az ATP (adenozin-trifoszfát) minden élő szervezetben megtalálható

allosztérikus effektorként, csoport-hordozó koenzimként és szubsztrátként működik

allosztérikus: az enzim nem csupán a szubsztrátkötésre alkalmas katalitikus hellyel rendelkezik, hanem még egy vagy több más, olyan hellyel is, ahol kicsiny, a szubsztráttól eltérő szerkezetű, szabályozó molekula, effektor vagy ligand megkötése válik lehetségessé (allosztéria = más alakú) 

az ATP a legfontosabb molekula a sejtekben lejátszódó energia leadó és felvevő folyamatokban, az elhalt sejtekben az ATP gyorsan degradálódik → a mikrobiális aktivitás becslésére használható paraméter

a talajból kivonható, majd mennyisége meghatározható

legelterjedtebb: az ATP biolumineszcens reakciója segítségével (luciferin-luciferáz rendszer) gyors módszer nagyon érzékeny kimutatás

HPLC módszerrel nem elterjedt sok időt vesz igénybe az analízis drága a szükséges felszerelés

A lumineszcencia olyan kémiai folyamat, ahol a molekula energia hatására gerjesztett állapotba kerül, majd alapállapotába visszajutva, fényt bocsát ki.

az ATP a biokémiai reakció során luciferin-luciferáz enzimpreparátum hatására lebomlik, miközben biolumineszcencia (fénykibocsátás) történik az enzim reakcióba lép az élő szervezetek – mikrobák –

energiataroló komponensével, az ATP-vel a reakció során oxiluciferin-luciferáz-AMP komplex képződik,

amely oxidálódik a gerjesztett állapotban levő átmeneti komplex (*-gal

jelölve) energiatöbbletét a normál állapotba visszatérve foton formájában adja le

A kibocsátott fény - műszeresen – luminométer segítségével detektálható minél erősebb a fényintenzitás, annál magasabb az ATP-tartalom,

a mérés rendkívül érzékeny, hiszen 10-13 g ATP már kimutatható

Előnyök: rendkívül kis mennyiségű ATP jelenléte már nagy biztonsággal

kimutatható rendkívül gyors vizsgálati módszer (a reakció 10 másodpercen

belül lejátszódik) Hátrányok:

az ATP extrakciós hatásfoka erősen függ a használt extraháló szertől az ATPáz és ATP kináz enzimek inaktivitásának sebességétől és

intenzitásától az ATP adszorpciójától a talaj szerves és ásványi kolloidokon

a talaj kivonatokban található különböző vegyületeknek (pl. NO3

- Mg2+, Ca2+, Cl-) gátló hatása lehet a luciferáz aktivitására néhány vegyület (pl . Fe3+) komplexet alakít ki az ATP-vel a talajban az ATP-t ki lehet vonni növények gyökereiből és

állati sejtekből is a mikrobiális sejtek mellett (az az ATP interferál a mikrobiális aktivitással)

Sok fajta ATP extrakciós módszert használnak: az egyik ilyen: a TCA (triklóracetát) extrakciós módszer

Szükséges anyagok és készülékek luminométer és küvetták ultrahangos és egy 12.5 átmérőjű

szonda minicentrifuga (Eppendorf centrifuga

és csövek) jégfürdő szűrő (Whatman 44) pH mérő finnpipetta és steril csíkok üvegcsövek polipropilén vagy üveg centrifuga

csövek

Szükséges anyagok és oldószerek EDTA-magnézium arzenát puffer TCA-foszfát-paraquat extraháló

oldat Luciferin-luciferáz keverék belső standard ATP-oldat (10-3 M)

A módszer elve: az ATP extrakciója a talajból triklóracetát- foszfát- paraquat keverék segítségével, majd a kivont ATP mennyiségi meghatározása a luciferin-luciferáz rendszerrel

EDTA-magnézium-arzenát pufferoldat 1.oldat: 31,2 g Na2HAsO4·7H2O-et kell feloldani 800 ml vízben,

majd hozzáadni 10 ml 0,2 M EDTA oldatot 2. oldat: 2,46 g MgSO4·7H2O-t kell feloldani 100 ml desztillált

vízben a két oldatot össze kell önteni és 7,4-es pH-ra beállítani 1 M

kénsav segítségével , majd 1000 ml-re kiegészíteni desztillált vízzel, hogy az oldat 0,1 M legyen az arzenátra nézve, 10 mM a Mg2+-ra és 2 mM az EDTA-ra

  TCA-foszfát-paraquat extraháló oldat

81,6 g TCA-t és 89,6 g Na2HPO4·12H2O-t kell feloldani 600 ml desztillált vízben

25,8 g paraquat-dikloridot (1,1-dimetil-4,4-bipiridilium-diklorid) kell feloldani 100 ml desztillált vízben és ezt a TCA-Na2HPO4 oldathoz adni

az így elkészült oldatot vízzel ki kell egészíteni 1000 ml-re, hogy az oldat 0,5 M legyen a TCA-ra nézve, 0,25 M a foszfátra és 0,1 M a paraquatra

Az oldat pH-ja 1,6 lesz és -15 ºC-on kell tárolni

Luciferin-luciferáz keverék a tisztított luciferáz és a D-luciferin liofilizált keverékét fel

kell oldani 2 ml desztillált vízben injekciós üvegenként a gyártó utasításai szerint (Packard Instrument Co.)

ATP belső standard oldat (10-3 M) 5,07 g savmentes ATP-t kell feloldani 7 ml steril extraháló

szerben, majd kiegészíteni az extraháló szerrel 10 ml-re minden 0,5 ml ATP oldatot helyezzük egy-egy steril

Eppendorf csőbe és tároljuk -20 ºC-on

 ATP extrakció 4 adag nedves talaj mintát (<2 mm szemcseméret),

amelyek mind 2,5 g szárított talajt tartalmaznak, be kell mérni 50 ml-es polipropilén (vagy üveg) centrifugacsőbe és jégen kell hagyni

25 ml hideg TCA-foszfát-paraquat extrahálószert kell adni mindegyik kémcsőbe

Két kémcsőbe belső standard ATP oldatot kell tenni ezek után a talajt 1 percig kell szonikálni a 12,5 mm

átmérőjű szondában a Branson Sonifier B12 készülékkel, a szonda csúcsa 1 cm-re legyen a folyadék felülete alatt

az ultrahangos kezelés után a kémcsöveket hűteni kell jégen legalább 5 percig, majd szűrni

a szűrt kivonatokat lehet tovább használni

Az ATP meghatározása a talajszűrletethez (50μl) hozzá kell önteni 5 ml EDTA-MG

arzenát pufferoldatot és jégen tartani a törzsoldatot a luciferin-luciferáz keverékből 50μl-t a küvettába kell

pipettázni, majd a luminométeren lemérni ezt a vakmintát (az intenzitása nem lehet nagyobb 150 RLU/10 s-nál, RLU (relative light unit))

ezután 250 μl-t kell adni a jegelt törzsoldatból a küvettába, majd háromszor mérni egy percen belül a készülékkel a minta intenzitását

A kalibrációs görbe  A belső standard ATP oldatból küvettákban hígítással kell

készíteni egy sorozatot, amelyek ATP koncentrációja rendre legyen 10-5, 10-6, 10-7 és 10-8 M

majd mérni ezen kalibrációs minták intenzitását

ATP (μg)/ dwt (g) = (A*ATPS*40) / (B-A) A: a talajszűrlet minta intenzitása ATPS: hozzáadott belső standard mennyisége [μg] B: a belső standard oldatból készült minta intenzitása dwt: a száraz tömege 1 g nedves talajnak

A paraquat használata nem szükségszerű, mivel hozzáadása csak segíti az extrakciós hatásfok javítását. Nagy hátránya a használatának, hogy erősen mérgező anyag és drága is.

Nem lehet alkalmazni ezt a módszert, ha a talaj több, mint 10% CaCO3 tartalmaz (semlegesíti a TCA-oldatot)

Vizsgálat előtt el kell távolítani a mintából a látható növényi gyökereket és az állati szöveteket, mert a módszer az ezekben található ATP-t is megméri.

Élelmiszervizsgálati közlemények (1997. XLIII. kötet 2. füzet) http://www.eoq.hu/evik/evik97-2.pdf

Redox-potenciál mérésén alapuló gyors mikrobiológiai módszer validálása és ipari alakalmazhatóságának vizsgálata - Nádaskiné dr. Szakmár Katalin http://phd.lib.uni-corvinus.hu/403/1/szakmar_katalin.pdf

Mikrobiális fiziológia – Novák Béla http://www.cellcycle.bme.hu/oktatas/mikrofiz/extra/

metabolizmus_regulacio.pdf Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil

Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995 Estimation of adenosine triphosphate in soils The trichloroacetic acid extraction method