AVANCES EN LA MICROPROPAGACION DE CINCO ESPECIES ... · Propagación in vitro de palma de chontaduro (Bactris gasipaes H.B.K.). 15 ... cultivo de tejidos vegetales, para obtener material

CORPORACIÓN AUTÓNOMA REGIONAL DEL CENTRO DE ANTIOQUIA

CORANTIOQUIA

AVANCES EN LA MICROPROPAGACION DE CINCO

ESPECIES FORESTALES EN LA ESTACIÓN

BIODIVERSIDAD DE PIEDRAS BLANCAS

INFORME FINAL

Medellín, Junio de 2006

AVANCES EN LA MICROPROPAGACION DE CINCO ESPECIES

FORESTALES EN LA ESTACIÓN BIODIVERSIDAD DE PIEDRAS

BLANCAS

PROGRAMA PARA LA BIODIVERSIDAD Y EL DESAROLLO

PROYECTO “MANEJO Y CONSERVACIÓN DE LA FLORA”

Contrato 6571/2005

Presentado por

OSCAR DARIO QUINTERO GARCÍA. Ingeniero Agrónomo

Interventor

Juan Lázaro Toro Murillo Ingeniero Forestal

Corporación Autónoma Regional del Centro de Antioquia Medellín, Junio de 2006

Avances en la micropropagación de cinco especies forestales________________________

TABLA DE CONTENIDO

Pág. RESUMEN 6 INTRODUCCION 7 1. PROPAGACION in vitro del Caunce (Godoya antioquensis Planch). 9

1.1 Antecedentes. 9 1.2 Material vegetal 10

1.3 Establecimiento in vitro 10

1.4 Multiplicación 10

1.5 Enraizamiento 12 2. Propagación in vitro de yarumo blanco (C. telenitida) y yarumo común (C. angustifolia). 13

2.1 Antecedentes 13

3. Propagación in vitro de palma de chontaduro (Bactris gasipaes H.B.K.). 15

3.1 Antecedentes 15

4. Inducción de brotes sobre cotiledones inmaduros de Cedro Negro (Juglans neotropica).

17

5. Seguimiento a las palmas de chontaduro en el suroeste Antioqueño. 20 5.1 Antecedentes 20 6. Propagación asexual de Caunce (Godoya antioquensis Planch) 23 CONCLUSIONES 25 BIBLIOGRAFIA 28 ANEXO 31

3


LISTA DE FIFURAS

Pág.Figura 1. Cápsulas inmaduras (a) y maduras (b) del Caunce 11

Figura 2. Secuencia de la dehiscencia en cápsulas de Caunce y Semillas 11 Figura 3. Respuesta de acodos al ácido indol butírico (AIB). 24

Figura 4. Siembra de acodos en bolsas con tierra-arena (2:1)

24

4


LISTA DE TABLAS

Pág. Tabla 1. Micropropagación in vitro de G. antioquensis Diels. 12 Tabla 2. Micropropagación de C. telenitida y C. angustifolia. 14

Tabla 3. Micropropagación de palma chontaduro (B. gasipaes H.B.K.). 16

Tabla 4. Micropropagación de Cedro Negro (J. neotropica Diels) 18

Tabla 5. Evaluación de diferentes hormonas en brotes de J. neotropica 19

Tabla 6. Insectos plaga en palma de chontaduro. 21

Tabla 7. Recomendaciones realizadas para palma de chontaduro. 22

5


Resumen

Con base en el trabajo realizado se demostró la utilidad de la técnica de

cultivo de tejidos vegetales, para obtener material de forma clonal masiva

vía organogénesis directa e indirecta, para las especies Bactris gasipaes,

Cecropia telenitida, Cecropia angustifolia y Godoya antioquensis. Para la

especie forestal cedro negro (Juglans neotropica Diels), se logró la

estandarización preliminar del protocolo de micropropagación in vitro, a

partir de frutos inmaduros, como una alternativa de propagación para esta

especie vulnerable a la extinción.

De otro lado, mostrar la importancia de transferir de condiciones in vitro

a ex vitro (campo o medio ambiente), y hacer seguimiento al material

vegetal de B. gasipaes, producido por vía embriogénesis somática, para

observar el crecimiento, desarrollo, producción de flores, frutos,

resistencia o susceptibilidad a plagas y enfermedades etc. Parámetros que

determinan que no se afectaron las características de la especie, al ser

producidas por técnicas de cultivo de tejidos vegetales in vitro.

Palabras claves: Propagación in vitro, micropropagación, especies forestales, Bactris gasipaes, Cecropia

telenitida, Cecropia angustifolia, Godoya antioquensis, Juglans neotropica.

6


INTRODUCCIÓN

Entre los avances y desarrollos de la ciencia, la biotecnología es

posiblemente el de mayor importancia para el sector agrícola. De las

técnicas mas utilizados en la biotecnología, específicamente en el área

vegetal, es el cultivo de tejidos, el cual es un método de micropropagación

in vitro, que ofrece un gran potencial como alternativa y complemento a

los métodos tradicionales de propagación y mejoramiento genético de las

plantas.

La técnica de micropropagación in vitro, es un proceso que se realiza en

laboratorio y consiste esencialmente, en aislar una porción de tejido

(explante) de una planta (hoja, yema apical, raíz, embrión, cotiledón,

meristemo, etc.) y proporcionarle artificialmente las condiciones

apropiadas de luz, humedad, temperatura (condiciones físicas), y

vitaminas, minerales, carbohidratos, hormonas (condiciones químicas), en

ambiente completamente aséptico, para producir una gran cantidad de

material vegetal idéntico al individuo de donde se extrajo tejido.

En especies forestales la micropropagación in vitro, se muestra como una

alternativa a los métodos de propagación convencional, para obtener

material vegetal, sobre todo en especies, que están en peligro de

extinción, que tienen problemas de germinación o que producen poca

semilla.

El objetivo general del presente trabajo de investigación, fue la utilización

de la técnica de cultivo de tejidos in vitro para micropropagar material

vegetal de las especies, yarumo blanco (Cecropia telenitida), yarumo

común (Cecropia angustifolia), Caunce (Godoya antioquensis) y palma de

chontaduro (Bactris gasipaes), especies con importancia ecológica y/o

económica, presentes en la jurisdicción de CORANTIOQUIA, y cuyos

7


lineamientos se enmarcan dentro del proyecto Manejo y conservación de

la flora.

Los resultados promisorios de este trabajo se muestran especie por

especie, cuyo manejo en laboratorio puede servir de modelo para

extrapolar a otras especies de características similares. Además será de

gran utilidad para proyectos dirigidos a la propagación y conservación de

árboles nativos cuyas poblaciones naturales se encuentran amenazadas.

8


1. PROPAGACION in vitro de CAUNCE (Godoya antioquensis Planch)

1.1 Antecedentes

Especie endémica del departamento de Antioquia, se encuentra en las

cordilleras Central y Occidental, entre 1600 – 2600 m.s.n.m , en el parque

ARVI es una especie muy rara, crece en bosques secundarios, rastrojos

altos y áreas abiertas. Su madera fue utilizada para leña y la fabricación

de cabos de herramientas. En el área del parque ARVI se utilizó

ampliamente como leña, por sus facilidades para arder, aun en estado

verde, lo cual causó la casi desaparición de la especie en este territorio

(Toro, 2000).

A.G.S., (2004), al realizar una investigación en especies endémicas en la

jurisdicción de CORANTIOQUIA, encontró información sobre la existencia

en Ecuador y Perú de ejemplares de herbarios de G. antioquensis,

colectados en los años 1979 y 1997 respectivamente, y a pesar de ello, en

Colombia solo está reportada para el departamento de Antioquia; hasta el

momento. Los municipios dentro de la jurisdicción de CORANTIOQUIA

donde se encuentra la especie son: Medellín, Andes, Anorí, Caicedo,

Caldas, Copacabana, Envigado, Pueblo Rico, Santa Rosa de Osos e

Ituango.

La micropropagación in vitro del caunce, se plantea como un complemento

y alternativa potencialmente útil para la obtención de material vegetal, la

cual puede enmarcarse dentro de la estrategia Nacional para la

conservación de plantas, cuya misión se dirige a orientar las acciones de

conocimiento, conservación y uso sostenible, adelantada por el instituto

Alexander von Humboldt, la red Nacional de Jardines Botánicos, Ministerio

de medio ambiente y la Asociación Colombiana de Herbarios desde el año

2001.

9


1.2 Material vegetal

Cápsulas indehiscentes o dehiscentes fueron recolectadas de árboles

localizados en Cerro Asturias (Parque regional ARVI), la madurez de las

cápsulas se caracteriza por el cambio de color de amarillo a café (fig. 1),

las cápsulas se lavaron con agua corriente para retirar el polvo, antes de

iniciar el proceso de desinfección.

1.3 Establecimiento in vitro

En la cabina de flujo laminar, las cápsulas indehiscentes se desinfectaron

sumergiendo en etanol al 70% durante 30 segundos y luego flameando,

operación que se repitió dos veces. Luego con ayuda de un bisturí y pinzas

se realizó un corte longitudinal en la cápsula para extraer las semillas y

sembrarlas en medio de germinación WG (tabla 1). Para el caso de las

cápsulas que ya estaban dehiscentes (fig. 2a y b), se sacaron las semillas

con ayuda de un pinza, y se desinfectaron mediante dos lavados, el

primero, con una solución de etanol al 70% durante 30 segundos, seguido

del segundo lavado con solución de hipoclorito de sodio al 0.25% por 30

min. Luego se retiraron los residuos de ambas soluciones, realizando tres

lavados consecutivos con agua destilada estéril, para sembrar también en

el medio WG.

1.4 Multiplicación

La germinación se inicio alrededor de los 30 días extendiéndose hasta los

70 días, pasado este tiempo las parte aérea (epicótilo), se cortó y se

subcultivó en medio WC (tabla 1), que estimula la brotación de yemas

preexistentes y su posterior elongación, luego cada tallo fue separado y

llevado a condiciones de enraizamiento.

10


a b

Figura 1. Cápsulas inmaduras (a) y maduras (b) del Caunce.

eda b c

Figura 2. Secuencia de la dehiscencia en cápsulas de Caunce (a, b, c, d),

y Semillas (e).

11


Tabla 1. Micropropagación de G. antioquensis Diels.

PROCEDIMIENTO DETALLE FIGURA

Material Vegetal: semillas maduras Procedentes de

cápsulas dehiscentes e indehiscentes.

Los frutos se recolectan al inicio de la madurez cuando se

tornan cafés, se secan al sol sobre papel periódico hasta

que liberen las semillas.

Desinfección

1. Cápsulas indehiscentes: sumergir en etanol al 70%

durante 30 seg y flamear (fig. a y b).

2. Cápsulas dehiscentes: lavar las semillas con NaOCl al

0.25%(v/v) durante 30 min, luego con etanol al 70%

por 30 seg. Enjuagar tres veces.

1. Abrir la cápsula, haciendo un corte longitudinal para

extraer las semillas y sembrar directamente en medio

WG.

2. Pesar 0,2 gr de semillas y envolver con papel filtro,

preparar 100 ml de solución de NaOCl al 0,25%(v/v),

suplementado con 2 gotas de tween-20, agitar a 150 r.p.m

durante 30 min.

Establecimiento

Colocar las semillas sobre medio WG, compuesto de

sales WPM ( Lloyd y Mccown, 1981) o MS (Murashige

& Skoog, 1962) a la mitad de la concentración original,

sin reguladores de crecimiento.

Composición WG

Sales MS/2 o WPM/2, Sacarosa 3% (p/v), Tiamina 1

mg/L, Piridoxina 0,5 mg/L, Ac. Nicotínico 0,5 mg/L,

Glicina 1 mg/L, Mio inositol 100 mg/L, Phytagel 0.2%

(p/v). pH ajustado a 5.7 antes de ser esterilizado a 121ºC

durante 20 minutos.

Multiplicación

Separar el epicótilo (parte aérea), de las plántulas y

sembrarlo sobre el medio WC, colocar en condiciones

de luz (8h) a temperatura 23±1°C

Composición WC

Sales MS, Sacarosa 3%(v/v), Adenina 2 mg/L, Tiamina 1

mg/L, Piridoxina 0,5 mg/L, Ac. Nicotínico 0,5 mg/L,

Glicina 1 mg/L, Mio inositol 100 mg/L, Biotina 1 mg/L,

Phytagel 0.2% (p/v). pH ajustado a 5.7 antes de ser

esterilizado a 121ºC durante 20 minutos.

ENRAIZAMIENTO

Sembrar los esquejes en medio CR, compuesto de sales

MS (Murashige & Skoog, 1962), a la mitad de la

concentración original (MS/2), suplementado con AIB,

sacarosa y vitaminas.

Composición CR

Sales MS/2, AIB 0.5 mg/L, Sacarosa 15g/L, Tiamina 0.5

mg/L, Piridoxina 0.25 mg/L, Ac. Nicotínico 0.25 mg/L,

Glicina 0.5 mg/L, Mio inositol 50 mg/L, Phytagel 1.8

g/L, pH 5.7; Esterilizar a 121ºC por 22 min.

1.5 Enraizamiento

Los tallos de aproximadamente de 1-2 cm de longitud, fueron sembrados

en medio RC (tabla 1), durante ocho días en condiciones de oscuridad,

posteriormente se pasaron a condiciones de luz (8h) y transcurridos otros

14 días se indujo los brotes radicales in vitro.

Al cabo de 45 días las plántulas enraizadas, se pasaron a condiciones ex

vitro, primero se retiro el agar y residuos de medio de cultivo con agua

12


corriente y sembradas en una mezcla de sustrato compuesto de tierra

negra, tierra amarilla y arena (1:1:1), las plántulas se colocaron bajo

condiciones de polisombra en el vivero.

2. PROPAGACION in vitro DE YARUMO BLANCO (Cecropia telenitida)

y YARUMO COMÚN (Cecropia angustifolia).

2.1 Antecedentes

Ambas especies forestales son de importancia ecológica, son muy

utilizadas en la protección de microcuencas, en la recuperación de suelos

y coberturas vegetales, los frutos son consumidos por las aves silvestres y

murciélagos (Toro, 2000), aunque son propagadas normalmente por

semilla sexual, presentan la dificultad de conseguir semilla viable por ser

muy apetecidas por las aves, además su recolección es muy dispendiosa

por tener que recolectar directamente los frutos de los árboles. La

propagación clonal masiva por medio de cultivos in vitro, ha mostrado

rápidas tasas de multiplicación y crecimiento en poco tiempo, frente a la

propagación sexual (Quintero, 2004). El protocolo de multiplicación que se

utilizo para la obtención del material vegetal de yarumo blanco y común

se resume en la tabla 2.

13


Tabla 2. Micropropagación de C. telenitida y C. angustifolia. PROCEDIMIENTO DETALLE FIGURA

Material Vegetal

Semillas sexuales

Los frutos maduros se dejan en remojo y luego se maceran

para extraer las semillas y secar a la sombra.

Desinfección

Sumergir las semillas en etanol al 70% durante 1 min.

Luego lavar con de hipoclorito de sodio al 3%

durante 30 minutos, se enjuagaron tres veces con

agua destilada estéril y sembrar.

Pesar 0,2 gr de semillas y envolver con papel filtro, preparar

100 ml de solución de NaOCl al 3%(v/v), suplementado

con 2 gotas de tween-20, agitar a 150 r.p.m durante 30 min.

Establecimiento

Sembrar las semillas en medio GY, en fase liquida y

en condiciones de luz (16h) y temperatura 23±1°C La

germinación en este medio inicia aproximadamente a

los 30 días.

Composición del medio GY

Sales Murashige & Skoog, 1962 (1/4) de concentración,

14,4 µM de ácido giberélico (GA3), 2,5% (p/v) de sacarosa.

El pH del medio fue ajustado a 5,8 antes de ser esterilizado

a 121 ºC por 20 minutos.

Multiplicación

Las semillas que van germinando se subcultivan en

medio MY, donde se forman masas organogénicas

que se subcultivan cada 30 días en el mismo medio.

Cada tres meses se obtienen tallos diferenciados los

cuales son separados con ayuda de un bisturí y

subcultivados en medio para enraizamiento.

Composición medio MY

Sales WPM (Lloyd & Mccown, 1981) completo,

suplementado con 4,4 µM de BAP, 3% (p/v) sacarosa,

0.24% (p/v) gelrite. El pH del medio fue ajustado a 5,8

antes de ser esterilizado a 121ºC por 20 minutos; las

condiciones de crecimiento temperatura 21 ±1°C,

fotoperíodo de 16 horas de luz.

Enraizamiento

Subcultivar los esquejes en medio R, e incubar en

condiciones de oscuridad durante 72 horas, después

sacar a condiciones de luz (16h) y al cabo de 24 días

están listas para ser transferidas a condiciones ex vitro

en bandejas de polipropileno.

Composición medio R

Sales WPM a la mitad de la concentración, suplementado

con 4,9 µM de AIB, 1,5% (p/v) sacarosa, 0,24% (p/v)

gelrite. El pH del medio fue ajustado a 5,8 antes de ser

esterilizado a 121ºC por 20 minutos

Aclimatación

1. Siembra en bandejas de polipropileno con sustrato

estéril, compuesto de compost mas arena (1:1), y

cubiertas con tapas transparentes.

2. siembra en bolsas negras de 1kg, para dejar en

condiciones de vivero.

1. Las plántulas con raíces bien formadas, se sacan de los

frascos y se lavan las raíces con agua corriente para retirar

los residuos de gel, para evitar contaminación. Permanecen

dos meses bajo este sistema, el primer mes cubiertas y

realizando riegos semanales con medio WPM diluido; el

segundo mes sin tapa y riegos con agua corriente.

2. Transplantar a bolsas con sustrato compuesto de tierra

negra y arena (2:1). Mantener en condiciones de luz

indirecta y riego nebulizado durante la primera semana.

14


3. PROPAGACIÓN in vitro DE PALMA DE CHONTADURO (Bactris

gasipaes H.B.K.).

3.1 Antecedentes

La especie esta distribuida ampliamente en el Neotrópico, en Colombia se

cuenta con pequeños bancos de germoplasma, pero no cuentan con

suficiente caracterización que permita a los cultivadores disponer de

material de calidad (Reyes et al., 2002). Actualmente el cultivo se ha visto

limitado por los problemas de propagación por semilla sexual y por los

sistemas de propagación vegetativa vía hijuelos (Mora y Solis, 1980). Las

variedades más productivas son partenocárpicas (fruto sin semilla) y la

propagación por hijuelos es bastante limitada, por su bajo porcentaje de

prendimiento y problemas de anclaje (Blaak, 1980). Además los procesos

de autoincompatibilidad genera una alta variabilidad (heterocigocidad) lo

cual dificulta el establecimiento de plantaciones homogéneas, altamente

productivas y de gran rendimiento (Mora, 1981).

La mayor parte de las investigaciones realizadas sobre el cultivo in vitro

en esta especie se han realizado en Costa Rica y Ecuador (Arias y Huete,

1983; Arias, 1985; Valverde y Arias, 1985; Valverde et al., 1987;

Valverde et al., 1989; Stein y Stephens, 1991; Valverde et al., 1992),

indicando que es factible la producción masiva optimizando los métodos

desarrollados. La labor de micropropagación del material de chontaduro

procedente del suroeste antioqueño (Colombia), se hizo de acuerdo a los

protocolos establecidos por Garcés y Roldan, (1996) y Botero y Atehortúa,

(1999), (Tabla 3).

15


Tabla 3. Micropropagación de palma chontaduro (B. gasipaes H.B.K.).

PROCEDIMIENTO DETALLE FIGURA

Material vegetal: meristemas apicales, sometidos a

doble esterilización con NaOCl al 2.3% (v/v) con

adición de 2 gotas de Tween-20 por cada 100 ml, durante

40 y 10 min en agitación constante.

Ápices caulinares, aislados de plantas de menos de un

año de edad.

Siembra in vitro: reducir los ápices hasta un tamaño de

0.2-0.5 cm de altura, sembrar los ápices en posición

vertical en medio M50 y mantener durante un mes en

condiciones de oscuridad a 24 ±1°C.

Composición M50

Sales Murashige & Skoog, (1962) completo,

suplementado con 1.0 mg/L de biotina, 5.7µM de AIA,

9µM de 2-4 D, 8.3µM de piclorám, 5.4µM de ANA,

0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v) de sacarosa y agua de

coco 15% (v/v), El pH del medio fue ajustado a 5,7

antes de ser esterilizado a 121ºC por 20 minutos

Composición M7

Murashige & Skoog, 1962) completo, suplementado con

1.0 mg/L de biotina, 22.8µM de AIA, 9µM de 2-4 D,

5.4µM de ANA, 0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v) de

sacarosa, y agua de coco 15% (v/v). El pH del medio

fue ajustado a 5,7 antes de ser esterilizado a 121ºC por 20

minutos.

Inducción de Embriones y multiplicación.

Posteriormente subcultivar en medio M7, retirar el

exceso de tejido foliar y cortar verticalmente, procurando

pasar por la mitad de la zona meristemática. Mantener en

condiciones de oscuridad a 24±1°C hasta que se formen

los embriones. En este medio se mantienen entre 8-10

meses, con subcultivos mensuales.

Bioconversión de los embriones en plántulas.

Los embriones formados son retirados del explante y

subcultivados al medio CH los explantes se mantuvieron

bajo condiciones de luz (16h) a 23 ±1°C durante un mes.

Luego son transferidos a medio B otro mes y subcultivar

al medio inicial CH hasta el desarrollo de las plántulas.

Composición medio CH

MS (Murashige & Skoog, 1962) completo, suplementado

con Biotina 1.0 mg/L, 0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v)

de sacarosa. El pH del medio fue ajustado a 5,7 antes de

ser esterilizado a 121ºC por 20 minutos,

Composición medio B

MS (Murashige & Skoog, 1962) completo a mitad de

concentración, suplementado con Biotina 1.0 mg/L, agua

de coco 15% (v/v), 0.16% (p/v) de Fitagel, 3% (p/v) de

sacarosa. El pH del medio fue ajustado a 5,7 antes de ser

esterilizado a 121ºC por 20 minutos

Enraizamiento: esta fase se realiza con palmas que no

desarrollan raíz durante la fase de bioconversión, las

palmas se siembran en medio R en medio haciendo

cambios de medio cada 30 días. La formación de raíces

en las palmas dura como mínimo 4 meses, al cabo de los

cuales se obtienen entre 2-5 raíces nuevas, que se

caracterizan por su grosor y de color crema.

Composición medio R

MS (Murashige & Skoog, 1962) diluido al 50% de su

concentración, con sus respectivas vitaminas y

suplementado con 2,5µM de AIB, 1.5% (p/v) de

sacarosa, 0.2 % (p/v) de fitagel a un pH de 5,7 y

mantenidos con un fotoperíodo de 12 horas a 23 ±1ºC.

16


4. Inducción de brotes sobre cotiledones inmaduros de cedro

negro (Juglans neotropica Diels).

4.1 Antecedentes

El Cedro Negro o Nogal (Juglans neotropica Diels), es una especie forestal,

que presenta problemas de latencia en la semilla (López y Piedrahita,

1999; Gómez, 2001); además el Nogal es vulnerable de extinción

(Calderón, 2001), por la extracción intensiva de su madera, utilizada en la

fabricación de guitarras, muebles, puertas, ventanas, armarios entre otros

(Ospina et al, 2003). Dando como resultado la desaparición progresiva de

la especie dentro del ecosistema (Humboldt, 1998).

Una solución alternativa y complementaria para la propagación y

producción de las especies maderables, es la aplicación de la

micropropagación in vitro, técnica, que permite rápidas tasas de

multiplicación Castro et al. (1994); Carrizosa et al, (1994), hecho que se

ha demostrado con éxito en otras especies del mismo genero como J.

regia L., J. nigra L., J. cinerea L., valoradas por su importancia ecológica,

maderable y nueces comestibles. (Driver y Kuniyuki, 1984; Tulecke y

McGranahan, 1985; Leslie y McGranahan, 1992; Pijut, 1992; Chenevard

et al. 1997; Saadat y Hennerty, 2002). En Colombia solo ha sido

reportado el protocolo parcial, para la inducción de brotes in vitro, vía

organogénesis directa para J. neotropica Diels; utilizando yemas apicales

obtenidas a partir de plantas de invernadero de 1-4 meses de edad (Cruz

y Cruz, 2003).

El procedimiento que se resume a continuación describe los pasos

preliminares de desinfección, establecimiento, multiplicación y

enraizamiento para J. neotropica, utilizando cotiledones en estado

inmaduro (tabla 4).

17


Tabla 4. Micropropagación de cedro negro (J. neotropica Diels).

PROCEDIMIENTO DETALLE FIGURA MATERIAL VEGETAL: Frutos inmaduros, los cuales

presentan formación de la testa (cubierta).

Edad entre 20 y 28 semanas después de la polinización.

DESINFECCION -Lavar las semillas con Hipoclorito de sodio (NaOCl) al

2.5%, durante 20 min.

-Flamear con Etanol al 90%, tres veces, en cabina de

flujo laminar.

Retirar la cáscara de los frutos, con ayuda de un cuchillo

y lavar los restos de corteza con cepillo y agua corriente.

Extraer los cotiledones con la ayuda de pinzas y bisturí.

Explante Colocar las semillas desinfectadas sobre papel craft

estéril y envolverlas, para fracturar la semilla, con ayuda

de un martillo y poder extraer los fragmentos de

cotiledón.

Medio de establecimiento Colocar los fragmentos de cotiledón sobre el medio de

inducción de brotes (MI), en la oscuridad a 22ºC,

durante 30 días, para obtener la inducción de los brotes.

Composición del medio MI:

Sales Murashige y Skoog (1962), suplementado con 2

mg/L de kinetina, 1 mg/L de BAP, 0.5 mg/L de TDZ,

250 mg/L de L-glutamina, sacarosa 30 g/L, phytagel

0.22%, pH 5.7

Desarrollo y crecimiento de brotes Los brotes que se obtienen son transferidos a medio de

desarrollo (MD), libre de reguladores de crecimiento y

condiciones de luz (12h) para inducir la elongación.

Hasta el momento los porcentajes de desarrollo son

bajos (1%).

Composición del medio MD:

Sales Murashige y Skoog (1962), suplementado con 200

mg/L de caseína hidrolizada, sacarosa 30 g/L, phytagel

0.22%, pH 5.7

Enraizamiento Se cortan los esquejes (1cm) y se siembran en medio de

enraizamiento (MR1). Los explantes fueron sembrados

en el medio y colocados en condiciones de oscuridad por

7 días a temperatura 21 ±1ºC para la inducción de raíces.

Transcurridos siete días, los esquejes se transfieren a otro

medio de cultivo (MR2), a una temperatura 21 ± 1ºC y

un fotoperíodo de 12h. Al cabo de seis días se observa la

formación de un primordio radicular.

Composición medio (MR1)

Sales MS al 50% de su concentración, suplementado

IBA 2,5 µM, sacarosa al 1,5% (p/v), caseína hidrolizada

100 mg/L, gelrite 0,22% (p/v).

Composición medio MR2

sales MS al 50%, suplementado con 1.5% (p/v) de

sacarosa, gelrite 0.22% (p/v)

18


Cabe mencionar que durante el desarrollo del procedimiento para la

multiplicación in vitro de cedro negro, se han obtenido otros resultados

satisfactorios, y que solo se mencionan de forma cualitativa, por que los

datos no se han analizado por métodos estadísticos; los resultados son los

siguientes: Inducción de los brotes adventicios en tres diferentes medios

de Cultivo MS (Murashige & Skoog, 1962), WPM (Lloyd y McCown, 1981),

DKW (Driver y Kuniyuki, 1984) (Anexo 1); inducción de brotes con tres

diferentes concentraciones (2.27, 1.4 y 0.5 µM de la hormona Thidiazuron

(TDZ), no hay diferencias al sembrar los fragmentos de cotiledón para

inducir los brotes, en el medio de cultivo por su cara interior (envés) o

exterior (haz), los embriones que se obtienen al abrir los frutos

inmaduros, tienen un 70% de germinación al sembrarse en medios de

cultivo (MS, WPM y DKW) libres de hormonas y en condiciones de

oscuridad durante 30 días.

También se evaluaron diferentes combinaciones de hormonas (Tabla 5),

para ayudar a la elongación de los brotes, pero sin ningún éxito. Los

ensayos que se realizaron fueron los siguientes:

Tabla 5. Evaluación de diferentes hormonas en brotes de J. neotropica.

COMPONENTE DB1 DB2 DB3 DB4 DB5

MS(Murashige & Skoog) 100 100 100 100 100

BAP(mg/L) 0.1 0.1 0.5 0.5 0.1 ANA (mg/L) 0.15 0.15 0.01 0.01 -- AIA (mg/L) - -- -- -- -- AIB (mg/L) -- -- -- -- -- GA3 (mg/L) -- -- -- -- 1.0 L-Glutamina (mg/L) -- 125 -- -- -- Caseina hidrolizada (mg/L) -- -- 200 200 -- Tiamina (mg/L) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Piridoxina (mg/L) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Ac. Nicotínico (mg/L) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Glicina (mg/L) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 Mio inositol (mg/L) 100 100 100 100 100 Sacarosa (g/L) 30 30 30 30 30 Phytagel (g/L) 2.2 2.2 1.8 1.8 -- Gelrite (g/L) -- -- -- -- 2.4 pH 5.7 5.7 5.7 5.7 5.7

*DB: Medio para desarrollo de brotes.

19


5. Seguimiento a las palmas de chontaduro en el suroeste

Antioqueño.

5.1 Antecedentes

Desde el año de 1999 se realizó un experimento para obtener palmas de

chontaduro (Bactris gasipaes H.B.K.) en convenio con la Universidad de

Antioquia, por cultivo in vitro mediante embriogénesis somática, el

material vegetal obtenido, de la multiplicación in vitro se adapto en los

viveros de Niquía, en convenio de CORANTIOQUIA-Secretaria de

Agricultura. Se escogieron las palmas mas adaptas a las condiciones

ambientales y se llevaron a la región del suroeste antioqueño (Hispania),

donde fueron sembradas 43 palmas.

A la fecha de las 43 palmas sembradas en el predio del Ingeniero Forestal

Benicio Uribe Escobar, solo crecieron 33 palmas de chontaduro,

aproximadamente de cinco años de edad, y una altura promedio de 7 m;

todas se encuentran en fase reproductiva (formación de flores y frutos).

Pero la perdida permanente de frutos inmaduros y las inflorescencias se

observo, inicialmente desconociendo el agente (s) causal (es).

Se recolectaron frutos del suelo para determinar la perdida, tanto de

frutos y palmas. Al realizar la disección de los frutos se encontró

perforaciones y ataques en forma de galerías, causadas por larvas de tipo

curculionidae, características del orden coleóptera, así como el ataque de

hongos saprofitos e insectos en fase adulta, que permitieron su posterior

identificación (tabla 6). Las recomendaciones como la captura de insectos,

control de insectos con biopreparados, plateo y fertilización recomendados

durante el periodo 10 de Noviembre de 2005 hasta 20 de Mayo de 2006,

se resumen en la tabla 7.

20


Tabla 6. Insectos plaga en palma de chontaduro.

ESPECIE CARACTERISTICA DAÑO Picudo de la caña de azúcar (Metamasius hemipterus).

tomado de Peña et al, 2002

Como su nombre lo dice también ataca caña de azúcar, plátano y

banano por eso no es aconsejable tener cerca dichos cultivos. Su daño

consiste en la elaboración de galerías en la base de los racimos de las

flores, los cuales se debilitan y se secan. Su control se realiza con

trampas construidas con tarros que contengan rodajas de piña o partes

tiernas picadas de tallo de caña, banano y/o chontaduro como cebo,

para su posterior captura, utilizando 10 tarros/hectárea.

Barrenador del tallo

(Rhynchophorus palmarum)

tomado de Peña et al, 2002

Los daños son causados por las larvas que emergen de los huevos

ovipositados por la hembra en los tejidos frescos resultante del deshije.

Las larvas penetran en el tallo y como consecuencia el daño favorece el

desarrollo de pudriciones que pueden destruir La planta. Su control es

ante todo preventivo, es un insecto que es atraído por las heridas

frescas o que comienzan a fermentarse por lo cual se deben proteger los

cortes después del deshije con soluciones insecticidas o caldo bórdeles,

actualmente el insecto se captura mediante la localización de trampas

con feromona de agregación y trozos de material vegetal (rodajas de

piña, caña, banano o chontaduro) como cebo.

El Picudo negro

(Palmelampius heinrichi)

Actualmente es la plaga de mayor importancia económica que afecta los

cultivos de chontaduro. El insecto en estado adulto perfora el botón

floral femenino o el fruto para alimentarse u ovipositar. Los huevos

colocados por la hembra, eclosionan y la larva barrena (perfora) los

botones ó frutos provocando la caída. En inflorescencias recién abiertas

el insecto puede atacar acentuándose el daño. Cuando el ataque del

insecto ocurre en frutos desarrollados, estos pueden llegar a su

maduración, pero afectando su calidad tanto externa como interna. Su

control y manejo esta relacionado con el proceso de apertura de la

espata floral y polinización de las flores recomendando el método del

embolsado del racimo con bolsa plástica.

Cucharón marceño

(Cyclocephala sp.)

Antes que la espata abra (estructura que protege la inflorescencia), se

debe regar con extracto de ají-ajo (10 cc/L), para repeler a los adultos,

los cuales son atraídos por el olor que expelen las flores durante la

polinización,. Tumbando las flores y frutos pequeños.

21


Tabla 7. Recomendaciones realizadas para palma de chontaduro.

LA URA

BOR DETALLE FIG

Em sar las

ncias y

Practica que se debe realizar preferiblemente entre 0 y 24 horas después de la apertura, para

protegerlo del pequeño insecto, el picudo negro us heinrichi: Curculionidae

bol

infloresce

racimos

Palmelampi

Deshoje Enterrar y aplicar cal agrícola a los tallos y hojas de las palmas que se cortan durante la limpia del

cultivo, muy importante para evitar que los insectos plagas se sigan multiplicando y afectando el

cultivo.

Plateo y

Fertilización

Realizar como mínimo cuatro fertilizaciones al año, de la siguiente manera: la primera aplicación,

agregar materia orgánica 3 Kg/planta, cal dolomítica (100 gr) y fosforita Huila (200 gr), completar

la fertilización con 5 gr de elementos menores (AGRIMINS), revolver bien con tierra y agregar

alrededor de cada planta. La segunda aplicación, materia orgánica 3 Kg/planta, cal dolomítica (100

gr) y fosforita Huila (200 gr). En la tercera aplicación, materia orgánica 3 Kg/plant), cal

dolomítica (100 gr) y fosforita Huila (200 gr). La cuarta aplicación, materia orgánica 3 Kg/planta,

cal dolomítica (100 gr) y fosforita Huila (200 gr), 5 gr de elementos menores (AGRIMINS).

Trampeo eden

fabricar con tarros plásticos y residuos vegetales en proceso de fermentación (trozos de tallo de

Colocar trampas para la captura de M. hemipterus, R. palmarum, P. heinrichi ). Las trampas se pu

plátano, caña de azúcar, palma de chontaduro), posteriormente al capturar los insectos, se echan

en un recipiente con solución jabonosa para matarlos. Las mismas trampas se pueden utilizar

como cebos tóxicos, sumergir los trozos de material vegetal en melaza (150 cc + 850 cc de agua

+ 1cc de insecticida), y dejar remojando de un día para otro, luego colocar los trozos en el tarro.

Las trampas con cebos atrayentes se deben cambiar cada 8 o15 días.

Fumigar con

controladores

Aplicar a la base de los racimos ANISAFER (Metarhizium anisoplae) y BASSAR (Beauveria bassiana)

como controladores biológicos en dosis de 4 g/L, dejando en remojo 12 horas antes.

biológicos

Aplicación de

Materia orgánica

a materia orgánica se obtiene de desechos orgánicos como hojarasca, cáscaras, residuos de

cosechas, desechos de desyerbas, pulpa de café, estiércol de animales (bovinos, equinos, aves y

L

cerdos) no se deben aplicar frescos, es mejor prepararlos por medio de técnicas de compostaje.

Renovación s importante que siempre se deje crecer un tallo productor de racimos y un hijuelo para que lo

stituyan (el hijuelo no debe sobre pasar los 1.5 mt de altura, de lo contrario se deben cortar y de

E

su

dejar crecer otro de nuevo) cuando el principal esté muy alto o un ataque de plaga o enfermedad

lo dañe como se viene presentando.

22


6. Propa ación asexual de Caunce (Godoya antioquensis Planch).

Este ensayo se plantea como una alternativa para obtener material de

mayor altura en menor tiempo, debido a que hasta el momento las tasas

s

btenidas por semillas.

60 brotes básales (chupones), y proceder con

yuda de una navaja a efectuar un corte en forma de anillado, para

la

roducción de raíces adventicias. Encontrando un efecto positivo en los 35

antas independientes (fig.

).

g

de multiplicación in vitro no superan a las tasas de crecimiento de planta

o

En el sitio conocido como Cerro Asturias (parque ARVI), se realizó un

ensayo preliminar con la especie conocida como Caunce, el ensayo

consistió en seleccionar

a

realizar acodos aéreos y comparar el efecto de 5000ppm de ácido

indolbutírico (AIB) con 0 ppm (control), para inducir raíces adventicias.

De 60 acodos realizados 35 fueron con AIB y los 25 restantes sin

hormona. Después de tres meses de seguimiento, se procedió a

separarlos de las ramas y observar el efecto de la hormona AIB, en

p

acodos que se realizaron con AIB (5.000 ppm), al presentar abundante

formación de raíces, en comparación con los acodos a los que no se les

aplico la hormona, los cuales presentaban al momento de la evaluación

formación de callo en la base del corte (fig. 3).

Los acodos se sembraron en bolsas plásticas negras conteniendo tierra y

arena en proporción (2:1), para continuar con el proceso de prendimiento

de cada brote (chupón) y adaptación como pl

4

23


Figura 3. Respuesta de acodos al Ácido indol butírico (AIB). a. Form de tejido calloso en acodos sin AIB. presencia de AIB. c. Acodo

Figura 4

aciónb. Inducción de raíces adventicias en

s con AIB, listo para transplantar.

. Siembra de acodos en bolsas con tierra-arena (2:1).

a b c

24


CONCLUSIONES

-Aunque se logró el establecimiento y micropropagación clonal para G.

antioquensis Planch, las tasas de multiplicación no son lo suficientemente

in vitro de G. antioquensis Planch,

e la de obtener material de mayor altura que el propagado por semillas.

tras hormonas enraizadoras, como el

nch, en condiciones

e vivero y campo (parcelas demostrativas), es importante para observar si

ún, la ventaja de propagar

or la técnica de cultivo in vitro, se justifica por las altas tasas de

rápidas para obtener gran cantidad de material, indicando que se deben

evaluar nuevas combinaciones de hormonas, que aceleren las tasas de

división celular.

-La ventaja que mostró la propagación

fu

De otro lado la propagación por medio de acodos aéreos que se realizó en

árboles de la misma especie, se observa como otro método alternativo con

muy buenas perspectivas, al producirse material vegetal de muy buen

tamaño y características deseadas.

-Importante evaluar concentraciones mas bajas de ácido indol butírico

(AIB), e inclusive comparar con o

ácido indolacético (AIA) y ácido naftalenacético (ANA).

-Hacer seguimiento a los acodos de G. antioquensis Pla

d

hay crecimientos plagiotrópicos, como se ha observado en otras especies

forestales que son propagadas por este método.

-Para las especies yarumo blanco y yarumo com

p

multiplicación y de producción masiva, ya que se obtienen grandes

cantidades de plántulas listas para sembrar en condiciones de campo en un

periodo de 8 meses, situación que no se observa al producir el material por

semillas.

25


-Aunque hay reportes de la inducción de brotes in vitro en cedro (J.

neotropica Diels, utilizando yemas apicales, no se ha logrado producir

aterial a condiciones ex vitro (medio ambiente); de ahí la importancia de

y bajos

orcentajes de desarrollo de los brotes en plántulas (1%), faltando dilucidar

ios MS, DKW y WPM, ha mostrado

sultados muy positivos, si se observa como una labor de rescate de

o se ha

emostrado en otras especie como J. regia L., J. nigra L., J. cinerea L.

evo,

iciando desde el establecimiento de nuevos ápices, por las bajas tasas de

visto afectado por las condiciones climáticas de la

m

implementar un protocolo utilizando otro tipo de explante (cotiledones

inmaduros), permitiendo en un futuro cercano la obtención de plántulas de

cedro negro en épocas donde no hay producción de semilla sexual.

-Hasta el momento se obtienen grandes cantidades de brotes sobre la

superficie de los cotiledones de J. neotropica, pero se obtienen mu

p

los factores químicos y físicos que permitan obtener grandes cantidades de

plántulas, por medio de este protocolo.

-La siembra y germinación de los embriones inmaduros de J. neotropica, de

16-24 semanas de edad, sobre los med

re

embriones, y podría ser una práctica a utilizar, si en la especie se presenta

perdidas de frutos durante la etapa de formación y maduración.

-Los embriones se pueden evaluar bajo condiciones in vitro, para tratar de

obtener material vegetal vía embriogénesis somática com

d

-La producción de palmas de chontaduro, por el protocolo establecido por

Botero y Atehortúa (1999), no ha permitido obtener material nu

in

bioconversión de embriones a plántulas, el número de ensayos ha sido

grande pero sin éxito.

-El proceso de adaptación al medio ambiente, de las palmas que se sacan

del laboratorio, se ha

26


zona donde se realiza dicha labor, haciendo muy dispendioso y lento el

rmal; el inicio de la

roducción de flores y frutos tampoco se vio afectada. Las limitantes han

hasta donde la situación lo permita, la fertilización con abono

rgánico, suplementado con cal agrícola y elementos menores ha sido

inrich, para su posterior

estrucción. Pero no se obtenido éxito para el control de Metamasius

ausando pudrición del mismo, de

hí la importancia de mantener un hijuelo como mínimo por planta (para la

ha tenido una aceptación total por parte del propietario, ya

ue estos microorganismos actúan lentamente en el control de insectos

desarrollo y crecimiento de las palmas de B. gasipaes.

-El material que se encuentra establecido en campo de B. gasipaes, ha

presentado un crecimiento vegetativo y desarrollo no

p

sido la aparición de plagas relacionadas con el cultivo afectando la

producción.

-Las recomendaciones realizadas se han encaminado al no uso de

agroquímicos

o

suficiente para mantener una emisión constante de inflorescencias y frutos,

sin la manifestación de deficiencias minerales.

-El uso de trampas dentro del cultivo ha permitido la capturar una gran

cantidad de adultos de Palmelampius he

d

hemipterus y Rhynchophorus palmarum.

-El corte y tumba de algunas palmas se debió, a que fueron perforadas en

el tallo por Rhynchophorus palmarum, c

a

sustitución).

-El uso de controladores biológicos (Beauveria bassiana y Metarhizium

anisoplae), no

q

blanco (Metamasius hemipterus y Rhynchophorus palmarum, Palmelampius

heinrich).

27


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30


ANEXO 1. Composición química de los medios de cultivo MS, WPM y DKW.

COMPUESTO MS (mg/L) WPM (mg/L) DKW (mg/L)

Na2 EDTA 37,3 37,3 45.4

FeSO4.7H2O 27,8 27,8 33.8

NH4NO3 1650 400 1416

KNO3 1900 ----

Zn(NO3)2. 6H2O --- --- 17

H3BO3 6,2 6,2 4.8

KH2PO4 170 170 265

Ca(N 2O ---- 1968 O3).4H 556

CaCl2.2H2O 440 96 149

KI 0,83 ----

NaMoO 2O 0,25 4.2H ---- 0.39

CoCl2.6H2O 0 ,025 ---- ---

K2SO4 --- --- 1559

NiSO 2O --- 0.005 4. 6H ---

MgSO4.7H2O 370 370 740

MnSO4.4H2O 22,3 22,3 33.5

ZnSO 2O 8,6 4.7H 8,6 ---

CuSO4.5H2O 0 0,025 ,025 0.25

Mio inositol 100 100 100

Tiamina 0,1-1 0,1-1 2

Á cido nicotínico 0,5 0,5 1

Piridoxina 0,5 0,5 ---

Glicina 2,0 2,0 2

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AVANCES EN LA MICROPROPAGACION DE CINCO ESPECIES ... · Propagación in vitro de palma de chontaduro (Bactris gasipaes H.B.K.). 15 ... cultivo de tejidos vegetales, para obtener material