5º estádios, uma
quantidade insignificante dos insetos conseguiram alimentar-se.
Os resultados obtidos nos diferentes dias de observação apresentaram uma
mortalidade com crescimento gradual para ninfas do 4º estádio, sendo este
considerado um relevante resultado. No teste com ninfas do 5º estádio, a
mortalidade também apresentou um crescimento gradativo até o final do teste,
sendo que as concentrações que apresentaram mortalidade significativa foram
apenas as de 100 e 200mg/ml. Mesmo não havendo mortalidade nas menores
concentrações, os efeitos causados, como deterrência alimentar, alterações
morfológicas e inibição da ecdise foram suficientes para impedir o
desenvolvimento das ninfas de 5º estádio em todas as concentrações testadas.
O efeito da mortalidade com crescimento gradual, também foi constatado
por Coelho et al. (2006), observando que o extrato etanólico da casca da raiz de
Simarouba versicolor A. St. Hil matou praticamente todos os insetos da espécie R.
milesi com uma atividade de crescimento gradual ao longo do tempo, matando
15% dos insetos depois de 24horas, 35% depois de 48 e 72h, 50% depois de 7
dias, 90% em 14 dias e 95% do insetos depois de 21 dias, sendo mantido essa
porcentagem até o final dos 28 dias de observação.
Nos insetos adultos, o crescimento gradativo da mortalidade foi observado
somente na concentração de 25mg/ml, onde a porcentagem de indivíduos mortos
foi equivalente ao observado em ninfas de 4º estádio na maior concentração,
evidenciando que os insetos adultos apresentam maior suscetibilidade a
toxicidade do que os estádios evolutivos de 4º e 5º. Assim como observado por
Costa & Perondini (1973) a resistência aumentou até o 5º estádio caindo no
estádio adulto.
51
A redução nas taxas de fecundidade e fertilidade das fêmeas de R.
neglectus registradas durante o período de 28 dias de observação, ocorreu
provavelmente devido a deterrência alimentar causada pela privação alimentar,
efeito este constatado por Braga & Lima (2001) que avaliaram o efeito da privação
alimentar em fêmeas de Panstrongylus megistus Burmeister 1835 concluindo que
a fecundidade das fêmeas está relacionada com a quantidade de sangue ingerido,
sendo a privação alimentar responsável pela diminuição da fertilidade.
Pode-se concluir dessa forma, que o extrato de A. coriacea apresentou
efeito ninficida, sendo capaz de alterar o desenvolvimento em ninfas do 4º e 5º
estádios de R. neglectus, apresentando significativa mortalidade para ninfas de 4º
estádio, inibindo o processo de ecdise, causando deterrência alimentar e
alterações morfológicas em ambos os testes, interrompendo o desenvolvimento
das ninfas de R. neglectus. Na fase adulta, o extrato demonstrou ser um eficiente
biocida desde a menor concentração 25mg/ml.
AGRADECIMENTOS
Agradecemos a Professora Doutora Liléia Diotaiuti e a toda a sua equipe do
Centro de Pesquisas René Rachou (CpqRR) / Fundação Oswaldo Cruz
(FIOCRUZ), Belo Horizonte - MG, pela a oportunidade de estágio e doação dos
insetos para a colônia inicial. A professora Carla Galbiati pela colaboração na
pesquisa. A Kelly, secretária do Centro de Limnologia (CELBE). A FAPEMAT pelo
projeto aprovado e a CAPES pelo provimento da bolsa durante o mestrado.
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55
Figura 1. Número de ninfas mortas do 4º estádio de Rhodnius neglectus sob o
efeito de diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea, durante 28 dias
de observação. As concentrações foram identificadas por letras; a: 25mg/ml, b:
50mg/ml, c: 100mg/ml, d: 200mg/ml e o controle.
56
Tabela I – Número de mortos e porcentagem da mortalidade de ninfas de 4º e 5º
estádios de Rhodnius neglectus em diferentes concentrações do extrato de
Annona coriacea, ao final dos 28 dias de observação (Teste de Tukey).
Concentração Indivíduos mortos
(mg/ml)
Ninfas de
4º estádio
(n)
Ninfas de
4º estádio
(%)
Ninfas de
5º estádio
(n)
Ninfas de
5º estádio
(%)
Total
(n)
Controle 0 a 0 0 a 0 30
25 5 ab 16,6 1 a 3,3 30
50 10 b 33,3 1 a 3,3 30
100 24 c 80 8 ab 26,6 30
200 28 c 93,3 11 b 36,6 30
Obs.: Valores seguidos da mesma letra na coluna não apresentam diferença
significativa entre si ao nível de 5% de probabilidade.
57
Tabela II – Efeito das concentrações (%) do extrato de Annona coriacea sobre
ninfas de 4º e 5º estádios de Rhodnius neglectus, ao final dos 28 dias de
observação.
Concentração
(mg/ml)
Ninfas que
realizaram o
repasto
Ninfas que
realizaram a
muda
Ninfas vivas com
alterações
morfológicas
4º
estádio
Controle 100 100 0
25 3,3 26,6 36,6
50 3,3 3,3 20
100 3,3 0 3,3
200 0 3,3 3,3
5º
estádio
Controle 100 100 0
25 0 16,6 20
50 0 0 30
100 0 0 40
200 0 0 33,3
58
Figura 2. Número de ninfas mortas do 5º estádio de Rhodnius neglectus sob o
efeito de diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea, durante 28 dias
de observação. As concentrações foram identificadas por letras e agrupadas
apartir das médias que não diferiram entre si, a: controle, 25mg/ml e 50mg/ml, c:
100mg/ml, d: 200mg/ml.
59
Figura 3. Número de adultos mortos de Rhodnius neglectus sob o efeito de
diferentes concentrações do extrato de Annona coriacea, durante 28 dias de
observação. As concentrações foram identificadas por letras; a: 25mg/ml, b:
50mg/ml, c: 100mg/ml, d: 200mg/ml e o controle.
60
Tabela III – Número de mortos, porcentagem da mortalidade, fecundidade e
fertilidade de adultos de Rhodnius neglectus em diferentes concentrações do
extrato de Annona coriacea, após 28 dias.
Conc.
(mg/ml)
Adultos
Mortos
Fecundidade
(n)
Fertilidade
(ovos eclodidos)
Repasto
sanguíneo
(%)
Total
(n) (n) (%) (n) (%)
Controle 1 a 2,5 530 a 517 a 97, 5 100 40
25 36 b 90 332 ab 288 b 86,4 0 40
50 37 b 92,5 124 c 90 c 72, 5 0 40
100 40 b 100 67 d 11 d 16,4 0 40
200 40 b 100 45 d 6 d 13,3 0 40
Obs.: Valores seguidos da mesma letra na coluna não apresentam diferença
significativa entre si ao nível de 5% de probabilidade.
61
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os extratos de A. coriacea apresentam ação ovicida, sendo que os métodos
de aplicação tópica e de contato apresentaram resultados satisfatórios, capazes
de interromperem o desenvolvimento evolutivo do vetor da doença de Chagas.
O extrato apresentou também ação ninficida, pois, além da mortalidade,
causou deterrência alimentar, interrupção da ecdise e alterações morfológicas,
sobre ninfas de 4º e 5º estádios, mortalidade dos insetos adultos, inibição da
fecundidade e fertilidade, sendo suficiente para impedir que estes insetos sejam
considerados como vetores qualificados para a transmissão da doença em suas
várias fases evolutivas.
Além dos efeitos positivos encontrados no extrato de A. coriacea sobre o
vetor R. neglectus, a proposta de trabalhar com produtos vegetais se torna
importante do ponto de vista ambiental, principalmente por ser uma forma de
exploração sustentável dos recursos naturais, disponíveis na flora regional.
Portanto, A. coriacea mostrou ser um biocida promissor no controle de
ovos, ninfas e adultos do vetor R. neglectus, exigindo futuras pesquisas como
fracionamento, isolamento de compostos ativos e identificação para elaboração de
um promissor inseticida botânico.
62
ANEXO
63
ANEXO A -
Normas para publicação: Revista Brasileira de Entomologia (ISSN 00855626 -
B1 – Interdisciplinar).
Os manuscritos devem ser enviados online pelo endereço
http://submission.scielo.br/index.php/rbent/login. O texto deve ser editado, de
preferência, em Microsoft Word®, em página formato A4, usando fonte Times New
Roman tamanho 12, espaço duplo entre as linhas, com margem direita não
justificada e com páginas numeradas. Usar a fonte Times New Roman também
para rotulagem das figuras e dos gráficos. Apenas tabelas e gráficos podem ser
incorporados no arquivo contendo o texto do manuscrito. Os manuscritos deverão
ter, no máximo, 120 páginas incluindo as pranchas das figuras. Para manuscritos
maiores, os autores deverão consultar a comissão editorial previamente à
submissão.
O manuscrito deve começar com uma página de rosto, contendo: título do trabalho
e nome(s) do(s) autor(es) seguido(s) de número(s) (sobrescrito) com endereço(s)
completo(s), inclusive endereço eletrônico, e com respectivos algarismos arábicos
para remissão. Não utilizar palavras escritas totalmente em maiúsculas, exceto
nas indicações a seguir. Em seguida, apresentar ABSTRACT, com no máximo 250
palavras, com o título do trabalho em inglês e em parágrafo único; KEYWORDS,
em inglês, em ordem alfabética e no máximo cinco. Na seqüência virá o RESUMO
em português, incluindo o título e PALAVRAS-CHAVE, em ordem alfabética e
equivalentes às KEYWORDS. Devem ser evitadas palavras-chave que constem
do título e do resumo do artigo.
No corpo do texto, os nomes do grupo-gênero e do grupo-espécie devem ser
escritos em itálico. Os nomes científicos devem ser seguidos de autor e data, pelo
menos na primeira vez. Não usar sinais de marcação, de ênfase, ou quaisquer
outros. Conforme o caso (manuscritos de outra área, que não sejam de
Sistemática, Morfologia e Biogeografia), a Comissão Editorial decidirá como
proceder.
64
As referências devem ser citadas da seguinte forma: Canhedo (2004); (Canhedo
2003, 2004); (Canhedo 2004; Martins & Galileo 2004); Parra et al. (2004).
As figuras (fotografias, desenhos, gráficos e mapas) devem ser sempre
numeradas com algarismos arábicos e, na medida do possível, na ordem de
chamada no texto. As escalas devem ser colocadas na posição vertical ou
horizontal. As tabelas devem ser numeradas com algarismos romanos e incluídas,
no final do texto em páginas separadas. Se necessário, gráficos podem ser
incluídos no arquivo do texto e, como as tabelas, deverão vir no final do texto. As
figuras devem ser enviadas em arquivos suplementares, com, no mínimo, 300 dpi
de resolução para fotos coloridas e 600 dpi para desenhos a traço e fotos branco e
preto, em formato tiff ou jpeg de baixa compactação, sendo que os manuscritos
que não atendam às configurações indicadas acima serão devolvidos. O tamanho
da prancha deve ser proporcional ao espelho da página (23 x 17,5 cm), de
preferência não superior a duas vezes. Para a numeração das figuras utilizar
Times New Roman 11, com o número colocado à direita e abaixo. Isto só deve ser
aplicado para as pranchas quando em seu tamanho final de publicação. A fonte
Times New Roman deve ser usada também para rotulagem inserida em fotos,
desenhos e mapas (letras ou números utilizados para indicar nomes das
estruturas, abreviaturas etc.) e em tamanho apropriado de modo que em seu
tamanho final não fique mais destacada que as figuras propriamente ditas.
Fotografias (preto e branco ou coloridas) e desenhos a traço devem ser montados
em pranchas distintas. A Comissão Editorial poderá fazer alterações ou solicitar
aos autores uma nova montagem, bem como o envio de novos arquivos de
figuras. As legendas das figuras devem ser apresentadas no arquivo de texto. O
custo da publicação de pranchas coloridas deverá ser arcado pelos autores.
Os AGRADECIMENTOS devem ser relacionados no final do trabalho,
imediatamente antes das Referências. Sugere-se aos autores que sejam sucintos
e objetivos. Para as REFERÊNCIAS, adota-se o seguinte:
1. Periódicos (os títulos dos periódicos devem ser escritos por extenso e em
negrito, assim como o volume do periódico):
65
Zanol, K. M. R. 1999. Revisão do gênero Bahita Oman, 1936 (Homoptera,
Cicadellidae, Deltocephalinae). Biociências 7: 73145.
Martins, U. R. & M. H. M. Galileo. 2004. Contribuição ao conhecimento dos
Hemilophini (Coleoptera, Cerambycidae, Lamiinae), principalmente da Costa Rica.
Revista Brasileira de Entomologia 48: 467472.
Alves-dos-Santos, I. 2004. Biologia da nidificação de Anthodioctes megachiloides
Holmberg (Anthidiini, Megachilidae, Apoidea). Revista Brasileira de Zoologia 21:
739744.
2. Livros:
Michener, C. D. 2000. The Bees of the World. Baltimore, Johns Hopkins
University Press, xiv+913 p.
3. Capítulo de livro:
Ball, G. E. 1985. Reconstructed phylogeny and geographical history of genera of
the tribe Galeritini (Coleoptera: Carabidae), p. 276321. In: G. E. Ball (ed.).
Taxonomy, Phylogeny and Zoogeography of Beetles and Ants. Dordrecht, W.
Junk Publishers, xiii+514 p.
Referências a resumos de eventos não são permitidas e deve-se evitar a citação
de dissertações e teses.
Nas Comunicações Científicas o texto deve ser corrido sem divisão em itens
(Material e Métodos, Resultados e Discussão). Inclua o Abstract e o Resumo
seguidos das Keywords e Palavras-Chave.
Provas serão enviadas eletronicamente ao autor responsável e deverão ser
devolvidas, com as devidas correções, no tempo solicitado.
O teor científico do trabalho assim como a observância às normas gramaticais são
de inteira responsabilidade do(s) autor(es). Para cada trabalho publicado serão
fornecidas 10 (dez) separatas, independente do número de autores.
Sugere-se aos autores que consultem a última edição da revista para verificar o
estilo e lay-out. Ao submeter o manuscrito o autor poderá sugerir até três nomes
de revisores para analisar o trabalho, enviando: nome completo, endereço e email.
Entretanto, a escolha final dos consultores permanecerá com os Editores.
