AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE Rubus

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ

AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE Rubus

imperialis Cham. Schl. (Rosaceae) em modelos experimentais in

vivo

PRISCILA ELIZABET BERTÉ

Itajaí, 2013

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS

ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E

SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS




vivo

Dissertação submetida ao Programa de Mestrado Acadêmico em Ciências Farmacêuticas, da Universidade do Vale do Itajaí, como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Sérgio Faloni de Andrade Co-orientador: Prof. Dr. Rivaldo Niero

Itajaí, março de 2013



vivo


‘Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas, Área de Concentração Produtos Naturais e Substâncias Bioativas e aprovada em sua forma final pelo Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas da Universidade do Vale do Itajaí.’

____________________________________ Sérgio Faloni de Andrade, Doutor

Orientador

__________________________________________________________ Tania Mari Bellé Bresolin, Doutora

Coordenador do Programa Mestrado em Ciências Farmacêuticas Apresentado perante a Banca Examinadora composta pelos Professores:

______________________________________ Dr. Sérgio Faloni de Andrade (PMCF - UNIVALI)

Presidente

______________________________________ Dr. Rivaldo Niero (PMCF - UNIVALI)

Co-orientador

______________________________________ Dra. Márcia Maria de Souza. (PMCF - UNIVALI)

Membro Interno

______________________________________ Dra. Angélica Garcia Couto (PMCF - UNIVALI)

Membro Interno

____________________________________ Dra. Claudriana Locatelli (UNOESC)

Membro Externo

Agradecimentos

Primeiramente quero agradecer ao Universo, e todas as coisas existentes

nele, para que possamos progredir e assim realizar determinados sonhos em nossa

vida. Acredito que uma força maior nos rege e nos impulsiona a atingir nossos

objetivos. Posteriormente temos dentro de nós essa vontade, força e entusiasmo

para ir atrás e realizar.

Agradeço a minha família, pelo apoio emocional e financeiro, pela força, pelas

palavras de entusiasmo, por demonstrações de amor, carinho. A minha mãe Ilda,

sempre estava ali, na alegria, na tristeza, na saudade, me apoiando, me dizendo

para nunca desistir, obrigada mãe, foi super essencial essa força e carinho, eu te

amo muito. Agradeço ao meu pai Leonir por tudo que eu conquistei até hoje, pois

sempre me incentivou a estudar, e me apoiou sempre nas decisões, obrigada Pai,

do fundo do meu coração, agradeço por ter pais tão especiais, eu amo vocês.

Agradeço ao meu tio Claudio, que sempre foi fonte de inspiração pra mim,

como também realizou um mestrado, sempre me proporcionou suas palavras de

apoio, e sempre me incentivou a estudar muito.

Ao meu professor orientador Sérgio Faloni de Andrade, que me proporcionou

a oportunidade de realizar a minha pesquisa com modelo de úlcera gástrica, além de

orientador foi um grande amigo nessa caminhada, pois muitas vezes me ouviu com

a maior atenção e carinho, obrigada Sérgio.

Ao meu co-orientador Rivaldo Niero, pelos ensinamentos, colaboração para

que minha pesquisa fosse realizada.

Aos Docentes do Programa do Mestrado em Ciências Farmacêuticas pelos

ensinamentos e também a Coordenadora professora Tânia Mari Bellé Bresolin, pelas

palavras e paciência que teve comigo em determinados momentos.

Ao Jhony da Silva Lopes, o qual preparou o extrato e as frações da Rubus

imperislis e a purificação dos compostos isolados utilizados no presente trabalho,

obrigada Jhony.

A minha prima irmã Maira, a qual dividiu apartamento comigo por quatro anos,

e em período de mestrado também morou comigo. Sempre me escutou e

compartilhou momentos, agradeço pela sua paciência, por me ouvir, por me

estender a mão quando eu precisei, muito obrigada Maira.

A minha amiga Francielle Zanatta, a qual conheci na prova eliminatória do

mestrado, e ali já começou uma grande afinidade, Fran muito obrigada por tudo,

pelos momentos, pelas disciplinas que realizamos juntas, pelos experimentos nos

quais você me ajudou, pela sua amizade, carinho, risadas, ensinamentos e palavras,

te adoro lindona.

A meu amigo Antônio Luis Fermino, pelas conversas, pelo apoio, pela

amizade.

A minha amiga e professora Sandra Soares de Melo, a qual foi minha

orientadora em minha caminhada na iniciação científica da graduação de Nutrição,

que além de professora e Doutora sempre foi uma grande amiga com suas palavras,

ensinamentos e carinho, muito obrigada Prof. Sandra.

Agradecer as colegas de laboratório, Marta, Jady e Ana Paula, pela ajuda nos

experimentos, sem a ajuda de vocês não teria sido a mesma coisa, obrigada de

coração.

Agradecer aos funcionários do laboratório de farmacologia “in vivo” que de

uma forma ou de outra me auxiliaram, especialmente a Claudia e a Maria Angélica.

A todos os amigos que me ajudaram de forma direta ou indireta com a minha

caminhada, com muito carinho e companheirismo, muito obrigada!



vivo


Março/2013 Orientador: Sérgio Faloni de Andrade, Doutor. Co-orientador: Rivaldo Niero, Doutor. Área de concentração: Produtos naturais e substâncias sintéticas bioativas.

Resumo: A úlcera gástrica (UG) é uma doença heterogênea, com múltiplos fatores envolvidos

na sua gênese. O uso abusivo de álcool, de antiinflamatórios não esteroidais (AINEs), o estresse, a hereditariedade, o tabagismo e a infecção por Helicobacter pylori, têm sido considerados os principais fatores de risco, responsáveis por lesões na mucosa gástrica. Algumas classes de compostos de origem natural como terpenos, triterpenos, flavonóides, taninos, alcalóides, glicosídeos e saponinas, são conhecidas por apresentarem atividade gastroprotetora. Rubus imperialis Cham. Schl (amora branca) apresenta em sua composição terpenos e outros compostos com atividade anti-úlcera. O presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade gastroprotetora obtidas das partes aéreas do Extrato metanólico bruto de R. imperialis (ExtMB) e das frações: hexano, clorofórmio e acetato de etila, tendo em vista os relevantes resultados fitoquímicos e farmacológicos realizados anteriormente em nossos laboratórios. Para determinação da atividade gastroprotetora foram empregados os ensaios de: úlcera induzida por etanol, por anti-inflamatórios não esteroidais (AINEs), ácido acético, ligadura de piloro (pH, volume e acidez total), dosagem de muco e avaliação da participação do óxido nítrico sintase (L-NAME) e grupamentos sulfidrila (NEM). Para a avaliação do ExtMB foram utilizados ratos wistar (pesando entre 150-200g) e para as frações e substâncias isoladas foram utilizados camundongos swiss (pesando entre 25-30g), provenientes do Biotério Central da UNIVALI. No modelo de etanol utilizando tratamento com ExtMB (100, 250, 500 mg/kg) o índice de cura obtido foi de 55,56%, 63,49%, 78,14% respectivamente, e o fármaco omeprazol (30 mg/kg) foi de 86,62%. Quando utilizado as frações: acetato de etila, hexano e clorofórmio (250 mg/kg) o índice de cura obtido foi de 86,47%, 81,2%, 85,63%, respectivamente, o do omeprazol (30 mg/kg) foi 92,12%. No modelo de AINEs, o índice de cura obtido foi 49,50%, 48,43% e 59,99% utilizando-se ExtMB nas doses de 100, 250 e 500 mg/kg, o índice de cura da cimetidina (100 mg/kg) foi de 55,89%. As frações acetato de etila, hexano e clorofórmio apresentaram índice de cura de 31,67%, 47,68% e 61,44% respectivamente, e a cimetidina 87,75%. No modelo de ácido acético o índice de cura do ExtMB (500mg) foi de 65,75% e do fármaco cimetidina (100 mg/kg) foi 75,55 %. O ExtMB e as frações utilizadas se mostraram efetivas em aumentar pH e diminuir acidez total quando comparado ao controle negativo. De acordo com os resultados obtidos o efeito gastroprotetor não inclui a participação do muco, porém é dependente da participação do óxido nítrico e dos compostos sulfidrílicos. Os estudos fitoquímicos levaram ao isolamento das substâncias Niga-ichigosídeo F1 e Ácido 2β, 3β, 19α-triidróxiursólico (RI5-20), essas substâncias demonstraram resultados estatisticamente significativos para todos os parâmetros analisados em úlceras induzidas por etanol. De acordo com resultados, o extrato bruto de R. imperialis e as frações são capazes de promover gastroproteção, este efeito parece envolver diminuição da acidez gástrica, participação do óxido nítrico e compostos sulfidrílicos. Os resultados em conjunto sugerem que R. imperilalis apresenta potencial terapêutico gastroprotetor. Palavras-chave: Ação gastroprotetora, Úlcera, Rubus imperialis Cham. Schl.

ABSTRACT

Gastric ulcer (GU) is a heterogeneous disease with multiple factors involved in its genesis. Alcohol abuse, nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), stress, heredity, smoking and Helicobacter pylori infection are considered the major risk factors responsible for gastric mucosa injury. Some classes of natural compounds, such as terpenes, triterpenes, flavonoids, tannins, alkaloids, saponins and glycosides, are known to have gastroprotective activity. Rubus imperialis Cham. Schl (yellow raspberry) has terpenes and other compounds with anti-ulcer activity in its composition. The present study evaluates the gastroprotective activity obtained from the aerial parts of crude methanol extract of R. imperialis (ExtMB) and the fractions: hexane, chloroform and ethyl acetate, in view of the relevant pharmacological and phytochemicals results obtained previously in our laboratories. To determine the gastroprotective activity, the following assays were used: ethanol-induced ulcer, by nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs), acetic acid, pylorus ligature (pH, volume and total acidity), determination of mucus, and evaluation of the participation of oxide synthase (L-NAME) and sulfhydryl group (NEM). For the evaluation of ExtMB Wistar rats were used (weighing 150-200g) and for fractions and isolated compounds, Swiss mice were used (weighing between 25-30g) from the Central animal house of UNIVALI. In the model of ethanol using ExtMB treatment (100, 250, 500 mg / kg) the cure rates obtained were 55.56%, 63.49%, 78.14% respectively, while that obtained for the drug omeprazole (30 mg/kg) was 86.62%. When the fractions ethyl acetate, hexane and chloroform (250 mg/kg) were used, the cure rates obtained were 86.47%, 81.2%, 85.63% respectively, while that obtained with omeprazol (30 mg/kg) was 92.12%. In the NSAIDs model, the cure rates obtained were 49.50%, 48.43% and 59.99% using ExtMB at doses of 100, 250 and 500 mg/kg, the cure rate obtained with cimetidine (100 mg/kg) was 55.89%. The fractions ethyl acetate, hexane and chloroform showed cure rates of 31.67%, 47.68% and 61.44% respectively, and cimetidine presented a cure rate of 87.75%. In the model of acetic acid the cure rate of ExtMB (500mg) was 65.75% and the drug cimetidine (100 mg/-kg) was 75.55%. The ExtMB and fractions used have proven to be effective in increasing pH and decreasing total acidity when compared to the negative control. According with the results obtained, the gastroprotective effect does not include the contribution of the mucus, but is dependent on the role of nitric oxide and sulfhydryl compounds. Phytochemical studies led to the isolation of substances Niga-ichigoside F1 and Acid 2β, 3β, 19α-triidroxiursolic (RI5-20). These substances showed statistically significant results for all the parameters analyzed in ethanol-induced ulcers. According to the results, the crude extract of R. imperialis and fractions are able to promote gastroprotection. This effect appears to involve reduction of gastric acidity, participation of nitric oxide and sulfhydryl compounds. Together, the results suggest that R. imperilalis has therapeutic gastroprotective potential.

Keywords: Gastroprotective activity, Ulcer, Rubus imperialis Cham. Schl.

LISTA DE FIGURAS Figura 1 Partes aéreas, flores e frutos de Rubus imperialis......................................24 Figura 2 Fitoconstituintes presentes na Rubus imperialis.........................................24 Figura 3 Representação esquemática do mecanismo de secreção de ácido pelo estômago.............................................................................................27 Figura 4 Fluxograma resumido da preparação e obtenção das frações...................34 Figura 5 Índice de cura do extrato metanólico bruto de R. imperialis e omeprazol em lesões induzidas por etanol. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais..............................................43 Figura 6 Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol em ratos.........43 Figura 7 Índice de cura das frações FAE, FH, FCHCl3 e omeprazol em lesões induzidas por etanol. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais................................................................................................44 Figura 8 Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol em camundongos.............................................................................................................45 Figura 9 Índice cura do extrato metanólico bruto de R. Imperialis e cimetidina em lesões induzidas por indometacina. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais...................................................................47 Figura 10 Imagens de estômagos após indução de úlcera por indometacina em ratos, utilizando tratamento com extrato metanólico bruto de R. imperialis em diferentes concentrações e o fármaco cimetidina.....................................................48 Figura 11- Índice de cura das frações FAE, FH, FCHCl3 e cimetidina em lesões induzidas por indometacina. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais.....................................................................................49 Figura 12. Imagens de estômagos após indução de úlcera por indometacina em camundongos, utilizando tratamento com as diferentes frações e fármaco cimetidina...................................................................................................................49 Figura 13 - Índice de cura do extrato Metanólico Bruto de R. imperialis e cimetidina em lesões induzidas por ácido acético em ratos. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM)..................................................................................52

Figura 14 – Efeito do Extrato Metanólico bruto de R. imperialis (500 mg/kg) e carbenoxolona (200 mg/kg) em lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com L-NAME. Resultados expressos em Média ± EPM de seis ratos. Estatística foi

feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01 quando comparados com o grupo controle, ##p<0.01 quando comparado ao grupo L-NAME.........................................................................................................................58 Figura 15 – Efeitos do ExtMB de R. imperialis (500 mg/kg) e carbenoxolona (200 mg/kg) em lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com NEM. Resultados são Média ± EPM de seis ratos. Estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01 quando comparados com o grupo controle, # #p<0.01 quando comparado ao grupo NEM............................................................................59 Figura 16. Índice de cura das substâncias isoladas: Niga-ichigosídeo e RI5-20 (30 mg/kg) e do omeprazol (30 mg/kg) em lesões induzidas por etanol em camundongos. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais................................................................................................................61

LISTA DE TABELAS Tabela 1 Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico bruto das partes aéreas de Rubus imperialis Cham. Schl (100, 250 e 500 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em ratos......................................................................................................................42 Tabela 2 Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes frações do extrato metanólico de R. imperialis (hexano, clorofórmio e acetato de etila, na dose de 250 mg/kg) em úlceras gástricas induzidas por etanol/HCl em camundongos.............................................................................................................44 Tabela 3 Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes doses do extrato metanólico bruto das partes aéreas de Rubus imperialis (100, 250 e 500 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina em ratos...........................................................................................................................47 Tabela 4 Efeito da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes frações: acetato de etila, hexano e clorofórmio, na dose de 250 mg/kg, em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina em camundongos..............................48 Tabela 5 Efeito do extrato metanolico bruto de R. imperialis e cimetidina no modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético em ratos...............................................51

Tabela 6 Efeito do extrato metanólico bruto de R. imperialis nas diferentes doses (100, 250 e 500 mg) e cimetidina, administrados intraduodenal, avaliando os parâmetros obtidos no suco gástrico, através de ligadura de piloro em ratos...........53 Tabela 7 Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das diferentes frações: acetato de etila, hexano e clorofórmio na dose de 250 mg/kg nos parâmetros bioquímicos obtidos no suco gástrico de camundongos submetidos a ligadura de piloro........................................................................................................54

Tabela 8 Efeitos das diferentes doses do extrato metanólico de R. imperialis e carbenoxolona na dosagem de muco em mucosa gástrica.......................................55 Tabela 9 Efeitos das frações (acetato de etila, hexano e clorofórmio) de R. imperialis e carbenoxolona na dosagem de muco em mucosa gástrica....................................56

Tabela 10 Efeito da administração oral de omeprazol (30mg/kg) e das substâncias isoladas: Niga-ichigosídeo F1 e RI5-20 em úlceras gástricas induzidas por etanol/HCl em camundongos.............................................................................................................61

LISTA DE ABREVIATURAS

AIDS - Síndrome da imunodeficiência Adquirida

AINEs – Anti-inflamatórios não esteroidais

AMPc- AMP cíclico

ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária

ExtMB – Extrato Metanólico Bruto

FAE- Fração Acetato de Etila

FH – Fração Hexânica

FCHCl3 - Fração Clorofórmio

GSH – Glutationa reduzida

HCO3 - Bicarbonato de sódio

HCl - Ácido clorídrico

H2-Ras – Antagonistas de receptores de histamina-2

H. pylori – Helicobacter pylori

IBP- Inibidores da bomba de prótons

IC – Índice de Cura

I.P- Intraperitoneal

L-NAME – Ng-Nitro-Arginina-Metil Ester

NEM – N-etilmaleimida

NIGA- Niga-ichigosídeo

NO – Óxido nítrico

NOS – Óxido nítrico-sintase

OMS – Organização Mundial da Saúde

PG- Prostaglandinas

RI5-20- Ácido 2 β, 3 β, 19α-triidróxiursólico

SUS – Sistema Único de Saúde

SH- Compostos sulfidrílicos

TGI – Trato Gastrointestinal

UG- Úlcera Gástrica

ULI – Índice de Lesões Ulcerativas

V.O – Via oral

13

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15

2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 17

2.1 OBJETIVO GERAL:............................................................................................ 17

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: .............................................................................. 17

3 EMBASAMENTO TEÓRICO .................................................................................. 18

3.1 IMPORTÂNCIA DAS PLANTAS MEDICINAIS ................................................... 18

3.2 FAMÍLIA ROSACEAE......................................................................................... 21

3.3 GÊNERO RUBUS ............................................................................................... 21

3.4 DA PLANTA EM ESTUDO: RUBUS IMPERIALIS ............................................. 23

3.5 FISIOPATOLOGIA DA ÚLCERA E TERAPIA ANTIÚLCERA ........................... 26

3.5.1 SECREÇÃO GÁSTRICA ................................................................................. 26

3.5.2 SECREÇÃO DE MUCO ................................................................................... 28

3.5.3 ÚLCERA E AINES ........................................................................................... 28

3.5.4 ÚLCERA E HELICOBACTER PILORY ........................................................... 30

3.5.5 TRATAMENTO DA ÚLCERA GÁSTRICA ....................................................... 31

4 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 33

4.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL ............................................................ 33

4.2 PREPARAÇÃO DO EXTRATO E DAS FRAÇÕES ............................................ 33

4.2.1 OBTENÇÃO DOS COMPOSTOS: ................................................................... 34

4.3 ANIMAIS E ENSAIOS FARMACOLÓGICOS ..................................................... 35

4.3.1 ANIMAIS .......................................................................................................... 35

4.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIÚLCERA .................................................... 36

4.4.1 MODELO DE ÚLCERA INDUZIDA POR ETANOL ......................................... 36

4.4.2 ÚLCERA AGUDA INDUZIDA POR ANTI-INFLAMATÓRIO NÃO

ESTEROIDAL ........................................................................................................... 37

4.4.3 MODELO DE ÚLCERA CRÔNICA INDUZIDA POR ÁCIDO ACÉTICO .......... 38

4.5 MECANISMOS DE AÇÃO ANTIÚLCERA .......................................................... 38

4.5.1 AVALIAÇÕES DA SECREÇÃO GÁSTRICA E MUCO .................................... 38

4.5.2 LIGADURA DE PILORO .................................................................................. 38

4.5.3 DOSEAMENTO DE MUCO EM MUCOSA GÁSTRICA ................................... 39

14

4.6 PARTICIPAÇÃO DO ÓXIDO NÍTRICO ENDÓGENO ENVOLVIDO NA

GASTROPROTEÇÃO ............................................................................................... 40

4.6.1 PARTICIPAÇÃO DOS GRUPAMENTOS SULFIDRILA ENDÓGENOS SOBRE

O EFEITO GASTROPROTETOR ............................................................................. 40

4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................... 41

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 42

6 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 63

7 PERSPECTIVAS DO TRABALHO ........................................................................ 64

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 65

ANEXO A – PARECER DE APROVAÇÃO DO PROJETO DE PESQUISA PELO

COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA (CEP) DA UNIVALI ........................................ 76

APÊNDICE- ARTIGO CIENTÍFICO SUBMETIDO E ACEITO PARA A REVISTA

NAUNYN-SCHMIEDEBERG'S ARCH PHARMACOL .............................................. 79

15

1 INTRODUÇÃO

A úlcera gástrica (UG) é uma patologia que acomete considerável número de

pessoas no mundo. O uso abusivo de álcool, antiinflamatórios não esteroidais

(AINEs), o estresse, a hereditariedade, o tabagismo e a infecção por Helicobacter

pylori têm sido considerados os principais fatores de risco responsáveis pela lesão

da mucosa gástrica (MALFERTHEINER et al., 2007.; BABU et al., 2010).

A úlcera é uma doença heterogênea muito comum em indivíduos adultos.

Patologicamente consiste em uma perda de tecido da superfície interna do trato

digestivo que pode alcançar em maior profundidade à submucosa (SONNENBERG,

2006.; SOLL; GRAHAM, 2009). Tem sido reportado que a predisposição hereditária

está relacionada com aparecimento da UG, em alguns pacientes. O estresse

emocional e os fatores psicossociais também são freqüentemente identificadas

como importantes contribuintes para a patogênese da úlcera (ROSENSTOCK et al.,

2003).

Embora a incidência de úlcera em países ocidentais tenha diminuído ao longo

dos últimos 100 anos, cerca de 1 a cada 10 indivíduos ainda são afetados. Como a

prevalência da úlcera aumenta com o avanço da idade, é esperado que a doença

continuará a ter impacto significativo sobre a saúde, economia e qualidade de vida

dos pacientes (RAMAKRISHNAN; SALINAS, 2007).

Entre as principais classes químicas de componentes bioativos, com atividade

gastroprotetora são os alcalóides, saponinas, xantonas, terpenos, triterpenos,

taninos, flavonóides, compostos fenólicos, glicosídeos e polissacarídeos. (BAGGIO

et al., 2005; MORIKAWA et al., 2006; VASCONCELOS et al., 2010). Os compostos

fenólicos apresentam ampla gama de atividades fisiológicas que incluem

propriedades antioxidantes, antimicrobianas, antiinflamatórias, dentre muitas outras

(MANACH; MAZUR; SCALBERT, 2005.; HALLIWELL, 2007).

Rubus imperialis pertencente à família Rosaceae, apresenta em sua

composição alguns terpenos e derivados do ácido elágico e o principal componente

ativo identificado na planta foi o triterpeno Nigaichigosideo F1 (NIERO et al.,1999).

Algumas substâncias de origem vegetal, entre elas flavonóides, taninos e

terpenóides, têm apresentado atividade antiúlcera significativa, demonstrando o

16

potencial das plantas medicinais como fontes alternativas para o tratamento de

úlceras gástricas (DONANTINI et al., 2009).

Dessa forma ressalta-se a importância da busca por novos fármacos mais

eficazes e que apresentam menos efeitos indesejáveis para o tratamento dessa

patologia. Nesse contexto, as plantas medicinais e os produtos naturais ganham

grande importância, já que muitos extratos e/ou compostos isolados das mesmas,

têm apresentado resultados terapêuticos para o tratamento/prevenção de úlceras

gástricas (SANNOMIYA et al., 2005).

Diante do exposto o presente estudo teve como objetivo avaliar a atividade

gastroprotetora das partes aéreas do extrato metanólico e das frações: acetato de

etila, hexânica e clorofórmio de Rubus imperialis Cham. Schl. (Rosaceae), conhecida

como Amora branca, em diferentes modelos animais, tendo em vista os relevantes

resultados fitoquímicos e farmacológicos realizados anteriormente em nossos

laboratórios. Também duas substâncias isoladas da planta (Niga-ishigosideo-F1 e

Ácido 2β, 3β, 19α-triidróxiursólico) foram testadas.

17

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral:

Avaliar a atividade gastroprotetora do extrato metanólico bruto, e das frações

acetato de etila, hexânica e clorofórmio, substâncias isoladas obtidos das partes aéreas

de R. imperialis Cham. Schl. (Rosaceae) – amora branca em diferentes modelos

animais de úlcera.

2.2 Objetivos Específicos:

a) Avaliar atividade gastroprotetora do extrato metanólico bruto (ExtMB) e das

frações hexânica, clorofórmio e acetato de etila em modelos animais (etanol, AINEs

e ácido acético).

b) Avaliar as substâncias isoladas Niga-ishigosídeo F1 e Ácido 2β, 3β, 19α-

triidróxiursólico em modelo de etanol.

c) Avaliar a atividade do extrato e das frações sobre a secreção gástrica e

produção de muco.

d) Estudar possíveis mecanismos de ação antiúlcera (participação do sistema do

óxido nítrico e grupamentos sulfidrila).

e) Comparar a atividade gastroprotetora do extrato com fármacos utilizados na

terapia antiúlcera (omeprazol, cimetidina e carbenoxolona).

18

3 EMBASAMENTO TEÓRICO

3.1 Importância das Plantas medicinais

Conceitualmente, são consideradas plantas medicinais, aquelas que possuem

propriedades terapêuticas. Elas são amplamente utilizadas na medicina popular

contra várias patologias, e seu uso vem crescendo gradativamente ao longo dos

últimos anos devido a vários fatores, dentre os quais se destaca o baixo poder

aquisitivo da maioria da população que procura uma alternativa com menores

custos. De acordo com a Organização Mundial da saúde (OMS), no início da década

de 90, 65% a 80% da população, em países desenvolvidos, já utilizavam plantas

medicinais como única fonte de cuidados básicos de saúde (BUTLER, 2008).

De acordo com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)

(BRASIL, 2010), são considerados medicamentos fitoterápicos aqueles obtidos com

emprego exclusivo de matérias-primas ativas vegetais, cuja eficácia e segurança são

validadas por meio de levantamentos etnofarmacológicos, de utilização,

documentações tecnocientíficas ou evidências clínicas. Os medicamentos

fitoterápicos são caracterizados através do conhecimento de sua eficácia e dos

riscos de seu uso, como também pela reprodutibilidade e constância de sua

qualidade. A droga vegetal define-se como planta medicinal, ou suas partes, que

contenham as substâncias, ou classes de substâncias, responsáveis pela ação

terapêutica, após processos de coleta, estabilização, quando aplicável, e secagem,

podendo estar na forma íntegra, rasurada, triturada ou pulverizada.

Com a crescente utilização da fitoterapia por profissionais da saúde,

impulsionada pela produção científica nessa área, principalmente nas duas últimas

décadas, a cada dia, mais fármacos de origem vegetal são colocados no mercado e

introduzidos para uso terapêutico. Além disso, a realização de estudos

etnofarmacológicos possibilita o resgate, a preservação e o uso das plantas como

subsídio de pesquisa, do conhecimento popular ou tradicional. (GALVANNI;

BARRENECHE, 1994.; BOORHEM; LAGE, 2009).

Segundo Newmann e Cragg (2007), dos fármacos lançados entre os anos de

1981 e 2006, 6% eram oriundos de produtos naturais. Destes 28% eram derivados,

e 5% eram sintéticos, mas com o grupo farmacofórico obtidos de modelos naturais.

19

Houve grande destaque na participação desta fonte de fármacos, no campo do

combate ao câncer e às infecções. Cerca de 40% dos medicamentos existentes no

mercado são obtidos de forma direta ou indireta de fontes naturais, dos quais 20%

são oriundos das plantas. Atualmente os fitoterápicos representam cerca de 15% do

capital da indústria farmacêutica mundial, e avança em direção ao tratamento de

doenças de maior gravidade como vitiligo, psoríase e Síndrome da imunodeficiência

Adquirida (AIDS).

No Brasil, o surgimento da medicina popular com uso das plantas, teve seu

inicio com os índios, e posteriormente com contribuições dos negros e europeus. Na

época em que o Brasil era colônia de Portugal, os médicos restringiam-se às

metrópoles. Na zona rural e/ou suburbana, a população recorria ao uso das ervas

medicinais para os problemas de saúde. A construção desta terapia alternativa

surgiu da articulação dos conhecimentos dos indígenas, jesuítas e fazendeiros. Este

processo de miscigenação gerou diversificada bagagem de usos para as plantas e

seus aspectos medicinais, que sobreviveram dos nossos antepassados até os dias

atuais (ARAUJO,1979.; FIRENZUOLI; GORI; NERI, 2005).

De acordo com estimativas da Convenção da Diversidade Biológica, o Brasil

contém entre 15 e 20% de toda a biodiversidade mundial, sendo considerado a

maior do planeta em número de espécies endêmicas. Dados estatísticos indicam

ainda que existam 55 mil espécies de plantas, 517 anfíbios (294 endêmicos), 1.622

aves (192 endêmicas), 524 mamíferos (cerca de 130 endêmicos), 468 répteis (172

endêmicos), 3.000 espécies de peixes de água doce e cerca de 15 milhões de

insetos, muitos completamente desconhecidos. Mesmo com toda essa riqueza

biológica, o maior produto de exportação comercial do país (40%) refere-se a

espécies de plantas exóticas, que foram introduzidas como, por exemplo, a laranja, a

soja, a cana-de-açúcar e o eucalipto (LEWINSONHN; PRADO, 2002).

Como reportado anteriormente, a biodiversidade do Brasil é considerada uma

fonte de substâncias biologicamente ativas e, sua preservação é fundamental tanto

pelo valor intrínseco dessa imensa riqueza biológica, como pelo seu enorme

potencial como fonte de novos fármacos. Diante desta realidade, várias pesquisas

de bioprospecção dos nossos biomas vêm sendo incrementadas objetivando a

busca racional de bioprodutos de valor agregado (BARREIRO; FRAGA, 1999.;

COSTA, 2002).

20

O desenvolvimento sustentável de um país depende essencialmente de uma

política consistente de educação, ciência, tecnologia e inovação, sustentada na

preservação da natureza, na biodiversidade e na exploração racional de fontes

naturais necessárias para alimentação, avanço social e econômico, num cenário que

assegura a manutenção da saúde e a cura de doenças (BRAZ FILHO, 2010). No

Brasil, as pesquisas de descoberta de protótipos de fármacos e/ou fitofármacos,

além de propiciarem o avanço da pesquisa básica multidisciplinar, podem contribuir

também para o desenvolvimento tecnológico nacional, levando em conta que a

diversidade micromolecular dos inúmeros biomas brasileiros é ainda muito pouco

explorada como uma fonte de substâncias de interesse farmacológico (BARREIRO,

2009).

Medicamentos tradicionais são amplamente divulgados e estima-se que 80%

da população do mundo dependam deles como uma fonte de saúde primária. No

Brasil, as populações das zonas rurais e de florestas dependem da medicina popular

e tradicional para o tratamento de muitas doenças infecciosas. Algumas espécies

são incluídas nas prescrições para determinados fins terapêuticos, como a

cicatrização de feridas, inflamação, infecções microbianas ou parasitárias, lesões de

pele e úlceras (ALVES; ROSA, 2007).

As plantas têm sido amplamente reconhecidas como importante fonte da

maior parte dos componentes ativos em medicamentos terapeuticamente eficazes.

Vale ressaltar que através das pesquisas realizadas com os produtos naturais, foi

demonstrado que estes, além de serem utilizados como medicamentos, também são

ferramentas para revelar importante aspecto de ações e mecanismos fisiológicos,

devido a interações com os canais de membrana, receptores e vias metabólicas

(LORENZI; MATOS, 2000.; HARVEY, 2008).

Como preconizado pela Política Nacional de Plantas Medicinais e

Fitoterápicos (BRASIL, 2006), os fitoterápicos constituem importante fonte de

inovação em saúde, sendo objeto de interesses empresariais privados e fator de

competitividade do Complexo Produtivo da Saúde. O desenvolvimento do setor de

plantas medicinais e fitoterápicos pode se configurar como importante estratégia

para o enfrentamento das desigualdades regionais existentes em nosso país,

podendo prover a necessária oportunidade de inserção socioeconômica das

populações de territórios caracterizados pelo baixo dinamismo econômico e

indicadores sociais precários. A ampliação das opções terapêuticas ofertadas aos

21

usuários do Sistema Único de Saúde (SUS), com garantia de acesso a plantas

medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à fitoterapia, com segurança,

eficácia e qualidade, na perspectiva da integralidade da atenção à saúde, é uma

importante estratégia com vistas à melhoria da atenção à saúde da população e à

inclusão social.

Desta forma, as pesquisas com descoberta de novos produtos derivados

dessa ampla biodiversidade encontrada nas diferentes regiões do Brasil é de grande

relevância, tanto para avanço da pesquisa, em desenvolvimento tecnológico e

conhecimento científico sobre as plantas, inovação e isolamento de compostos

terapeuticamente eficazes para tratamento de diferentes patologias.

3.2 Família Rosaceae

Rosaceae consiste em uma grande família de plantas, a grande maioria dos

representantes é composta por especies frutíferas como ameixeira, cerejeira,

amoreira, framboesa, morangos, damasco, pêra, pêssego, dentre outras (JORGE;

MARKMAN, 1993). Tais plantas crescem em todas as partes do mundo,

especialmente em regiões temperadas. Algumas foram cultivadas há décadas, e são

conhecidas por sua variedade de frutas, utilizada para a fabricação de doces e

compotas. Na flora brasileira, a família é representada por cinco gêneros, ocorrendo

principalmente no sul do país. Muitas espécies são usadas na medicina popular para

tratar diferentes patologias (JOLY, 1991.; LIFE; BED, 1993).

3.3 Gênero Rubus

Rubus é um dos cem gêneros da família Rosaceae, com diversas classes de

compostos com atividades biológicas comprovadas. O Gênero Rubus é constituído

de muitas espécies que são empregadas na medicina popular de vários países para

o tratamento de diferentes patologias, especialmente diabetes mellitus. Estudos

fitoquímicos e farmacológicos têm mostrado que algumas espécies produzem

princípios ativos que exercem atividade gastroprotetora, antioxidante, antitumoral e

anti-inflamatória (PATEL; ROJAS-VERA; DACKE, 2004).

O gênero Rubus têm sido utilizada no uso popular para diversos efeitos

benéficos. Folhas de amora apresentam propriedades anti-inflamatória, antiviral e

22

antimicrobiana, bem como atividade anti-proliferativa contra as células cancerosas.

Estudos recentes focaram-se na identificação de componentes fenólicos das folhas

de Rubus, bem como a determinação da sua atividade antioxidante (PANIZZI et al,

2002.; DALL’ACQUA et al, 2008).

Estudos farmacológicos confirmaram várias indicações populares, incluindo

atividade antimicrobiana, antifúngica, antidiabética e antinoceptiva. Além disso, há

uma grande ocorrência de diferentes classes de compostos, destacando-se os

terpenóides, flavonóides e outros compostos fenólicos (NIERO; CECHINEL-FILHO,

2008).

A Rubus occidentalis é conhecida como framboesa preta, muito utilizada para

preparação de caldas, sorvetes, sucos e vinhos. Tem sido amplamente estudada

devido a presença de compostos antioxidantes. Os principais constituentes

fitoquímicos presentes nessa especie incluem as antocianinas, flavonóides, taninos

(proantocianidina), ácidos fenólicos e lignanas (HAGER et al, 2008). Como reportado

anteriormente, esta planta apresenta significativa capacidade antioxidante, a qual é

atribuída à alta concentração de antocianinas e compostos fenólicos totais

(SEERAM, 2008.; TULIO et al, 2008.; WANG; LIN, 2000). Estudos realizados têm

demonstrado propriedade anti-proliferativa para tumores de cólon, mama e próstata

(SEERAM et al, 2006). Jung et al (2009) relataram que o vinho de R. occidentalis

apresentou atividade antioxidante comparável à vinhos tinto importados, com

propriedade antitumoral para câncer de fígado.

Rubus aleaefolius é tradicionalmente utilizada no tratamento de problemas

hepáticos, bem como estomatite. Vários compostos foram isolados de diferentes

partes da planta, como triterpenóides glicosídeos e taninos hidrolisáveis (GAN et al,

1998.; GAN et al, 2000). A decocção das raízes é utilizada por nativos Anxi (que

vivem em regiões montanhosas da Província de Fujian) contra hepatite aguda e

outros tipos de patologias (SUN et al, 2004). Embora a terapia utilizando R.

aleaefolius sugere que esta pode ser realmente eficaz, ainda faltam estudos

científicos sobre sua eficácia para desordens hepáticas. Nenhum estudo sistemático

da planta foi realizado para se estabelecer qual é o principio ativo químico

responsável para a atividade hepatoprotetora. O que se tem observado na literatura

é que a decocção, o extrato etanólico e polissacarídeos provenientes da raiz de R.

aleaefolius tem a capacidade de melhorar as funções hepáticas em algumas

23

patologias de fígado (HONG et al, 2005.; YE et al, 2005.; CHEN et al, 2006.; ZHOU

et al, 2007).

O extrato das raízes de Rubus pinfaensis é utilizado na China para o

tratamento de queimaduras e, ensaios in vitro demonstraram significativa atividade

antibacteriana. A análise fitoquímica desta espécie revelou a presença de alguns

terpenóides como o ácido ursólico, euscáfico, 28-glicosil tormêntico e 19α-

hidroxiasiático (MAATTA-RIIHINEM et al, 2004).

Segundo Yoon et al (2010), Rubus coreanus possui propriedade antioxidante.

Os principais constituintes encontrados nessa espécie incluem ácido fenólico, ácido

linoléico, ácido linolênico, ácido oléico, ácido palmítico, ácidos orgânicos, triterpenos,

e flavonóides. Dentre os efeitos biológicos de R. Coreanus, destaca-se atividade

antioxidante, anti-fadiga, anti-fertilidade, adstringente, anti-osteoporose, anti-

diabética, anti-tumoral e anti-inflamatória (BAE et al, 2007.; KUA; MUN, 2008.; DO et

al, 2008).

Estudos foram realizados pelo NIQFAR/UNIVALI com a Rubus rosaefolius. A

planta é utilizada na medicina popular como anti-espasmódica, analgésica. Desta

espécie, foram obtidos das partes aéreas alguns esteróides como o estigmasterol, β-

sitosterol livre e glicosilado e os triterpenos ácido tormêntico e 28-metoxitormêntico.

Este último quando avaliado em camundongos no modelo de contorções abdominais

induzidas por ácido acético e modelo de dor induzida por formalina, apresentou-se

eficaz em diminuir o processo doloroso, incluindo a dor de origem inflamatória e

neurogênica (KANEGUSUKU et al., 2007).

Sugere-se que alguns desses compostos com estas propriedades descritas

anteriormente estejam presentes também em outros tipos de Rubus, como é o caso

da R. imperialis, objeto de pesquisa nesse estudo.

3.4 Da planta em estudo: Rubus imperialis

R. imperialis ocorre abundantemente no sul do Brasil, sendo conhecida como

amora-do-mato, amora-branca, amora rosa ou amora-brava (NIERO et al., 1999).É

uma planta arbustiva, samentosa, perene, de ramos angulosos, armados de acúleos

grandes, podendo atingir 4 a 5 m de comprimento. Flores com pétalas brancas, fruto

composto de inúmeras drupas verde-amareladas (Figura 01). Os frutos são

24

saborosos, suculentos e adocicados, esta espécie possui grande potencial para a

utilização em geléia, doces em calda e outros derivados ou até mesmo para consumo

in natura (BIANCHINI, 2010).

Figura 01: Partes aéreas, flores e frutos de Rubus imperialis (Fonte: SILVA-LOPES, 2010)

Estudos fitoquímicos realizados por pesquisadores do NIQFAR/UNIVALI,

demonstraram na planta a presença de alguns terpenos e derivados do ácido elágico

(Figura 2), como o niga-ichigosídeo F1 (ácido 23-hidroxitormêntico-28-O-glicosídeo)

(1), ácido 23-hidroxitormêntico (2), ácido 4’metil-3-O-metilelágico (3) e ácido 3-O-

metil-4’-O-α-ramnose elágico (4) (BELLA CRUZ et al., 2006).

Figura 02. Fitoconstituintes presentes na Rubus imperialis. Fonte: BELLA CRUZ et al (2006).

25

Esta planta, além de ser usada pelas comunidades rurais para o tratamento

de diabetes, é também utilizada para combater outras enfermidades, algumas

relacionadas à dor. Neste contexto, alguns extratos obtidos de diferentes partes da

planta (folhas, caule, raíz) foram testados em alguns modelos de dor específicos, os

quais mostraram-se ativos. O principal componente ativo foi identificado como o

triterpeno Nigaichigosideo F1, o qual foi isolado com alto rendimento das partes

aéreas. Este composto foi aproximadamente 30 vezes mais potente do que a

aspirina e o paracetamol, no teste de contorções abdominais induzidas por ácido

acético em camundongos, além de previnir tanto a dor de origem neurogênica, como

a dor de origem inflamatória no teste da formalina (NIERO et al., 1999).

ARDENGHI et al (2006), demonstraram que este triterpeno atua por diversas

vias de neurotransmissores para exibir seu efeito antinoceptivo, tais como a via

dopaminérgica, taquicininérgica, L-arginina-óxido nitrérgica e glutamatérgica.

Um ensaio simples de avaliação da citotoxicidade empregando o modelo da

Artemia salina foi conduzido com os extratos metanólicos das raízes, galhos e

folhas, juntamente com a fração em hexano e em acetato de etila das raízes e com

os compostos Niga-ichigosídeo F1, ácido 23-hidroxitormêntico e ácido 3-O-metil-4’-

O-α-ramnoseelágico. Apenas os extratos metanólicos e a fração em acetato de etila

mostraram citotóxicos em concentrações letais (CL50) abaixo de 1000 µg/mL. Já os

compostos isolados não evidenciaram nenhuma citotoxicidade, levando a crer que

esta atividade se dá em sinergismo por diversos constituintes do extrato

(KANEGUSUKU et al., 2002).

A substância Niga-ichigosídeo F1 também foi isolada da espécie Rubus

coreanus, e esse composto se mostrou efetivo inibindo inflamação em modelo de

artrite reumatóide e também atividade de reduzir lesões gástricas em modelo de

úlcera induzida por etanol em ratos (NAM et al., 2006).

Embora existam inúmeras referências a respeito de outras espécies do

gênero Rubus, poucos são os estudos científicos realizados com R. imperialis, tanto

fitoquímico quanto farmacologicamente (SILVA-LOPES, 2010). Desta forma, é de

grande importância estar investigando os efeitos da planta na atividade

gastroprotetora em ensaios farmacológicos in vivo.

26

3.5 Fisiopatologia da úlcera e terapia antiúlcera

Úlceras gástricas são lesões na mucosa gastrointestinal que atingem a

camada muscular da mucosa, que persistem e são geralmente dependente da

atividade ácido-péptica do estômago. As principais causas são a infecção pelo H.

pylori e consumo de antiinflamatórios não esteroidais (AINEs), incluindo aspirina

(SOLL; GRAHAM, 2009).

A patogênese da úlcera gástrica é complexa e multifatorial, e tem sido

estudada por várias décadas. Uma das causas está relacionada com desequilíbrio

entre o aumento da secreção de ácido gástrico e função defensiva da barreira da

mucosa, ou seja, o enfraquecimento da barreira da mucosa. Vários fatores

ambientais também contribuem para formação da úlcera. Dentre estes, podemos

citar o uso prolongado de antinflamatórios não esteroidais, uso abusivo de álcool,

cigarro e estress (MALFERTHEINER; CHAN; MCCOLL, 2007).

A UG pode aparecer na parte inferior do esôfago, estômago, primeira porção

do duodeno e menos frequentemente na segunda porção do duodeno e jejuno. O

lugar preferencial para úlceras gástricas é o ângulo da curvatura menor do

estomago, porém pode ocorrer em qualquer local a partir da cárdia até o piloro

(YUAN; PADOL; HUNT, 2006).

O sintoma predominante da UG não complicada é dor epigástrica, que pode

ser acompanhada por outros sintomas dispépticos como plenitude, distensão

abdominal, saciedade precoce e náuseas. Em pacientes com úlcera duodenal, a dor

epigástrica ocorre normalmente durante o estado de jejum ou durante a noite, e

geralmente é aliviada pela ingestão de alimentos ou de agentes neutralizantes de

ácido. Cerca de um terço dos pacientes também têm dispepsia, a maioria sem

apresentar esofagite erosiva (PRIMROSE, 2004.; SHAH, 2007).

3.5.1 Secreção gástrica

O estômago é anatomicamente dividido em quatro regiões: cárdia, fundo,

corpo e antro, formado por várias camadas de músculo liso e revestidas por uma

mucosa (KUTCHAI, 1996). Esse órgão secreta cerca de 2,5 litros de suco gástrico

por dia. As principais secreções exócrinas são pró enzimas; como a pró renina e o

27

pepsinogênio, sintetizadas pelas células principais ou pépticas; ácido clorídrico e

fator intrínseco, secretados pelas células parietais ou oxínticas (GUYTON, 2006).

A regulação da secreção de ácido pelas células parietais é de suma

importância na patologia da úlcera péptica. A secreção das células parietais é

constituída por uma solução isotônica de ácido clorídrico (HCl) (150 nmol/L) com pH

abaixo de 1, sendo que a concentração de íons hidrogênio é um milhão de vezes

mais alta que a do plasma. O HCl é secretado no canalículo da célula parietal por

um processo de três etapas (Figura 03):

• O processo de transporte ativo começa pelo transporte de íons K+ e Cl- para o

canalículo. O íon Cl- é transportado por bomba ou através do canal. O fluxo

dos íons Cl- cria um potencial negativo no canalículo, provocando o fluxo

passivo de íons K+ para o canalículo.

• Em seguida, o íon H+ é trocado pelo K+ pela bomba H+ - K+ - ATPase.

• A água entra no canalículo na direção do gradiente osmótico criado pelo

movimento de HCl no canalículo.

Figura 03. Representação esquemática do mecanismo de secreção de ácido pelo estômago. (Fonte: OLBE, CARLSSON, LINDBERG, 1998)

28

Os principais estímulos que atuam sobre as células parietais são:

• Gastrina;

• Acetilcolina;

• Histamina;

• Prostaglandinas E2 e I2.

3.5.2 Secreção de muco

A mucosa gástrica preserva sua integridade estrutural e funcional apesar da

contínua exposição a fatores nocivos, incluindo o ácido clorídrico e a pepsina, os

quais são capazes de digerir o tecido gástrico. No entanto, graças aos mecanismos

de defesa, tal digestão não acontece (LAINE et al., 2008).

O muco e o bicarbonato protegem a superfície do estômago das ações do

HCl e das pepsinas. A secreção do muco é estimulada por alguns dos mesmos

estímulos que intensificam a secreção de ácido e pepsinogênio, especialmente pela

acetilcolina (HOWARD; KUTCHAI, 2004).

O gel de muco protetor, que se forma sobre a superfície luminal do estômago

e as secreções alcalinas, constituem uma barreira chamada de barreira de mucosa

gástrica que previne os danos à mucosa pelos conteúdos gástricos. O muco permite

que as células epiteliais mantenham um pH quase neutro. A proteção do epitélio

gástrico depende tanto do muco quanto das secreções de HCO3. A barreira da

mucosa gástrica pode proteger o estômago mesmo quando as taxas de secreção do

HCl e das pepsinas estão elevadas. Entretanto, se a secreção de HCO3 ou de muco

for suprimida, a barreira mucosa gástrica fica comprometida, e as ações do ácido e

da pepsina na superfície do estômago podem ocasionar úlceras gástricas (BERNE

et al., 2009).

Evidências sugerem que em condições fisiológicas normais, a barreira de

bicarbonato junto ao muco é suficiente para a proteção da mucosa gástrica contra o

ácido e pepsina, apresentando também proteção ao duodeno (ALLEN;

FLEMSTROM, 2005).

3.5.3 Úlcera e AINEs

A associação entre a UG e o consumo de AINEs é conhecida há muito tempo.

Os antinflamatórios não esteroidais (AINEs) correspondem aos agentes

29

farmacológicos mais utilizados na prática clínica, devido ao seu amplo espectro de

indicações terapêuticas, tais como analgesia, inflamação, profilaxia contra doenças

cardiovasculares, importante analgésico pós-operatório, desempenhando grande

eficácia (KUMMER; COELHO, 2002). No entanto, as lesões agudas gastrointestinais

são os efeitos colaterais mais graves e frequentes dos AINEs, o que os tornam

responsáveis pela causa mais comum do desenvolvimento de úlceras

gastroduodenais nos países ocidentais e no mundo (GLAVIN; SZABO, 1992; YUAN

et al., 2006).

Os AINEs inibem a secreção tanto de muco quanto de HCO3 e podem causar

gastrites, hemorragia subepitelial, erosões e úlceras. Aproximadamente 10-40% dos

pacientes que fazem uso de AINEs por 3 meses podem ter úlcera gástrica e úlcera

duodenal, respectivamente. O consumo a longo prazo de AINEs aumenta cerca de 4

vezes o risco de complicações gastrointestinais (sangramento de UG e perfuração).

Freqüentemente UG associada ao consumo de AINEs é assintomática, mesmo

antes da ocorrência de alguma complicação (SINGH; TRIADAFILOPOULOS, 1999.;

HAWKEY, 2000.; WALLACE, 2001).

Tais agravos no tecido da mucosa gastrointestinal ocorrem devido à inibição

da enzima ciclooxigenase (COX), a qual se diferencia em pelo menos três isoformas

(COX-1, COX-2 e COX-3) e detém diferenças na sua regulação e expressão. Vale

ressaltar que a atividade de ambas é inibida por todos os AINEs, porém em níveis

variáveis, dependente do fármaco utilizado (MONTEIRO et al., 2008).

A COX-1, designada como constitutiva, contribui na integridade da mucosa

gastroduodenal, homeostase vascular, agregação plaquetária e modulação do fluxo

plasmático renal. A COX-2, corresponde à enzima indutível, com relevância na

modulação do fluxo sanguíneo glomerular e balanço hidroeletrolítico. Sua expressão

na maioria dos tecidos é indetectável, no entanto, no processo inflamatório esta se

encontra aumentada, e ainda, a presença de glicocorticóides inibe a COX-2, o que

pode explicar seus efeitos antiinflamatórios (WATTS, 2008).

A expressão de uma terceira variante catalítica da COX (COX-3) foi

demonstrada em estudos in vitro com linhagens de macrófagos. A singularidade é

que a expressão desta variante não originaria prostaglandinas pró-inflamatórias, mas

um membro da família das ciclopentanonas, a 15desoxe-D PGJ2, agonista dos

receptores ativadores de proliferação do peroxissomo (PPARs), com atividade

antiinflamatória. Se a hipótese de uma terceira ciclooxigenase com atividade

30

antiinflamatória estiver correta, a sua expressão pode resultar em períodos típicos de

remissão do processo inflamatório, como tem sido constatado em algumas doenças

crônicas, como a artrite reumática (COLVILLE-NASH; QURESHI; WILLIS et al.,

1988.; GILROY; TOMLINSON; WILLOUGHBY, 1998).

A COX-3, possivelmente uma variante da COX-1 (pois é derivada do mesmo

gene dessa isorforma), encontra-se distribuída principalmente no córtex cerebral,

medula espinhal e coração (CHANDRASEKHARAN; DAI; ROOS et al., 2002).

3.5.4 Úlcera e Helicobacter pilory

A infecção por H. pilory é reconhecida como uma das infecções crônicas mais

comuns, estimando-se que cerca de metade da população mundial esteja infectada.

É conhecido também que a sua prevalência varia consideravelmente com diversos

fatores sendo, geralmente, superior em meios socioeconômicos desfavorecidos em

que são comuns habitações com grandes aglomerados familiares e deficientes

condições higiênico-sanitárias – ambientes reconhecidos como propiciadores da

transmissão da bactéria. Dessa forma, a prevalências da infecção por H. pilory é

muito amplo variando com o grau de desenvolvimento das regiões. A maioria dos

países em desenvolvimento apresenta taxas superiores a 80% em contraste com os

20 a 40% dos países desenvolvidos (CAVE, 1997.; BROWN, 2000; SANTOS et al.,

2010).

Infecção por H. pilory é considerada a mais comum no homem e em

contrapartida é uma das causas da gastrite aguda e crônica. Entre 85-95% dos

pacientes com úlcera duodenal e 70-85% dos pacientes com infecção gástrica

apresentam a bactéria (GISBERT; PAJARES, 2003). Em um estudo realizado por

Aragão (1997), dos 86% dos pacientes que apresentavam úlcera duodenal, 78% dos

mesmos apresetaram infecção com H. pilory.

Grandes esforços científicos estão sendo realizados para o controle da H.

pylori, visto que a sua infecção é de difícil tratamento, por muitas vezes recorrente,

utilizando-se antibióticos específicos e inibidores de bomba, como por exemplo

amoxicilina e claritromicina, associada a esomeprazol (LEE et al., 1995.; SIQUEIRA

et al., 2007.; SOUZA et al., 2009).

31

Embora a incidência de úlceras causadas por H. pilory em países

desenvolvidos tenha diminuído, a úlcera péptica continua ser um importante desafio

para pacientes, médicos e investigadores (SOLL; GRAHAM, 2009).

3.5.5 Tratamento da Úlcera Gástrica

As terapias mais utilizadas para tratamento de úlceras gástricas consistem

nos seguintes mecanismos descritos:

• Fármacos que inibem ou neutralizam a secreção de ácido gástrico:

� Antiácidos que neutralizam o ácido gástrico (hidróxido de magnésio,

bicarbonato de sódio, trissilicato de magnésio, gel de hidróxido de alumínio).

� Antagonistas de receptores H2 da histamina (cimetidina, ranitidina, famotidina)

� Inibidores da bomba de prótons (IBP), inibem irreversivelmente a bomba H+-

K+- ATPase, a etapa terminal na via secretora de ácido (omeprazol,

pantoprazol, lansoprazol, esomeprasol, rabeprazol).

• Fármacos que protegem a mucosa (quelato de bismuto, sucralfato,

misoprostol).

Essas duas classes de medicamentos anti-secretores (inibidores da bomba

de prótons e antagonistas de receptores H2 da histamina), podem ser efetivas na

cura da doença aguda, porém nem o tratamento de manutenção nem o tratamento

intermitente com tais compostos previnem totalmente as recidivas de úlcera gástrica

(HUNT, 2005.; SCARPIGNATO, 2007).

Fármacos anti-úlcera incluindo os IBP e antagonistas dos receptores H2 estão

disponíveis para o tratamento da úlcera peptica, mas a avaliação clínica desses

fármacos mostrou incidência de recidivas, efeitos colaterais e interações

medicamentosas. Os efeitos indesejados desses fármacos tem sido a justificativa

para o desenvolvimento de novos fármacos anti-úlcera e, portanto, a busca de novas

moléculas através das plantas medicinais, as quais podem oferecer uma melhor

proteção e também diminuir as úlceras recidivas (LAKSHMI et al., 2010).

Sanders (1996), demonstrou que a classe de antagonistas dos receptores H2

pode desenvolver taquifilaxia, ou seja, redução da efetividade após o uso, com

pequena e fraca resposta do organismo ao medicamento ou até mesmo podem ter

pouca absorção por via oral, ocasionando a redução em até 50% de sua eficácia.

32

Já os IBP são, em geral, bem tolerados pelo organismo. Até o momento,

estudos sobre a tolerabilidade dos IBP descrevem que as reações adversas mais

comuns relatadas são: cefaléia, diarréia e náusea, com incidência de < 10%, valores

que são semelhantes quando comparados com placebo e antagonistas do receptor

H2 (SCOTT et al., 2002).

O tratamento da úlcera gástrica consiste basicamente em modular a secreção

ácida. A busca por novos fármacos que atuem por diferentes mecanismos auxiliaria

o tratamento como uma forma alternativa aos fármacos atuais ou para atuar em

sinergismo com estes e evitar alguns efeitos adversos dos tratamentos. As plantas

apresentam um grande potencial de moléculas bio-ativas, e nos dias de hoje temos

a tecnologia que nos permite isolar, testar e definir a segurança dos compostos

ativos e determinar parâmetros farmacológicos e farmacocinéticos (OSÓRIO, 2011).

Desta forma se torna necessário investigar/estudar terapias mais eficazes do

que as já existentes de forma que possam contribuir para o tratamento de úlceras

gástricas.

33

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 Obtenção do Material vegetal

Partes aéreas de R. imperialis Cham. Schl foram coletadas na localidade de

São Sebastião no município de Treze de Maio (SC) em agosto de 2008. Após a

coleta, o material foi limpo e seco em estufa a 40°C. As folhas foram separadas dos

galhos, estes foram então triturados em moinho de martelos. O peso total dos galhos

secos foi de 1,1 kg. Uma exsicata foi depositada no Herbário Barbosa Rodrigues sob

número VC-Filho nº 036.

4.2 Preparação do extrato e das frações

A preparação do extrato e das frações, bem como a purificação e purificação

dos compostos, foi realizada pelo acadêmico Jhonny da Silva Lopes, como trabalho

de conclusão de curso de Farmácia, UNIVALI, sob orientação do professor Doutor

Rivaldo Niero.

O material vegetal (galhos) foi submetido à maceração por 12 dias em

percolador com capacidade total de 5 litros empregando-se o metanol como líquido

extrator. Após este período, o extrato metanólico bruto (ExtMB) foi filtrado e

concentrado em rota evaporador à 50 °C, resultando numa massa total de 127,5 g

(12,7 %). A utilização de metanol como líquido extrator objetivou a obtenção de uma

maior quantidade de moléculas presentes no material vegetal (CECHINEL-FILHO;

YUNES, 1997).

A partir do ExtMB foram realizadas sucessivas partições líquido/líquido com

os solventes hexano clorofórmio e acetato de etila. Todas as frações também foram

concentradas em rotaevaporador a pressão reduzida para manter a integridade das

mesmas, tendo como rendimento (5,32g), (8,39g) e (9,25g), respectivamente

(SILVA-LOPES, 2010). Essa etapa visa uma pré-purificação do extrato bruto,

separando os compostos químicos por afinidade pelo solvente em questão

(CECHINEL-FILHO; YUNES, 1997).

Um fluxograma das extrações realizadas encontra-se na figura 4.

34

Figura 4 – Fluxograma resumido da preparação e obtenção das frações. (SILVA-LOPES,

2010).

4.2.1 Obtenção dos compostos:

Todas as frações passaram por um processo cromatográfico na tentativa de

isolar as substâncias de interesse farmacológico.

Neste sentido, a fração hexânica, foi submetida à coluna de sílica gel, a fase

móvel empregada foi uma mistura de hexano e acetona, partindo de hexano 100%

até a proporção de hexano/acetona 1:1, sendo a coluna finalmente eluída com

metanol 100%, obtendo-se 186 frações. Da subfração de maior grau de pureza foi

identificado o esteroide estigmasterol.

35

O material precipitado da fração hexano também foi cromatografado em

coluna aberta com sistema de solvente composto de clorofórmio e metanol, variando

gradativamente a polaridade desde 100% clorofórmio até 100% metanol. Esta

coluna originou 94 frações. A subfração que apresentou maior grau de pureza por

CCD foi denominada de RI5-20 e identificado como triterpeno denominado de Ácido

2β, 3β, 19α-triidróxiursólico.

Da mesma forma, a fração de acetato de etila foi cromatografada conforme

mencionado acima, utilizou-se clorofórmio e metanol em diferentes proporções como

fase móvel. Esta coluna apresentou rendimento de 146 subfrações, e na subfração

de maior grau de pureza foi identificado o triterpeno Niga-ichigosídeo F1, já isolado

previamente de Rubus imperialis.

4.3 Animais e ensaios farmacológicos

As doses estabelecidas nos experimentos foram baseadas em estudos

preliminares realizados no laboratório de experimentação animal. No estudo

farmacológico de plantas utilizaram-se doses crescentes correlacionadas para

possível observação da relação dose - resposta. Neste trabalho foi avaliado o efeito

do extrato metanólico bruto (ExtMB) utilizando-se as doses de 100 mg/kg, 250 mg/kg

e 500 mg/kg, e como modelos animais utilizou-se ratos. A dose utilizadas das

frações acetato de etila, hexano e clorofórmio foi de 250 mg/kg, e utilizou-se

camundongos. Para os compostos isolados a dose utilizada foi de 30 mg/kg, e

utilizou-se camundongos.

4.3.1 Animais

Para o ensaio farmacológico foram utilizados ratos machos e fêmeas wistar

pesando entre 150-200g, e camundongos machos e fêmeas swiss pesando entre

25-30g, provenientes do Biotério Central da Universidade do Vale do Itajaí –

UNIVALI. Os animais foram mantidos em caixas de polipropileno, acondicionados

em sala climatizada (22 ± 3 ºC), com período claro e escuro de 12 horas cada,

controlado automaticamente, tendo livre acesso à ração Labina e água. Doze

horas antes dos experimentos, os animais foram mantidos em jejum, com água ad

libitum.

36

Quanto aos aspectos éticos da experimentação animal, foram respeitadas as

normas preconizadas pelo COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal).

Os experimentos foram aprovados pela Comissão de Ética no uso de animais –

CEUA - Universidade do Vale do Itajaí (Protocolo 023/11p2) – Anexo A.

4.4 Avaliação da atividade antiúlcera

Para avaliação da atividade gastroprotetora do extrato metanólico bruto de R.

imperialis Cham. Schl e das suas respectivas frações (hexano, clorofórmio e acetato

de etila) foram utilizados diferentes modelos experimentais, todos baseados em

fatores etiológicos da doença, como: uso abusivo de álcool, antiinflamatórios não

esteroidais e aumento da secreção gástrica.

4.4.1 Modelo de úlcera induzida por etanol

O método empregado foi descrito por Morimoto et al. (1991), com algumas

modificações. Os animais (ratos) foram divididos em diferentes grupos (n=6) e foram

pré-tratados por via oral com omeprazol na dose de 30 mg/kg (Controle positivo),

veículo (controle negativo), ExtMB de R. imperialis nas doses de 100, 250 e 500

mg/kg. Utilizou-se camundongos para a utilização das frações e a dose das mesmas

(hexano, clorofórmio e acetato de etila) foi de 250 mg/kg.

Para a utilização das substâncias isoladas Niga-ichigosídeo F1 e Ácido 2β,

3β, 19α-triidróxiursólico, utilizou-se camundongos para os testes e a dose utilizada

estabelecida foi de 30 mg/ kg.

Após uma hora e meia dos tratamentos, foi administrado aos animais 1 mL de

álcool etílico 96 % (agente lesivo) por via oral, e uma hora e meia após a

administração do agente lesivo, os mesmos foram sacrificados por deslocamento

cervical. Em seguida, os estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura

maior, sendo esticados em placas de parafina, e através de Scanner, as imagens

obtidas foram captadas e analisadas por software de análise de imagens EARP, a

fim de determinar-se o número de lesões e o tamanho destas. Posteriormente foi

realizada a determinação da área total de lesão, porcentagem de área lesada e

37

índice de cura (IC) calculado através da severidade das lesões da mucosa gástrica,

classificadas como:

a) tipo 1 (T1): área da úlcera < 1 mm²;

b) tipo 2 (T2): área da úlcera de 1-3 mm²;

c) tipo 3 (T3): área da úlcera > 3 mm².

O índice de cura foi determinado como:

(%) da taxa de cura = (área controle negativo – área tratado X 100 Área do controle negativo

Os resultados foram expressos em porcentagem de área (%), quantidade total

de área lesada (mm²), índice de cura (IC).

4.4.2 Úlcera aguda induzida por anti-inflamatório não esteroidal

Foi empregada a metodologia descrita por Nwafor, Okwuasaba e Binda

(2000), com algumas modificações. Os animais (ratos) foram divididos em diferentes

grupos (n=6) e foram pré-tratados por via oral com cimetidina na dose de 100 mg/kg

(controle positivo), veiculo (controle negativo), ExtMB de R. imperialis nas doses de

100, 250 e 500 mg/kg. Utilizou-se camundongos para a utilização das frações e a

dose das mesmas (hexano, clorofórmio e acetato de etila) foi de 250 mg/kg.

Após uma hora e meia, os animais receberam 100 mg/kg de indometacina

(v.o).

Após doze horas da administração de indometacina os animais foram

sacrificados por deslocamento cervical e os estômagos retirados e abertos ao longo

da curvatura maior, esticados e através de Scanner, as imagens, captadas e

analisadas por software de análise de imagens EARP, a fim de determinar-se o

número de lesões e o tamanho destas.

Posteriormente foi realizada a determinação da área total de lesão,

porcentagem da área lesada e índice de cura (IC), conforme descrito anteriormente

no item 4.4.1.

38

4.4.3 Modelo de úlcera crônica induzida por ácido acético

A metodologia utilizada é descrita por Takagi, Okabe e Saziki (1969), com

algumas modificações. Utilizou-se ratos para esse modelo. Os ratos foram divididos

em 3 grupos (n=6). Em seguida foram anestesiados e submetidos a uma incisão

longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide. Após a exposição do estômago, foi

injetado na camada sub-serosa da parede externa do órgão 20 µL de solução de

ácido acético 30%, na face posterior.

O local foi pressionado por 30 segundos para evitar o extravasamento do

líquido injetado. Cuidadosamente o estômago foi lavado com salina e então realizou-

se a sutura da parede abdominal. Dois dias após a cirurgia e com os animais já

recuperados, foi realizado o tratamento que teve duração de sete dias. Os animais

receberam por via oral cimetidina na dose de 100 mg/kg (controle positivo), veículo

(água),e o ExtMB de R. imperialis, na dose 500 mg/kg.

Após os dias de tratamento os animais foram sacrificados por deslocamento

cervical, e os estômagos foram retirados e abertos ao longo da curvatura maior;

esticados e através de Scanner, as imagens foram captadas e analisadas por

software de análise de imagens EARP, a fim de determinar se ocorreu regressão da

lesão nos tratamentos quando comparados com o controle positivo e negativo. Foi

realizada a determinação da área total de lesão e a porcentagem de área lesada. O

índice de cura expresso pela equação:

(%) da taxa de cura = (área controle – área tratado) X 100 Área do controle

4.5 Mecanismos de ação antiúlcera

4.5.1 Avaliações da secreção gástrica e muco

4.5.2 Ligadura de piloro

39

Este experimento foi realizado conforme o método descrito por Shay et al.

(1945), com algumas modificações. Os animais (ratos) foram divididos em diferentes

grupos (n=6). Em seguida foram anestesiados e submetidos a uma incisão

longitudinal abaixo ao processo apófise xifóide, para amarração do piloro e a

administração por via intraduodenal dos diferentes tratamentos: cimetidina na dose

de 100 mg/kg (controle positivo), veículo (controle negativo), ExtMB de R. imperialis

nas doses de 100, 250 e 500 mg/kg. Utilizou-se camundongos para a utilização das

frações e a dose das mesmas (hexano, clorofórmio e acetato de etila) foi de 250

mg/kg.

Após os tratamentos, as incisões foram suturadas e quatro horas após a

cirurgia os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. As incisões foram

reabertas e após pinçamento da válvula cárdia (para evitar-se a perda do conteúdo

gástrico) o estômago foi retirado.

O conteúdo estomacal foi coletado e foram analisados os parâmetros:

volume, pH e concentração de íons hidrogênio. Após a determinação do volume e

de pH, foi adicionado 10 mL de água destilada à amostra e esta foi centrifugada por

10 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante foi titulado com solução de hidróxido de

sódio 0,01 N, utilizando-se fenolftaleína como indicador. Os resultados foram

expressos em mL (volume), pH e mEq/L/4h (Concentração de íons hidrogênio).

4.5.3 Doseamento de muco em mucosa gástrica

Este ensaio foi realizado de acordo com a metodologia descrita por Sun,

Matsumoto e Yamada (1991) com algumas modificações. Os ratos foram separados

em grupos (n=6). Após 12 horas de jejum, sob anestesia, foi realizada uma incisão

no abdômen e a ligadura do piloro foi feita. Imediatamente, após a ligadura do piloro,

o ExtMB de R. imperialis (100, 250 e 500 mg/kg) e das frações hexano, clorofórmio e

acetato de etila (250 mg/kg) foi administrado via intraduodenal. Carbenoxolona (250

mg/kg) foi utilizado como controle positivo, e 1 mL de veículo foi administrado como

controle negativo.

Os animais foram sacrificados 4 horas após os tratamentos. O conteúdo

estomacal foi imerso em 10 mL de solução de Alcian Blue (Alcian Blue 0,02%,

sacarose 0,16 M, acetato de sódio 0,05 M; pH 5,8 a 20 ºC) por 24 horas,

40

posteriormente foi centrifugado a 3.000 × 10 min. A absorção do sobrenadante foi

determinada por espectrofotometria em 615 nm. O muco livre do conteúdo gástrico

foi calculado a partir da quantidade de Alcian blue ligado ao tecido (tecido/mg de

peso (g)).

4.6 Participação do óxido nítrico endógeno envolvido na gastroproteção

O método empregado neste estudo é descrito primeiramente por Arrieta et al.

(2003), com algumas modificações. Nessa metodologia utilizaram-se ratos, os

mesmos foram separados em seis grupos (n=6), nos quais, três grupos receberam

pré-tratamento com L-NAME (N-nitro-L-Arginina metil éster), um inibidor da enzima

óxido nítrico sintase, na dose de 70 mg/kg, i.p. e os demais grupos foram pré-

tratados com salina, i.p. Os animais foram separados nos seguintes grupos: veículo

(água destilada) + L-NAME, veículo (água destilada) + salina, carbenoxolona (200

mg/kg) + L-NAME, carbenoxolona (200 mg/kg) + salina, ExtMB de R. imperialis (500

mg/kg) + L-NAME, ExtMB de R. imperialis (500 mg/kg) + salina.

Após 30 minutos dos pré-tratamentos, foi aplicado o teste de indução de

úlcera por etanol. Decorrido o tempo do teste, os animais foram sacrificados e os

estômagos retirados e abertos ao longo da grande curvatura, esticados e através de

Scanner, as imagens, então captadas e analisadas por software de análise de

imagens EARP, a fim de determinar-se a % de área lesada.

4.6.1 Participação dos grupamentos sulfidrila endógenos sobre o efeito

gastroprotetor

Para a avaliação da participação dos grupamentos sulfidrila na

gastroproteção, foi adotado o modelo de Matsuda e Yoshikawa (1999). Nessa

metodologia utilizaram-se ratos, os mesmos foram separados em seis grupos (n=6),

onde três grupos receberam o pré-tratamento com NEM (N-etilmaleimida), um

quelante de grupamentos sulfidrila, na dose de 10 mg/kg, i.p. e os grupos restantes

foram pré-tratados com salina, i.p. Os animais foram separados nos seguintes

grupos: veículo (água destilada) + NEM, veículo (água destilada) + salina,

carbenoxolona (200 mg/kg) + NEM, carbenoxolona (200 mg/kg) + salina, ExtMB R.

41

imperialis (500 mg/kg) + NEM, ExtMB de R. imperialis (500 mg/kg) + salina. Após 30

minutos dos pré-tratamentos, foi aplicado o teste de indução de úlcera por etanol.

Passado o tempo do teste, os animais foram sacrificados e os estômagos,

retirados e abertos ao longo da grande curvatura, esticados e através de Scanner,

as imagens então foram captadas e analisadas por software de análise de imagens

EARP, a fim de determinar-se a % de área lesada.

4.7 Análise estatística

Para a análise estatística dos resultados obtidos foi utilizada a análise de

variância (ANOVA) e para comparação das médias dos grupos testados utilizou-se o

teste de Dunnet e/ou Tukey, sendo os valores com p<0,05 considerados

estatisticamente significativos (SOKAL; ROHLF, 1995).

42

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO

As plantas medicinais estão entre as mais atrativas fontes de novos

medicamentos, particularmente o uso popular mostra que algumas plantas já vêm

sendo amplamente utilizadas para o tratamento de úlceras gástricas. Diversos

estudos comprovam os efeitos gastroprotetores de extratos e outros derivados

vegetais (BORELLI; IZZO, 2000.; VYAWAHARE, 2009). A atividade gastroprotetora

de uma substância não conhecida pode ser determinada em animais de

experimentação. Os modelos de triagem (etanol, AINE) são os mais utilizados

porque representam os agentes etiológicos mais comuns envolvidos na patologia de

úlcera gástrica humana.

Sendo assim, para avaliação inicial da atividade gastroprotetora do ExtMB de

R. imperialis, foi realizado modelo de úlcera induzida por etanol.

No presente trabalho, no modelo de etanol observou-se que os tratamentos

com o ExtMB (100, 250 e 500 mg/kg) e com o omeprazol (30 mg/kg) foram eficazes

em reduzir significativamente a área total da lesão (mm²) e porcentagem de área

lesada (Tabela 1). O ExtMB apresentou um Índice de cura de 55,56% para dose de

100mg/kg, 63,49% para dose de 250mg/kg e 78,14% para 500mg/kg. O fármaco

omeprazol apresentou um índice de cura de 86,62%.(Figura 5).

Tabela 1. Efeitos da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das diferentes

doses do ExtMB das partes aéreas de Rubus imperialis (100, 250 e 500 mg/kg) em

úlceras gástricas agudas induzidas por etanol/HCl em ratos.

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis ratos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. **p<0,01, quando comparado ao grupo controle.

Tratamento

(v.o)

Dose

(mg/Kg)

Área total de lesão

(mm2)

% de área

lesada

Índice de cura

(%)

Controle (-) - 175,68 ± 33,48 16,88 ± 2,65 -

Omeprazol 30 43,29 ± 10,48** 0,072 ± 0,015** 86,62 ± 4,78**

ExtMB 100 51,66 ± 21,67** 5,38 ± 1,81** 55,56 ± 5.59**

ExtMB 250 50,28 ± 17,16** 5,40 ± 1,86** 63,49 ± 10,23**

ExtMB 500 24,06 ± 11,40** 2,58 ± 1,82 ** 78,14 ± 6,87**

43

Figura 5 – Índice de cura do extrato metanólico bruto de R. imperialis (100mg/kg, 250mg/kg, 500mg/kg) e omeprazol (30mg/kg) em lesões induzidas por etanol. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais. ** denotam diferenças estatísticas quando comparados com controle. **p<0,01.

Na figura 6 estão representados os cortes de estômagos e suas

características macroscópicas.

Figura 6 - Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol em ratos, utilizando tratamento com extrato metanólico bruto de R. imperialis em diferentes concentrações e o fármaco omeprazol.

44

As frações de acetato de etila, hexânica e clorofórmica foram avaliadas neste

mesmo modelo de úlcera induzida por etanol na dose de 250 mg/kg, afim de

determinar-se qual ou quais delas seriam mais ativas. Observou-se que todas as

frações testadas e o omeprazol (30 mg/kg) mostraram-se eficazes para redução da

área total de lesão (mm²), % de área lesada (Tabela 2). Além disso, o índice de cura

obtido foi de 86,47% para FAE, 81,2% para FH, 85,63% para FCHCl3 e 92,12%

para o omeprazol.

Tabela 2. Efeito da administração oral de omeprazol (30mg/kg) e das diferentes

frações (acetato de etila, hexano e clorofórmio, na dose de 250 mg/kg) em úlceras

gástricas induzidas por etanol/HCl em camundongos.

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. **p<0,01, quando comparado ao grupo controle. Figura 7- Índice de cura das frações FAE, FH, FCHCl3 (250mg/kg) e omeprazol (30 mg/kg) em lesões induzidas por etanol. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais.** denotam diferenças estatísticas quando comparados com controle. **p<0,01.

Tratamento

(v.o)

Dose

(mg/Kg)

Área total de

lesão (mm2)

% de área

lesada

Índice de cura

(%)

Controle (-) - 36,87 ± 3,88 9,94 ± 1,28 -

Omeprazol 30 4,81 ± 1,50** 1,57 ± 0,59** 92,12 ± 3,15**

FAE 250 4,98 ± 1,77** 1,50 ± 0,48** 86,47 ± 4,79**

FH 250 4,99 ± 2,40** 1,71 ± 0,75** 81,2 ± 5,89**

FCHCl3 250 4,49 ± 0,70** 1,56 ± 0,27 ** 85,63 ± 1,17**

45

Na figura 8, estão representados os cortes de estômagos e suas


Figura 8- Imagens de estômagos após indução de úlcera por etanol em camundongos, utilizando tratamento com as diferentes frações e fármaco omeprazol.

O modelo de indução de úlcera por etanol apresenta dois papéis bastante

importantes: primeiro, ele indica a ação gastroprotetora dos extratos frente a um

agente extremamente lesivo, e, segundo, serve de triagem para verificação da dose

mais eficiente dos extratos (ARRUDA, 2008).

O etanol é uma substância tóxica e comumente utilizada com a finalidade de

produzir dano na mucosa gástrica em modelos experimentais. O etanol possui efeito

ulcerogênico e necrotizante, por sua capacidade lipossolúvel. Ele atravessa

facilmente a mucosa resultando dano na mesma (MATSUHASHI, et al., 2007). O

etanol é capaz de alcançar o epitélio da mucosa através do rompimento da barreira

muco-bicarbonato e suas ações celulares refletem em ruptura da parede dos vasos

sanguíneos. Assim, provocam lesões hemorrágicas, resultantes de danos oxidativos

das células do epitélio gástrico. Estes danos levam a constrição de veias e artérias

da mucosa gástrica, produzindo congestão, inflamação e lesão tecidual.

Provavelmente esses efeitos ocorrem devido a ações de lipoperoxidação, formação

de radicais livres, estresse oxidativo intracelular, alterações na permeabilidade e

46

despolarização da membrana mitocondrial que culminam na morte celular das

células do epitélio gástrico (REPETTO; LIESUY, 2002.; HIRUMA-LIMA , 2009).

Sabe-se que as lesões da mucosa gástrica provocadas pelo etanol não são

inibidas por agentes anti-secretores do tipo antagonista do receptor H2, como a

cimetidina, mas sim por indutores dos fatores defensivos da mucosa (MORIMOTO et

al., 1991). Dentre eles, destacam-se os inibidores de bomba de prótons (H+/K+

ATPase), os quais inibem a secreção ácida por se ligarem aos resíduos do

aminoácido cisteína (fator determinante para desencadear o processo) em uma

subunidade da bomba de prótons (PADILLA; NORIEGA, 2001). Diante disso,

justifica-se a utilização do fármaco omeprazol como controle positivo, o qual é

classificado como IBP.

De acordo com os resultados obtidos no presente estudo, no experimento de

indução de úlcera por etanol/HCl, os tratamentos com ExtMB (100, 250 e 500mg/kg)

e as frações FAE, FH e FCHCl3 (250mg/kg) demostraram efeito gastroprotetor

relevante, evidenciando uma capacidade importante do extrato e das frações em

impedir a formação de lesões que seriam geradas pelo etanol (Figura 6 e 8).

Outro modelo de triagem utilizada para avaliação do potencial gastroprotetor é

o de indução de úlceras gástricas por AINEs. É descrito na literatura, que os AINEs

que podem ser utilizados experimentalmente para indução de úlceras em animais de

laboratório. No presente estudo utilizou-se a indometacina como agente lesivo.

Os resultados apresentados na tabela 3, demonstram que no modelo de

úlcera induzida por indometacina, houve redução significativa de área total de lesão

e porcentagem de área lesada utilizando os tratamentos com cimetidina (100 mg/kg)

e com ExtMB R. imperialis (100, 250 e 500 mg/Kg), quando comparado ao grupo

controle negativo. Em adição, o ExtMB apresentou índice de cura de 49,50% para

dose de 100 mg/kg, 48,43% para a dose de 250 mg/kg, 59,99% para a dose de 500

mg/kg e 55,89% para o fármaco cimetidina (100 mg/kg) (Figura 9).

47

Tabela 3. Efeitos da administração oral de cimetidina (100 mg/kg) e das

diferentes doses do extrato ExtMB das partes aéreas de R. imperialis (100, 250 e

500 mg/kg) em úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina em ratos.

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis ratos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, **p<0,01,quando comparado ao grupo controle.

Figura 9- Índice de cura do extrato metanólico bruto de R. Imperialis e cimetidina (100mg/kg) em lesões induzidas por indometacina. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais. ** denotam diferenças estatísticas quando comparados com controle. **p<0,01

Tratamento

(v.o)

Dose

(mg/Kg)


(mm2)

% de área

lesada

Índice de cura

(%)

Controle (-) - 5,39 ± 0,77 0,56 ± 0,09 -

Cimetidina 100 2,60 ± 0,41* 0,34 ± 0,06* 55,89 ± 4,35**

ExtMB 100 3,16 ± 0,51* 0,2 ± 0,05* 49,50 ± 9,43**

ExtMB 250 2,97 ± 0,24* 0,28 ± 0,08* 48,43 ± 11,51**

ExtMB 500 1,58 ± 0,29** 0,13 ± 0,09** 59,99 ± 9,63**

48

Figura 10. Imagens de estômagos após indução de úlcera por indometacina em ratos, utilizando tratamento com extrato metanólico bruto de R. imperialis em diferentes concentrações e o fármaco cimetidina

Também foi observado nesse mesmo modelo que todas as frações utilizadas

na dose de 250 mg/kg, foram efetivas em diminuir de forma estatisticamente

significativa à área total de lesão (mm²) e % de área lesada. O fármaco cimetidina,

na dose utilizada (100mg/kg), se mostrou eficaz em todos os parâmetros analisados,

apresentando diferenças estatísticas significativas (Tabela 4).

O índice de cura obtido das frações (250 mg/kg) foi de 31,67% para FAE,

47,98% para FH, 61,44% para FCHCl3 e 87,75% para o fármaco cimetidina

(100mg/kg). De acordo com o índice de cura, de todas as frações testadas, a fração

clorofórmica apresentou-se mais ativa, seguida pela fração hexano. (Figura 11).

Tabela 4. Efeito da administração oral de cimetidina (100mg/kg) e das

diferentes frações: acetato de etila, hexano e clorofórmio, na dose de 250 mg/kg, em

úlceras gástricas agudas induzidas por indometacina em camundongos.

Tratamento

(v.o)

Dose

(mg/Kg)


(mm2)

% de área

lesada

Índice de cura

(%)

Controle (-) - 2,85 ± 0,19 0,75 ± 0,02 -

Cimetidina 100 0,35 ± 0,15** 0,14 ± 0,06** 87,75 ± 5,32**

FAE 250 1,78 ± 0,18** 0,53 ± 0,05* 31,67 ± 3,43**

FH 250 1,53 ± 0,34** 0,45 ± 0,09** 47,98 ± 7,54**

FCHCl3 250 1,22 ± 0,24** 0,42 ± 0,03** 61,44 ± 6,64**

49

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, **p<0,01, quando comparado ao grupo controle. Figura 11- Índice de cura das frações FAE, FH, FCHCl3 (250mg/kg) e cimetidina (100mg/kg) em lesões induzidas por indometacina. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais. ** denotam diferenças estatísticas quando comparados com controle. **p<0,01.

Na figura 12 estão representados os cortes de estômagos e suas


Figura 12. Imagens de estômagos após indução de úlcera por indometacina em camundongos, utilizando tratamento com as diferentes frações e fármaco cimetidina.

50

Com relação à indometacina, experimentalmente se tornou um fármaco de

primeira escolha para indução de lesão gástrica, devido ao seu maior potencial

ulcerogênico, em comparação com outros fármacos da classe. A administração

deste AINE, representa um modelo muito simples e eficaz para o estudo de

gastropatia ulcerativa induzida em animais, pois este AINE atua inibindo a síntese de

prostaglandinas e, consequentemente, diminuindo os mecanismos de citoproteção

da mucosa gástrica mediadas por estas substâncias (SULEYMAN el al., 2010).

A prostaglandina produzida pela mucosa gástrica, aumenta na presença de

agentes irritantes, e apresenta um papel citoprotetor importante, inibindo a secreção

ácida por reduzir a produção celular do monofosfato de adenosina (AMP) (BEEJAY;

WOLFE, 2000). A enzima ciclooxigenase (COX-1) converte o ácido araquidônico em

prostaglandina G2 reduzindo este intermediário a prostaglandina H2 (PGH2).

Sabe-se que a ação antiinflamatória dos AINEs ocorre principalmente através

da inibição da enzima COX (cicloxigenase) e, conseqüente, redução da produção de

prostaglandinas. Os AINEs não seletivos como a aspirina, a indometacina, dentre

outros provocam danos na mucosa gástrica por mais de uma via, como por exemplo,

ao inibirem COX-1 reduzem o fluxo sanguíneo, ao inibirem COX-2 aumentam a

aderência de leucócitos no endotélio vascular e por uma ação tópica direta causam

irritação da mucosa (WALLACE, 2006). Como descrito anteriormente úlceras

causadas por AINES envolvem mecanismos de inibição das cicloxigenases I e II, de

maneira a promover redução da produção de prostaglandinas E2. As prostaglandinas

possuem efeitos na síntese de muco e bicarbonato, na regulação da secreção ácida

e do fluxo sanguíneo da mucosa gástrica (CURTIS et al., 1995; HALTER et al.,

2001).

Segundo Suzuki et al (2000), outros fatores como a hipermotilidade gástrica e

infiltração ou ativação de neutrófilos estariam envolvidos com os processos iniciais

de formação das lesões causadas por AINEs. A redução dos níveis de

prostaglandina compromete a barreira mucosa, que é composta de muco e

bicarbonato e facilita a formação de lesões causadas pelas secreções gástricas

(ácida e enzimática).

No modelo experimental de úlcera por AINE, o ExtMB em todas as doses

utilizadas, e as frações hexano e clorofórmio, foram capazes de promover a

diminuição das lesões de forma significativa, desta forma isto indica que o extrato e

51

as frações são capazes de promover um efeito protetor sobre a mucosa (Figura 10 e

12), podendo estar relacionado com o aumento de síntese de prostaglandinas.

Dando continuidade ao trabalho, como foi observado que o extrato e as

frações exercem efeito gastroprotetor nos modelos de triagem (úlcera induzida por

etanol e indometacina), os quais são modelos agudos, foi então testado o modelo de

úlcera induzida por ácido acético, o qual permite avaliar atividade curativa e

cicatrizante do extrato em úlceras gástricas crônicas. O ácido acético, é ainda o

único modelo de úlcera gástrica que permite avaliar o processo de cicatrização e foi

introduzido pela primeira vez por Takagi et al (1969).

A atividade curativa do ExtMB de R. imperialis (500mg/kg) sobre úlceras

gástricas crônicas, foi avaliada após 7 dias de indução de lesão por ácido acético. O

índice de cura do extrato foi de 65,75%, ou seja, o extrato foi capaz de diminuir o

tamanho da úlcera em comparação ao grupo tratado com salina. O tratamento com

cimetidina também se mostrou efetivo, sendo que o índice de cura foi de 75,55%

(Tabela 5)

Tabela 5. Efeito do extrato metanolico bruto de R. imperialis e cimetidina no modelo

de úlcera crônica induzida por ácido acético em ratos.

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, **p<0,01, quando comparado ao grupo controle.

Tratamento

(v.o)

Dose

(mg/Kg)


(mm2)

% de área

lesionada

Índice de cura

(%)

Controle (-) - 25,74 ± 3,28 2,50 ± 0,18 -

Cimetidina 100 10,58 ± 3,14** 1,28 ± 0,36* 75,55 ± 6,95

ExtMB 500 11,72 ± 3,25** 1,22 ± 0,33* 65,75 ± 5,54

52

Figura 13 - Índice de cura do extrato Metanólico Bruto de R. imperialis e cimetidina em lesões induzidas por ácido acético em ratos. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM). ** denotam diferenças estatísticas quando comparados com controle. **p<0,01.

O modelo de úlcera induzida por ácido acético é o que mais se aproxima da

doença ulcerosa humana. Tem sido demonstrado que a aplicação de ácido acético

na superfície da serosa de estômagos de ratos resulta em úlceras muito

semelhantes às observadas em humanos em termos de localização, severidade e

cronicidade, bem como no que diz respeito ao processo de cicatrização. O dano

causado pelo ácido não se restringe a camada de muco e a submucosa, mas se

estende até a camada muscular (BONAMIN et al., 2011).

A lesão induzida por ácido acético ocorre por alterações de múltiplos fatores,

incluindo alterações nos níveis de prostaglandinas, de fatores de crescimento, óxido

nítrico e citocinas, além de mudanças no padrão de aderência do muco e alterações

na microcirculação (TARNAWSKI, 2005).

A cicatrização da úlcera gástrica é um processo complexo, que inclui a

reconstrução da mucosa através da formação do tecido de granulação na base da

úlcera, angiogênese e o reestabelecimento da arquitetura glandular. Nesse

processo, é especialmente importante a participação da PG gerada pela COX-2, já

que essa estimula a proliferação celular, promove angiogênese e restaura a

integridade da mucosa (KONTUREK et al., 2005).

Diante do exposto, como a cicatrização da úlcera envolve diversos

mecanismos, como descrito anteriormente, uma das possibilidades na qual o extrato

mostrou-se efetivo para promover a cicatrização, devido a sua ação antioxidante,

uma vez que a planta apresenta em sua composição compostos com ação

antioxidante e anti-inflamatória. Sugere-se que esses compostos atuem na

cicatrização das lesões geradas pelo ácido acético.

53

Antioxidantes são compostos que podem retardar ou inibir a oxidação de

lipídios ou outras moléculas, evitando o início ou propagação das reações de

oxidação em cadeia. De forma geral, denominam-se antioxidantes as substâncias

que presentes em concentrações baixas, comparadas ao substrato oxidável,

retardam significativamente ou inibem a oxidação do substrato. Os radicais formados

a partir de antioxidantes não são reativos para propagar a reação em cadeia, sendo

neutralizados por reação com outro radical, formando produtos estáveis ou podem

ser reciclados por outro antioxidante (ATOUI et al., 2005.; BARREIROS et al, 2006).

Devido aos resultados obtidos nos modelos utilizados anteriormente, que

mostraram potencial gastroprotetor e cicatrizante de lesões ulcerativas, passou-se

então a investigar possíveis mecanismos envolvidos neste efeito. Dessa forma, foi

realizado avaliação da secreção gástrica, através do modelo de ligadura de piloro.

A tabela 6 apresenta os valores de média e desvio padrão de volume, pH e

concentração de íons hidrogênio na secreção gástrica em animais, sob tratamento

com as diferentes doses (100, 250 e 500mg/kg) do ExtMB e o fármaco cimetidina

(100mg/kg).

Na avaliação de pH, todos os grupos tratados com o extrato e cimetidina

(tabela 6) tiveram diminuição significativa da acidez estomacal, caracterizada pelo

aumento de pH quando comparado ao grupo controle. Também foi observado que

todos os tratamentos foram eficazes em diminuir significativamente a concentração

de íons hidrogênio ([H+] mEq/l/4h) na secreção gástrica, quando comparados ao

grupo controle. No presente ensaio não se observou diferença estatística

significativa de volume de suco gástrico.

Tabela 6. Efeito do extrato metanólico bruto de R. imperialis nas diferentes doses

(100, 250 e 500 mg) e cimetidina, administrados intraduodenal, avaliando os

parâmetros obtidos no suco gástrico, através de ligadura de piloro em ratos.

Tratamento

(intraduodenal)

Dose

(mg/kg)

Volume

(mL)

pH [H+]

mEq/l/4h

Controle - 0,13 ± 0,02 4,53 ± 0,14 69,40 ± 5,94

Cimetidina 100 0,11 ± 0,01 4,74 ± 0,24 13,67 ± 3,43**

FAE 250 0,24 ± 0,07 5,36 ± 0,18* 15,89 ± 3,64**

FH 250 0,16 ± 0,04 4,79 ± 0,17 31,67 ± 7,91 **

FCHCl3 250 0,30 ± 0,06 4,94 ± 0,18 34,75 ± 1,06**

54

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis ratos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. **p<0,01, quando comparado ao grupo controle.

Neste mesmo ensaio (tabela 7), utilizando as diferentes frações, não se

constatou diferença estatística do volume de suco gástrico dos animais quando

comparado ao grupo controle negativo. Apesar de todos os tratamentos se

mostrarem eficazes em diminuir significativamente a concentração de íons

hidrogênio ([H+] mEq/l/4h) na secreção gástrica, somente a fração acetato de etila

apresentou diferença estatística significativa (5,36 ± 0,44) para aumento de pH

quando comparado ao grupo controle negativo, sugerindo que as mesma pode ser

efetiva e capaz de agir de modo parecido com o fármaco cimetidina.

Tabela 7. Efeitos da administração intraduodenal de cimetidina (100 mg/kg) e das

diferentes frações: acetato de etila, hexano e clorofórmio na dose de 250 mg/kg nos

parâmetros bioquímicos obtidos no suco gástrico de camundongos submetidos a

ligadura de piloro.

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, **p<0,01, quando comparado ao grupo controle.

No modelo de ligadura de piloro é possível avaliar alterações nos parâmetros

bioquímicos do conteúdo gástrico, como pH, acidez total e volume gástrico. Podendo

ser considerada com atividade anti-secretória as substâncias que afetam a acidez

gástrica (TOMA et al., 2004).

A via de administração utilizada no modelo de ligadura de piloro é via

intraduodenal, que permite investigar as ações do extrato por via sistêmica, não

tendo interações do contato direto com a mucosa gástrica. O tratamento dos animais

com ExtMB se mostrou efetivo em reduzir o pH e a acidez total da secreção ácida

gástrica, sugerindo que o extrato inibe especificamente a secreção de ácido, o que

Tratamento

(intraduodenal)

Dose

(mg/kg)

Volume

(mL)

pH [ H+]

mEq/l/4h

Controle - 0,9 ± 0,20 2,46 ± 0,14 94,76 ± 2,02

Cimetidina 100 1,2 ± 0,20 6,38 ± 0,34** 10,35 ± 1,32**

ExtMB 100 1,5 ± 0,22 3,31 ± 0,44** 29,11 ± 2,49**

ExtMB 250 1,1 ± 0,24 3,96 ± 0,16** 28,73 ± 5,52**

ExtMB 500 1,3 ± 0,23 4,10 ± 0,17** 26,65 ± 3,16**

55

leva a uma diminuição da acidez de forma gradual que não é acompanhada pela

diminuição do volume secretado. Essa diminuição da acidez estomacal contribui na

terapêutica da úlcera gástrica, pois a exposição da mucosa a altas concentrações de

ácido favorece a lesão epitelial (LAINE et al., 2008). A secreção ácida gástrica é finamente regulada por vias interdependentes

que incluem o sistema nervoso central, o sistema nervoso entérico e uma rede de

células neuroendócrinas e imunes, que atuam na modulação parácrina e hormonal

(SCHUBERT, 2004). Acredita-se que a secreção ácida seja liberada por reflexo

vagal em decorrência da distensão gástrica. Este procedimento estimula a secreção

do hormônio gastrina, cuja função no trato gástrico é estimular as células parietais a

secretar HCl (BAGGIO et al.,2005).

A interação da histamina, gastrina e acetilcolina com seus receptores nas

células parietais são os principais responsáveis pela ativação da bomba de prótons,

proteína secretadora de íon H+ que confere o pH ácido ao suco gástrico. Realizado

modelo de ligadura de piloro, foi então, analisado a quantidade de muco na mucosa

gástrica dos animais. Essa metodologia visa verificar participação do muco na

gastroproteção.

Com relação aos resultados obtidos (tabela 08), observa-se que o ExtMB

(100, 250 e 500 mg/kg) e a cimetidina (100mg/kg), não foram capazes de promover

aumento de muco na mucosa gástrica, quando comparado ao grupo controle

negativo. A carbenoxolona (250 mg/kg) mostrou-se efetiva, pois promoveu o

aumento de muco.

Tabela 8. Efeitos das diferentes doses do extrato metanólico de R. imperialis e

carbenoxolona na dosagem de muco em mucosa gástrica em ratos.

Tratamento

Itraduodenal

Dose (mg/kg) Alcian Blue ligado

(mg/g tecido)

Controle - 1,59 ± 0,09

Carbenoxolona 250 1,73 ± 0.02*

Cimetidina 100 0,87 ± 0,03

ExtMB 100 0,99 ± 0,08

ExtMB 250 1,00 ± 0,04

ExtMB 500 0,98 ± 0,07

56

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis ratos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, quando comparado ao grupo controle.

As frações acetato de etila, hexânica e clorofórmica na dose utilizada (250

mg/kg) também não foram capazes de aumentar a quantidade de muco presente na

mucosa gástrica quando comparado ao controle negativo. A cimetidina também não

promoveu aumento de muco presente na mucosa gástrica. A carbenoxolona (250

mg/kg) se mostrou efetiva, pois promoveu aumento de muco em mucosa gástrica

quando comparado ao grupo controle negativo. Os resultados são descritos na

tabela 9.

Tabela 9. Efeitos das frações (acetato de etila, hexano e clorofórmio) de R.

imperialis e carbenoxolona na dosagem de muco em mucosa gástrica em

camundongos.

Tratamento

Itraduodenal

Dose (mg/kg) Alcian Blue ligado

(mg/g tecido)

Controle - 7,92 ± 0,44

Carbenoxolona 250 9,46 ± 0,47*

Cimetidina 100 7,04 ± 0,53

FAE 250 7,07 ± 0,47

FH 250 7,67 ± 0,30

FCHCl3 250 7,29 ± 0,41

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet. *p<0,05, quando comparado ao grupo controle.

O muco gástrico é um componente protetor importante,consiste em um gel

viscoso, elástico e transparente, formado por água (95%) e glicoproteínas (5%), que

abrange toda mucosa gástrica, sendo a primeira linha de defesa contra o ácido, o

muco aderido juntamente com o bicarbonato secretado pelo epitélio, serve como

uma barreira contra a autodigestão (ALLEN; FLEMSTROM, 2005). O muco também

tem um importante papel na prevenção da agressão mecânica ao epitélio e fornece

um microambiente sobre a área lesionada que é rapidamente restituída. As

propriedades protetoras da barreira de muco dependem não somente da estrutura

do gel, como também da quantidade ou espessura da parede que recobre a

superfície da mucosa (WALLACE et al.,2006).

57

Como foi descrito anteriormente, os resultados obtidos nesse modelo

experimental, que teve como intuito a determinação do muco gástrico aderido a

mucosa, após o tratamento com ExtMB e as frações, indicaram que esses

tratamentos não foram capazes de aumentar de modo significativo a produção de

muco. Já a carbenoxolona se mostrou efetiva, mas esse resultado já era esperado,

sendo que este fármaco atua estimulando a produção de muco gástrico (FRANCO et

al., 1993).

Avaliado a participação do muco no efeito gastroprotetor, a próxima etapa do

presente trabalho foi verificar a participação do óxido nítrico endógeno e dos

grupamentos sulfidrila na gastroproteção.

Em modelos de avaliação da atividade gastroprotetora, verificou-se a

participação do óxido nítrico através da pré-administração de L-NAME (Nω-nitro-L-

arginina metil-éster), uma substância capaz de inibir a enzima óxido nítrico sintase.

uma substância capaz de inibir a enzima óxido nítrico sintase.

Quando os animais foram pré-tratados com L-NAME, e tratados com o ExtMB

(500 mg/kg), observa-se que houve diminuição da gastroproteção em relação aos

animais pré-tratados com salina e tratados com o ExtMB (Figura 14). Ou seja,

quando administrado L-NAME aos animais, o tratamento com ExtMB (500 mg/kg)

perde sua atividade gastroprotetora, evidenciando, desta forma que o NO está

envolvido na resposta protetora do extrato.

Os resultados obtidos para o ExtMB (500 mg/kg) no modelo de úlcera gástrica

induzida por etanol em ratos pré-tratados com L-NAME (70 mg/kg, i.p.) são

apresentados na figura 14.

58

Figura 14 – Efeito do Extrato Metanólico bruto de R. imperialis (500mg/kg) e carbenoxolona (200mg/kg) em lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com L-NAME. Resultados expressos em Média ± EPM de seis ratos. Estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01 quando comparados com o grupo controle, ##p<0.01 quando comparado ao grupo L-NAME, ♦ ♦ p<0.01 quando comparado ao grupo ExtMB.

controle L-name ExtMB L-name + ExtMB Carbex L-name + Carbex0

10

20

30

40

Tratamentos

**# #

**# #

**# #

**# #

% l

esão

Estudos demonstram que o pré-tratamento com L-NAME, acentua as lesões

gástricas induzidas por etanol (MATSUDA et al., 1999), pois a inibição pode resultar

em distúrbios de motilidade gastrintestinal, no fluxo de sangue, na secreção gástrica,

entre outros fatores (WALLACE; MA, 2001).

De acordo com os resultados obtidos, o efeito gastroprotetor do extrato

parece estar envolvido na via do óxido nítrico.

A importância do NO na defesa da mucosa do TGI é bem estabelecida. O

principal papel do NO sobre manutenção do fluxo sanguíneo, a partir de sua

liberação do endotélio, e da integridade do epitélio gástrico, estimulando a secreção

e síntese de muco e bicarbonato bem como prostaglandinas. O óxido nítrico

contribui na manutenção da integridade da mucosa por estar envolvido na regulação

do fluxo sanguíneo, da secreção gástrica, e por contribuir na síntese de

prostaglandinas (BRZOZOWSKI et al., 2005; FREITAS et al., 2011; WALLACE,

2008).

O óxido nítrico também contribui para a defesa da mucosa através de sua

propriedade citotóxica, uma defesa primaria contra as bactérias e parasitas que são

ingeridos (MARCINKIEWICZ et al., 2000, TULASSAY; HERSZENYI, 2010).

♦ ♦

♦ ♦

59

No modelo de indução de úlcera por etanol, o dano provocado à mucosa está

associado com um significativo decréscimo nos níveis de compostos sulfidrílicos

(SH) da mucosa, como por exemplo, o da glutationa reduzida (GSH), e o pré-

tratamento com bloqueadores de SH reverte a gastroproteção dos compostos

sulfidrílicos (SBAZO et al., 2001).

Quando pré-administrado NEM, e utilizado tratamento com ExtMB (500

mg/kg), o extrato perde sua atividade gastroprotetora quando comparado com os

animais tratados somente com ExtMB (500 mg/kg), ou seja o efeito gastroprotetor é

dependente dos compostos sulfidrílicos.

Os resultados obtidos para o ExtMB (500 mg/kg) no modelo de úlcera gástrica

induzida por etanol em ratos pré-tratados com NEM (10 mg/kg, i.p.) são

apresentados na figura 15.

Figura 15- Efeitos do ExtMB de R. imperialis (500 mg/kg) e carbenoxolona (200 mg/kg) em lesões induzidas por etanol em ratos pré-tratados com NEM. Resultados são Média ± EPM de seis ratos. Estatística foi feita por comparação usando ANOVA e pós teste de Tukey. **p<0.01 quando comparados com o grupo controle, # #p<0.01 quando comparado ao grupo NEM, ♦♦ p<0.01 quando comparado ao grupo ExtMB.

Controle Nem ExtMB Nem + ExtMB Carbexonolona Nem + Carbex 0

10

20

30

40

**# #

**# #

# #

**# #

Tratamentos

% o

f le

sio

n a

rea

♦ ♦

♦ ♦

♦ ♦

60

Os grupamentos sulfidrílicos participam da proteção da mucosa pela ligação a

radicais-livres (antioxidante) e por formar pontes dissulfeto entre as subunidades do

muco de maneira a impedir a sua dissociação (AVILLA et al, 1996). Sendo assim, os

grupamentos sulfidrilas são responsáveis pela manutenção da integridade gástrica

por estimular a produção de muco e mantê-lo, assim como desempenham papel

antioxidante por evitar que espécies reativas de oxigênio causem dano à mucosa

(NATALE et al., 2004; HIRUMA-LIMA et al., 2009).

Os grupamentos estão presentes na glutationa, uma substancia endógena

que, em sua forma reduzida, tem importância na redução do estresse oxidativo, por

eliminar radicais livres, reduzir peróxidos e por se complexar com compostos

eletrofilícos de maneira a proteger estruturas celulares proteicas, DNA e lipídeos,

além de proteger a célula de outros produtos tóxicos (HAYES; MCLELLAN, 1999.;

KIMURA et al., 2001).

O composto químico NEM apresenta a propriedade de quelar as pontes

dissulfeto, as quais são responsáveis pela manutenção da conformação da barreira

mucosa gástrica. Sendo assim, a pré-administração de NEM provocou um

significativo aumento das lesões gástricas em todos os grupos experimentais,

quando comparados aos grupos pré-tratados com salina (Figura 15).

O grupo tratado com a carbenoxolona, utilizada como controle positivo,

apresentou diferenças estatísticas. A carbenoxolona atua promovendo aumento da

síntese de muco gástrico e assim auxilia na proteção da mucosa, auxiliando desta

forma na proteção das lesões gástricas (NAGAYAMA et al., 2001).

O ExtMB demonstrou exercer gastroproteção tanto através do envolvimento

de NO quanto de SH, indicando que seus efeitos sobre a mucosa gástrica estão

dependentes destes compostos para exercer seu mecanismo de ação.

Considerando os resultados obtidos nos modelos anteriores, e que os estudos

fitoquímicos levaram ao isolamento das substancias Niga-ichigosídeo F1 e RI5-20,

essas duas substâncias foram testadas em modelo de úlcera induzida por etanol em

camundongos (Tabela 10).

Observou-se que as duas substâncias mostraram-se efetivas para todos os

parâmetros avaliados, vale ressaltar que elas foram mais efetivas do que o fármaco

omeprazol. O índice de cura obtido foi de 98,43% para substancia Niga-ichigosideo

(30 mg/kg), 99,22% para RI5-20 (30mg/kg), e 92,12% para o omeprazol (30 mg/kg).

61

Tabela 10. Efeito da administração oral de omeprazol (30 mg/kg) e das substâncias

isoladas: Niga-ichigosídeo F1 e RI5-20 em úlceras gástricas induzidas por

etanol/HCl em camundongos.

Resultados apresentados como média ± Erro Padrão da média (EPM), com um grupo de seis camundongos. Comparação estatística realizada utilizando ANOVA seguida pelo teste de Dunnet.

*p0,05, **p<0,01, quando comparado ao grupo controle. Figura 16. Índice de cura das substâncias isoladas: Niga-ichigosídeo F1 e RI5-20 (30mg/kg) e do omeprazol (30 mg/kg) em lesões induzidas por etanol em camundongos. Resultados expressos como Média ± Erro Padrão da Média (EPM) de seis animais.

Em um estudo realizado por Nam et al. (2006), no qual se avaliou o Niga-

ichigosideo F1, isolada da R. coreanus, sobre o efeito de lesões gástricas induzidas

por etanol em animais de laboratório, observou-se que na dose de 10 mg/kg não

houve diminuição significativa na lesão da úlcera quando comparado ao grupo

controle, porém quando utilizada dose de 30 mg/kg houve significativa diminuição.

Esse estudo corrobora com o presente trabalho, onde a dose utilizada da mesma

Tratamento

(vo)

Dose

(mg/Kg)

Área total de

lesão (mm2)

% de área

lesada

Índice de cura (%)

Controle (-) - 36,87 ± 9,5 9,94 ± 3,14 -

Omeprazol 30 4,81 ± 3,36** 1,57 ± 1,33** 92,12 ± 7,06**

Niga-ichigosideo F1 30 0,57 ± 1,72** 0,12 ± 0,22** 98,43 ± 1,29**

RI5-20 30 0,25 ± 0,33** 0,05 ± 0,06** 99,22 ± 0,37**

** ** **

62

substância (Niga) foi de 30 mg/kg, e mostrou-se efetiva em diminuir

significativamente a área total de lesão e % de área lesada.

No presente estudo ressalta-se também a ação da substância RI5-20, isolada

pela primeira vez da Rubus imperialis, demonstrando atividade gastroprotetora em

úlcera induzida por etanol.

Como revisado na literatura, gênero Rubus, apresenta em sua composição

terpenos, flavonoides e outros compostos fenólicos. Sabe-se que esses compostos

estão envolvidos na gastroproteção. Essa gastroproteção pode estar relacionada

com a manutenção da integridade da mucosa gástrica, que depende da manutenção

da microcirculação, e atividade de enzimas antioxidantes (KWIECIÉN et al, 2004).

Os resultados obtidos no modelo de úlcera induzida por etanol sugerem

indiretamente que o ExtMB, as frações e as substâncias isoladas apresentem efeitos

gastroprotetores por aumentar a citoproteção favorecendo os processos

antioxidantes.

Estudos demonstram que os compostos fenólicos têm um grande papel como

seqüestradores de radicais livres e por isso, se tornam importantes para a prevenção

e terapia da úlcera gástrica. Também é descrito na literatura que os compostos

polifenólicos, como o ácido gálico, elágico e seus derivados são capazes de inibir a

bomba protônica, presente na célula parietal, participando assim na proteção

estomacal contra agentes danosos (TAEKO et al, 2001.; RAO et al, 2008).

Sendo a substância Niga-ichigosideo F1 um triterpeno, uma das

possibilidades sobre a atividade gastroprotetora da planta, seria devido à ação deste

triterpeno.

Deste modo, sugere-se que o extrato bruto de R. imperialis, frações, e

substancias isoladas avaliados neste trabalho apresentam atividade gastroprotetora

na prevenção e cicatrização de úlceras gástricas, provavelmente relacionada as

propriedades farmacológicas descritas dos compostos antioxidantes (fenólicos)

encontrados no extrato, uma vez que reduziu os níveis de lesão no modelo de

etanol, AINEs e mostrou-se efetiva em reduzir acidez estomacal no modelo de

ligadura de piloro e eficaz na atividade cicatrizante no modelo de úlcera crônica por

ácido acético.

63

6 Conclusão

Por meio dos resultados obtidos nos modelos realizados no presente estudo,

conclui-se que o Extrato Metanólico Bruto e as frações utilizadas de Rubus

imperialis:

- Apresentaram atividade gastroprotetora para úlceras induzidas por etanol e

anti-inflamatório não esteroidal (AINEs);

- O extrato metanólico bruto na dose utilizada apresentou atividade curativa

em modelo de lesão gástrica crônica induzida por ácido acético;

- A atividade gastroprotetora do extrato metanólico bruto e das frações

acetato de etila, hexânica e clorofórmica está provavelmente relacionada com a

diminuição da secreção gástrica ácida, não estando relacionada com o aumento da

produção de muco;

- A ação gastroprotetora é dependente da ação do óxido nítrico e dos

compostos sulfidrílicos;

- As substâncias isoladas (Niga-ishigosideo F1 e Ácido 2β, 3β, 19α-

triidróxiursólico) apresentaram efeito gastroprotetor em modelo de indução de úlcera

por etanol quando comparado ao controle negativo e se mostraram tão efetivas

quanto o fármaco omeprazol.

A substância RI5-20 (Ácido 2β, 3β, 19α-triidróxiursólico) foi isolada pela

primeira vez da R. imperialis, e apresentou atividade gastroprotetora em modelo de

úlcera induzida por etanol.

64

7 PERSPECTIVAS DO TRABALHO

- Quantificar óxido nítrico;

- Testar o extrato e as frações em modelo de bomba de prótons;

- Dosar enzimas presentes no estômago e mucosa com finalidade

antisecretória;

-Testar as substâncias isoladas em diferentes modelos de úlcera gástrica;

- Dosar perfil antioxidante do extrato metanólico e das frações de R. imperilis

in vitro;

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ANEXOS

Anexo A – Parecer de aprovação do projeto de pesquisa pelo Comitê de Ética

em Pesquisa (CEP) da UNIVALI

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APÊNDICE- Artigo Científico submetido e aceito para a Revista Naunyn-

Schmiedeberg's Arch Pharmacol

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AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE GASTROPROTETORA DE Rubus