AUTOREFERAT Beata Polak - umlub.pl · Beata Polak, Władysław Gołkiewicz, Tomasz Tuzimski – Effect of mobile phase pH* on chromatographic behaviour in chiral ligand-exchange thin-layer

AUTOREFERAT

Beata Polak

Katedra Chemii, Zakład Chemii Fizycznej

Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Analityki Medycznej

Uniwersytet Medyczny w Lublinie

Lublin 2016

Dr n. farm. Beata Polak, Załącznik 2, autoreferat

2


3

SPIS TREŚCI

1. POSIADANE DYPLOMY I STOPNIE NAUKOWE 4

2. INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU 4

3. OSIĄGNIĘCIA WYNIKAJĄCE Z ART. 16 UST. 2 USTAWY

Z DN. 14 MARCA 2003 R. O STOPNIACH NAUKOWYCH

I TYTULE NAUKOWYM ORAZ O STOPNIACH I TYTULE

W ZAKRESIE SZTUKI (DZ.U. NR 65, POZ. 595 ZE ZM.)

4

3.a. TYTUŁ OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO 4

3.b. SPIS PUBLIKACJI WCHODZĄCYCH W SKŁAD

OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO

5

3.c. CEL OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO, WYNIKI,

PODSUMOWANIE I WYCIĄGNIETE WNIOSKI

7

3.c.1. Cel osiągnięcia naukowego 7

3.c.2. Wprowadzenie 8

3.c.3. Wyniki 13

3.c.4. Podsumowanie i wnioski 33

3.c.5. Literatura 35

4. OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO-

BADAWCZYCH

39

4.a. DZIAŁALNOŚĆ NAUKOWO-BADAWCZA PRZED

UZYSKANIEM STOPNIA DOKTORA NAUK

FARMACEUTYCZNYCH

39

4.b. DZIAŁALNOŚĆ NAUKOWO-BADAWCZA PO UZYSKANIU

STOPNIA DOKTORA NAUK FARMACEUTYCZNYCH

40

5. TABELA PODSUMOWUJĄCA DOROBEK NAUKOWY 46


4

1. POSIADANE DYPLOMY I STOPNIE NAUKOWE

Dyplom magistra farmacji – 1990 r. Akademia Medyczna w Lublinie, dyplom na

podstawie pracy magisterskiej pt. „Mikropreparatywne rozdzielanie ekstraktów

roślinnych metodą TLC” wykonanej w Katedrze i Zakładzie Chemii Nieorganicznej

i Analitycznej pod kierunkiem prof. dr hab. Edwarda Soczewińskiego.

Dyplom doktora nauk farmaceutycznych– 1998 r. Akademia Medyczna w Lublinie na

podstawie rozprawy doktorskiej pt. „Chromatografia cieczowa substancji chiralnych”

wykonanej pod kierunkiem prof. dr hab. Władysława Gołkiewicza w Katedrze Chemii

Nieorganicznej i Analitycznej.

2. INFORMACJE O DOTYCHCZASOWYM ZATRUDNIENIU

Od 2008 – do chwili obecnej - Katedra Chemii, Zakład Chemii Fizycznej, Uniwersytet

Medyczny w Lublinie na etacie adiunkta

2003 - 2008 r. – Katedra Chemii, Zakład Chemii Fizycznej, Akademia Medyczna

w Lublinie na etacie adiunkta

1999 - 2003 r. - Katedra Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Akademia Medyczna

w Lublinie na etacie adiunkta

1990 - 1999 r. – Katedra Chemii Nieorganicznej i Analitycznej, Akademia Medyczna

w Lublinie na etacie asystenta

3. OSIĄGNIĘCIA WYNIKAJĄCE Z ART. 16 UST. 2 USTAWY Z DN. 14 MARCA

2003 R. O STOPNIACH NAUKOWYCH I TYTULE NAUKOWYM ORAZ

O STOPNIACH I TYTULE W ZAKRESIE SZTUKI (DZ.U. NR 65, POZ. 595 ZE

ZM.)

3.a. TYTUŁ OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO

Uzyskane osiągnięcia naukowe, stanowiące podstawę habilitacji, zostały przedstawione

w monotematycznym cyklu dwunastu prac opublikowanych w latach 2002 – 2016

o problematyce pt. „Badania nad wpływem warunków prowadzenia procesu


5

rozdzielania izomerów, ze szczególnym uwzględnieniem enancjomerów, wybranymi

technikami elektrochromatografii i chromatografii cieczowej.”

Łączny współczynnik oddziaływania (IF) wymienionych prac wynosi: 11,262

łączna punktacja MNiSW wynosi: 156 pkt .

3.b. SPIS PUBLIKACJI WCHODZACYCH W SKŁAD OSIĄGNIĘCIA

NAUKWEGO

autor/autorzy, tytuł/tytuły publikacji, rok wydania, nazwa czasopisma

H-1. Beata Polak, Władysław Gołkiewicz – Correlation method of comparison of

selectivity and retention on different chiral stationary phases. (2002). Chromatographia,

56, 323-330.

(IF: 1,230; punkty KBN/ MNiSW: 9,000)

Mój wkład w powstanie tej publikacji polegał na autorstwie koncepcji pracy, przeprowadzeniu

eksperymentów, opracowaniu wyników oraz przygotowaniu manuskryptu. Oceniam go na 60%.

H-2. Beata Polak, Krzysztof Jóźwiak, Władysław Gołkiewicz, Dariusz Matosiuk –

Determination of chiral diamines by LC-DAD and LC. (2002). Journal of Liquid

Chromatography and Related Technologies, 25, 2933-2945.


Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na przeprowadzeniu eksperymentów, opracowaniu wyników

oraz przygotowaniu manuskryptu. Oceniam go na 60%.

H-3. Tadeusz H. Dzido, Rafał Majewski, Beata Polak, Władysław Gołkiewicz, Edward

Soczewiński – Application of a horizontal DS chamber to planar electrochromatography.

(2003). Journal of Planar Chromatography, 16, 176-182.


Moim wkładem w tej publikacji była koncepcja dotycząca rozdzielania enancjomerów DL-fenyloalaniny

przy zastosowaniu nowej techniki oraz redakcja fragmentu manuskryptu dotyczącego tego aspektu.

Oceniam go na 20%.

H-4. Beata Polak, Władysław Gołkiewicz, Tomasz Tuzimski – Effect of mobile phase

pH* on chromatographic behaviour in chiral ligand-exchange thin-layer chromatography

(CLETLC) of amino acid enantiomers. (2006). Chromatographia, 63, 197-201.

(IF: 1,171; Punkty KBN/ MNiSW: 15,000)

Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na autorstwie koncepcji, przeprowadzeniu eksperymentów,

opracowaniu wyników chromatograficznych oraz przygotowaniu manuskryptu. Oceniam go na 60%.

H-5. Beata Polak, Aneta Hałka, Tadeusz H. Dzido - Pressurized planar

electrochromatography separation of tryptophan and valine enantiomers. (2008). Journal

of Planar Chromatography, 21, 33-37.


6


Mój wkład w powstanie tej pracy polegał na autorstwie koncepcji pracy, przeprowadzeniu części

eksperymentów, opracowaniu wyników oraz przygotowaniu manuskryptu. Oceniam go na 70%.

H-6. Beata Polak - Influence of temperature and mobile phase pH on the

chromatographic parameters of mandelic acid racemate on Whelk-01 chiral stationary

phase. (2008). Annales UMCS, DDD sectio Pharmacia, 21, 15-22.


Mój wkład w powstanie tej publikacji polegał na autorstwie koncepcji pracy, przeprowadzeniu

doświadczeń, opracowaniu wyników, redakcji manuskryptu.

H-7. Beata Polak, Krzysztof K. Wojtanowski, Piotr Ślązak, Tadeusz H. Dzido -

Separation of some aromatic amino acid enantiomers with pressurized planar

electrochromatography and TLC. (2011). Chromatographia, 73, 339-345.


Mój wkład w powstanie tej publikacji polegał na autorstwie koncepcji pracy, przeprowadzeniu części

doświadczeń, opracowaniu wyników, redakcji manuskryptu. Mój udział szacuję na 70%.

H-8. Beata Polak, Karolina Balasa, Tadeusz H. Dzido - Separation of Amino Acid 2,4-

Dinitrophenyl-5-L-Valine Amide Diastereomeric Derivatives with High-Performance

Planar Chromatography and Pressurized Planar Electrochromatography. (2013). Journal

of Planar Chromatography, 28, 180-189.




H-9. Beata Polak, Paweł Garbacz – β- cyclodextrin as the mobile phase component for

separation of some DNS-amino acid enantiomers with HPTLC and PPEC. (2015).

Current Analytical Chemistry, 11, 68-77.




H-10. Beata Polak, Urszula Majcher - Influence of two cyclodextrin HP-derivatives on

retention and migration distance of some isomers in high-performance thin-layer

chromatography and pressurized planar electrochromatography systems with non-polar

adsorbents. (2015). Current Analytical Chemistry, 11, 199-210.




H-11. Beata Polak, Anna Maruszak, Paweł W. Płocharz –High-performance thin-layer

chromatography and pressurized planar electrochromatography of some diastereomeric


7

amino acid derivatives in reversed - phase system with carboxylic acid mobile phase

buffers. (2016). Journal of Planar Chromatography, 29, 22-29.




H-12. Beata Polak, Adam Chomicki, Piotr Wierzchowski, Anna Klimek-Turek -

Influence of some variables on separation of diastereomeric FVDA-amino alcohol

derivatives in high-performance thin-layer chromatography and pressurized planar

electrochromatography systems. (2016). Current Analytical Chemistry, 12, 4, dostępne

online. DOI: 10.2174/1573411011666150813235958




3.c. CEL OSIĄGNIĘCIA NAUKOWEGO, WYNIKI, PODSUMOWANIE

I WNIOSKI

3.c.1. Cel osiągnięcia naukowego

Celem badań było określenie wpływu warunków prowadzenia eksperymentu na

rozdzielanie izomerów, ze szczególnym uwzględnieniem enancjomerów, wybranymi

technikami elektrochromatografii i chromatografii cieczowej.

Zamysł ten realizowałam w następujących etapach:

1.Badanie wpływu parametrów bezpośrednio związanych z fazami ruchomą

i stacjonarną na retencję lub migrację badanych izomerów:

1.a. skład ilościowy i jakościowy fazy ruchomej:

1.a.1. stężenie i rodzaj modyfikatora organicznego,

1.a.2. pH, stężenie i rodzaj buforu fazy ruchomej,

1.a.3. rodzaj chiralnego modyfikatora i jego stężenie;

1.b. rodzaj zastosowanej fazy stacjonarnej.

2. Badanie wpływu temperatury na rozdzielenie izomerów technikami chromatografii

cieczowej i elektrochromatografii planarnej ciśnieniowej.

3. Badanie wpływu parametrów, charakterystycznych dla ciśnieniowej elektrochro-

matografii planarnej, na migrację i selektywność rozdzielenia substancji:

3.a. pole elektryczne,


8

3.b. czas działania pola elektrycznego.

4. Weryfikacja rozdzielenia enancjomerów poprzez zastosowanie odpowiedniej

detekcji.

3.c.2. Wprowadzenie

Konieczność rozdzielania, oczyszczania i izolacji różnych typów izomerów rodzi wiele

problemów związanych z tym zadaniem. Dysproporcje we właściwościach fizycznych

izomerów konstytucyjnych, czy diastereoizomerów, sprzyjają ich różnicowaniu przy

zastosowaniu wielu powszechnie dostępnych technik rozdzielczych. Inaczej sprawa ma

się z rozdzielaniem enancjomerów - izomerów posiadających prawie takie same

właściwości fizyczne, a różniących się jedynie ich oddziaływaniem ze środowiskiem

chiralnym takim jak np. światło spolaryzowane czy układ enzymatyczny. Sposobem na

rozwiązanie problemu rozdzielania enancjomerów jest przekształcenie ich

w diastereoizomery. Zmiana ta może się odbywać podczas procesu rozdzielania (metoda

bezpośrednia) lub go poprzedzać (metoda pośrednia). W pierwszej metodzie

wykorzystuje się homochiralne czynniki różnicujące (chiralne selektory), związane

z adsorbentem (chiralna faza stacjonarna, CSP), lub też stanowiące składnik eluentu

(chiralny dodatek do fazy ruchomej, CMPA). Natomiast w drugiej metodzie również

stosuje się chiralne selektory, które w reakcji z cząsteczkami rozdzielanych

enancjomerów tworzą diastereomeryczne pochodne o zróżnicowanych właściwościach.

Z uwagi na budowę chemiczną i oddziaływania prowadzące do różnicowania

składników racematu chiralne fazy stacjonarne zostały podzielone przez Wainera

[Wainer, 1987] na kilka grup. W badaniach opisywanych w niniejszym cyklu

korzystałam z dwóch typów CSP. Pierwszy z nich opierał się na procesie chiralnej

wymiany ligandów, zaś drugi wykorzystywał oddziaływania typu Pirkle’a. Z tego też

powodu w tej części skupię się wyłącznie na szerszym opisaniu tych dwóch typów CSP.

Proces rozdzielania enancjomerów stosowany w metodzie chiralnej wymiany

ligandów (z ang. Chiral Ligand Exchange Chromatography, CLEC) opiera się na

tworzeniu kompleksu, w którym rolę atomu centralnego stanowi najczęściej jon

miedzi(II). Jednym z ligandów jest na przykład pochodna 4-hydroksy-L-proliny związana

z adsorbentem, zaś drugim wymienialnym, jest enancjomer analitu. Odmienne

przestrzenne położenie grup funkcyjnych przy atomie węgla, stanowiącym centrum


9

asymetrii rozdzielanych enancjomerów, powoduje powstanie dwóch kompleksów

zawierających po jednym z enancjomerów. Cząsteczka, której kształt przestrzenny

enancjomeru sprzyja tworzeniu silniejszych oddziaływań z selektorem charakteryzuje się

większą retencją. Natomiast ta o słabszych oddziaływaniach ma mniejszą retencję. Dzięki

temu enancjomery można rozdzielić w układzie chromatograficznym. Faza stacjonarna

typu CLEC z pochodną enancjomeru 4-hydroksyproliny jest jedynym chiralnym

adsorbentem dostępnym w handlu przeznaczonym dla chromatografii cienkowarstwowej.

Natomiast drugi model chiralnej fazy stacjonarnej - typu Pirkle’a, lub typu

szczotki (brush-type phase), jest stosowany wyłącznie w wysokosprawnej chromatografii

cieczowej (HPLC). Chiralnym selektorem tej fazy jest najczęściej specjalnie

modyfikowana homochiralna cząsteczka aminokwasu, zawierająca grupy posiadające

nadmiar lub niedomiar elektronów π. Ugrupowania te są zdolne do wytworzenia

dodatkowych oddziaływań typu -kwas - -zasada z analitem w stosunku do już

obecnych, prowadzących wspólnie do powstania przejściowego kompleksu

diastereoizomerycznego i w wyniku tego do rozdzielenia enancjomerów. Oprócz

opisanych faz typu Pirkle’a o typowym charakterze -kwasu lub -zasady, powstały

również fazy mieszane zawierające oba typy ugrupowań (np. faza Whelk-01) [Pirkle,

Hyun, Bank, 1984; Pirkle, Welch, Wilson, 1994].

Jak już wspomniałam powyżej, rozdzielanie enancjomerów może się również odbywać

z wykorzystaniem chiralnego modyfikatora fazy ruchomej, CMPA. Do najstarszych

selektorów tego typu należą cyklodekstryny, CD [Hinze, Armstrong, 1980; Armstrong,

1980]. Są to cykliczne polimery składające się z kilku ugrupowań glukozowych

połączonych wiązaniem -1,4. W zależności od liczby cząsteczek glukozy i średnicy

wewnętrznej cyklodekstryny dzielą się na (6-reszt glukozy, średnica 0,5 nm), (7-reszt

glukozy, średnica 0,6 nm) i (8-reszt glukozy, średnica 0,8 nm). Rozmiar średnicy

wewnętrznej cyklodekstryny wpływa na zdolność rozdzielania analitu

w zależności od wielkości cząsteczki. Zaś różnicowanie enancjomerów polega na

utworzeniu oddziaływań typu gość - gospodarz (host - guest) pomiędzy lipofilowym

wnętrzem CD a cząsteczką izomeru. Dodatkowe oddziaływania w postaci np. wiązań

wodorowych tworzą się między hydrofilową powierzchnią cyklodekstryny

i odpowiadającymi jej charakterowi grupami funkcyjnymi analitu. Z uwagi na rozmiary

cząsteczek do najbardziej popularnych selektorów z tej grupy należą β-CD. Pewną


10

niedogodnością, ograniczającą ich stosowanie, jest niska rozpuszczalność w wodzie,

którą dodatkowo obniża dodatek rozpuszczalnika organicznego. Jednym ze sposobów

rozwiązania tego problemu jest rozpuszczenie cyklodekstryn w nasyconym roztworze

mocznika, a następnie dodanie części organicznej eluentu. Niestety, zastosowanie tej

opcji zwiększa lepkość fazy ruchomej i wydłuża czas analizy. Znacznie bardziej

korzystniejszym sposobem jest modyfikacja cząsteczki cyklodekstryny, prowadząca do

zmniejszenia hydrofilowości powierzchni zewnętrznej poprzez przyłączenie lipofilowych

ugrupowań. Otrzymane w ten sposób pochodne cechują się zwiększoną

rozpuszczalnością w wodno-organicznych fazach ruchomych.

Rozdzielanie izomerów optycznych może być przeprowadzone sposobem

pośrednim polegającym na ich reakcji z chiralnym odczynnikiem derywatyzującym

(CDR) i utworzeniu pary diastereoizomerów. Substancje te, o różnych właściwościach

fizycznych, są następnie rozdzielane podczas procesu chromatograficznego,

prowadzonego zarówno w normalnym jak i odwróconym układzie faz.

Z uwagi na rodzaj grupy funkcyjnej enancjomeru, zdolnej do reakcji, powstało

szereg typów CDR. Relatywnie dużą grupą są chiralne odczynniki derywatyzujące

przeznaczone do reakcji z ugrupowaniem aminowym enancjomerów. Zaś pośród nich do

najczęściej stosowanych należą amidy fluoro-2,4-dinitrobenzoilowych pochodnych

aminokwasów. Odczynniki te noszą ogólną nazwę odczynników Marfey’a od nazwiska

ich twórcy [Marfey, 1984]. Podstawowy wariant odczynnika zawiera alaninę (odczynnik

ten jest nadal dostępny w handlu), lecz po kilkunastu latach powstało wiele jego wersji

(z fenyloalaniną, proliną, leucyną, metioniną czy waliną) zsyntetyzowanych przez zespół

Bhushana [Tanwar, Bhushan, 2015; Bhushan i wsp., 2007]. Jedna z zaproponowanych

modyfikacji (zawierająca enancjomer waliny, FVDA) pozwala na uzyskanie większego

enancjoróżnicowania w porównaniu z pierwowzorem i jest również dostępna w handlu.

Popularność tego odczynnika jest wynikiem łatwej do przeprowadzenia reakcji

z rozdzielanymi substancjami. Zachodzi ona bowiem w środowisku słabo zasadowym

(pH ok. 9.0 - 10.0) w stosunkowo niskiej temperaturze (40 - 45oC). Otrzymane pochodne

są barwne, co dodatkowo ułatwia ich detekcję. Dane literaturowe raportują o możliwości

wykorzystania tego odczynnika do reakcji z szeroką gamą substancji posiadających grupy

aminowe, począwszy od aminokwasów a skończywszy na lekach z różnych grup

terapeutycznych takich jak: -adrenolityki (aminoalkohole) [Bhushan, Kumar, 2009],


11

spazmolityki (baklofen) [Bhushan, Kumar, 2008], przeciw arytmiczne (meksyletyna)

[Bhushan, Vashistha, 2015], środki stosowane do usuwania jonów metali ciężkich

z płynów fizjologicznych (penicylamina) [Bhushan, Brückner, Kumar, 2007]. Niestety,

pewną niedogodnością pojawiającą się podczas stosowania tego CDR-u jest konieczność

ochrony pochodnych przed światłem i przechowywanie ich w niskiej temperaturze.

Rozpatrując techniki wykorzystywane do procesu rozdzielania izomerów można

je podzielić na chromatograficzne (chromatografia cienkowarstwowa, TLC, czy

wysokosprawna chromatografia cieczowa, HPLC) i elektromigracyjne (elektroforeza

kapilarna, CE, elektrochromatografia kapilarna, CEC). W przypadku pierwszej

z wymienionych grup migracja fazy ruchomej odbywa się dzięki siłom kapilarnym (TLC)

lub też jest wymuszana ciśnieniem wytworzonym przez pompę (HPLC). W obu

przypadkach przepływ ten ma charakter laminarny o charakterystycznym parabolicznymi

profilu. Taka forma migracji eluentu sprzyja rozszerzeniu stref rozdzielanych substancji.

Zupełnie inny, płaski profil przepływu fazy ruchomej występuje w przypadku

zastosowania technik elektromigracyjnych. Taki efekt sprzyja minimalnemu rozmyciu

migrujących stref substancji. Sam zaś przepływ fazy ciekłej (efekt elektroosmotyczny)

wewnątrz kapilary spowodowany jest przyłożonym polem elektrycznym (różnicą

potencjałów) i istnieniem podwójnej warstwy elektrycznej granicy faz roztwór – ciało

stałe (ściana kapilary i/lub powierzchnia adsorbentu).

Naukowcy próbowali od lat połączyć techniki chromatograficzne

i elektromigracyjne. Taki proces zakończył się powodzeniem w przypadku

wysokosprawnej chromatografii kolumnowej i elektroforezy kapilarnej. Powstała w ten

sposób nowa technika, elektrochromatografia kapilarna (CEC), charakteryzująca się

bardzo wysoką sprawnością układu rozdzielczego. [Knox, Grant, 1991; Rathore, 2002].

Przez szereg lat brakowało odpowiednika CEC dla technik planarnych. Pierwsze

próby połączenia technik planarnych chromatograficznych i elektromigracyjnych zostały

podjęte dopiero w 1974 roku przez Pretoriusa. Nowa technika charakteryzowała się

większą sprawnością rozdzielania i krótszym czasem trwania eksperymentu [Pretorius,

Hopkins, Schieke, 1974]. Niestety pomimo udanych rezultatów prace nad rozwojem tej

techniki zostały zawieszone do pierwszych lat XXI wieku. W tym czasie kilka ośrodków

naukowych (między innymi i zespół profesora Dzido) wznowiło eksperymenty

z wykorzystaniem techniki łączącej chromatografię planarną i elektroforezę, dla której


12

przyjęto nazwę: elektrochromatografia planarna, PEC. Wstępne eksperymenty

przeprowadzono przy wykorzystaniu urządzeń złożonych z komory poziomej DS do

chromatografii cienkowarstwowej, specjalnie przystosowanej do tego celu, oraz zasilacza

wysokonapięciowego [H-3]. Zaproponowałam, aby do badań oprócz barwników wybrano

również mieszaninę racemiczną DL-fenyloalaniny i chiralną fazę stacjonarną typu CLEC.

W wyniku przeprowadzonych eksperymentów uzyskano bardzo dobre rozdzielenie

enancjomerów, zaś czas trwania procesu separacji był znacznie krótszy w porównaniu do

analiz prowadzonych techniką chromatografii planarnej. Pozytywny rezultat i nowa, mało

znana technika zachęciły mnie do badań nad jej zastosowaniem do rozdzielania różnych

izomerów, głównie enancjomerów i diastereoizomerów.

Prowadzenie eksperymentów elektrochromatografii planarnej prowadziłam

w warunkach bardzo zbliżonych do równowagi fizykochemicznej układu, podobnych do

tych uzyskiwanych w kolumnie podczas procesu rozdzielania analitów z zastosowaniem

wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) [Dzido, Płocharz, Ślązak, 2006].

Początkowe doświadczenia realizowałam przy wykorzystaniu dwóch zestawów urządzeń

- jednego do zwilżania warstwy adsorbentu (ustalania równowagi pomiędzy fazami

stacjonarną i roztworem eluentu) i drugiego, w którym rozwijałam elektrochromatogramy

[H-5]. Zastosowanie folii teflonowej dociskanej do warstwy adsorbentu za pomocą

specjalnej przykrywy pozwoliło na ograniczenie problemu odparowania fazy ruchomej

i bardziej stabilne prowadzenie procesu rozdzielania. Ta wersja techniki otrzymała nazwę

- elektrochromatografia planarna ciśnieniowa (Pressurized Planar Electrochroma-

tography, PPEC) [Nurok i wsp., 2004]. Trwające w zespole prof. Dzido prace nad

polepszeniem warunków prowadzenia eksperymentów PPEC doprowadziły do

zaprojektowania i wykonania nowej komory do elektrochromatografii planarnej

pozwalającej na przeprowadzenie procesu zwilżania warstwy adsorbentu i rozwijania

elektrochromatogramu w jednym urządzeniu [H-7]. Większość prac związanych z moim

osiągnięciem naukowym dotyczy eksperymentów przeprowadzonych z wykorzystaniem

takiej komory do PPEC .


13

3.c.3. Wyniki

3.c.3.1.Badanie wpływu parametrów, bezpośrednio związanych z fazami ruchomą

i stacjonarną, na retencję lub migrację badanych izomerów

3.c.3.1.a. Skład ilościowy i jakościowy fazy ruchomej:

3.c.3.1a.1.Stężenie i rodzaj modyfikatora organicznego

W układach chromatografii cieczowej do podstawowych parametrów wpływających na

oddziaływania analitu z fazami stacjonarną i eluentem należy skład ilościowy

i jakościowy fazy ruchomej. Równanie Soczewińskiego – Wachtmeistera (równ. 1.)

przedstawia zależność współczynnika retencji substancji, k, od zawartości procentowej

modyfikatora organicznego fazy ruchomej, φ, dla chromatografii cieczowej prowadzonej

w układzie faz odwróconych:

log k = log kw – S φmod (równ. 1.) [Soczewiński, Wachtmeister, 1962;

Snyder, Dolan, Gant, 1979]

gdzie S – stała, kw –współczynnik retencji substancji, gdy fazą ruchomą jest woda.

Natomiast podczas rozdzielania substancji w układach PPEC, prędkość przepływu fazy

ruchomej, νeof, odbywa się dzięki efektowi elektroosmotycznemu, który, jak już

wspominałam w części wstępnej, wywoływany jest przez przyłożone pole elektryczne, E.

Oprócz niego pozostałymi czynnikami wpływającymi na νeof są, zgodnie z równaniem

Smoluchowskiego (równ. 2.): stała dielektryczna (względna przenikalność elektryczna)

roztworu, εr, potencjał elektrokinetyczny (potencjał zeta (dzeta)), ζ, oraz lepkość

roztworu, η.

(równ. 2.) [Smoluchowski, 1903, Marina i wsp.,2005]

ε0 jest przenikalnością elektryczną próżni.

Zwiększenie zawartości składnika organicznego w eluencie na ogół zmniejsza

udział oddziaływań międzycząsteczkowych pomiędzy rozdzielaną substancją a fazą

stacjonarną i w konsekwencji powoduje zmniejszenie współczynnika retencji substancji

w układzie faz odwróconych HPLC, zwiększenie współczynnika opóźnienia


14

w chromatografii planarnej oraz dystansu migracji w elektrochromatografii planarnej

ciśnieniowej. W przypadku PPEC migracja substancji jest wypadkową efektów

chromatograficznych (podział analitu pomiędzy fazy stacjonarną i eluent)

i elektroforetycznych (ruchliwość elektroforetyczna substancji). Ma na nią również

wpływ prędkość przemieszczania się fazy ruchomej (przepływ elektroosmotyczny). Ten

parametr zależy, zgodnie z równaniem Smoluchowskiego, od stosunku stałej

dielektrycznej do lepkości fazy ruchomej [Smoluchowski, 1903]. Zwiększenie jego

wartości przyczynia się do wzmożenia przepływu elektroosmotycznego, co prowadzi do

wzrostu dystansu migracji badanych związków.

Dobór optymalnych warunków procesu rozdzielania izomerów, niezależnie od

stosowanej techniki rozdzielczej i wybranej fazy stacjonarnej, zwykle rozpoczynałam od

zbadania zależności retencja izomerów w funkcji zawartości organicznego

rozpuszczalnika w fazie ruchomej. W układach faz odwróconych zaobserwowałam,

że wzrost jego zawartości powodował zmniejszenie retencji badanych izomerów,

co prowadziło do zwiększenia wartości ich współczynnika opóźnienia, Rf, (w przypadku

chromatografii planarnej), i dystansu migracji (w przypadku elektrochromatografii

planarnej), a także do zwiększenia współczynnika rozdzielenia, α (TLC), enancjomerów

bądź też odległości pomiędzy strefami pary DL- i LL- diasteroizomerycznych

pochodnych aminokwasu [H-8, H-11], czy aminoalkoholu [H-12] (PPEC).

Niestety, zastosowanie zbyt dużego stężenia rozpuszczalników organicznych (80%)

w wodno-organicznej fazie ruchomej układów TLC prowadziło do słabej retencji

badanych substancji, a w konsekwencji powodowało znaczne zmniejszenie ich

rozdzielenia. W układach techniki PPEC nie obserwowałam tego efektu głównie

z powodu bardziej złożonego mechanizmu separacji (podział i elektroforeza).

W eksperymentach prowadzonych z udziałem trójskładnikowej fazy ruchomej

w procesie różnicowania enancjomerów zauważyłam, że istotnym czynnikiem był

stosunek stężenia poszczególnych składników organicznych. Podczas rozdzielania

optycznych antypodów w układach z chiralną fazą stacjonarną, typu chiralnej wymiany

ligandów, wykorzystywałam eluent zawierający w swym składzie acetonitryl, metanol

(razem 80% v/v fazy ruchomej) i roztwór buforowy. Zauważyłam, że proporcje pomiędzy

dwoma pierwszymi składnikami fazy ruchomej wpływają na retencję i rozdzielenie par

enancjomerów w układach zarówno TLC jak i PPEC [H-5, H-7].


15

Zwiększanie zawartości metanolu od 0 do 15-20% v/v, w stosunku do drugiego

składnika organicznego eluentu, prowadziło do polepszenia rozdzielenia par

enancjomerów aminokwasów w obu technikach. Niestety, ten efekt, w przypadku

zastosowania układu TLC, przyczynia się do spadku rozdzielenia związków o podobnej

budowie (jak np. D-tyrozyny i L-fenyloalaniny). Zmiana techniki separacyjnej z TLC na

PPEC i zastosowanie zwiększonej zawartości metanolu nie zakłócało rozdzielenia

powyżej omawianych związków. Jednakże pewną niedogodnością obserwowaną w tej

metodzie jest spadek różnicowania enancjomerów 3,4-dihydroksyfenyloalaniny (DOPA)

w eluencie zawierającym 20% metanolu [H-7]. Dalsze zwiększanie zawartości metanolu

w fazie ruchomej, do 50%, prowadzi do skrócenia dystansów migracji enancjomerów

tryptofanu i waliny przy zachowaniu jednakże ich dobrego rozdzielenia [H-5].

Wykorzystując technikę ciśnieniowej elektrochromatografii planarnej do

różnicowania pasm enancjomerów 5-(dimetyloamino)-naftaleno-1-sulfonylowych (DNS-)

pochodnych aminokwasów w układach zawierających chiralny selektor i niepolarną fazę

stacjonarną (RP-18) zaobserwowałam, że zmiana rodzaju organicznego składnika fazy

ruchomej modyfikuje zarówno ich dystanse migracji jak i rozsunięcie pasm pomiędzy

poszczególnymi enancjomerami [H-9]. Zastąpienie acetonitrylu metanolem powoduje

zmniejszenie wartości stosunku stałej dielektrycznej do lepkości, co zmniejsza wielkość

przepływu elektroosmotycznego [Hałka-Grysińska i wsp. 2014]. Efektem tego działania

była nie tylko zmiana uzyskanych dystansów migracji substancji, ale też inna ich

kolejność migracji oraz zwiększenie enancjoróżnicowania dla niektórych badanych par.

Zgodnie z danymi literaturowymi efekt ten może być powiązany z wpływem

modyfikatora organicznego na stałe tworzenia kompleksu DNS-aminokwas –

cyklodekstryna [Ward, Armstrong, 1986; Valko, Siren, Riekkola, 1996].

3.c.1.a.2. pH, stężenie i rodzaj buforu fazy ruchomej

pH roztworu fazy ruchomej wpływa istotnie na właściwości elementów układu

chromatograficznego takich jak analit, faza stacjonarna i roztwór fazy ruchomej. pH

modyfikuje właściwości substancji ulegających jonizacji, np. słabych kwasów, czy zasad.

Substancje hydrofilowe (formy zjonizowane) mające duże powinowactwo do wodno-

organicznej fazy ruchomej, po przekroczeniu pewnych wartości pH stają się hydrofobowe

(formy niezjonizowane), a ich powinowactwo do wodno-organicznego eluentu wyraźnie


16

spada. Rosną natomiast ich oddziaływania międzycząsteczkowe z niepolarną fazą

stacjonarną, czego efektem jest zwiększenie retencji.

pH wpływa na jonizację grup silanolowych znajdujących się na powierzchni żelu

krzemionkowego niemodyfikowanego i modyfikowanego chemicznie (adsorbenty typu

RP-8, RP-18) (szczególnie jest to ważne w przypadku TLC). Prowadzi to do udziału

w mechanizmie rozdzielania dodatkowych oddziaływań, np. typu wymiany jonowej,

które zmieniają retencję analitu [van den Driest, Ritchie, 1987].

Wspomniana powyżej jonizacja grup silanolowych żelu krzemionkowego wpływa

również na wartość potencjału elektrokinetycznego (zeta) układu faz ciało stałe - roztwór.

Zaś potencjał dzeta, zgodnie z równaniem Smoluchowskiego (równ. 2.), określa przepływ

elektroosmotyczny eluentu w układach technik elektromigracyjnych (PPEC, CEC).

Zaobserwowano, że wzrost pH buforu fazy ruchomej przyspiesza migrację

elektroosmotyczną eluentu [Dzido, Płocharz, Ślązak, 2006]. Równocześnie należy dodać,

że w technikach elektromigracyjnych jony przemieszczają się w polu elektrycznym przy

współudziale przepływu elektroosmotycznego. Cząsteczki substancji nie wykazują efektu

elektroforetycznego, więc ich migracja w układzie PPEC zależy od prędkości przepływu

elektroosmotycznego i od podziału substancji pomiędzy fazami ruchomą i stacjonarną.

Większość moich prac, należących do cyklu habilitacyjnego, dotyczy

aminokwasów bądź ich pochodnych [H-4, H-5, H-7, H-8, H-9, H-11]. Wiadomo, że

związki te posiadają przynajmniej dwie grupy funkcyjne (aminową i karboksylową),

które są odpowiedzialne za generowanie jonów. Z tego względu każdy aminokwas jest

charakteryzowany przez określoną wartość pH jego roztworu, przy którym sumaryczny

ładunek wszystkich jonów (grup funkcyjnych zjonizowanych) dodatnich i ujemnych tego

aminokwasu jest równy zero. Takie pH odpowiada punktowi izoelektrycznemu (pI)

danego związku. W roztworach o pH mniejszym od pI przeważa forma kationowa

aminokwasu (postać hydrofilowa). Natomiast w roztworach o pH większym pI przeważa

postać hydrofilowych anionów. Zaś w buforze o pH równym pI związki te praktycznie

występują w postaci jonu obojnaczego (zwitterjonu), co powoduje zmniejszenie ich

hydrofilowego charakteru. W związku z tym pH jest istotnym czynnikiem wpływającym

na retencję, migrację i enancjoróżnicowanie zarówno aminokwasów jak i ich

pochodnych, rozdzielanych techniką TLC jak i PPEC.


17

Natomiast związki opisane w pracach H-12 i H-6 mają w swej strukturze

cząsteczkowej tylko jedną grupę zdolną do jonizacji – aminową (pochodne aminoalkoholi

[H-12]) lub karboksylową (kwas migdałowy [H-6]. Zatem pH zmienia ich właściwości

i z tego powodu wpływa na retencję, migrację i różnicowanie enancjomerów lub

diastereoizomerów.

W przypadku zastosowania mechanizmu rozdzielania opartego na chiralnej

wymianie ligandów (CLEC) separacja izomerów opiera się na równowadze tworzenia

przejściowych kompleksów pomiędzy rozdzielanym analitem a kompleksem kationu

miedzi(II) z chiralnym selektorem związanym z fazą stacjonarną. Powstawaniu tych

kompleksów sprzyja obecność selektanta (aminokwasu) w formie jonowej. Efekt

tworzenia takich kompleksów wykorzystałam do badania wpływu pH buforu fazy

ruchomej na retencję i selektywność separacji mieszanin racemicznych 11 aminokwasów

rozdzielanych techniką TLC w układach z chiralną fazą stacjonarną typu CLEC [H-4].

Najmniejsze wartości współczynnika opóźnienia, Rf, zaobserwowałam dla wartości pH

buforu eluentu zbliżonej do punktu izoelektrycznego badanych związków. Retencja

enancjomerów aminokwasów przy pH buforu fazy ruchomej poniżej i powyżej pI jest

znacznie niższa. Zaś najmniejsze enancjoróżnicowanie pomiędzy niektórymi optycznymi

antypodami zaobserwowałam, gdy pH buforu fazy ruchomej jest równe lub zbliżone do

pI aminokwasu (pH pomiędzy 5,0 - 5,5). Zwiększoną retencję i polepszenie

enancjoróżnicowania badanych aminokwasów uzyskałam przy zastosowaniu eluentów

w zakresach pH 3 - 4 i 6 - 7.

Również w przypadku zastosowania techniki PPEC i tego samego sposobu

różnicowania enancjomerów, zmiany pH buforu fazy ruchomej wpływały znacząco na

modyfikację migracji pasm enancjomerów waliny i tryptofanu [H-5]. Najdłuższe

dystanse migracji zaobserwowałam przy pH buforu 6,0 (wartość ta jest zbliżona do pI

badanych aminokwasów, odpowiednio 5,89 dla tryptofanu i 6,00 dla waliny). Jest to

związane z ograniczoną ruchliwością elektroforetyczną izomerów w tych warunkach,

oraz ze zwiększeniem przepływu elektroosmotycznego, spowodowanym wzrostem pH

[Dzido, Płocharz, Ślązak, 2006]. Jednakże dalszy wzrost pH buforu wywołuje

powstawanie przewagi formy anionowej nad kationową aminokwasów, a to sprzyja

migracji w kierunku przeciwnym do przepływu elektroosmotycznego. Efektem tego jest

zmniejszenie dystansów migracji obu aminokwasów.


18

W przypadku badania wpływu pH buforu fazy ruchomej na retencję (w układach

TLC) i dystans migracji (w układach PPEC) enancjomerów aminokwasów o podobnej

budowie chemicznej (fenyloalaniny, tyrozyny, DOPA) z wykorzystaniem mechanizmu

CLEC [H-7] zaobserwowałam, że pH istotnie wpływa na te parametry. Najmniejszy

dystans migracji badanych aminokwasów obserwowałam przy pH buforu zbliżonym do

ich pI (5,2 -5,7). Efekt ten jest spowodowany utworzeniem ładunku obojętnego (jon

obojnaczy) przez jony badanych związków. W tych warunkach strefy substancji migrują

tylko dzięki przepływowi elektroosmotycznemu. Ponadto rozmiar cząsteczek badanych

analitów i obecność dodatkowych grup (Tyr czy DOPA) powodują silniejsze

oddziaływania z fazą stacjonarną. pH buforu fazy ruchomej wpływa również na kolejność

migracji badanych substancji. Zaś jego zmiany mogą prowadzić do zmniejszania się lub

nawet braku enancjoróżnicowania (obserwowałam to w przypadku DOPA).

Podczas badań enancjomerów fenyloalaniny, tyrozyny i DOPA techniką TLC

zauważyłam, że pH buforu fazy ruchomej również wpływa na ich retencję. Podobnie jak

dystans migracji substancji w przypadku układu PPEC, tak również współczynnik

opóźnienia przyjmuje najmniejsze wartości w układzie TLC z buforem o pH zbliżonym

do pI badanych aminokwasów. Na kolejność retencji związków wpływa ich lipofilowość.

Również kolejność retencji substancji była inna w układach obu stosowanych technik.

Odmienna kolejność retencji w układzie PPEC w stosunku do TLC jest związana

z udziałem efektu elektroforetycznego w mechanizmie rozdzielania w pierwszym

układzie.

Wpływ pH buforu fazy ruchomej na retencję i migrację DNS-pochodnych

aminokwasów (DNS-Val, DNS-Phe, DNS-Ala, DNS-Leu) obserwowałam również

w przypadku zastosowania dodatku chiralnego do fazy ruchomej w układach obu technik

(TLC i PPEC) [H-9]. Zmiana charakteru chemicznego cząsteczek z hydrofilowego

(zjonizowana cząsteczka) na hydrofobowy (jon obojnaczy) modyfikuje ich oddziaływania

z hydrofobowymi wnękami cyklodekstryn. Z tego też względu największą retencję

większości badanych substancji w układach techniki TLC obserwowałam dla pH buforu

równego ich pI. Ta wartość pH również sprzyjała enancjoróżnicowaniu DNS-pochodnych

aminokwasów.

Nieco odmiennie zachowanie badanych DNS-aminokwasów obserwowałam

w układach PPEC. Najdłuższe dystanse migracje tych związków są uzyskiwane dla


19

buforu o pH niższym od ich pI. Wówczas substancje badane występowały w formie

kationowej i efekt elektroforetyczny powodował ich zwiększoną migracje. Niestety,

z uwagi na hydrofobowy charakter oddziaływań odpowiedzialnych za różnicowanie

enancjomerów, niskie pH nie przyczyniało się do polepszenia enancjoróżnicowania.

Dużo większe rozsunięcie pasm poszczególnych par enancjomerów obserwowałam przy

pH buforu zbliżonym/równym pI badanych związków (pH ≈ 4,0). Efekt ten był podobny

w układach obu technik.

pH buforu fazy ruchomej wpływało również na retencję i różnicowanie

enancjomerów kwasu migdałowego rozdzielanych przy wykorzystaniu wysokosprawnej

chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych z chiralną fazą stacjonarną typu

Pirkle’a (Whelk-01) [H-6]. Zastosowany przeze mnie zakres pH eluentu obejmował

wartości od pKA kwasu - 1,5 do pKA kwasu + 1,5. Największą retencję enancjomerów

obserwowałam, gdy pH eluentu było niższe od pKA kwasu migdałowego (pKA = 3,41).

Efekt ten świadczy o lepszym przestrzennym dopasowaniu się niezjonizowanej

cząsteczki kwasu do chiralnego selektora. Dodatkową korzyścią ze stosowania niskiego

pH buforu były największe wartości współczynnika rozdzielenia enancjomerów, .

Również wyniki eksperymentów związanych z rozdzielaniem sześciu

diasteromerycznych par pochodnych aminokwasów (waliny, izoleucyny, asparaginy,

leucyny, cysteiny i tryptofanu) i amidu 2,4-dinitrofenylo-5-L waliny (FVDA), które

prowadziłam dwoma technikami TLC i PPEC, potwierdziły wpływ zastosowanego pH

buforu fazy ruchomej na ich retencję, dystans migracji jak i rozdzielenie pasm [H-8].

W przypadku zastosowania techniki TLC zauważyłam, że retencja badanych

analitów zmienia się wraz ze wzrostem pH buforu eluentu. Najsilniejszą retencję

zaobserwowałam dla pH buforu wynoszącego 3,2. To pH jest w przybliżeniu równe pKA

grupy kwasowej badanych pochodnych, co wpływa na jej zmniejszoną jonizację.

Zaś duża retencja jest spowodowana silnymi oddziaływaniami hydrofobowymi pomiędzy

FVDA-pochodnymi aminokwasów a fazą stacjonarną. Niestety silna retencja nie

sprzyjała różnicowaniu par diastereoizomerów i dla większości spośród rozdzielnych LL-

i DL-izomerów (cztery spośród sześciu badanych par) obserwowałam wyraźne

zmniejszenie odległości pomiędzy ich pasmami/plamkami. pH buforu poniżej i powyżej

3,2 sprzyja oddziaływaniom analit - faza ruchoma, zmniejsza retencję i w nieznacznym

stopniu wpływa na rozdzielenie pasm par diastereomerów w układzie TLC. Kolejność


20

retencji badanych pochodnych zależy od ich lipofilowości i jest zgodna ze spadkiem

wartości ich współczynników podziału, D.

Zmiana stosowanej techniki z TLC na PPEC spowodowała, że wpływ pH buforu

fazy ruchomej na migrację FVDA-pochodnych aminokwasów był bardziej zauważalny.

Zwiększanie pH buforu eluentu zmienia typ jonizacji FVDA-pochodnych, zwiększa

udział frakcji anionów i w efekcie powoduje spadek ich dystansów migracji w kierunku

ujemnie naładowanej elektrody (katody). W przypadku większości badanych substancji

(FVDA-Cys, FVDA-Leu, FVDA-Ile, FVDA-Val) efekt ten był tak silny, że w celu

przeprowadzenia udanego eksperymentu konieczna była zmiana polaryzacji płytki

chromatograficznej. Zwiększenie udziału frakcji anionowej substancji w procesie

rozdzielania pod wpływem pH powoduje, w przypadku techniki PPEC, zmniejszenie lub

wręcz zanik rozdzielenia pasm diasteromerycznych par. Odstępstwo od tego efektu

wykazuje para FVDA-LL-Asn i FVDA-DL-Asn, której rozdzielenie nieznacznie zależy

od pH.

Warto podkreślić, że kolejność migracji pasm diastereomerów uzyskana

w układach PPEC znacznie różni się od tej osiągniętej w analogicznych układach TLC.

Właściwość ta jest charakterystyczna i wielokrotnie obserwowana dla różnych typów

związków badanych przy zastosowaniu tej pierwszej techniki [Pukl, Prosek, Kaiser,

1994; Hałka i wsp., 2010; Kopciał i wsp., 2012; Kopciał i wsp., 2013].

Zbadałam również wpływ zmian pH buforu fazy ruchomej na retencję i migrację

diastereoizomerycznych FVDA-pochodnych aminoalkoholi (acebutololu, atenololu,

metoprololu, oksprenololu i pindololu) [H-12]. Związki te są aminami trzeciorzędowymi

i ulegają dysocjacji kationowej lub mogą pozostawać w formie obojętnej w zależności od

stosowanego pH buforu fazy ruchomej.

W przypadku zastosowania techniki TLC pH buforu eluentu w badanym zakresie

(3,0 – 7,0) w nieznaczny sposób wpływa na zmiany retencji FVDA-pochodnych. Można

jednak zauważyć małą selektywność tego układu dla izomerów o słabszej retencji

w porównaniu do ich odpowiedników charakteryzujących się silniejszymi

oddziaływaniami z niepolarną fazą stacjonarną. Dla większości badanych pochodnych

kolejność retencji jest uwarunkowana ich lipofilowością (log P).

W przypadku zastosowania techniki PPEC do badania FVDA-pochodnych

aminoalkoholi zmiana pH buforu fazy ruchomej znacząco modyfikuje migrację pasm obu


21

grup izomerów (o słabszej jak i silniejszej retencji). Zauważyłam również znacznie

większą selektywność układu rozdzielczego i zmiany kolejności migracji poszczególnych

związków w porównaniu do układów TLC. Wszystkie te efekty spowodowane są

wcześniej wspominanym udziałem elektroforezy w mechanizmie migracji substancji

w układach PPEC w porównaniu do układów chromatografii cieczowej (TLC).

Dodatkowym czynnikiem sprzyjającym migracji pasm FVDA-pochodnych jest opisany

wcześniej wzrost przepływu elektroosmotycznego (ruchliwość elektroosmotyczna

eluentu) pod wpływem zwiększania pH.

Kolejnym badanym przeze mnie parametrem, wpływającym na retencję i migrację

izomerów w obu technikach, było stężenie buforu w eluencie. Czynnik ten jest

szczególnie istotny w przypadku zastosowania technik elektromigracyjnych (np. PPEC)

z uwagi na grubość podwójnej warstwy elektrycznej i prędkość przepływu

elektroosmotycznego [Crego, Martinez, Marina, 2000; Nurok, Koers, Carmichael, 2003;

Dzido, Płocharz, Ślązak, 2006; Novotny i wsp., 2006; Dzido, Płocharz, 2007]. Wysokie

stężenie buforu w fazie ruchomej powoduje zmniejszenie grubości podwójnej warstwy

elektrycznej [Jouyban i wsp., 2003] i jednocześnie generuje znaczne ilości ciepła Joule’a

podczas eksperymentu.

Już w jednej z pierwszych prac cyklu, poświęconej rozdzielaniu enancjomerów

tryptofanu i waliny techniką PPEC [H-5] w układach z chiralną fazą stacjonarną,

zauważyłam, że zmiana stężenia buforu w fazie ruchomej wpływa istotnie na ich dystans

migracji. Podobne efekty przedstawiłam w kolejnej pracy [H-7], również związanej

z rozdzielaniem enancjomerów tyrozyny, fenyloalaniny i DOPA w układzie z fazą

stacjonarną typu CLEC.

Wzrost zawartości buforu w eluencie do pewnych wartości (2 mM, [H-5] i (7,5

mM [H-7]) sprzyjał migracji pasm badanych enancjomerów aminokwasów. Niestety,

dalsze zwiększanie stężenia buforu powodowało skracanie dystansów migracji

aminokwasów.

Co ciekawe, nie obserwowałam jednak wpływu zmian stężenia buforu na

enancjoróżnicowanie.

Prowadzone równolegle eksperymenty techniką TLC wykazały brak wpływu zmian

stężenia buforu w eluencie na retencję i enancjoselektywność enancjomerów

fenyloalaniny, tyrozyny i DOPA [H-7].


22

Intrygowało mnie, czy oprócz pH i stężenia buforu również jego rodzaj ma wpływ

na retencję (TLC) i dystanse migracji (PPEC) rozdzielanych izomerów. Temu

zagadnieniu poświęciłam dwie prace z cyklu habilitacyjnego. Były one związane

z rozdzielaniem diasteromerycznych FVDA-pochodnych aminokwasów w układach faz

odwróconych chromatografii planarnej i elektrochromatografii planarnej ciśnieniowej

[H-8, H-11].

W pierwszej z prac przedstawiłam wpływ kilku różnych buforów: fosforanowego

i wybranych buforów kwasów karboksylowych (chlorooctowego, malonowego

i cytrynowego). Natomiast późniejsza stanowi niejako jej rozwinięcie i próbę pewnego

usystematyzowania na przykładzie grupy buforów kwasów dikarboksylowych. Bufory

stosowane w badaniach zostały podzielone na dwie grupy. Pierwszą stanowiły bufory

zawierające homologi dikarboksylowych kwasów (szczawiowy, malonowy, bursztynowy,

pimelinowy) i bufor mrówczanowy, drugą zaś różne kwasy dikarboksylowe

o czterowęglowym łańcuchu cząsteczki, (bursztynowy, jabłkowy, maleinowy, L-winowy,

D-winowy). W obu pracach pH buforu fazy ruchomej mieściło się w zakresie pKA1 kwasu -

1,0 ≤ pH ≤ pKA1 kwasu + 1,0 oraz pKA2 kwasu - 1,0 ≤ pH ≤ pKA2 kwasu + 1,0.

W eksperymentach prowadzonych techniką TLC zaobserwowałam brak istotnych

zmian zarówno retencji jak i różnicowania par diasteroizomerów FVDA-pochodnych

asparaginy, cysteiny, izoleucyny, leucyny, tryptofanu i waliny pod wpływem

zastosowanego buforu [H-8]. Zmiana techniki rozdzielczej na PPEC powodowała

znaczne zmiany migracji jak i rozdzielenia pasm diasteroizomerów. Obecność niektórych

buforów w fazie ruchomej np. kwasu malonowego prowadziła do wyraźnego skrócenia

dystansu migracji i nawet do powstania jednego wspólnego pasma pary diasteroizomerów

[H-8]. Efekt ten zrodził pytanie, czy zastosowanie różnych kwasów dikarboksylowych,

jako składników buforów, będzie w jednakowy sposób działać na migrację pasm

substancji w układach PPEC i czy w jakikolwiek sposób zmieni retencję w analogicznych

układach TLC? Stąd też zaczerpnęłam koncepcję następnych badań - porównanie wpływu

dwóch typów buforów, zawierających dikarboksylowe kwasy, na retencję i migrację

diastereomerycznych FVDA-pochodnych kwasu asparaginowego, cysteiny i histydyny

w układach obu opisywanych przeze mnie technik [H-11]. Jako składniki pierwszego

typu buforu wybrałam homologi kwasu szczawiowego i ich sole sodowe oraz jako

odnośnik bufor mrówczanowy (jednokarboksylowy). Zaś drugi utworzyłam z grupy


23

różnych czterowęglowych kwasów o dwóch grupach karboksylowych. W obu

przypadkach skład ilościowy eluentu tak dostosowałam, że jedynym czynnikiem

wpływającym na zachowanie się analitów podczas procesu rozdzielania był typ

zastosowanego buforu (suma stężeń molowych, kationowego i anionowego komponentu

buforu wynosiła 10,45 mM; pH buforu 4,2; 60% v/v acetonitrylu). Podczas prowadzenia

eksperymentów TLC zauważyłam wpływ rodzaju buforu z pierwszej grupy (typu)

zarówno na retencję jak i różnicowanie pasm par diastereoizomerów. Najmniejsze

wartości współczynnika opóźnienia dla większości badanych pochodnych obserwowałam

w układach zawierających bufor mrówczanowy. Natomiast najmniejszą retencją

substancji badanych charakteryzują się układy zawierające bufor malonowy. Pewnym

odstępstwem od wyżej opisanego zachowania był brak wpływu rodzaju buforowego

składnika fazy ruchomej na zmianę retencji LL-diastereomerycznej pochodnej kwasu

asparaginowego.

Typ zastosowanego buforu zmieniał też selektywność rozdzielenia pary

diastereoizomerów. I tak, najmniejsze rozdzielenie pasm diastereoizomerów

obserwowałam w przypadku zastosowania buforu mrówczanowego lub malonowego, zaś

największe, gdy eluent zawierał bufor pimelinowy lub bursztynowy. Nieznaczne różnice

retencji badanych pochodnych w układach techniki TLC były obserwowane dla buforów

zawierających L- lub D-enancjomer kwasu winowego.

Również w przypadku zastosowania różnych czterowęglowych dikarboksylowych

kwasów i ich soli sodowych, jako składników buforów, obserwowałam wpływ

zastosowanego buforu na retencję i różnicowanie pasm diastereoizomerów badanych

techniką TLC. Dla większości z pochodnych najsilniejszą retencję zaobserwowałam dla

układów z buforem maleinianowym (wiązanie podwójne w cząsteczce), natomiast

najsłabszą z buforem winianowym (w cząsteczce dodatkowe grupy hydroksylowe).

Zauważyłam również, iż rodzaj zastosowanego buforu wpływał na zmiany odległości

pomiędzy pasmami pary diastereoizomerów. Największą selektywność rozdzielenia

odnotowałam dla eluentu zawierającego bufor bursztynianowy, najmniejszą zaś dla fazy

ruchomej z buforem kwasu L-lub D-winowego. W przypadku obu typów buforów,

i techniki TLC, kolejność FVDA-pochodnych zmieniała się w niewielkim stopniu.

W badaniach prowadzonych z wykorzystaniem techniki PPEC i buforów

pierwszego typu najdłuższe dystanse migracji pasm badanych pochodnych uzyskałam


24

w układach z fazą ruchomą zawierająca bufor malonianowy, bursztynianowy lub

pimelinianowy. Natomiast najkrótsze dystanse migracji zaobserwowałam, gdy w eluencie

obecny był bufor mrówczanowy lub szczawianowy. Te ostatnie eluenty w układzie

z stosowaną fazą stacjonarną charakteryzują się bardziej ujemnymi wartościami

potencjału zeta granicy faz stacjonarna - ruchoma w porównaniu z wcześniej

wymienionymi [H-11].

Jak już wielokrotnie podkreślałam rodzaj zastosowanej techniki wpływa na

kolejność migracji poszczególnych FVDA-pochodnych enancjomerów aminokwasów.

W układach obu technik obserwowałam znaczne pogorszenie rozdzielenia pasm

pochodnych w obecności eluentu zawierającego bufor mrówczanowy lub malonowy.

Również eluenty zawierające drugą grupę buforów zmieniają dystanse migracji

FVDA-pochodnych aminokwasów rozdzielanych techniką PPEC. Najkrótsze dystanse

migracji uzyskują anality w układach z eluentem zawierającym bufor kwasu

D-winowego. Znacznie dłuższe dystanse migracji FVDA-pochodnych są wynikiem

zastosowania faz ruchomych mających w swym składzie bufor maleinianowy,

jabłczanowy lub bursztynianowy. Przedstawione powyżej eluenty charakteryzują się

wyższymi (mniej ujemnymi) wartościami potencjału elektrokinetycznego granicy faz

stałej i ciekłej w porównaniu do układów zawierających bufor kwasu winowego (D- lub

L-) [H-11]. Również i w tym przypadku obserwowałam wpływ stosowanej techniki na

zmiany kolejności migracji pasm badanych związków.

Ciekawym efektem jest zwiększenie rozdzielenia pasm par diastereoizomerów

w układach PPEC zawierających bufor kwasu L-winowego w porównaniu do układów

TLC. Występowanie różnego mechanizmu rozdzielenia substancji w układach obu

technik może być przyczyną tego efektu.

3.c.3.1.a.3. Rodzaj chiralnego modyfikatora i jego stężenie

Jednym z możliwych sposobów rozdzielania izomerów optycznych jest zastosowanie

chiralnego dodatku do fazy ruchomej. - lub -cyklodekstryny i ich pochodne

wykorzystałam jako CMPA w obu technikach (TLC i PPEC) do różnicowania DNS-

pochodnych enancjomerów 4 aminokwasów (fenyloalaniny, leucyny, alaniny i waliny)

[H-9], różnych typów izomerów (diastereomerycznych alkaloidów, enancjomerów 1-(1-


25

naftylo)-etanolu czy 1-(2–naftylo)-etanolu, czy enancjomerów binaftylodiaminy) [H-10]

w układach z niepolarną fazą stacjonarną.

Natywna -cyklodekstryna ( -CD), jako chiralny selektor fazy ruchomej, jest

zastosowana w pierwszej z wymienionych prac [H-9]. Zwiększanie zawartości tego

chiralnego modyfikatora w fazie ruchomej w układach chromatograficznych

intensyfikowało oddziaływania analit – chiralna faza ruchoma, co skutkowało

zmniejszaniem retencji badanych pochodnych. Obserwowałam również wzrost,

a następnie spadek enancjoróżnicowania ze wzrostem stężenia tego składnika fazy

ruchomej. Takie zachowanie jest zgodne z danymi literaturowymi [Armstrong, He, Han,

1988]. Niestety z uwagi na właściwości fizykochemiczne -cyklodekstryny (niską

rozpuszczalność w roztworach zawierających rozpuszczalniki organiczne) przygotowane

przeze mnie fazy ruchome zawierały duże stężenie mocznika. Było to przyczyną

zwiększenia lepkości eluentu i znacznego wydłużenia trwania procesu rozdzielania przy

dużej zawartości cyklodekstryn. Kolejność retencji DNS-aminokwasów w układach TLC

była zgodna ze wzrostem ich lipofilowości. D-izomery pochodnych aminokwasów silniej

oddziaływały z fazą stacjonarną w porównaniu do ich L-antypodów.

Natomiast w eksperymentach prowadzonych techniką PPEC zaobserwowałam

efekt odmienny od przedstawionego przy zastosowaniu TLC. Zwiększenie stężenia

-cyklodekstryny w eluencie powodowało spadek dystansu migracji badanych

pochodnych. Należy podkreślić fakt, że eksperymenty prowadzone techniką PPEC,

w odróżnieniu od ich odpowiedników TLC, miały jednakowy czas trwania procesu

rozdzielania (20 min). Podobnie jak we wcześniej wymienionych eksperymentach,

prowadzonych z wykorzystaniem techniki PPEC, również i w tym przypadku, kolejność

migracji badanych pochodnych aminokwasów różniła się znacznie od sekwencji

uzyskanej techniką TLC. Zastosowanie PPEC pozwoliło mi również na wyodrębnienie

z mieszaniny poreakcyjnej czystych pasm enancjomerów. Przyczynił się do tego efekt

migrowania kwasu 5-dimetyloamino-naftalenosulfonowego w kierunku przeciwnym niż

analizowane związki.

W drugiej z wymienionych powyżej prac poświęconych CMPA, z uwagi na

lepszą rozpuszczalność w eluentach wodno-organicznych, zastosowałam - i -

hydroksypropylo-cyklodekstryny ( -HP-CD i -HP-CD) [H-10]. Podobnie jak

w przypadku natywnej -cyklodekstryny, opisanej powyżej, również i dla jej HP-


26

pochodnej, badanych techniką TLC, wzrost stężenia w fazie ruchomej zwiększał retencję

izomerów. Proces ten sprzyjał rozdzieleniu wszystkich izomerów zarówno pozycyjnych

(1-(1-naftylo)- i 1-(2–naftylo)-etanolu), diastereoizomerów (chininy i chinidyny oraz

cynchoniny i cynchonidyny) jak i enancjomerów binaftylodiaminy. Niestety, nie

obserwowałam rozdzielenia enancjomerów zarówno 1-(1-naftylo)- jak i 1-(2—naftylo)-

etanolu. Podobnie jak w poprzednich badaniach kolejność retencji badanych związków

w układach TLC jest związana z ich lipofilowością.

Wzrost zawartości -HP-cyklodekstryny w fazie ruchomej, w przypadku

zastosowania techniki PPEC, na ogół nie wywoływał tożsamych efektów na badane

związki jak w przypadku TLC. Zależały one od struktury i chemicznych właściwości

badanych substancji. Zaobserwowałam, że dystans migracji izomerów 1-(1-naftylo)- i 1-

(2-naftylo)-etanolu, czy enancjomerów binaftylodiaminy, zwiększał się pod wpływem

wzrostu zawartości -HP-CD w eluencie. Natomiast wysokie stężenie tego CMPA

w eluencie powodowało wyraźny spadek retencji diastereoizomerycznych alkaloidów.

W tym przypadku obserwowałam jednakowy efekt w układach obu technik (TLC

i PPEC). Po raz kolejny zauważyłam wpływ zastosowanej techniki na kolejność migracji

stref badanych izomerów. W układach PPEC dodatkowo kolejność ta była zależna od

stężenia cyklodekstryn.

Zaobserwowałam również, że zastąpienie HP- -cyklodekstryny HP- -

cyklodekstryną (cząsteczka o większej średnicy) poprawiało rozdzielenie enancjomerów

binaftylodiaminy i pary chinidyna - cynchonidyna (technika TLC ) oraz pary cynchonina

i cynchonidyna (technika PPEC). W tej ostatniej obecność HP- -CD w eluencie znacznie

polepszała rozdzielenie izomerów 1-(1-naftylo)- i 1-(2-naftylo)-etanolu oraz chininy

i chinidyny. Jednak zwykle układami zapewniającymi lepsze rozdzielenie izomerów,

w przypadku zastosowania obu technik, były te zawierające HP- -cyklodekstrynę jako

CMPA. Modyfikacja stężenia tego składnika w fazie ruchomej przyczyniała się do

polepszenia separacji. Dodatkowo, wydłużenie czasu trwania eksperymentu, a tym

samym dystansu migracji substancji, możliwe tylko w układach PPEC, doprowadziło do

polepszenia rozdzielenia enancjomerów zarówno 1-(1-naftylo)- jak i 1(2-naftylo)-etanolu.


27

3.c.3.1.b. Rodzaj zastosowanej fazy stacjonarnej

W technice PPEC najczęściej wykorzystywaną fazą stacjonarną jest modyfikowany żel

krzemionkowy grupami oktadecylowymi (C18) o gęstości pokrycia umożliwiającej

zastosowanie fazy ruchomej o dużej zawartości wody (płytki oznaczone symbolem

komercyjnym RP-18W). Ten typ fazy stacjonarnej dostępny jest w handlu w dwóch

wersjach. Pierwsza z nich znajduje zastosowanie w konwencjonalnej (TLC), zaś druga

w wysokosprawnej chromatografii planarnej (HPTLC). Porównanie dystansów migracji

substancji otrzymanych techniką PPEC w układach z obu rodzajami adsorbentów

przedstawiono w pracy [Dzido, Płocharz, 2007]. Wyniki tych eksperymentów

potwierdzają większą sprawność układu rozdzielczego zawierającego adsorbent

w wariancie wysokosprawnym.

W badaniach opublikowanych brakowało jednak przedstawienia wpływu różnych

faz stacjonarnych na retencję i migrację stref substancji z wykorzystaniem technik TLC

i PPEC. Postanowiłam uzupełnić tą lukę i wykorzystać różne niepolarne fazy stacjonarne

(RP-2, RP-8 i RP-18) do rozdzielania kilku izomerów w układach zawierających

-hydroksypropylocyklodekstrynę jako chiralny modyfikator fazy ruchomej. Wyniki tych

badań zawarłam w publikacji [H-10].

W przypadku zastosowania techniki TLC kolejność spadku współczynnika

opóźnienia analitów w układach z różnymi fazami stacjonarnymi była następująca:

RP-2 > RP-18 > RP-8. Efekt ten był powiązany z zawartością grup metylenowych na

powierzchni adsorbentu. W pierwszej i drugiej, spośród badanych faz stacjonarnych, jest

ona zbliżona, natomiast w przypadku ostatniej jest największa [Schulz, Minarik, 2008].

Właściwość ta powodowała powstawanie najsilniejszych oddziaływań dyspersyjnych

pomiędzy sorbentem a analitem. Z uwagi na ich intensywność obserwowałam znaczne

obniżenie właściwości separacyjnych układu zawierającego fazę RP-8 w porównaniu

z pozostałymi fazami stacjonarnymi. Efekt ten może sugerować uczestnictwo

oddziaływań analit - wolne grupy silanolowe jako uzupełniających mechanizm

różnicowania. Porównując dwie fazy stacjonarne (RP-2 i RP-18) zastosowane w technice

TLC zauważyłam wpływ sorbentu na kolejności retencji analitów i rozdzielenie

enancjomerów (brak różnicowania optycznych antypodów binaftylodiaminy w przypadku

zastosowania pierwszej z faz). Z uwagi na te okoliczności lepszą fazą stacjonarną do

rozdzielania tych związków wydaje się być RP-18.


28

W przypadku przeprowadzenia badań techniką PPEC najmniejsze dystanse

migracji izomerów, podobnie jak w TLC, uzyskiwałam dla sorbentu RP-8. Natomiast

porównywalne odległości migracji analitów obserwowałam zarówno dla fazy RP-2 jak

i RP-18. Również selektywności obu wymienionych sorbentów były zbliżone. Godnym

podkreślenia jest wpływ rodzaju zastosowanej fazy stacjonarnej na kolejność migracji

enancjomerów binaftylodiaminy. W przypadku rozdzielania enancjomerów

z wykorzystaniem adsorbentu RP-2 zaobserwowałam, że L-enancjomer wykazywał

silniejsze oddziaływania z fazą stacjonarną w porównaniu do jego D-odpowiednika.

Natomiast, gdy zastosowałam fazę RP-18, kolejność ich migracji była odwrotna.

Dwie chiralne fazy stacjonarne typu Pirkle’a, a mianowicie DNBPG i DNBL,

wykorzystałam do zbadania retencji różnych enancjomerów (pochodnych aminokwasów

i aminoalkoholi). Badania te prowadziłam w normalnym układzie faz wysokosprawnej

chromatografii cieczowej [H-1]. Jako polarny modyfikator fazy ruchomej zastosowałam

2-propanol, 1-propanol lub etanol. Uzyskane wyniki pozwoliły mi na określenie korelacji

retencji substancji pomiędzy układami z obydwoma fazami stacjonarnymi jak i różnymi

eluentami. Zarówno budowa chemiczna badanych substancji jak również i chiralnego

selektora miała wpływ na enancjoróżnicowanie. Lepszą selektywność dla pochodnych

aminokwasów uzyskałam w układzie z CSP tylko o jednym pierścieniu aromatycznym

(DNBL) w porównaniu do układu z dwoma pierścieniami aromatycznymi (DNBPG).

Natomiast dla pochodnych aminoalkoholi o bardziej złożonej budowie zależności te były

odwrotne. Świadczy to o zróżnicowanym mechanizmie enancjoróżnicowania w układach

z obu fazami stacjonarnymi. Również zastosowany polarny modyfikator miał wpływ na

selektywność. Efekty otrzymane podczas eksperymentów zostały potwierdzone

równaniami korelacyjnymi. Dodatkowo możliwość określenia retencji enancjomerów

poprzez zastosowanie wyżej wspomnianych współzależności dla różnych CSP

wypróbowałam również wykorzystując dane literaturowe.

3.c.3.2. Badanie wpływu temperatury na rozdzielanie izomerów technikami

chromatografii cieczowej i elektrochromatografii planarnej ciśnieniowej

Temperatura układu separacyjnego była kolejnym badanym przeze mnie parametrem

wpływającym na retencję i migrację rozdzielanych substancji. Modyfikacja tej zmiennej,

w przypadku techniki chromatografii cieczowej, wpływa zarówno na lepkość eluentu jak


29

i napięcie międzyfazowe granicy faz [Snyder, Kirkland, Glajch, 1997; Wolcott i wsp.,

2000]. Stąd też zwiększenie temperatury układu rozdzielczego w tej technice powoduje

przyśpieszenie migracji eluentu i skrócenie czasu trwania eksperymentu. Pewną

niedogodnością obserwowaną podczas eksperymentów w podwyższonej temperaturze

jest zwiększenie procesu dyfuzji pasm analitu. Natomiast dotychczas opublikowana

literatura dotycząca PPEC jest uboga w dane na temat wpływu temperatury na dystans

migracji analitów. Jedyne dostępne informacje pochodzą z pracy [Novotny i wsp., 2006].

Zgodnie z nimi wzrost temperatury układu rozdzielczego prowadzi do zwiększenia

dystansów migracji badanych substancji.

Dwie prace z cyklu habilitacyjnego poświęciłam wpływowi temperatury układu

separacyjnego na retencję i/lub dystans migracji różnych izomerów [H-6 i H-12].

W pierwszej z nich określiłam wpływ tego parametru na retencję i enancjoselektywność

enancjomerów kwasu migdałowego badanych w układzie faz odwróconych techniką

wysokosprawnej chromatografii cieczowej z kolumną chiralną typu Whelk-01. Podobnie

jak w przypadku różnych układów chromatograficznych opisanych w [Snyder, Kirkland,

Glajch, 1997] również i tutaj wzrost temperatury procesu rozdzielczego prowadzi do

obniżenia współczynników retencji. Jednakże istotnym parametrem wpływającym na

enancjoselektywność było pH buforu fazy ruchomej. Niezjonizowane cząsteczki kwasu

migdałowego (dla pH buforu fazy ruchomej poniżej pKA kwasu migdałowego, 3,41)

zachowują oddziaływania z selektorem prowadzące do enancjoróżnicowania pomimo

wzrostu temperatury. Natomiast w przypadku cząsteczek wykazujących częściową (dla

pH buforu równego pKA) lub całkowitą jonizację (dla pH buforu powyżej pKA) wzrost

temperatury zmniejsza (w pierwszym przypadku) lub nawet prowadzi do braku

enancjoróżnicowania (w drugim przypadku).

W drugiej z wymienionych prac zbadałam wpływ temperatury na retencję

i migrację pasm diasteroizomerycznych FVDA-pochodnych 5 aminoalkoholi

(acebutololu, atenololu, metoprololu, oxprenololu, pindololu) rozdzielanych dwoma

technikami - chromatografią planarną i ciśnieniową elektrochromatografią planarną

[H-12]. W obu przypadkach zakres badanych temperatur obejmował 50oC (od 5.5 do

55.5oC). Eksperymenty techniką TLC prowadziłam w specjalnie zaprojektowanej

komorze. Zaś uzyskane wyniki dotyczące zastosowania tego urządzenia należą do

niewielu dotychczas opublikowanych.


30

Wzrost temperatury układu rozdzielczego, jak już wcześniej wspomniałam,

powodował zmniejszanie retencji FVDA-pochodnych aminoalkoholi. Zależność

współczynnika Rf analitów w funkcji temperatury wykazuje minimum i wynika z niej

wpływ tego parametru na rozdzielenie pasm badanych diastereoizomerów. Minimum tej

zależności występuje dla układu o temperaturze 15,5oC. Zastosowanie układu o niskiej

temperaturze (5,5oC) nie sprzyja rozdzieleniu par diastereoizomerów z powodu silnej

retencji, którą obserwowałam dla wszystkich badanych związków. Zwiększenie

temperatury powoduje z jednej strony spadek retencji, a z drugiej wzrost rozsunięcia par

diasteroizomerów. Istotny okazał się wpływ temperatury układu rozdzielczego na czas

trwania eksperymentu. Podwyższenie temperatury z 5,5oC do 55,5

oC, skracało czas

eksperymentu z 68 do 25 min. Zmiany temperatury nie miały natomiast znaczącego

wpływu na kolejność retencji badanych substancji.

W przypadku zastosowania techniki PPEC zmienne równania Smoluchowskiego

(patrz równ. 2), takie jak lepkość i potencjał elektrokinetyczny są w różny sposób zależne

od temperatury. Złożoność wpływu temperatury zarówno na oddziaływania

międzycząsteczkowe w fazie stacjonarnej jak i w eluencie, obserwowane podczas badań

wykonywanych przy zastosowaniu technik elektromigracyjnych, są przedstawione

w literaturze [Jiskira, Claessens, Cramers, 2002] .

W celu uzyskania wymaganej temperatury termostatowanego układu

rozdzielczego roztwór fazy ruchomej był wstępnie, przed wprowadzeniem do układu,

podgrzewany, lub ochładzany, do tej temperatury. Analogiczna procedura była stosowana

przez autorów [Wolcott i wsp., 2000]. Należy podkreślić, że, w odróżnieniu od

eksperymentów TLC, eksperymenty prowadzone przy wykorzystaniu techniki PPEC

miały określony czas trwania (7 min) niezależnie od zastosowanej temperatury.

Podobnie jak w przypadku techniki TLC również i w PPEC wzrost temperatury

układu w badanym zakresie temperatury 25 - 54oC zwiększał dystanse migracji stref

badanych diastereoizomerów. Zależność dystansów migracji w funkcji temperatury ma

charakter krzywoliniowy z wyraźnym minimum przy temperaturze 25oC. Kształt ten jest

odmienny niż w publikacji [Novotny i wsp., 2006]. Inaczej niż w przypadku TLC,

w technice PPEC temperatura układu miała wpływ na selektywność rozdzielenia

(kolejność migracji stref substancji).


31

Chciałabym w tym miejscu również przedstawić wpływ temperatury na

sprawność układu separacyjnego obu technik (TLC i PPEC) wyrażoną jako wysokość

półki, H. Uzyskane dane eksperymentalne pozwalają na stwierdzenie, że w obu

technikach temperatura eksperymentu wpływała na ten parametr. Najmniejsze wartości

H, a więc największą sprawność układu, uzyskałam dla 25oC. Jednakże w przypadku

PPEC wyznaczona wysokość półki była 4 - 5 krotnie mniejsza w porównaniu do tej

uzyskanej dla układu TLC. Takie wartości H potwierdzają znany z literatury fakt

większej sprawności układów PPEC w stosunku do TLC [Novotny i wsp., 2006,

Dzido, Płocharz, Ślązak, 2006]. Przedstawione przeze mnie wyniki potwierdzają dane

literaturowe dostępne w jedynej z dotychczas opublikowanych prac omawiających wpływ

temperatury eksperymentu na sprawność układu PPEC [Novotny i wsp., 2006].

3.c.3.3. Badanie wpływu parametrów charakterystycznych dla ciśnieniowej

elektrochromatografii planarnej na migrację i selektywność rozdzielenia substancji

3.c.3.3.a. Pole elektryczne

Oprócz przedstawionych powyżej wspólnych czynników wpływających na retencję

analitów rozdzielanych technikami chromatografii cieczowej i elektrochromatografii

planarnej ciśnieniowej są również takie, które są dostępne tylko dla drugiej z technik.

W tej ostatniej dodatkowo stosuje się inne parametry/czynniki do optymalizacji

warunków procesu rozdzielania. Należą do nich wielkość pola elektrycznego i czas

trwania eksperymentu. Zgodnie z równaniem Smoluchowskiego przedstawionym

wcześniej (równ. 2.) przepływ elektroosmotyczny zależy od wielkości przyłożonego pola

elektrycznego.

Z uwagi na fakt, że dane literaturowe posługują się raczej pojęciem napięcia polaryzacji

warstwy adsorbentu [Dzido, Płocharz, Ślązak, 2006; Dzido, Płocharz 2007] niż pola

elektrycznego, ja również posługiwałam się tą wielkością.

Z dostępnej literatury wiadomo, że wzrost zastosowanego napięcia

polaryzującego warstwę adsorbentu przyspiesza przepływ fazy ruchomej i przez to

zwiększa dystans migracji badanych substancji [Dzido, Płocharz, Ślązak, 2006; Novotny

i wsp., 2006; Dzido, Płocharz 2007]. Prowadzone przeze mnie eksperymenty

potwierdziły te wnioski również w przypadku rozdzielania enancjomerów aminokwasów


32

w układach z chiralną fazą stacjonarną [H-5], DNS-pochodnych aminokwasów z chiralną

fazą ruchomą [H-9], czy też diasteroizomerycznych aminoalkoholi [H-12].

3.c.3.3.b. Czas działania pola elektrycznego

Jak wspomniałam powyżej w ciśnieniowej elektrochromatografii planarnej istnieje

możliwość kontrolowania czasu trwania eksperymentu (działania pola elektrycznego) bez

względu na wymiary zastosowanej płytki chromatograficznej. Już w jednej z pierwszych

prac dotyczącej elektrochromatografii w układzie zamkniętym Dzido i współpracownicy

wykazali, że zwiększenie czasu trwania eksperymentu prowadzi do wydłużenia migracji

stref badanych substancji [Dzido, Mróz, Jóźwiak, 2004]. Wnioski te zostały potwierdzone

przez zespół Nuroka [Nurok i wsp., 2004] i późniejsze prace [Hałka i wsp., 2010].

Poprzez odpowiednią korekcję tego parametru można doprowadzić do pełnego

rozdzielenia mieszaniny substancji np. enancjomerów, czy mieszaniny leków w czasie

znacznie krótszym w porównaniu do badań prowadzonych technikami

chromatograficznymi [odpowiednio H-3 i Hałka i wsp., 2010]. Możliwość ta jest

zazwyczaj połączona z prowadzeniem eksperymentów przy wyższym napięciu

polaryzacji. Również w swoich badaniach stosowałam krótszy czas analizy i wyższe

napięcie do opracowania wstępnych warunków prowadzenia procesu rozdzielania [H-8,

H-12], by następnie wydłużyć go w celu uzyskania optymalnego rozdzielenia izomerów

[H-10, H-12].

3.c.3.4. Weryfikacja rozdzielenia enancjomerów poprzez zastosowanie odpowiedniej

detekcji

Detektory spektrofotometryczne w zakresie widma UV-VIS, jak również ich wersje

wyposażone w matrycę diodową (DAD), należą do najczęściej wykorzystywanych do

wykrycia pasm analitów w różnych technikach chromatograficznych, również w HPLC

jak i TLC. W przypadku rozdzielania enancjomerów oprócz wykrycia, ważne jest

również potwierdzenie tożsamości wyizolowanych pasm enancjomerów, czy

diastereoizomerów. Ten proces, z wykorzystaniem pomiaru widma UV-VIS substancji,

zastosowałam w dwóch pracach z cyklu [H-4, H-8]. W tym celu posłużyłam się

detektorem DAD przystosowanym do zbierania widm substancji z powierzchni płytki

chromatograficznej.


33

Natomiast zastosowanie dwóch różnych detektorów, DAD i polarymetrycznego,

obu połączonych szeregowo w chromatografie cieczowym HPLC, pozwoliło mi na

potwierdzenia rozdzielenia enancjomerów chiralnych diamin jak również na określenie

ich skręcalności optycznej [H-2].

Kolejny sposób weryfikacji tożsamości pasm rozdzielonych

diastereoizomerycznych pochodnych pindololu przedstawiłam w pracy [H-12].

Dokonałam tego poprzez wykorzystanie zestawu pozwalającego na przeniesienie pasma

z powierzchni płytki chromatograficznej do spektrometru mas za pomocą przystawki

o oryginalnej nazwie „TLC-MS Interface” firmy Camag.

3.c.4. Podsumowanie i wnioski

Badania przedstawione w cyklu habilitacyjnym prowadzone były w dwóch

zintegrowanych ze sobą nurtach. Pierwszy z nich dotyczy wykorzystania nowej techniki

ciśnieniowej elektrochromatografii planarnej, PPEC, do rozdzielania różnych rodzajów

izomerów.

W pracach należących do cyklu opisałam po raz pierwszy możliwość zastosowania

techniki PPEC do różnicowania/rozdzielania enancjomerów aminokwasów, ich

pochodnych oraz innych izomerów przy wykorzystaniu zarówno chiralnej fazy

stacjonarnej, czy chiralnego dodatku do fazy ruchomej (bezpośredni sposób rozdzielania

chiralnych związków). Szereg publikacji cyklu świadczy o tym, że opisana technika może

być również z powodzeniem zastosowana do pośredniego rozdzielania enancjomerów

aminokwasów, czy aminoalkoholi poprzez separację ich diastereoizomerycznych

pochodnych.

Natomiast drugi nurt badań związany jest z rozdzielaniem/różnicowaniem

izomerów przy wykorzystaniu technik chromatografii cieczowej kolumnowej i planarnej.

Oba typy doświadczeń pozwoliły na ustalenie optymalnych warunków służących

do uzyskania dobrego rozdzielenia wybranych izomerów, w tym izomerów optycznych,

technikami chromatografii cieczowej i ciśnieniowej elektrochromatografii planarnej.

Należą do nich czynniki związane ze składem ilościowym i jakościowym fazy ruchomej

(stężenie i rodzaj modyfikatora organicznego, pH, stężenie i rodzaj buforu, rodzaj

chiralnego modyfikatora/dodatku), adsorbentu (achiralnego typu RP-2, RP-8, RP-18, czy

chiralnego DNBPG i DNBL). Wpływ wymienionych powyżej czynników na retencję


34

(TLC i HPLC) badanych izomerów, ich dystans migracji (PPEC) i selektywność

rozdzielenia został określony po raz pierwszy.

Na szczególną uwagę zasługuje określenie wpływu temperatury układu

separacyjnego na migrację stref diasteroizomerycznych pochodnych aminoalkoholi

rozdzielanych techniką PPEC. Praca ta należy do nielicznych poświęconych temu

tematowi.

Podczas swoich badań prowadziłam również syntezy diastereomerycznych

pochodnych. Dwa z analizowanych diastereoizomerów (FVDA-oksprenolol i FVDA-

pindolol) zostały otrzymane po raz pierwszy.

Uzyskane przeze mnie wyniki pozwoliły na wyciągnięcie następujących wniosków:

1. Technika ciśnieniowej elektrochromatografii planarnej może być z powodzeniem

zastosowana do rozdzielania rożnych izomerów w tym enancjomerów i diastereo-

izomerów.

2. Znane z innych publikacji zalety ciśnieniowej elektrochromatografii planarnej

takie, jak odmienna selektywność, krótszy czas procesu rozdzielania, czy większa

sprawność układu rozdzielczego w porównaniu do chromatografii planarnej

zostały potwierdzone podczas eksperymentów z wykorzystaniem izomerów jako

substancji badanych.

3. Retencję izomerów w układach elektrochromatografii planarnej ciśnieniowej,

podobnie jak w chromatografii cieczowej, można regulować poprzez zmianę

parametrów/czynników takich jak skład ilościowy i jakościowy eluentu, rodzaj

stosowanej fazy stacjonarnej. Czynniki te można stosować do optymalizacji

warunków prowadzenia procesu rozdzielenia wspomnianymi technikami.

W technice elektrochromatografii planarnej ciśnieniowej do optymalizacji

warunków prowadzenia procesu rozdzielenia izomerów można dodatkowo

zastosować, w odróżnieniu od chromatografii cieczowej, wielkość napięcia

polaryzującego warstwę adsorbentu i czas działania tego napięcia na układ

rozdzielczy.

4. Proces rozdzielania mieszanin izomerów prowadzony z wykorzystaniem techniki

elektrochromatografii planarnej ciśnieniowej jest bardziej uzależniony od rodzaju,

stężenia i pH buforu fazy ruchomej w porównaniu do chromatografii planarnej.


35

5. Jednakże podkreślenia wymaga występowanie istotnego wpływu pH buforu fazy

ruchomej na rozdzielenie badanych enancjomerów w układach technik

chromatograficznych, a szczególnie elektrochromatografii planarnej ciśnieniowej.

6. Temperatura układu separacyjnego ma wpływ na retencję analitów, sprawność

układu i czas prowadzenia procesu rozdzielania obu stosowanych technik

planarnych. Parametr ten może być wykorzystany do optymalizacji warunków

prowadzenia procesu rozdzielenia izomerów.

7. Równania korelacyjne, wyznaczone na podstawie danych eksperymentalnych,

ułatwiają przewidywanie retencji i selektywności rozdzielenia badanych

substancji w układach HPLC z chiralnymi selektorami typu Pirkle’a.

Tematykę przedstawioną w publikacjach przedstawionych w cyklu uważam za

nowatorską. Na szczególną uwagę zasługują przedstawione po raz pierwszy badania

nad wpływem różnych parametrów/czynników na migrację izomerów w układach

nowej techniki elektrochromatografii planarnej ciśnieniowej, PPEC. Chciałabym

w tym miejscu również wspomnieć, że dwie publikacje wchodzące w skład cyklu,

a mianowicie H-3 i H-5, należą, wg bazy danych Web of Science, do najczęściej

cytowanych prac poświęconych ciśnieniowej elektrochromatografii planarnej.

Uzyskane wyniki eksperymentów dowodzą, że wykorzystanie techniki PPEC do

analizy próbek biologicznych jest tylko kwestią czasu.

3.c.5. Literatura

Armstrong D.W., Pseudophase Liquid Chromatography: Applications to TLC, J. Liq.

Chromatogr., 3, 6, 895-900, (1980).

Armstrong D.W., He F.-Y., Han S.M., Planar chromatographic separation of enantiomers and

diastereomers with cyclodextrin mobile phase additives, J. Chromatography, 448, 345-354,

(1988).

Bhushan R., Brückner H., Kumar V., Gupta D., Indirect TLC Resolution of Amino Acid

Enantiomers After Derivatization with Marfey’s Reagent and its Chiral Variants, J. Planar

Chromatogr., 20, 165-171, (2007).

Bhushan R., Brückner H., Kumar V., Indirect resolution of enantiomers of penicillamine by TLC

and HPLC using Marfey’s reagent and its variants, Biomed. Chromatogr., 21, 1064-1068, (2007).


36

Bhushan R., Kumar V., Indirect resolution of baclofen enantiomers from pharmaceutical dosage

form by reversed-phase liquid chromatography after derivatization with Marfey’s reagent and its

structural variants, Biomed. Chromatogr., 22, 906–911,(2008).

Bhushan R., Kumar V., Reversed-phase high performance liquid chromatographic separation of

diastereomers of β-amino alcohols and microwave assisted synthesis of Marfey’s reagent, its

chiral variants and diastereomers, J. Chromatogr. A, 1216, 2592-2596, (2009).

Bhushan R., Vashistha V.K., Synthesis of variants of Marfey’s reagent having d-amino acids

aschiral auxiliaries and liquid-chromatographic enantioseparation of(RS)-Mexiletine in spiked

plasma: Assessment and comparison with l-amino acid analogs, J. Chromatogr. A, 1379, 43-50,

(2015).

Crego A.L., Martinez J., Marina M.L., Influence of mobile phase composition on electroosmotic

flow velocity, solute retention and column efficiency in open-tubular reversed-phase capillary

electrochromatography, J. Chromatogr. A ,869, 329–337, (2000).

van den Driest J.P., Ritchie H.J., Influence of silica gel pre-treatment and bonding technique on

PAH selectivity of octadecyl bonded phases, Chromatographia 24, 324–328,(1987).

Dzido T.H., Mróz J., Jóźwiak G.W., Adaptation of a horizontal DS chamber to planar in a closed

system,, J. Planar Chromatogr. 17, 404-410 (2004)

Dzido T.H., Płocharz P.W., Ślązak P., Apparatus for Pressurized Planar Electrochromatography

in a Completely Closed System, Anal. Chem., 78, 4713–4721, (2006).

Dzido T.H., Płocharz P.W., Planar Electrochromatography in a Closed System under Pressure—

Pressurized Planar Electrochromatography, J Liq. Chromatogr., 30, 2651–2667, (2007).

Hałka A., Płocharz P.W., Torbicz A., Dzido T.H., Reversed-Phase Pressurized Planar

Electrochromatography and Planar Chromatography of Acetylsalicylic Acid, Caffeine, and

Acetaminophen, J. Planar Chromatogr., 23, 6, 420-425, (2010).

Hałka-Grysińska A., Płocharz P.W., Torbicz A., Skwarek E., Janusz W., Dzido T.H., Influence of

the Modifier Type and its Concentration on Electroosmotic Flow of the Mobile Phase in

Pressurized Planar Electrochromatography, Chromatographia, 77, 941-950, (2014).

Hinze W.L., Armstrong D.W., Thin Layer Chromatographic Separation of Substituted Benzoic

Acids with Aqueous Solutions of α-Cyclodextrins, Anal. Lett., 13, A12, 1093-1103, (1980).


37

Jiskira J., Claessens H.A., Cramers C.A., Thermodynamics behaviour in capillary

electrochromatography, J. Sep. Sci., 25, 569-576, (2002).

Jouyban A., Chan H.K., Khoubnasabjafari M., Clark B.J., Calculation of electrophoretic mobility

in ternary solvent electrolyte systems, J. Pharm. Biomed. Anal.,32, 203–208, (2003).

Knox J., Grant J., Electrochromatography in packed tubes using 1.5 to 50 m silica gels and ODS

silica gels, Chromatographia, 32, 317-328, (1991).

Kopciał E., Polak B., Pietraś R., Dzido T.H., The Effect of Mobile Phase Composition on

Separation of Some Non- Steroidal Anti- Inflammatory Drugs of the 2- Arylpropanoic Acid

Derivatives in System of Reversed- Phase Pressurized Planar Electrochromatography and High-

Performance Thin- Layer Chromatography, Curr. Issues Pharm. Med. Sci., 25, 3, 282-285,

(2012).

Kopciał E., Polak B., Pietraś R., Mączka P., Dzido T.H., Effect of mobile phase buffer pH on

separation selectivity of some isoquinoline alkaloids in reversed-phase systems of Pressurized

Planar Electrochromatography and High-Performance Thin-Layer Chromatography, Curr. Issues

Pharm. Med. Sci., 26, 1, 45-49, (2013).

Marina M.L., Rios A., Varcalcel M., Analysis and detection by capillary electrophoresis, Elsevier,

2005

Marfey P., Determination of D-amino acids. II. Use of a bifunctional reagent, 1, 5-difluoro-2, 4-

dinitrobenzene, Carlsberg Res. Commun., 49, 591-596, (1984).

Novotny A.L., Nurok D., Replogle R.W., Hawkins G.L., Santini R.E., Results with an Apparatus

for Pressurized Planar Electrochromatography, Anal. Chem., 78, 2823–2831,(2006).

Nurok D., Koers J.M., Carmichael M.A., Role of buffer concentration and applied voltage in

obtaining a good separation in planar electrochromatography, J. Chromatogr. A, 983, 247–253,

(2003).

Nurok D., Koers J.M., Novotny A.L., Carmichael M.A., Kosiba J.J., Santini R.E., Hawkins G.L.,

Replogle R.W., Apparatus and Initial Results for Pressurized Planar Electrochromatography,

Anal. Chem., 76, 1690–1695, (2004).

Pirkle W.H., Hyun M.H., Bank B., A rational approach to the design of highly effective chiral

stationary phases, J. Chromatogr. 316, 585-604, (1984).


38

Pirkle W.H., Welch C.J., Wilson S.R., Assignment of absolute configuration to improved

enantioselective naproxen selector, Chirality, 6, 615-622, (1994).

Pretorius V., Hopkins B.J., Schieke J.D., Electro-osmosis, a new concept for high-speed liquid

chromatography, J. Chromatogr. 99, 23–30, (1974).

Pukl M., Prosek M., Kaiser R.M., Planar Electrochromatography part 1. On non-wetted thin

layers, Chromatographia, 38, 83–87, (1994).

Rathore A.S., Theory of electroosmotic flow, retention and separation efficiency in capillary

electrochromatography, Electrophoresis, 23, 3827-3846, (2002).

Schulz M., Minarik S., Use of reversed-phase (RP)-modified precoated plates. Planar

chromatography in practice. CAMAG. CBS, 101, 5-7, (2008).

Smoluchowski M., Contribution à la théorie de l’Endosmose électrique et de quelques

phénomènes corrélatifs W: Bull. Int. Acad. Sci. Cracovie, 184 [on-line]. 1903. [dostęp 2014-03-

01]

Snyder L.R., Dolan J.W., Gant J.R., Gradient elution in high-performance liquid chromatography:

I. Theoretical basis for reversed –phase systems, J. Chromatogr. 165, 3-30, (1979).

Snyder L.R., Kirkland J.J., Glajch J.L., Practical HPLC method development, Wiley and Sons,

New York, 1997.

Soczewiński E., Wachtmeister C.A., The relation between the composition of certain ternary two-

phase solvent systems and RM values, J. Chromatogr., 7,311–320, (1962).

Tanwar S., Bhushan R., Enantioresolution of Amino Acids: A Decade’s Perspective, Prospects

and Challenges, Chromatographia, 78, 1113-1134, (2015).

Valkó I.E., Sirén H., Riekkola M.-L., Chiral separation of dansylamino acids in a nonaqueous

medium by capillary electrophoresis, J. Chromatogr. A, 737(2), 263-272, (1996).

Wainer I.W., Proposal for the classification of high-performance liquid chromatographic chiral

stationary phases. How to choose the right column, Trends Anal. Chem., 6, 125-134, (1987).

Ward T.J., Armstrong D.W., Improved cyclodextrin chiral phases: A comparison and review,

J. Liq. Chromatogr., 9(2-3), 407-423, (1986).

http://pldml.icm.edu.pl/pldml/element/bwmeta1.element.bwnjournal-article-pmsv1i1p403bwm

http://pldml.icm.edu.pl/pldml/element/bwmeta1.element.bwnjournal-article-pmsv1i1p403bwm


39

Wolcott R.G., Dolan J.W., Snyder L.R., Bakalyar S.R., Arnold M.A., Nichols J.A., Control of

column temperature in reversed phase liquid chromatography, J. Chromatogr. A, 869, 211-230,

(2000).

4. OMÓWIENIE POZOSTAŁYCH OSIĄGNIĘĆ NAUKOWO-BADWCZYCH

4.a. DZIAŁANOŚĆ NAUKOWO-BADAWCZA PRZED UZYSKANIEM STOPNIA

DOKTORA NAUK FARMACEUTYCZNYCH

Swoją pracę naukową rozpoczęłam w Katedrze i Zakładzie Chemii Nieorganicznej

i Analitycznej Akademii Medycznej w Lublinie w 1990 roku. Początkowo prowadziłam

badania w zespole Prof. dr hab. Edwarda Soczewińskiego i Prof. dr hab. Grażyny

Matysik. Efektem tej współpracy są 2 publikacje. Pierwsza z nich dotyczy praktycznego

zastosowania modelu teoretycznego przewidywania profilu gradientu fazy ruchomej,

opracowanego przez dr. Wojciecha Markowskiego. Opracowany program gradientu

został wykorzystany do symulowania procesu gradientowego rozdzielania składników

mieszanin substancji (barwników i glikozydów). W drugim etapie badań został on

przetestowany podczas rozdzielania glikozydów w wyciągach z dwóch gatunków

naparstnic (Digitalis lanata Ehrh. i Digitalis orientalis Mill.). (zał. 7., II.a pozycja 1.).

Gradient fazy ruchomej został również wykorzystany w drugiej pracy do izolacji

preparatywnej składników ze złożonych ekstraktów roślinnych (zał. 7., II.a pozycja 2.).

W obu przypadkach uczestniczyłam w badaniach związanych z przeprowadzeniem

eksperymentów chromatograficznych.

Kolejna praca powstała we współpracy z prof. Tadeuszem Dzido. Związana ona była

z badaniem wpływu saturacji adsorbentu parami rozpuszczalników na retencję fenoli

i chinolin rozdzielanych techniką chromatografii cienkowarstwowej w normalnym

układzie faz (zał.7., II.a, pozycja 5.). Tutaj również byłam odpowiedzialna za

przeprowadzenie eksperymentów.

W 1994 roku, po przejściu do zespołu badawczego prof. Władysława

Gołkiewicza, zmieniłam dotychczasową problematykę badań naukowych na rozdzielanie

chromatograficzne substancji chiralnych. Początkowo zajmowałam się badaniem

zależności pomiędzy retencją wybranych enancjomerów a składem fazy ruchomej

w układach chromatografii cienkowarstwowej z zastosowaniem mechanizmu chiralnej


40

wymiany ligandów (CLEC) (zał. 7., II.a, pozycja 3.). To podejście zastosowałam do

układów wysokociśnieniowej chromatografii kolumnowej w odwróconym układzie faz

w celu badania możliwości zastosowania równań opisujących retencję substancji

w funkcji stężenia modyfikatora fazy ruchomej (zał. 7., II.a, pozycja 4.).

Moje zainteresowania problemem substancji wykazujących aktywność optyczną

zaowocowało również dwoma pracami poglądowymi (zał. 7., II.d, pozycje 1. i 2.).

Łączny współczynnik wpływu (impact factor) moich prac opublikowanych przed

uzyskaniem stopnia doktora nauk farmaceutycznych wyniósł 5,355. Do mojego dorobku

powstałego w tym okresie zaliczam również 11 komunikatów zjazdowych

przedstawianych na konferencjach krajowych i międzynarodowych (zał. 7., II.k.A.,

pozycje 1. – 10. i zał. 7., II.k.B. pozycja 1. ).

Pracę doktorską, zatytułowaną „Chromatografia cieczowa substancji chiralnych”,

obroniłam 25.03.1998 r. na macierzystym Wydziale. Jej promotorem był prof. dr hab.

Władysław Gołkiewicz. Przedstawiłam w niej wyniki badań nad wykorzystaniem równań

Snydera-Soczewińskiego oraz Jarońca i wsp. do opisu mechanizmu molekularnego

adsorpcji enancjomerów z chiralną wymianą ligandów (CLEC) i Pirkle’a w układach

wysokosprawnej chromatografii kolumnowej.

4.b. DZIAŁALNOŚĆ NAUKOWA PO UZYSKANIU STOPNIA DOKTORA NAUK

FARMACEUTYCZNYCH

Moja działalność naukowo-badawcza prowadzona po obronie pracy doktorskiej

koncentrowała się na następujących zagadnieniach:

1. Badanie wpływu różnych czynników na rozdzielanie enancjomerów estrów

N-benzoilowych pochodnych aminokwasów z wykorzystaniem chiralnych faz

stacjonarnych typu Pirkle’a (zał.7., II.a, pozycje 6., 7.).

2. Badanie zależności pomiędzy retencją/dystansem migracji różnych związków

a składem eluentu w układach HPLC, TLC i PPEC (zał. 7., II.a, pozycje 9.,10.,

17. - 19.).

3. Zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej do określenia lipofilowości nowo

zsyntetyzowanych związków o potencjalnym działaniu leczniczym (zał. 7., II.a,

pozycje 11. - 14.).


41

4. Wykorzystanie programów komputerowych do wspomagania przewidywania

retencji i rozdzielenia różnych związków w układach wysokosprawnej

chromatografii kolumnowej (zał. 7., II.a, pozycja 8. i II.e, (rozdziały

w monografiach w języku polskim) pozycja 1.).

5. Zastosowanie techniki TLC do badań nad optymalizacją warunków prowadzenia

procesu rozdzielania różnych związków chemicznych (zał. 7., II.a, pozycje. 15.,

16.).

Badanie wpływu różnych czynników na rozdzielanie enancjomerów estrów

N-benzoilowych pochodnych aminokwasów

Ta tematyka, stanowiąca kontynuację pracy doktorskiej, została przedstawiona w dwóch

pracach. W pierwszej z nich (zał. 7., II.a, poz.6.) zbadałam wpływ stężenia i rodzaju

modyfikatora polarnego fazy ruchomej na retencję estrów etylowych N- benzoilowych

pochodnych wybranych aminokwasów w normalnym układzie faz HPLC. W tym

przypadku chiralnym selektorem fazy stacjonarnej była R-3,5-

dinitrobenzoilofenyloglicyna (R-3,5-DNBPG). Liniowe zależności retencja (log k) vs.

ułamek molowy polarnego modyfikatora eluentu potwierdziły możliwość wykorzystania

równania Snydera - Soczewińskiego do badania mechanizmu enancjoróżnicowania.

Proces ten polega na konkurencyjnej adsorpcji cząsteczek enancjomeru i modyfikatora na

powierzchni CSP. Wartość współczynnika nachylenia wyżej wspomnianej zależności jest

powiązana z liczbą desorbowanych cząsteczek modyfikatora polarnego przez cząsteczki

enancjomeru.

Dodatkowymi czynnikami wpływającymi na rozdzielenie pary optycznych

antypodów były rodzaj zastosowanego modyfikatora fazy ruchomej i jego stężenie (dla

części z par enancjomerów). Porównując retencję badanych pochodnych w układach

z eluentem zawierającym różne alkohole jako modyfikatory wykazałam wpływ ich

budowy chemicznej na siłę elucyjną fazy ruchomej. Zastosowanie alkoholi o dłuższym

łańcuchu węglowodorowym w cząsteczce prowadziło do zwiększenia siły elucyjnej

eluentu w porównaniu do układów z alkoholami o krótszym łańcuchu. Natomiast fazy

ruchome zawierające alkohole o rozgałęzionych grupach w części niepolarnej

charakteryzują się mniejszą polarnością w porównaniu do tych z ich nierozgałęzionymi

odpowiednikami.


42

W drugiej z prac (zał.7., II.a, pozycja 7.) przedstawiłam wpływ rodzaju estru

N-benzoilowych pochodnych wybranych aminokwasów na ich oddziaływania z chiralną

fazą stacjonarną i współczynnik rozdzielenia enancjomerów. Również i w tym przypadku

do przeprowadzenia eksperymentów zastosowałam wysokosprawną chromatografię

cieczową z R-3,5-DNBPG jako CSP. Podobnie jak w poprzedniej pracy, do określenia

zależności retencja – skład eluentu zastosowałam z powodzeniem równanie Snydera-

Soczewińskiego. Dla większości badanych par enancjomerów najlepsze ich rozdzielenie

uzyskałam, gdy badany związek był estrem 2-propylowym aminokwasu.

Badanie zależności pomiędzy retencją różnych związków a składem eluentu

w układach HPLC, TLC i PPEC

Moje zainteresowania związane z wpływem składu ilościowego i jakościowego fazy

ruchomej na retencję różnych związków w układach chromatografii cieczowej

zaowocowały współpracą z kilkoma zespołami naukowymi Katedry Chemii

Nieorganicznej i Analitycznej .

Z ramach współpracy z prof. Matysik i jej zespołem badałam zależność retencji 18

indolochinolin od stężenia etanolu w wodno - organicznej fazie ruchomej w układach

z niepolaną fazą stacjonarną (zał. 7., II.a, pozycja 9.). Dane te pozwoliły na badanie

mechanizmu molekularnego retencji indolochinolin przy wykorzystaniu równania

Snydera-Soczewińskiego. Natomiast we współpracy z zespołem prof. Lucyny

Bieganowskiej badałam i porównałam retencję wybranych glikozydów flawonoidowych

w normalnym i odwróconym układzie faz TLC z sześcioma różnymi adsorbentami.

Efektem tej współpracy była jedna publikacja (zał. 7., II.a, pozycja 17.). Wykazano

w niej, że liczba i położenie hydroksylowych i glikozydowych grup w cząsteczce flawonu

w istotny sposób wpływają na retencję substancji. Porównanie retencji glikozydów

flawonoidowych w badanych układach pozwala na wybranie optymalnych układów do

ich rozdzielania i izolacji.

Wraz z dr Anną Rompała zbadałyśmy wpływ obecności różnych kwasów

w eluencie na retencję wybranych alkaloidów w układach faz normalnych chromatografii

planarnej. Wynikiem tych badań była jedna publikacja (zał. 7., II.a, pozycja 10.).

Wykazałyśmy w niej, że wyższa zawartość kwasowego dodatku w eluencie powoduje

zmniejszenie retencji badanych alkaloidów. Dodatkowym czynnikiem wpływającym na


43

ich adsorpcję był skład zastosowanej fazy ruchomej i rodzaj jej kwasowego dodatku.

Wysokie wartości współczynnika opóźnienia alkaloidów były efektem zastosowania

silnego kwasu (kwasu trójfluorooctowego).

Moje zainteresowania elektrochromatografią planarną ciśnieniową nie dotyczą wyłącznie

problematyki związanej z rozdzielaniem izomerów ale również i innych związków

chemicznych. We współpracy z dr Eweliną Kopciał porównałyśmy wpływ składu i pH

buforu fazy ruchomej na retencję wybranych niesterydowych leków przeciwzapalnych

i alkaloidów izochinolinowych w układach faz odwróconych TLC i PPEC (zał. 7., II.a,

pozycje 18., 19.). Wyniki naszych eksperymentów potwierdziły znany fakt z innych prac,

że za różnice retencji (TLC) i dystansu migracji (PPEC), jak również selektywności obu

grup substancji odpowiadają odmienne efekty. W układach TLC za współczynniki

opóźnienia substancji odpowiadał efekt związany z ich podziałem pomiędzy polarny

eluent i niepolarną fazę stacjonarną (lipofilowość). Natomiast w PPEC oprócz wyżej

wspomnianego, występował również efekt związany z poruszaniem się jonów w polu

elektrycznym (elektroforeza).

Zastosowanie chromatografii cienkowarstwowej do określenia lipofilowości nowo

zsyntetyzowanych związków o potencjalnym działaniu leczniczym

Od wielu lat do określania lipofilowości różnych związków technikami

chromatograficznymi wykorzystuje się równanie Soczewińskiego – Wachtmeistera.

Równanie to zostało opisane szerzej na stronie 11. autoreferatu, lecz w tym miejscu

przypomnę, że przedstawia ono zależność retencji różnych substancji od stężenia

modyfikatora organicznego fazy ruchomej w układach faz odwróconych chromatografii

cieczowej. Zaś hipotetyczna wartość retencji substancji, gdy eluentem jest czysta woda

(log kw), jest stosowana do określenia lipofilowości związków o potencjalnym działaniu

biologicznym. Ten sposób wyznaczenia lipofilowości został również wykorzystany

przeze mnie do analizy związków zsyntetyzowanych przez dr hab. Monikę Pituchę oraz

dr hab. Krzysztofa Sztanke. Określiłam lipofilowość kilkunastu pochodnych 1,2,4-triazol-

5-onów i semikarbazydów otrzymanych przez pierwszą z wymienionych osób (zał. 7.,

II.a, pozycje 11., 13.). Dr hab. Pitucha zsyntetyzowała również następną grupę badanych

przeze mnie związków o potencjalnym działaniu przeciwbakteryjnym a mianowicie

pochodne pirazolu z grupą karboksyamidową (zał. 7., II.a, pozycja 14.).


44

Natomiast porównanie lipofilowości nowych pochodnych 8-arylo-2,6,7,8-

tetrahydroimidazo[2,1-c][1,2,4]-triazino-3,4-dionów o działaniu przeciwnowotworowym

i przeciwbólowym, wyliczonej teoretycznie przy wykorzystaniu programów

komputerowych (Pallas, HyperChem i Titan) i wyznaczonej praktycznie przeze mnie

w układach HPLC-RP zostało przedstawione w kolejnej publikacji, tym razem we

współpracy z dr hab. Krzysztofem Sztanke, dr Wojciechem Markowskim i dr Ryszardem

Świebodą (zał. 7., II.a, pozycja 12.).

Wykorzystanie programów komputerowych do przewidywania retencji różnych

związków w układach wysokosprawnej chromatografii kolumnowej

Programy komputerowe takie jak Drylab, czy też ten opracowany przez dr Wojciecha

Markowskiego pozwalają, na podstawie wstępnych doświadczeń prowadzonych

w warunkach elucji gradientowej lub izokratycznej, na wyznaczenie optymalnych

warunków prowadzenia eksperymentu (skład eluentu, czas trwania poszczególnych

etapów gradientu) w procesach rozdzielania złożonych mieszanin. Uczestniczyłam

zarówno we wstępnych jak i systematycznych badaniach polegających na praktycznym

weryfikowaniu składu eluentu wyznaczonego za pomocą obu oprogramowań dla

rozdzielania składników ekstraktów roślinnych (fenolokwasy) jak i nowo

zsyntetyzowanych związków (np. karbonylowe pochodne 1-arylo-2-

iminoimidazolidyny).

Efektem współpracy z prof. Tadeuszem. Dzido i dr Małgorzatą Wojcińską

(Katedra Farmakognozji Akademii Medycznej w Poznaniu) jak i doktorami Wojciechem

Markowskim i Katarzyną Czapińską oraz zespołem Katedry Technologii Środków

Leczniczych (dr Elżbieta Szacoń, prof. Dariusz Matosiuk) były dwie publikacje

przedstawione w załączniku 7., II.a 8. oraz w części II.e, (rozdziały

w monografiach w języku polskim pozycja 1.).

Zastosowanie techniki TLC do badań nad optymalizacją warunków prowadzenia

procesu rozdzielania różnych związków chemicznych

W ostatnich latach brałam również udział multidyscyplinarnym zespole opracowującym

nową technikę dwuwymiarowego gradientu fazy ruchomej w układach TLC oraz


45

zastosowanie jej do izolacji składników olejków eterycznych (załącznik 7., II.a pozycja

15.).

Uczestniczyłam również w badaniach dr Katarzyny Paradowskiej (Kat. i Zakład

Biochemii) nad możliwością zastosowania chromatografii cienkowarstwowej do oceny

procesu inhibicji fosfoglukoizomerazy przez fosfoenolopirogronian. Eksperymenty te

zakończyły się powstaniem publikacji (załącznik 7., II.a, poz. 16.).

Podsumowanie pozostałego dorobku naukowego po uzyskaniu stopnia doktora

nauk farmaceutycznych

Mój dorobek naukowy po uzyskaniu stopnia doktora obejmuje: 15

pełnotekstowych prac oryginalnych, 3 prace poglądowe, 15 rozdziałów w monografiach

polsko- (6) i angielskojęzycznych (9), 1 patent krajowy. Łączny współczynnik

oddziaływania IF = 17,726 (KBN/MNiSW = 173) (bez uwzględnienia IF prac

wchodzących w skład cyklu). Wyniki badań prezentowałam w formie 59 doniesień

zjazdowych na konferencjach krajowych (33) i międzynarodowych (26), podczas których

byłam współautorem wykładów plenarnych i wystąpień ustnych na konferencjach

krajowych (4).


46

5. TABELA PODSUMOWUJĄCA DOROBEK NAUKOWY

1. Prace wchodzące w skład osiągnięcia naukowego

Rodzaj pracy Wyszczególnienie Liczba Współczynnik

oddziaływania

(IF)

Pkt

KBN/MNiSW

Publikacje z IF 11 11,262 150

bez IF 1 0 6

SUMA 12 11,262 156

2. Prace inne niż te, wchodzące w skład osiągnięcia naukowego

Publikacje nauko-

we w czasopis-

mach znajdują-

cych się w bazie

Journal Citation

Reports

z IF

15 19,092 162

bez IF 4 15

Patenty krajowe

1 0 0

Prace przeglądowe

w czasopismach

z IF

1 4,531 32

bez IF

2 0 0

Opracowania

zbiorowe (mono-

grafie i rozdziały

w podręcznikach)

Rozdziały w monogra-

fiach międzynaro-

dowych

9 0 0

Rozdziały w monogra-

fiach i podręcznikach

krajowych

6 0 0

Prace popularno-

naukowe i inne

1 0 0

SUMA 39 23,623 209

3. Streszczenia sympozjalne

Sympozja międzynarodowe

28 0 0

krajowe

42 0 0

SUMA 70

4. Podsumowanie

Publikacje i patenty 51

34,885

365 Sympozja 70

beatapolak

Stamp

Documents

AUTOREFERAT Beata Polak - umlub.pl · Beata Polak, Władysław Gołkiewicz, Tomasz Tuzimski – Effect of mobile phase pH* on chromatographic behaviour in chiral ligand-exchange thin-layer