Az alvadási rendszer fehérjéi

Kappelmayer János

DE OEC, KBMPI

Fehérje diagnosztika, Pécs, 2006

1. Az alvadási rendszer fehérjéinek áttekintése

2. Alvadási fehérje abnormalitások

3. Az alvadási rendszer fehérjéinek vizsgálata

Az alvadási rendszer fehérjéivel kapcsolatos kórképek

Thrombocyta funkciós zavarok

- thrombocyta túlmûködés

- thrombocytopathia

- glikoprotein hiány- denz-test hiány- alfa granulum hiány- jelátviteli zavar

A von Willebrand megbetegedés tipizálása

Teszt I típus IIA típus IIB típus Thr-vWd III típus

vWf:Ag

R:Co

RIPA

RIPA-LD

Gyakoriság

Normál

vWf multimerek:

±

±

±

±

±

normál normál

ø

ø

ø

ø ø øaggregál aggregál

70-80% 10-12% 3-5% 0-1% 1-3%

ø

Coagulopathiák

1./ Alvadási tényezôk,fibrinolízis inhibitorok hiánya vagy csökkent szintje

2./ Kóros alvadási faktorok,fibrinolízis inhibitorok szintézise

3./ Inhibitorok

Alvadási tényezôk, hiánya vagy csökkent szintje

A/ ÖröklöttB/ Szerzett

a. csökkent szintézis(májelégtelenség)

b. consumptioC/ Terápiás (thrombolysis)

Öröklésmenet Prevalencia1 millió lakosra

Haemophilia A XR 100

Haemophilia B XR 20

vonWillebrand bet AD >100 AR 1

XI-es faktor hiány AR ritka

Abnormális alvadási faktorok szintézise

A/ CongenitalisB/ Szerzett (dysfibrinogenaemia

májbetegségekben, K vitaminhiány)

C/ Terápiás (syncumar) D/ Iatrogén (cephalosporin)

InhibitorokA/ Faktor ellenes neutralizáló vagy

nem neutralizáló antitesteka. öröklött faktor hiánnyal b. öröklött faktor hiány nélkül

B/ Globális inhibitorok(terápiás: heparin)

Az alvadási rendszer fehérjéinek vizsgálómódszerei

A véralvadás szûrôtesztjeiVérzési idôAktivált parciális tromboplasztin idô (APTI):

az intrinsic út vizsgálatára, FXII →→→→ fibrinaktivátor, foszfolipid, kalcium

Protrombin idô (PI):az extrinsic út vizsgálatáraszöveti faktor →→→→ fibrinszöveti faktor, kalcium

Trombin idô (TI):fibrinogén-fibrin átalakulás,trombin →→→→ fibrin

Platelet Function Analyser

Fluorescence intensity

Control

Control + TRAP

PatientPatient+ TRAPC

ell c

ount

Vitronectin receptor

Negativ control

ControlPatient

Fluorescence intensity

Cel

l cou

nt

M1M2

M3 M4

a- KONTROLL (100/thr)

b- KONTROLL TRAP (100/thr)

c- BETEG (470/thr)

d- BETEG TRAP (720/thr)

GpIIb/IIIa complex

XIIXIIa

XIXIaCa2+

IX

VIII

IXaCa2+

PLTFVIIaCa2+

VII+

TF, Ca2+

XV

XaCa2+

PL

Protrombin Trombin

Fibrinogén Fibrin

Fibrin(kereszt-kötött)

XIIIaCa2+

XIII

Ca2+

Intrinsic út

Extrinsic út

Közös út

PI

APTI

TI

APTI

normál

APTI keverék

nem

igen

nem

megnyúlt

nincs teendô

TI meghatározás (3)

PI meghatározás (2)kumarin

heparin

az eredménynem értékelhetô

citráthiba (1)

lupus antikoagulánsfaktor ellenes gátlótestFaktormeghatározá

s FXII, XI, IX, VIIIPK, HK

nem korrigál (4b)korrigál (4a)

CoagulopathiCoagulopathiáákk-- SpeciSpeciáális vizsglis vizsgáálatoklatok

A: A: AlvadAlvadáási tsi téényezô hinyezô hiáánynyáának kimutatnak kimutatáásasa::--ExtrinsicExtrinsic--Intrinsic Intrinsic úútt faktorok aktivitfaktorok aktivitáássáánaknakmeghatmeghatáározrozáásasa -- alvadalvadáási teszt si teszt ((egyfegyfááziszisúú,, kkéétftfááziszisúú))

-- kromogkromogéén tesztn teszt--FXIII, AlfaFXIII, Alfa--2 2 plazmin plazmin inhibitor inhibitor

B: B: KKóóros alvadros alvadáási faktorok kimutatsi faktorok kimutatáásasa::--ExtrinsicExtrinsic--Intrinsic Intrinsic úútt faktorainak faktorainak antigantigéénn meghatmeghat..((immunolimmunolóógiai mgiai móódszerreldszerrel:IRMA, ELISA):IRMA, ELISA)--AktivitAktivitáás meghats meghatáározrozáásasa, , ReptilReptilááz idôz idô

C: C: GGáátltlóótestek meghattestek meghatáározrozáásasa

GGáátltlóótestek alvadtestek alvadáási faktorok ellensi faktorok ellen

1.1. Specifikus alvadSpecifikus alvadáási faktorok elleni Igsi faktorok elleni Ig--kkGyengeGyenge-- erôserôs ttíípuspusúú ggáátltlóótestektestek

2. 2. GyakorisGyakorisáágaga: FVIII, FIX : FVIII, FIX elleni gelleni gáátltlóótesttesta a leggyakoribb leggyakoribb (FXI, FXII, FV, FX, FXIII,(FXI, FXII, FV, FX, FXIII,fibrinogfibrinogéénn elleni gelleni gáátltlóótest igen ritkatest igen ritka

3. 3. ElôfordulElôfordulááss: : HaemophiliaHaemophilia, , autoimmun autoimmun betegsbetegséégekgek, , gygyóógyszerek gyszerek (INH, Streptomycin)(INH, Streptomycin)

FVIIIFVIII elleni gelleni gáátltlóótesttestFVIII:C FVIII:C ellen ellen ((vWFvWF--ra nem ra nem hat)hat)

KialakulKialakuláásasa: : HaemophiliHaemophiliáás betegeks betegekPost partumPost partumRA, SLERA, SLEMalignitMalignitááss

GyengeGyenge--erôserôs ttíípuspusMennyisMennyisééggéét t BethesdaBethesda--egysegyséégben fejezzgben fejezzüük kik ki..

Bethesda Bethesda egysegyséég meghatg meghatáározrozááss

1.1. A A betegplazmbetegplazmáábbóól hl hííggííttáások ksok kéészszííttéésese..2. A 2. A betegplazma hbetegplazma hííggííttáásainak kontroll plazmsainak kontroll plazmáávalval

ttöörtrtéénô nô 1:1 1:1 araráánynyúú keverkeveréékeinek kkeinek kéészszííttéésese..3. A 3. A kontroll plazma kontroll plazma éés a s a keverkeveréékek kek 2 h2 h-- 3737°°CC

inkubinkubáálláásasa..

4. FVIII 4. FVIII aktivitaktivitáás meghats meghatáározrozáásasa..5. 5. ReziduReziduáális lis FVIII FVIII aktivitaktivitáás megads megadáásasa..6. 1 BE6. 1 BE az aktivitaz aktivitáása annak sa annak a a ggáátltlóótest mennyistest mennyiséégnekgnek,,

ami ami a a keverkeveréék k FVIII FVIII aktivitaktivitáássáát t 50%50%--ra csra csöökkentikkenti. .

TI

normál

polibrénes TI(1)

megnyúlt

nincs teendô

megnyúlt

normál

TI keverék+ RI (2)

heparin

nem korrigál

fibrinogén/fibrindegradációs termék

alacsony fibrinogénvagy dysfibrinogenemia

korrigál

Haemophilia A vonWillebrand betegség

Thrombocyta szám N N

Vérzési idô N

FVIII N,

vWF-Ag N

RIPA N ,

AlvadAlvadáási faktor meghatsi faktor meghatáározrozáássegyfegyfááziszisúú alvadalvadáási teszttelsi teszttel

Ismeretlen Ismeretlen Faktor aktivitFaktor aktivitáássúú

mintaminta

HiHiáányplazmanyplazma:: a a vizsgvizsgááltltFaktort nemFaktort nem, de , de mindenmindenMMááss faktort feleslegbenfaktort feleslegbentartalmaztartalmaz

PI: extrinsic PI: extrinsic úútt faktoraifaktoraiAPTI: intrinsic APTI: intrinsic úútt faktoraifaktorai

AlvadAlvadáási idôt si idôt standard standard plazmplazmáával nyertval nyertkalibrkalibráácicióórróól leolvasnil leolvasni

Faktor meghatFaktor meghatáározrozáás kromogs kromogéén tesztteln teszttel

I.I. Direkt tesztDirekt teszt ((kallikreinkallikrein, , XaXa, , XIaXIa, , trombintrombin))aktivaktiváállááss

mméérendô inaktrendô inaktíív faktor v faktor aktivaktiváált faktorlt faktor

RR--pNApNAaktivaktiváált faktorlt faktor

RR--COOH + COOH + pNApNA

II.II. Indirekt tesztIndirekt teszt ((XIIaXIIa→→→→→→→→kallikreinkallikrein, , IXa IXa →→→→→→→→XaXaVIIa VIIa →→→→→→→→XaXa, , VIIIa VIIIa →→→→→→→→XaXa))

FVIIFVII FVIIaFVIIaTFTF

FXFX FXaFXaFVIIaFVIIa+Ca+Ca

RR--pNApNA RR--COOH +COOH + pNApNAFXaFXa

Faktor meghatFaktor meghatáározrozáás kromogs kromogéén tesztteln teszttel

KromogKromogéén szubsztrn szubsztráátoktok:: olyan szintetikus rolyan szintetikus röövid peptidekvid peptidek((ááltalltaláában ban 33--44 tagtagúú),), melyeket az alvadmelyeket az alvadáási faktorok si faktorok ((proteolitikus enzimekproteolitikus enzimek)) elhaselhasíítanak tanak ééss ez ez aa reakcireakcióószszíínknkéépzôdpzôdééshez vezetshez vezet. A. A peptidek specifikusak peptidek specifikusak aa vizsgvizsgáálnilnikivkiváánt alvadnt alvadáási faktorrasi faktorra, a, a termterméészetes szubsztrszetes szubsztráátot tot ututáánozznozzáákk. A. A szszíínknkéépzôdpzôdéés ars aráányos az enzim aktivitnyos az enzim aktivitáássáávalval..

IleIle--GluGlu--GlyGly--ArgArg--pNApNA

FXaFXa

AA FXa protrombin hasFXa protrombin hasííttáásisihelyhelyéét utt utáánozzanozza..

Faktor meghatFaktor meghatáározrozáás kromogs kromogéén tesztteln teszttel

I.I. Direkt tesztDirekt teszt:: Faktor Faktor XX meghatmeghatáározrozáásskromogkromogéén szubsztrn szubsztráátt:: ArgArg--GlyGly--ArgArg--pNApNAreakcireakcióó::

FXFX FXaFXaRVV, Ca2RVV, Ca2++

ArgArg--GlyGly--ArgArg--pNApNA+ H+ H22OO ArgArg--GlyGly--ArgArg--OH+OH+ pNApNAFXaFXa

FotometrFotometráálláás s 405 nm405 nm--enenA FXA FX aktivitaktivitáás leolvass leolvasáása kalibrsa kalibráácicióós gs göörbe alapjrbe alapjáánn

Faktor meghatFaktor meghatáározrozáás kromogs kromogéén tesztteln teszttel

II.II. Indirekt tesztIndirekt teszt: FVIII: FVIII meghatmeghatáározrozáásskromogkromogéén szubsztrn szubsztráátt:: ArgArg--GlyGly--ArgArg--pNApNAreakcireakcióó::

FXFX FXaFXaFIXaFIXa, Ca, Ca2+2+, PL, PL

FVIIIFVIII

ArgArg--GlyGly--ArgArg--pNApNA+H+H22OOFXaFXa

ArgArg--GlyGly--ArgArg--OH+OH+pNApNA

FotometrFotometráálláás s 405 nm405 nm--enenA FVIIIA FVIII aktivitaktivitáás leolvass leolvasáása kalibrsa kalibráácicióós gs göörbe alapjrbe alapjáánn

KromogKromogéén teszttel vn teszttel véégzett alvadgzett alvadáásisifaktor meghatfaktor meghatáározrozááss

ElônyeiElônyei::1.1. Nagyobb pontossNagyobb pontossáágg2.2. ÁÁltalltaláában nem igban nem igéényel hinyel hiáányplazmnyplazmáátt,,

ilyenkor olcsilyenkor olcsóóbbbbHHáátrtráányanya::HemolHemolííziszis,, liplipéémia zavarmia zavar,, ilyenkor minta vakotilyenkor minta vakotkell kkell kéészszííteniteni..A A direkt teszt kdirekt teszt kóóros faktor jelenlros faktor jelenlééttéére nem elre nem elééggéérzrzéékenykeny..