Manoel Teixeira Souza Júnio,-2Edilson Paiva3

AVALIAÇÃO DE PROCEDIMENTOS DE ISOLAMENT? E PURIFICAÇÃO DE .- DNA DE MILHO (Zea mays L.)

RESUMO

Foram avaliados 5 procedimentos de ísotarnentoe purificação de DNA genõmico de milho. Oprocedimento A, que utiliza N- lauroylsarcosine e Proteinase K, mostrou-se coma o que mais seaproxima do ideal, porém, apresenta a utilização e 1 mg de Proteinase K por amostra como fatorltrnltante. O uso de uma proteinase de amplo espectro se mostrou necessário ao processo depurificação de DNA.

TERMOS PARA INDEXAÇÃO: CTAS, RFLP;-'Profeinase' K, marcadores moleculares

INTRODUÇÃO

Atualmente, com O avanço do uso demarcadores genéticos, como a técnica e"Restriction Fragment Lenght Polymorphism"(RFLP), em programas de melhoramento deplantas, é importante considerar a maneira pelaqual o DNA de planta será isolado e purificado,visto que a qualidade da mesma e defundamental importância para a aplicação datécnica de RFLP a nível de laboratório.

Em alguns momentos, como na seleçãomassal em população de milho, uma únicaplanta é representante de um material a serselecionado em um processo de melhoramento.Isso leva à necessidade de um procedimento deisolamento e purificação de DNA que não exijao sacrifício da mesma, nem comprometasubstancialmente a obtenção da sua progênie.

O DNA alvo, seja qual for a fonte, devepreencher um requerimento essencial, isto é,deve ser de alto peso molecular. O isolamentode DNA de alto peso molecular que sejaadequado para a digestão com endonucleasesde restrição pode ser um sério obstáculo aoprocesso de estudos a nível molecular emmuitas espécies (KAISER & MURRAY, 1985 eDOYLE et alii, 1990). - " '

É inevitável que se proceda a certo grau dequebra durante o isolamento do DNA genõmico,devido ao choque mecânico durante o processoe à ação de enzimas degradativas liberadasdurante a ruptura das células. Essas enzimas seencontram principalmente no citoplasma e, deuma maneira geral, os procedimentos descritosna literatura não se preocupam em separar

inicialmente o núcleo do restante da célula,excetonodescríto por DAVIS et alii (1986).

Os vegetais são particularmente notórios peladificuldade de se trabalhar com eles em algunsprocedimentos de isolamento de DNA.principalmente pelas características inerentes àparede celular que envolve o protoplasmavegetal. Aléín do mals, um procedimento quetrabalha com um grupo de plantas pode não sersatisfatório com outro, devido à diversidadeencontrada entre as plantas e seus compostossecundários. Além disso, são desvantajososquando se necessita isolar o DNA de um grandenúmero de indivíduos. Os métodos que utilizamgradiente de CsCI (cloreto de césio) consomemtempo e são caros (DOYLE et alii, 1990).

Desde SAGHAI-MAROOF et alii (1984). algunsautores têm salientado o uso de procedimentoscom CTAS (hexadecyltrimethylammoniumbromide), os quais se caracterizam por seremrelat,ivamente baratos e por apresentarem altaprodução de DNA a partir de pequenaquantidade de tecido (HOISINGTON et alii.1988; UMC RFLP MANUAL, 1989 e DOYLE et alii,1990). .

O objetivo deste trabalho foi avaliarprocedimentos de isolamento e purificação deDNA .de alto peso molecular visando a futurasapllcaçô es da técnica de poliformismo decomprimento .de fragmento de DNA (RFLP) nomelhoramento do milho. O procedimento ideal éaquele que, partindo de pequena quantidade detecido de uma uníca planta. gere uma grandequantidade de DNA de alto peso molecular, combaixa taxa de degradação e alto grau de pureza;

1 Trabalho desenvolvido como parte da dissertação de Mestrado do primeiro autor.2 Engenheiro Agrônomo, MSc., CNPMF:EMBRAPA. Cx. Postal 007. CRLZ DAS ALMAS. BA.3 Engenheiro Agrônomo. PhD .. CNPMS/EMBRAPA. Cx. Postal 151. SETE LAGOAS, MG.

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além de ser um procedimento rápido, simples ede baixo custo.

MATERIAL E MÉTODOS

• Preparo de amostrasPlantas com 30 dias, após a semeadura, foram

liofilizadas (Continuous Freeze Dryer, NewBrunswick Scientific C.O., Inc. Edison, N.J.,USA) e imed iatamente moídas em moinhoThomas Wiley Intermediate Mill, com malha 0,5mm. As amostras foram acondicionadas emfrascos de vidro com tampa e armazenadas a20°C até o isolamento do DNA.

• Procedimentos utilizados

- HOISINGTON et alii (1988)O DNA genômico foi extraído incubando 400

mg de tecido liofilizado e moído em 9 ml detampão de extração (Tris-HCI 0,1 M pH 7,5; NaCI0,5 M; EDTA 0,1 pH 8,0; beta-mercaptoetanol0,14 M e CTAS 1%), a 60°C durante 90 minutos.

""A purificação se deu adicionando 4,5 ml declorofórmio: octanol (24: 1), misturando durante5 minutos por inversões suaves e centrifugandoa 3000 rpm (2508-M05 Clay Adams DynacHorizontal Rotor), por 10 minutos à temperaturaambiente. Transferiu-se o sobrenadante paraoutro tubo de ensaio e repetiu-se a purificaçãoaté que o mesmo se tornasse amarelo. Após apurificação, o sobrenadante, aproximadamente5 ml, foi tratado com(5mmicrolitros de RNAse A(10 mg/ml), por 30 -rrlinutos à temperaturaambiente. O DNA livre de RNA foi precipitadoadicionando 6 ml de isopropanol a -20oC/eagitando por inversões suaves. Após aprecipitação o DNA foi "pescado", utilizandouma pipeta de Pasteur, tendo a extremidade emforma de anzol, lavado em solução de etanol76% com acetato de sódio 0,2 M durante 20minutos à temperatura ambiente e em soluçãode etanol76% com acetato de amônio10 mM por10segundos à temperatura ambiente. O DNA foiressuspenso em um microtubo contendo 1,0 mlde TE pH 7,5 JTris 10 mM; EDTA 1 mM) earmazenado a 4 C até a sua utilização.

- UMC RFLP MANUAL (1989)Esse procedimento é uma modificação do

descrito acima. Após a precipitação do DNA, omesmo foi ressuspenso em TE pH 7,5 àtemperatura ambiente, por uma noite, sob lentaagitação. A seguir ele foi submetido a um novoprocesso de purificação com fenol equilibradocom Tris-HCI 0,1 M pH 8,0 e hidroxiquinolina0,1%, conforme MANIATIS et alii (1982) e a umprocesso de purificação por mistura comclorofórmio:octanol (24: 1). O DNA foinovamente precipitado adicionando 50

microlitros de NaCI 5 M e 2,5 ml de etanol 95%a -20°C. Após a precipitação, o DNA foi"pescado" e lavado como descrito emHOISINGTON et alii (1988).

- DOYLE et alii (1990)O DNA genômico foi extraído, incubando-se

400 mg de tecido lloflllzado e moído em 9 mltampão de extração (Tris-HCI 0,1 M pH 7,5; NaCI1,4 M; EDTA 20 mM pH 8,0; beta-mercaptoetanol

.0,02 M; CTAS 2%) a 65°C durante 30 minutos. Apurificação foi realizada como a descrita noprocedimento HOISINGTON et alii (1988). Osobrenadante, quando apresentava coloraçãoamarela, foi transferido para outro tubo e osácidos nucléicos foram precipitados,adicionando 6 ml de isopropanol a -20°C emisturando por inversões suaves. Após serem"pescados" foram lavados em 10 ml de etanol76% com acetato de amônio 10 mM por pelomenos 20 minutos à temperatura ambiente,seguindo-se então a secagem à temperatura eadição de 1 ml d TE pH 7,5. O tratamento comRNAse A foi realizado adicionando-se 1microlitro de solução estoque 10 mg/ml eincubando por 30 minutos a 37°C. O DNA foientão precipitado adicionando-se 2 volumes detampão TE pH 7,5 ou dH20, acetato de amôniopH 7,7 para concentração final de 2,5 M e 2,5volume de etanol 95% a -20°C. Após aprecipitação, o DNA foi "pescado", seco por 15minutos à temperatura ambiente, e ressuspensoem TE pH 7,5. Armazenado a 4°C até serutilizado.

- Procedimento A400 mg de tecido liofilizado e moído foram

incubados em 9 ml de EDTA 0,5 M pH 8,0;N-Lauroylsarcosine 0,5 % e proteinase K 1 mg,por 15 minutos a 65°C e por 12 horas a 37°C,sob agitação em mesa agitadora à rotação de150 rpm. A purificação se deu com 4,5 ml declorofórmio': álcool ioamflico (24: 1) ecentrifugação, sob as mesmas condiçõesdescritas em HOISINGTON et alii (1988). Osácidos nucléicos foram precipitadosadicionando ao sobrenadante l/lOdo volume deacetato de sódio 3 M, 2 volumes de dH20 e 20ml de etanol 95% a -20°C. Seguindo-se àprecipitação, os ácidos nucléicos foram"pescado" e incubados em etanol 76% +acetato de amônio 10 mM por pelo menos 20minutos. Após a incubação, os ácidos nucléicosforam secos a vácuo por 15 minutos eressuspensos em 4,5 ml de TE pH 7,5. O RNA foidegradado utilizando-se 10 microgramas/ml deRNAse A durante 30 minutos a 37°C, e novapurificação se deu adicionando acetato de sódiopara 0,3 M e igual volume de clorofórmio: álcoolisoamílico (24:1). O DNA foi precipitado

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adicionando-se 6 ml de etanol 95% a -20°C:seguindo-se às lavagens descritas emHOISINGTON et alii (1988).

- Procedimento BEsse procedimento foi uma adaptação do

procedimento A, onde utilizou-se a solução deextração descrita em HOISINGTON et alii (1988) .

• Quantificação e avaliaçãoA quantificação do DNA genõmico é

necessária para avaliar os procedimentos deisolamento e purificação utilizados, padronizar aquantidade de DNA dos diversos materiais aserem estudados, bem como viabilizar o usoadequado das endonucleases de restrição.

Dois foram os procedimentos dequantificação utilizados: espectrofotometria euso de padrões de DNA de alto peso molecular.No primeiro procedimento utilizou-se umacaracterfstica que é inerente aos ácidosnucléicos, isto é, de absorver luz ultravioleta tãoeficientemente que a absorbância óptica nafaixa de 260 nm pode ser usada como medidarápida, precisa e não destrutiva de quantificação1MANIATIS et alii, 1982). O segundoprocedimento utiliza padrões de DNA de altopeso molecular (DNA do fago lambda) comconcentrações conhecidas para processar aquantificação através de comparação visual deintensidade de bandas em géis de agarose.

Os DNA's genõmicos foram quantificados e,em iguais concentrações, eram avaliadosquanto ao DNA de alto peso molecular, DNAdegradado e teor de RNA presente nasamostras. Todas estas avaliações foram visuais,mediante observação do DNA em gel de agarose0,6%, após corrida a 30 volts/16 mA/10 watts por3 horas e coloração por 20 minutos em 500 mlde água destilada contendo 50 microlitros debrometo de etídio (10 mg/ml).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As amostras de tecido foliar, mesmo após umano de armazenagem, apresentaram-se aptaspara o isolamento e a purificação de DNAgenõmico, Esse tempo não influenciou naqualidade do DNA genõmico isolado, -

Conforme pode ser visto na Figura 1, osprocedimentos HOISINGTON et alii (1988), UMCRFLP MANUAL (1989) e DOYLE et alii (1990) eprocedimento B resultaram na obtenção detaxas maiores de DNA fragmentado e decontaminação com RNA, quando comparadoscom DNA isolado de Rhizobium sp e com DNAobtido pelo procedimento A.

O uso de detergentes fortes com agentes delise (proteinase K) não somente liberam DNAmas, simultaneamente, agem como inlbidores

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+FIGURA 1. ONA de Rhizobium sp doado pela Professora Nadja Maria de Sá Carneiro da UFMG e

utilizado como padrão de qualidade (A); ONA's de milho isolados pelo procedimentoHOISINGTON et alii (1988) (B), procedimento A (C), procedimento B (O), procedimentoOOYLE et alii (1990) (E) e procedimento UMC RFLP MANUAL (1989) (F).

FIGURA2. ONA's genomlco isolados, comrepetições. ONA's de milho isoladospelo procedimento UMC RFLPMANUAL (1989) (1), procedimentoOOYLE et alii (1990) (2).procedimento A (3) e ONARhizobium sp (4) utilizado comopadrão de qualidade.

molecular com concentração conhecida, esseúltimo apresentou-se como procedimento maisconfiável, tendo em vista que, além daquantificação do ONA de alto peso molecular, omesmo possibilitou ter acesso a informaçõesquanto ao ONA fragmentado e ao RNA.

O uso de espectrofotometria exige, para umaprecisa quantificação do ONA de alto pesomolecular, que a solução esteja pura, isto é, semsignificante quantidade de contaminantes, taiscomo: protefnas, fenol, agarose, CTAB,fragmentos de ONA de fita simples e RNA. Comoa espectrofotometria mede a quantidade deradiação ultra-violeta absorvida pela basenitrogenada constituinte do nucleotfdeo(MANIATIS et alii, 1982), a mesma leva àquantificação superestimada, visto que, além doONA de alto peso molecular, que é o único útilao processo, ela quantifica os nucleotfdeoslivres, os fragmentos de ONA de fita simples, osfragmentos de ONA de fita dupla geradosdurante o isolamento e a purificação e oRNAque porventura estejam na amostra.

A quantificação via comparação com padrõesde ONA de alto peso molecular comconcentrações conhecidas, embora sejabastante dependente da observação pessoal,possibilita considerar exclusivamente o DNA dealto peso molecular.

A Figura 3 apresenta o exemplo de um gel deagarose com oito padrões de ONA de alto pesomolecular, com concentrações conhecidas deONA e utilizadas para quantificar oito materiaiscom volume conhecido. Por exemplo, o ONA

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FIGURA 3. Padrões de DNA de alto pesomolecular utilizados paraquantificação de DNA genômico porcomparação visual. No alto, dadireita para a esquerda, padrões deDNA de fago lambda com 250 ng,200 ng, 175 ng, 150 ng; 100 ng, 50ng, 25 ng e 12,5 ng,respectivamente. No centro, dadireita para a esquerda, DNA isoladopelo procedimento A (1 a 5) e DNAde Rhizobium sp utilizado comopadrão de qualidade (6 a 8).

genômico número 1 mostra intensidade próximada banda padrão correspondente a 175 ng;como o volume da solução com este DNAgenômico foi de 3 microlitros, a concentraçãodeste DNA, isolado pelo procedimento A, éaproximadamente 60 ng/microlitro.

Se por outro lado a espectrofotometriasuperestima a quantificação quando o DNAgenômico tem alta taxa de degradação e/oucontaminação com RNA, por outro lado,observou-se que ela pode subestimar aquantificação quando a amostra tem somenteDNA de alto peso molecular. Para tanto, tem-secomo exemplo o mesmo DNA genômico número1 da Figura 3, que apresentou umaconcentração de 35 ng/microlitro pelaespectrofotometria. Isso também foi observadocom outros materiais do referido gel.

Segundo DOYLE et alii (1990), a quantificaçãopor absorbância a 260 nm geralmente apresentaresultados irreais devido à interferência porresfduos de CTAB nas amostras. Esses autorestambém sugerem uma purificação adicional porultracentrifugação em cloreto de césio, o quetorna o processo mais caro, complexo e longo,o que não foi objetivo do nosso trabalho.

CONCLUSÃO

Dentre os cinco procedimentos avaliados, oprocedimento A é o que mais se aproxima dodesejado, tanto quanto às caracterfsticasinerentes ao procedimento, quanto às inerentesao DNA isolado e purificado. A única limitaçãodesse procedimento é o alto custo da proteinaseK, que deve ser utilizada em grandesquantidades.

Para a quantificação de DNA genômico viaespectrofotometria seja confiável, é necessárioque a amostra apresente somente DNA de altopeso molecular. A quantificação, utilizandopadrões de DNA de alto peso molecular comconcentrações conhecidas, mostrou-se maisconfiável que a espectrofotometria.

SUMMARV

EVALUATION OF MAIZE (Zea mays L.) DNAISOLATION AND PURIFICATION PROCEDURES

Five procedures to isolate and purify maizeDNA were studied. The procedure A - usingN-Iauroylsarcosine and Proteinase K - was thebest of them; however, it use so muchProteinase K, becoming an expensiveprocedure .. The most pure DNA was obtainedwhen Proteinase K was utilized.

INDEX TERMS: CTAB, RFLP Proteinase Kmolecular markers. . , ,

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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