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Mutação e Reparação do DNA Aspectos Conceituais e Rotas Metabólicas Prof. Antonio Márcio Teodoro Cordeiro Silva, M.Sc. Mutação e Reparação do DNA Aspectos Conceituais e Rotas Metabólicas Prof. Henrique Santana Costa, M.Sc.

Aula 06 mutação e reparo

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Mutação e Reparação

do DNAAspectos

Conceituais e Rotas Metabólicas

Prof. Antonio Márcio Teodoro Cordeiro Silva, M.Sc.

Mutação e Reparaçãodo DNA

Aspectos Conceituais e Rotas Metabólicas

Prof. Henrique Santana Costa, M.Sc.

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Mutação

Mutações → modificação súbita e hereditária no conjunto gênico de um organismo não explicável pela recombinação da variabilidade genética pré-existente.

Mutante → organismo possuidor de uma forma alterada como resultado da presença de uma mutação.

# Tipos

aneuploidias → mudanças no número cromossômico.

aberrações cromossômicas → mudanças grosseiras na estrutura dos cromossomos.

mudanças dos genes individuais.

1. Atualmente, o termo mutação tem sido utilizado quando da presença de alterações detectadas em nível de genes individuais.

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Mutação

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Mutação

# Geralmente, organismos portadores de uma mutação num determinado gene apresentam problemas em sua sobrevivência (sendo, assim, eliminados por seleção natural).

# Contudo, nem toda mutação resulta numa conseqüências deletéria para seu portador.

# mutação → fonte básica de toda variabilidade genética (matéria-prima para a evolução)

Sem a mutação, todos genes existiriam apenas em uma forma.

mutações espontâneas → resultam de funções celulares normais ou interações aleatórias com o ambiente.

→ podem ser aumentadas pelo tratamento com determinados compostos (agentes mutagênicos – mutações induzidas)

→ atuam diretamente no DNA.

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Mutação

Síntese de Proteína

Mutação pode alterar a síntese protéica

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Mutações

Classificação Geral Mutação Cromossômica: Número ou Estrutura Mutações Gênicas: Genes individuais

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A mutação é a fonte básica de toda variabilidade genética, fornecendo a matéria-prima para a evolução

Mutação: Bom ou Ruim?

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Processo Evolutivo

1. Recombinação: Rearranjos Novas combinações2. Seleção Natural Preserva as combinações mais adaptadas3. Ausência de Mutação Genes com apenas uma forma

Mutação como fonte de variabilidade

1 2 3

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Classificação das Mutações

1. Mutação espontânea2. Mutação induzida

Mutagênese x Clastogênese x Teratogênese x Carcinogênese

Quanto à Natureza

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Mutações Cromossômicas

Conjunto de cromossomo de uma espécie

1. Monoploidia: n cromossomos2. Diploidia: 2n cromossomos3. Triploidia: 3n cromossomos4. Poliploidia: mais de dois conjuntos

Euploidia

Número de cromossomos difere da espécie

1. Monossomia: 2n – 1 2. Trissomia: 2n + 1 3. Nulissomia: 2n – 2

Aneuploidia

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Mutação

# Mutação de ponto → modificação num único par de base (substituição, adição ou deleção)

mau funcionamento do sistema replicativo mau funcionamento do sistema de reparo interferência química direta sobre uma das bases do DNA

# Mutação letal condicional → letal num determinado ambiente (condições restritivas)

Classes

Mutantes auxotróficos → incapazes de sintetizar um metabólito essencial (aminoácido, purina, pirimidina, etc.)

→ crescem e se reproduzem quando o metabólito é fornecido pelo meio (condição permissiva)

→ não crescem quando o metabólito está ausente (condição restritiva)

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Mutação

mutantes sensíveis à temperatura → crescerão numa determinada temperatura

→ aumento da labilidade ao calor ou ao frio do produto gênico mutado.

mutantes sensíveis ao supressor → viáveis quando um segundo fator genético (supressor) está presente - mas inviáveis na ausência deste.

# Mutações transmitidas à descendência → células germinativas

# Mutações perpetuadas em células que descenderam da célula original na qual a mutação ocorreu (podendo não afetar o organismo inteiro) → células somáticas

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Rearranjos Cromossômicos

1. Inversões: Paracêntricas ou Pericêntricas

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Rearranjos Cromossômicos

2. Deleção: Terminal ou Intersticial

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Rearranjos Cromossômicos

3. Translocação: Recíproca ou Robertisoniana

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Rearranjos Cromossômicos

4. Duplicação x Replicação

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Mutantes em nível molecular

modificações tautoméricas → flutuações químicas decorrentes de mudanças nas posições dos átomos (purinas, pirimidinas, grupamento amino, anel nitrogenado, etc.)

→ alteram o pareamento de bases normal.

# Envolvem a substituição de um par de bases por outro → tipo mais comum de mutação

# Transição → substituição de uma purina por outra purina, ou de uma pirimidina por outra pirimidina.

# Transversão → substituição de uma purina por uma pirimidina ou vice-versa.

mutações que modificam a estrutura da leitura → envolve a adição ou deleção de um ou alguns pares de bases.

→ alteram a estrutura de leitura de todas as trincas de pares de bases no gene depois da mutação.

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Mutação Molecular

Modificações Tautoméricas

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Mutação em Nível Molecular

A –

T

T –

A

C –

G

G –

C

A – T

T – A

C – G

G – C

Transição

Transversão

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Taxas de Mutações

procariotos → 10-5 a 10-6 evento/locus/geração (mutação espontânea)

eucariotos → estimativa semelhante à encontrada nos procariotos.

# mutações silenciosas → sem efeito aparente

# Hotspots → sítios de pares de bases mais susceptíveis à mutação.

• Envolvem a troca de bases do DNA mas não causam a troca do aminoácido presente na proteína correspondente.

• Levam à troca do aminoácido, mas a substituição não afeta a atividade da proteína (mutações neutras).

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Mutação em Nível Molecular

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Mutação em Nível Molecular

Alteração do Quadro de Leitura (Frameshift)

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Mutação em Nível Molecular

Deleção

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Mutação em Nível Molecular

Inserção

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Mutação em Nível Molecular

Sentido Trocado (Missense)

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Mutação em Nível Molecular

Sem Sentido (Nonsense)

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Mutação em Nível Molecular

Expansão de Repetição

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Radiação

→ porção do espectro eletromagnético que contém comprimentos de onda menores e de maior energia que a luz visível (0,1µm).

Tipos

ionizante → raios X, raios gama e raios cósmicos (úteis no diagnóstico médico pelo fato de poderem penetrar nos tecidos vivos).

não-ionizante → luz ultravioleta.

• No processo de penetração, a radiação ionizante colide com átomos da matéria causando a liberação de elétrons (formando radicais livres positivamente carregados – íons).

• Quimicamente mais reativos quando comparados à átomos em seu estado estável normal.

# a reatividade aumentada dos átomos presentes nas moléculas de DNA é a base dos efeitos mutagênicos da luz ultravioleta e da radiação ionizante.

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Mutação por Radiação

Radiação ionizante → não envolve uma extensão de tempo.

# a mesma dosagem de irradiação pode ser obtida por um longo período de tempo, ou uma alta intensidade num curto período.

# mutações de ponto → diretamente proporcionais à dose de irradiação.

# Teoria da cinética de colisão única → toda ionização tem uma probabilidade de induzir uma mutação.

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Mutação por Radiação

Radiação ionizante H2O H• + OH•

Radiação ionizante Efeito direto

Efeito indireto

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Aberrações Estruturais

Cariótipo - Metáfase

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Mutação por Radiação

Radiação não-ionizante (luz ultravioleta) → não possui energia suficiente para induzir ionizações.

# são absorvidos por purinas e pirimidinas (tornando-se mais reativas).

○ multicelulares → atingem apenas camadas de células superficiais.

○ unicelulares → potente agente mutagênico

Formação de hidratos de pirimidina e dímeros de pirimidinas.

# a relação entre a taxa de mutação e a dose de UV é muito variável, dependendo do tipo de mutação do organismo e das condições empregadas.

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Mutação por Radiação

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Mecanismos de reparo do DNA

• Um mutante sobrevive quando sua troca genética não é prejudicial ou, mais raramente, é benéfica.

• A maioria das mutações, contudo, são desvantajosas – impedindo a sobrevida celular.

• mecanismos de reparo → revertem os efeitos de processos mutagênicos artificiais ou naturais sob o DNA.

→ muitos dos danos sofridos pelo DNA podem ser reparados porque a informação genética é preservada em ambas as fitas da dupla-hélice.

→ a informação perdida em uma fita pode ser recuperada através da fita complementar

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APLICAÇÕES PRÁTICAS DAS MUTAÇÕES

• Apesar da maioria das mutações tornarem o organismo menos adaptado e serem, portanto, desvantajosas, há a possibilidade das mesmas desenvolverem novas características desejáveis.

• Mutantes induzidos de cevada, trigo, aveia, soja, tomate – podem melhorar as linhagens cultivadas.

• resistência à ferrugem, maior produção, maior quantidade de proteína, sementes sem casca, ente outro.

→ elucidam as vias pelas quais os processos biológicos ocorrem (isolamento e estudo das mutações nos genes que codificam enzimas envolvidas nas mais diversas atividades metabólicas)

→ dissecção de processos biológicos

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Reparação do DNA

Tipos de Reparação do DNA

1. Reparação por fotorreatividade enzimática

2. Reparação de bases alteradas

3. Reparação por excisão de base

4. Reparação por excisão de nucleotídeos

5. Reparação de bases malpareadas

6. Sistema de reparação por resgate

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Reparação por Fotorreatividade Enzimática

# dímeros de pirimidina → impedem a replicação e a expressão gênica

• Fotoliase → catalisa uma 2ª reação fotoquímica, na presença de luz visível, desfazendo a mutação e refazendo as bases pirimídicas individuais.

ETAPAS

1ª → reconhecimento da enzima ao dímero na ausência de luz.

2ª → após a absorção de luz, energia é fornecida para a conversão do dímero em monômeros de pirimidina.

3ª → dissociação da enzima do DNA.

Reparação do DNA

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Reparação do DNA

Reparação por Fotorreatividade Enzimática Fotorreativação

1. Fotoliase reconhece e se liga ao dímero

2. Absorção de luz Conversão em monômeros

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Reparação do DNA

Reparação de Bases Alquiladas

Ação de enzimas específicas: O6-Metilguanina-metiltransferase

CH3-Cys-Enzima

• Não há meios de recuperar a enzima metilada (necessidade de novas enzimas para cada grupamento metil removido).

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Reparo por excisão

# A remoção de uma base defeituosa (ou não habitual) pode ocorrer a partir da:

• clivagem da ligação base-açúcar (excisão de base)

• incisão endonucleolítica nos dois lados da lesão

• liberação de nucleotídeos

• preenchimento da região pela ação da DNA-polimerase I e posterior ligação

Reparação do DNA

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Reparação por excisão de base

# A citosina do DNA é desaminada espontaneamente sendo, portanto, percebida pela uracil.

• evento mutagênico potencial

→ formação de filamento apresentando pares de bases errôneos (AU no lugar de GC)

■ Etapas de reparo

1. Hidrólise da ligação glicosídica entre uracil e as moléculas de desoxirribose pela enzima uracil-DNA-glicosilase

2. Liberação da base nitrogenada errônea (formação do sítio AP)

3. Excisão da cadeia em regiões adjacentes à base perdida pela enzima AP endonuclease

Reparação do DNA

Page 43: Aula 06   mutação e reparo

Reparação por excisão de base

■ Etapas de reparo

1. Hidrólise da ligação glicosídica entre uracil e as moléculas de desoxirribose pela enzima uracil-DNA-glicosilase

2. Liberação da base nitrogenada errônea (formação do sítio AP)

3. Excisão da cadeia em regiões adjacentes à base perdida pela enzima AP endonuclease

4. Inserção de citosina no local mutado pela enzima DNA-polimerase I

5. Ligação da fita corrigida pela enzima DNA-ligase

Reparação do DNA

Page 44: Aula 06   mutação e reparo

Reparação do DNA

Page 45: Aula 06   mutação e reparo

Reparação do DNA

Reparação por Excisão de Base

Page 46: Aula 06   mutação e reparo

Reparo por excisão de nucleotídeos

■ Um dos mais importantes e gerais mecanismos de reparo (REN)

ETAPAS

1. Reconhecimento da lesão

2. Incisão da fita lesada em ambos os lados da lesão e a alguma distância desta

3. Excisão do segmento (oligonucleotídeo) contendo a lesão

4. Síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não-danificada como molde

5. Ligação

# reação, a princípio, livre de erro

Reparação do DNA

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Reparação do DNA

Reparação por Excisão de Nucleotídeo (REN)

1. Reconhecimento da lesão

2. Incisão da fita lesada em ambos os lados da lesão

3. Excisão do seguimento contendo a lesão

4. Síntese do novo seguimento de DNA e Ligação

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Reparação do DNA

REN: Sistema Uvr (E. coli)

ATP

Helicase 5’ 3’

5’ (8nt)

3’ (4 a 5nt)

Excisão de 12 a 13nt

UvrD

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• Algumas bases incorretamente pareadas escapam da correção realizada pela DNA-polimerase

# Remoção de bases mal pareadas → Qual das fitas contém o erro? Qual das bases é a errada?

■ Um dos mais importantes e gerais mecanismos de reparo (REN) → enzima de correção de erro

ETAPAS

1. Reconhecimento da lesão

2. Incisão da fita lesada em ambos os lados da lesão e a alguma distância desta

3. Excisão do segmento (oligonucleotídeo) contendo a lesão

4. Síntese de um novo segmento de DNA utilizando a fita não-danificada como molde

5. Ligação

# sinal que direciona o sistema de excisão do erro exclusivamente para a fita recém-sintetizada → seqüências GATC próximas ao erro

Enzimas de correção de erro

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Reparação do DNA

Sinalização por metilação de sítios específicos

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Reparação do DNA

1. Enzima de correção de erro liga-se à seqüência GATC não modificada e ao par de bases mal pareadas da mesma fita de DNA.

2. Enzima de correção de erro remove o segmento de DNA que inclui o erro da fita que contém a seqüência GATC não metilada.

3. DNA-polimerase preenche a fenda, substituindo a base mal pareada pela correta.

# Modificações na adenina da seqüência GATC por metilases farão com que a enzima de correção não mais atue (não ocorrendo a excisão).

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• Existem ocasiões em que o dano no DNA é tão extremo que não há maneira de os mecanismos celulares de reparo corrigirem de forma precisa o erro

→ perda completa de um par de bases

# Qual base deve ser inserida no local lesado?

■ Sistema de Reparo Sujeito ao Erro

→ qualquer uma das bases é inserida no local lesado a fim de garantir a continuidade do processo replicativo

# possível indutor mutagênico (3/4 – 75%)

◙ Ainda assim, é mais vantajoso para a célula a incorporação de uma base errada do que não replicar mais.

Reparo sujeito ao erro

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Reparação do DNA

N6-Metiladenina (GATC)

Padrão de metilação

Replicação

Divisão Celular

Metilação

Metiltransferase de Manutenção

Reparação de Bases Malpareadas

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Reparação do DNA

Reparação de Bases Malpareadas: Sistema Mut

1. MutS pb malpareado

2. Reconhece sítio do erro

3. MutL se liga a MutS

4. Deslizamento até GATC (ATP)

5. MutH Reconhece GATC

6. Cliva: GATC até o malpareamento

7. Remoção da fita clivada (SSB)

8. Síntese e ligação da nova fita

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Reparação do DNA

Sistema de Reparação por Resgate

1. Dano impede a replicação

2. Cópias com lacuna no sítio lesado

3. Resgata-se a seqüência da fita normal

4. A lacuna da fita lesada é preenchida

5. A lacuna da fita normal é repolimerizada

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Conclusão

Mutação: Alteração do código genético

Efeito benéfico x Efeito maléfico

Mutações cromossômicas numéricas/estruturais

Mutações gênicas (Nível molecular)

Mecanismos de reparação de erros

Sistemas enzimáticos complexos que removem vários tipos de erros

Manutenção da integridade do DNA