Apoptosi  

v  Vogt, 1842: la morte cellulare è parte del normale sviluppo v  Lockshin and Williams, 1965: propongono il termine morte cellulare programmata (Programmed Cell Death, PCD) osservando che alcune cellule destinate a morire durante la metamorfosi di anfibi e insetti sembrano essere guidate da un programma intrinseco alla cellula stessa

v  Kerr, Wyllie and Currie, 1972: introducono il termine apoptosi (dal greco antico: come il cadere delle foglie) per descrivere la morte cellulare associata con una serie di caratteristiche morfologiche comuni e ben definite

v  Horvitz and Sulston, fine degli anni 70: caratterizazione genetica dei componenti critici che regolano i meccanismi apoptotici utilizzando il nematode C.elegans (premio Nobel per la medicina 2001)

Lo studio dell’apoptosi in C. elegans

v Durante lo sviluppo di C. elegans, si formano 1090 cellule: di queste, 959 resteranno a far parte del verme adulto (post-mitoticamente), e 131 vanno incontro ad apoptosi.

v Ricerca di mutazioni in cui il pattern di morte cellulare é alterato: identificazione di regolatori apoptotici poi ritrovati anche in mammiferi

Ø Ced-3 e ced-4: mutazioni che li inattivano portano alla conservazione di tutte e 131 le cellule “condannate a morte”

Ø Ced-9: mutazioni che inattivano ced-9 portano a morte cellulare estesa a tutte le cellule, livelli aumentati di espressione di ced-9 bloccano l’apoptosi.

Ø é un “suicidio” che implica una reazione “attiva” della cellula

Ø può verificarsi sia in seguito a stimoli esterni (agenti

chimici, fisici, ormoni, citochine, farmaci) che a stimoli endogeni (turnover cellulare, differenziamento terminale, rimodellamento durante sviluppo e morfogenesi)

Apoptosi

v L’apoptosi esiste in tutti gli organismi pluricellulari

v Organismi monocellulari: presente in forme piú o meno simili anche nei batteri, forse in difesa contro infezioni virali (che a loro volta hanno escogitato numerosi mezzi per inattivare il programma apoptotico endocellulare)

Evoluzione dell’apoptosi

Ø una cascata di reazioni si susseguono in un ordine

stereotipato al fine di “terminare” la vita cellulare

Peculiarità del processo apoptotico:

Ø molte di queste reazioni sono “bloccabili” in punti ben precisi sia dall’esterno (agenti farmacologici o inibitori di natura sintetica) che dall’interno (modulazione di geni endogeni)

Ø i residui cellulari restano vengono eliminati

rapidamente da fagociti, professionali e non, evitando l’innesco di una reazione infiammatoria

Un problema esistenziale:

Perché una cellula dovrebbe suicidarsi?

A volte la morte cellulare rappresenta un evento positivo per l’organismo

1.  L’apoptosi é richiesta per un normale sviluppo embrionale

2.  L’apoptosi é necessaria per la distruzione di cellule che rappresentano una minaccia per l’integritá dell’organismo

Apoptosi, sviluppo embrionale e differenziamento

v Metamorfosi: il riassorbimento della coda del girino

v Sviluppo: apoptosi delle cellule occupanti lo spazio interdigitali, formazione delle appropriate sinapsi neuronali;

v Differenziamento: turnover fisiologico delle cellule “mature” in tessuti continuamente proliferanti (p.es., cellule intestinali, neutrofili)

Apoptosi e “difesa” dell’organismo

v Contro cellule infettate da virus (ad opera di linfociti T citotossici);

v Contro cellule del sistema immune autoreattive;

v Contro cellule in cui si verifica un danno al DNA;

v Contro cellule tumorali.

Caratteristiche morfologiche dell’apoptosi

Ø Diminuzione del volume cellulare (perdita di liquidi intracellulari per processi attivi mediati dalle pompe di membrana)

Ø Condensazione e marginalizzazione della cromatina e

frammentazione della stessa

Ø Formazione di protuberanze (blebs) citoplasmatiche, delimitate da membrana (esposizione di PS) e

contenenti frammenti di cromatina condensata e di organelli cellulari -> corpi apoptotici

La cellula in apoptosi subisce modificazioni morfologiche e biochimiche che portano alla sua

frammentazione e ne favoriscono la fagocitosi

normali apoptotiche

La  “scale.a”  di  DNA  frammentato  di  una  cellula  apopto8ca  

Normal Cell

Cell shrinkage away from neighbouring cells

Plasma membrane blebbing Cytoplasmic and nuclear condensation

Margination of condensed chromatin

Nuclear and cellular fragmentation

Apoptotic Bodies Phagocytosis

Pyknosis!

Membrane intact until phagocytosed !

Edema!

Membrane breaks down resulting in an inflammatory response!

Differenze  morfologiche  fra  apoptosi  e  necrosi  

Groups of Cells Affected

Apoptosis Necrosis

Nuclei Dense Condensation of Chromatin

Irregular Chromatin Clumping

Cytoplasmic Organelles

Morphologically Intact Disrupted

Cell Membrane Apoptotic Bodies, Blebbing

Blebbing and Loss of integrity

Cell Volume Cells swell Cells shrink

In Tissues Single Cells Affected

Tissue Response None Inflammation

vs

Morphological Differences between Apoptosis and Necrosis

Distruzione  causata  da  una  bomba  (Nagasaki,  1945)  

Necrosi  vs  apoptosi  

Demolizione  di  un  rudere  

Che cosa succede quando l’apoptosi non funziona?

Il  KO  per  Apaf-­‐1  arresta  lo  sviluppo  embrionale  

Mancanza  di  apoptosi  interdigitale  

Mancanza  di  aLvazione  della  caspasi  3  

Diminuita  apoptosi  in  vitro  di  cellule  Apaf-­‐1  -­‐/-­‐  

Ruolo dell’apoptosi nella tumorigenesi Aumento della sopravvivenza cellulare e riduzione dell’apoptosi nell’oncogenesi

•  mutatazione di geni oncosoppressori p53 (50% dei tumori umani ) •  Iperespressione di Bcl-2 in alcune leucemie and linfomi B. •  Perdita di espressione del fattore attivante l’apoptosi (Apaf-1) nel melanoma

Malattie Associate a deregolazione dell’ Apoptosi

Aumento Apoptosi

AIDS Malattie Neurodegenerative malattia di Alzeheimer, Morbo di Parkinson, Malattia di Huntington

Cancro linfoma Follicolare carcinomi con mutazione di p53 Malattie Autoimmuni Lupus erytematoso Sistemico Infectioni Virali Herpesvirus, poxvirus, adenovirus

Inhibizione Apoptosi

Ruolo dell’ apoptosi nelle Malattie Neurodegenerative

• Apoptosi fisiologica durante lo sviluppo embrionale del cervello innescata dall’assenza di fattori di crescita

• Tossicità di aggregati di proteine con anomalie strutturali possono innescare apoptosi nella malattia di Alzeheimer, nel morbo di Parkinson, nella malattia di Huntington (Caspasi 9 attivata nel cervello degli alzheimeriani)

amyloid-β

IC Ca2+

Oxidative stress Neuronal Receptors

Apoptosis

Aggregati -Huntington

FADD/ Caspase 8

Apoptosis

Le fasi del programma apoptotico

1.  Decisione se iniziare o meno la procedura di “suicidio” cellulare

2.  Passaggio del “punto di non ritorno” (“commitment”)

3.  L’esecuzione

1.  Decisione se iniziare o meno la procedura di “suicidio” cellulare

2.  Passaggio del “punto di non ritorno” (“commitment”)

3.  L’esecuzione

1.  Decisione se iniziare o meno la procedura di “suicidio” cellulare

2.  Passaggio del “punto di non ritorno” (“commitment”)

3.  L’esecuzione

1.  Decisione se iniziare o meno la procedura di “suicidio” cellulare

2.  Passaggio del “punto di non ritorno” (“commitment”)

3.  L’esecuzione

Via  intrinseca   Via  estrinseca  

v  Proteine regolatorie hanno il compito di “integrare” i segnali pro- ed anti-apoptotici, e a seconda delle circostanze intra- ed extra-cellulari avviare o meno l’esecuzione

1.  Adattatori, in grado di trasdurre direttamente segnali apoptotici agli “esecutori”

2.  Regolatori della funzionalitá mitocondriale (membri della famiglia Bcl-2)

La decisione ed il passaggio del “punto di non ritorno

Il mitocondrio

Ø  Fasi precoci -> mantenimento della funzionalità mitocondriale

Ø Rilascio di proteine normalmente residenti all’interno del mitocondrio (citocromo c, Smac, HtrA2/Omi, AIF)

Ø Caduta del potenziale di membrana mitocondriale e perdita della permeabilità della stessa (caspasi- mediata)

Ø Collassamento e/o fissione dei mitocondri

Il citocromo c Ø  normalmente risiede nello spazio fra la membrana interna ed

esterna mitocondriale e funziona nel pathway respiratorio mitocondriale

Ø  viene rilasciato dai mitocondri nel cytosol dopo stimoli apoptotici

Ø  forma un complesso con Apaf-1 (l’omologo di Ced-4) e procaspasi 9 (inattiva) in presenza di ATP -> apoptosoma, che porta ad auto- attivazione della procaspasi 9 -> innesco della fase di esecuzione

Ø il rilascio precede i cambiamenti morfologici, è un fenomeno del tipo “tutto-o-nulla” ed è rapidissimo e sincrono (meno di 5 minuti)

Ø  varie ipotesi per la via d’uscita: Bax-channels, megacanale mitocondriale (o PTP, permeability transition pore)

Pro

WD-40 Repeats

CED-4CARD

CARD CARD LL SS

Apaf-1

*cytochrome c

***

*

dATP

dADP

Pro-caspase-9 Active

caspase-9

L

S

Pro-caspase-3/-7

Active

caspase-3/-7

Apaf-1

unfolding

apoptosoma  

Altre proteine rilasciate dal mitocondrio

v Smac/Diablo v HtrA2/Omi

v  AIF: proteina dello spazio intermembrana -> nucleo -> cambiamenti nella morfologia nucleare associati all’apoptosi (caspasi-indipendente) Coinvolto nell’apoptosi solo in seguito a particolari stimoli (necessario per la cavitazione nei primi stadi embrionali)

v  EndoG: proteina dello spazio intermembrana -> nucleo -> cambiamenti nella morfologia nucleare associati all’apoptosi

ICAD   CAD  

caspasi-­‐3  

ICAD  

CAD  

EndoG  

AIF  

HMW  +  oligonuclosomi  

Frammentazione    DNA  

NUCLEO  CITOPLASMA  

Condensazione  croma8na  +HMW  

membri pro-apoptotici si legano al PTP —> apertura —> rilascio del citocromo c membri anti-apoptotici si legano al PTP —| apertura

BH3-only inducono la oligomerizzazione di Bax o Bak sul mitocondrio —> canale —> rilascio del citocromo c membri anti-apoptotici —| oligomerizzazione e formazione del canale

Regolazione mitocondriale da parte della Bcl2 family

La rimozione dei “cadaveri”

Pathways anti-apoptotici

Altre  forme  di  morte  cellulare  

Necroptosi,  entosi  

La  necroptosi  

•  Innescata  da  s8moli  che  più  frequentemente  inducono  apoptosi:  –  legame  di  un  ligando  ai  death  receptors  (processo  quindi  regolato)  

•  Non  richiede  fuoriuscita  di  citocromo  C,  nè  aLvazione  di  caspasi  nè  coinvolge  Bcl2  family  

•  La  membrana  cellulare  perde  permeabilità,  non  c’è  frammentazione  nucleosomale  del  DNA,  c’è  perdita  di  funzionalità  mitocondriale  –  tuL  fenomeni  simili  alla  morte  per  necrosi  

Possibili  meccanismi  molecolari  •  Danno  cellulare  che  aLva  s8moli  pro-­‐apopto8ci  (p.es.  aLvazione  dei  death  receptors)  –  cellula  che  avvia  il  processo  apopto8co  

•  Contemporaneamente,  il  danno  cellulare  porta  a  disfunzione  mitocondriale  e  perdita  del  pool  di  ATP  –  l’apoptosi  non  può  procedere,  e  quindi  la  cellula  prosegue  il  suo  cammino  verso  la  morte  per  necrosi  

L’adesione  cellulare  può  portare  alla  inges8one  di  una  cellula  da  parte  della  

vicina  

Cara.eris8che  dell’entosi  •  L’adesione  intercellulare  (mediata  da  caderine  ed  altre  

molecole)  è  regolata  dall’interazione  delle  cellule  epiteliali  con  la  matrice  extracellulare,  che  orienta  e  limita  le  interazioni  cellula-­‐cellula  

•  In  par8colari  condizioni  in  cui  le  cellule  epiteliali  non  aderiscono  alla  matrice  extracellulare,  ci  può  essere  un  processo  “estremo”  di  adesione  che  porta  all’inges8one  cellulare  

•  Nelle  prime  fasi,  il  processo  è  reversibile  e  la  cellula  ingerita  è  vitale  

•  La  cellula  ingerita  (“entocita”)  viene  quindi  degradata  per  fusione  con  i  lisosomi  dell’ospite  

•  Un  meccanismo  di  protezione  an1-­‐metasta1co?  

Tra  la  vita  e  la  morte  

L’Autofagia  

Autophagy  is  a  response  to  nutrient  stress  to  maintain  adequate  internal  levels  of  nutrients  (self-­‐cannibaliza8on).  

Role  in  cell  death  is  best  revealed  if  apoptosis  is  disabled  (bax/bak-­‐/-­‐,  caspase  inhibitors,  Bcl-­‐xL++).  

In  nutrient-­‐poor  condi8ons  (or  equivalent  effects  on  mTOR  signaling),  autophagy  maintains  survival.  

In  nutrient-­‐rich  condi8ons,  autophagy  promotes  cell  death  in  response  to  other  types  of  stress.  

Cara.eris8che  

Sopravvivenza  o  morte  cellulare?  •  Nella  maggior  parte  delle  circostanze,  l’autofagia  cos8tuisce  

un  meccanismo  di  ada.amento  allo  stress  •  Le  modalità  con  cui  l’autofagia  si  trasforma  in  un  processo  di  

morte  cellulare  non  sono  chiare  –  anche  dopo  estensiva  auto-­‐cannibalizzazione  in  assenza  di  fa.ori  di  

crescita,  le  cellule  possono  recuperare  se  trasportate  in  condizioni  adeguate  

•  Non  ci  sono  evidenze  che  geni  coinvol8  nel  processo  di  autofagia  siano  implica8  in  processi  di  morte  cellulare  fisiologica  (es.  sviluppo  embrionale)  –  nematodi  KO  per  bec-­‐1,  ortologo  di  ATG6/beclina  1  e  topi  KO  per  la  

beclina  1  hanno  un  numero  maggiore  di  cellule  apopto8che  

Autophagy/xenophagy  •  Autophagy  “eat  oneself”  •  Xenophagy  “eat  foreign  

maGer”  •  Highly  conserved  and  

regulated  process  that  maintains  cellular  homeostasis  and  protects  cells  against  starvaKon  and  microbe  invasion  

3  Stages  •  IniKaKon:    nutrient  starvaKon,  growth  factor-­‐mediated  starvaKon  

•  ExecuKon  •  MaturaKon  

Nature  reviews  microbiology  2004  2:301  

Autophagic  process  •  Cytoplasmic  organelles  and  porKons  of  cytoplasm  sequestered  in  double  membrane-­‐bound  vacuoles    

•  Source  of  membrane  mulKfactorial  (ribosome-­‐free  ER?)  

•  Fuse  with  lysosomes  

Nature  reviews  microbiology  2004  2:301  Science    2004  306:990  

Copyright ©2005 American Society for Clinical Investigation

Levine,  B.  et  al.  J.  Clin.  Invest.  2005;115:2679-­‐2688  

Ultrastructural examples of apoptotic and autophagic cell death

Lum  et  al.,  2005  

IniKaKon:Signaling  pathways  

•  Trimeric  G  proteins  •  Growth  receptors  •  PI3K  (classes  I  &  III)  •  protein  phosphatases  •  mTOR  

ExecuKon  •  Requires  covalent-­‐conjugaKon  pathways  •  Requires  Atg3,  Atg7,  Atg10  

–  Homologs  of  ubiquiKnylaKon  proteins  –  Modifies  pathway  components  but  does  not  target  them  for  

degradaKon  •  ProducKon  of  PIP3  via  hVPS34  (class  III  PI3K)  

–  Inhibited  by  wortmanin,  3-­‐Methyladenine  –  Promotes  proteolysis-­‐>producKon  of  amino  acids  

•  Complex  formed  between  hVPS34,  Atg14,  &  Atg6  (Beclin-­‐1)  which  is  necessary  for  downstream  recruitment  and  localizaKon  of  Atg5  &  Atg12  

•  Covalent  linkage  of  Atg5  and  Atg12  on  pre-­‐autophagosomal  membrane  •  Protease  cleavage  of  Atg8  (MAP1  Light  chain  3  (LC3),  followed  by  

covalent  lipidaKon  to  phosphaKdylethanolamine  and  translocaKon  to  autophagosome  membrane  

Fusion  

•  Autophagosomes  fuse  with  endosomes  •  Acquire  characterisKcs  of  lysosomes    –  LAMP1  &  2  –  Accessible  to  DAMP  –  Cathepsins,  acid  phosphatases  

•  Vesicle  fusion  mediated  by  Rabs  (Rab24)  

Involved  in  many  processes  

•  ATG6/Beclin  1:    tumour  suppressor  gene  –  Deleted  in  sporadic  breast,  ovarian,  prostate  CA  

•  Dauer  formaKon  in  C.  elegans  •  ATG5  &  ATG7:  Dictyostelium  nitrogen  starvaKon  •  Prevent  premature  senescence  •  Host  defense  against  pathogen  invasion  

Autofagia  ed  omeostasi  cellulare  

•  L’autofagia  è  coinvolta  nella  eliminazione  di  proteine  danneggiate  che  se  accumulate  possono  portare  alla  formazione  di  aggrega8  

•  Eliminazione  di  organelli  malfunzionan8  •  Mentre  l’eliminazione  di  proteine  può  essere  svolta  anche  da  altri  sistemi  (proteasoma),  l’autofagia  è  l’unico  processo  cellulare  che  può  portare  alla  degradazione  di  interi  organelli  (mitocondri,  perossisomi,  ecc.)  

Autofagia  e  malaLe  neurodegenera8ve  

•  Autofagosomi  si  accumulano  nel  cervello  dei  pazien8  affeL  da  diverse  malaLe  degenera8ve  –  inizialmente,  l’autofagia  ritenuta  come  un  meccanismo  patogene8co  e  scatenante  la  morte  cellulare  

–  a.ualmente,  almeno  nei  modelli  animali  è  chiaro  che  l’autofagia  rappresenta  un  meccanismo  di  difesa  e  l’accumulo  di  autofagosomi  una  risposta  fisiologica  e  di  tenta8vo  di  clearance  delle  componen8  cellulari  danneggiate  

Microbes  &  autophagy  •  Diverse  strategies  –  Host  defense  –  Bacterial  manipulate  it  to  survive  intracellularly  

Nature  reviews  microbiology  2004  2:301  

Autofagia  e  cancro  

•  La  dimostrazione  che  il  gene  per  la  beclina  è  perso  in  diversi  tumori  e  quindi  è  un  candidato  oncosoppressore  ha  portato  ad  ipo8zzare  che  l’autofagia  sia  un  meccanismo  prevalentemente  di  difesa  contro  i  tumori  

•  L’autofagia  però  può  anche  promuovere  la  sopravvivenza  delle  cellule  tumorali  in  condizioni  di  stress  (mancanza  di  nutrien8,  tra.amen8  farmacologici)  

Modelli  animali  di  studio  del  rapporto  fra  autofagia  e  cancro  

•  Solo  una  copia  di  bec-­‐1  (beclina)  è  persa  nei  tumori  mammari  

•  Topi  bec-­‐1  +/-­‐:  diminuita  autofagia,  aumento  della  frequenza  di  diversi  8pi  di  tumori  

•  Due  altri  gene  oncosoppressori  (PTEN  e  p53)  s8molano  l’autofagia  inibendo  la  funzione  di  TOR  

Autofagia  ed  invecchiamento  

•  Il  digiuno  intermi.ente  promuove  la  longevità  •  La  dieta  (restrizione  calorica)  è  un  indu.ore  di  autofagia  in  tu.e  le  specie  

•  La  aumentata  longevità  indo.a  da  restrizion  calorica  non  viene  mantenuta  se  vi  è  inaLvazione  dell’autofagia    –  modelli  animali  semplici  (verme,  moscerino)  

•  Vi  è  una  diminuita  espressione  dei  geni  “autofagici”  con  l’aumentare  dell’età  

ALvazione  dell’autofagia  aumenta  la  longevità  nei  mammiferi  

Gli  animali  sono  sta8  tra.a8  con  rapamicina  –inibitore  di  mTOR  e  quindi  aLvatore  dell’autofagia-­‐  a  par8re  da  600  giorni  di  età  (adulta-­‐inizio  della  vecchiaia).  I  topi  sopravvivono  Più  a  lungo  dopo  tra.amento  (meccanismi  molecolari  ancora  da  definire).