Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Peptid hordozók és alkalmazásuk
Mező Gábor
Budapest
2011. december 9.
Az MTA-ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport
50. éves jubileumi ünnepsége
Elágazó láncú polipeptidek (XAK)
polilizin gerinc
oligo-DL-alanin
AK
XAK
optikailag aktív
aminosav
Szekerke Mária
Z-Xxx-OPcp
Hudecz Ferenc
Hudecz F., Szekerke M.: (1985) Coll. Czech. Chem. Comm. 50, 103-113
Elágazó láncú polipeptidek javított szintézise
polilizin gerinc
oligo-DL-alanin
AK
XAK
optikailag aktív
aminosav
Z-Xxx-OPcp/HOBt
Mező G. és mtsai.: (1988) Coll. Czech. Chem. Comm. 53, 2843-2853
Szekerke Mária
Mező Gábor
Elágazó láncú polipeptidek (AXK)
polilizin gerinc
oligo-DL-alanin
AK
XAK
optikailag aktív
aminosav
XiK
AXK
Mező G. és mtsai.: (1993) Biopolymers 33, 873-885
Tartózkodás a szervezetben (24 óra):
ALK(36%) > EAK > SAK > AK (15%)
NH2 NH2
NH2NH2
NH2 NH2
NH2 NH2
HOOC HOOC
HOOC HOOC
EAK
NH2 NH2
NH2 NH2
HO HO
HO HO
AK
SAK ALK
Polilizin-gerincű elágazó láncú polipeptidek
Szerkezet befolyásoló hatása:
tartózkodás a szervezetben
biodisztribúció
Kiürülés a vérből (24 óra):
EAK (6%) > SAK > ALK > AK (0%)
Akkumuláció szervekben:
ALK: 18% lépben
12% májban
ALK kiválasztott hordozó
Leishmania donovani
kezelésére
NH2 NH2
NH2 NH2
Hudecz F. és mtsai: (1990) Bioconjugate Chemistry 1, 425-430 és (1999) Bioconjugate Chemistry 10, 781-790
Mező G. és mtsai: (1993) Biopolymers 33, 873-885 és (1997) Biopolymers 42, 719-730
Leishmania donovanival fertőzött egér makrofágok
in vitro kezelése: Mtx, ALK-Mtx,
(parazita szám/makrofág 72 órás kezelés)
NH NH2
NH NH2
Metotrexát (Mtx) – ALK konjugátum
25% szubsztitúció
Kontroll 3,8 ± 0,7
Mtx 2,8 ± 0,3
ALK 3,2 ± 0,3
ALK-Mtx 1,8 ± 0,2
ALK + Mtx 2,8 ± 0,2
Leishmania donovanival fertőzött egerek
parazitaszám csökkenése májban
Mtx és ALK-Mtx kezelés hatására
(a paraziták száma/100 sejtben)
Kontroll 115,2 ± 4,5
Mtx 66,2 ± 14,6
ALK 103,7 ± 5,5
ALK-Mtx 6,0 ± 1,9
ALK + Mtx 75,6 ± 4,1
Kóczán Gy. és mtsai: (2002) Bioconjugate Chemistry 13, 518-524
Kóczán György
Gaál D, Hudecz F. : (1998) Eur J Cancer 34, 155-161
Reményi J. és mtsai.: (2003) Biochem Biophys Res Commun. 303, 556-561
Reményi J. és mtsai: (2006) Biochim Biophys Acta 1758, 280-289
Cisz-akonitil daunomicint tartalmazó
elágazó láncú polipeptid konjugátumok
cAD-EAK cAD-SAK
10 mg Dau tartalom/kg
>60 napos túlélés
L1210 leukémiás
egerek esetén
Reményi JuditHudecz Ferenc
MI-1544: Ac-D-Trp-D-Cpa-D-Trp-Ser-Tyr-D-Lys-Leu-Arg-Pro-D-Ala-NH2
GnRH-antagonista (MI-1544) - Ac-EAK konjugátum
Ac-NH Ac-NH
Ac-NH Ac-NH
NHCO HOOC
NHCO HOOCMező Gábor
Mező G. és mtsai: (1996) Bioconjugate Chemistry 7, 642-650
Fokozott tumor növekedést gátló hatás (in vitro és in vivo)
Jelentősen csökkent az ovuláció gátló hatás az antagonista hatású
hormon peptidhez képest (tumor szelektivitás fokozása)
Jelentős túlélést eredményezett emlő tumoros egereken
Mező Imre
Szabó R. és mtsai: (2005) Bioconjugate Chemistry 16, 1442-1450
Anionos elágazó láncú polipeptidek sejtbe jutása
scavanger receptorokon keresztül
Szabó Rita
CH3CO-NH
HOOC HOOC
HOOC HOOC
HOOC HOOC
HOOC HOOC
CH3CO-NH
CH3CO-NH CH3CO-NH HOOC-(CH2)2-CO-NH NH-CO-(CH2)2-COOH
NH-CO-(CH2)2-COOH HOOC-(CH2)2-CO-NH
A típusú scavanger receptorok szerepet játszhatnak anionos karakterű polipeptidek
sejtbe jutásában, így alkalmas célpontok fertőzött makrofágokba történő hatóanyag
célba juttatására.
Ac-EAK Succ-EAK<
Cisztein tartalmú peptidek kapcsolása
elágazó láncú polipeptidekhez diszulfidhíd kialakításával
Mihala Nikolett
NH2 NH2
NH2NH
NH2-Cys(Npys)-CO
9-21-Ahx-Cys-276-284
NH2 NH2
NH2NH
NH2-Cys-CO
9-21-Ahx-Cys-276-284
S
S
9LKMADPNRFRGKDL22
276SALLEDPVG284
Herpes simplex vírus gD1
epitóp peptidek:
Npys: 3-nitro-2-piridinszulfenil
Ahx: 6-amino-hexánsav
Mező G. és mtsai: (2000) Bioconjugate Chemistry 11, 484-491
NH
NH
NH
H2N
NH
OOH
NH
HN
OHS
HN
O
O
O
O
NH2
ClCH2-CO-NH NH2
HO HO
HO HO
ClCH2-CO-NH NH2
S-CH2-CO-NH NH2
HO HO
HO HO
S-CH2-CO-NH
c[RGDfC]
c[RGDfC]
c[RGDfC]
c[RGDfC]
Ciszteint tartalmazó peptidek kapcsolása
elágazó láncú polipeptidekhez
kemoszelektív ligációval
Szabó IldikóLigeti Melinda
Markó K., és mtsai: (2008) Bioconjugate Chemistry 19, 1757-1566
- HCl
SAK bevonat SAK-c[RGDfC] bevonat
fibronektin bevonatbevonat nélküli titán háló
Mezenhimális őssejtek letapadása bevont és bevonatlan titán szövetre
Tuftsin és tuftsin analógok
Thr-Lys-Pro-Arg (humán) Thr-Lys-Pro-Lys (kutya)
g-globulin: a szekvencia 289-292 régiója
Analógok: Thr-Lys-Pro-Arg-Thr-Lys-Pro-Arg (TKPRTKPR, dituftsin)
fokozott hatás a Lys-Pro-Arg antagonista keletkezésének hiányában
Thr-Lys-Pro-Arg-Gly (TKPRG)
fokozott immunstimuláló hatás
Thr-Lys-Pro-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg (TKPKTKPR)
szarkóma vírus által okozott tumor növekedésének gátlása
Fridkin, M., Najjar, V. (1989) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 24, 1
fagocitózis stimulálás
immunmodulátor hatás
kemotaktikus aktivitás monocitákon
tumorellenes hatás
TNF termelés növelése
Hatások:
Oligotuftsin hordozó (OT20)
Oligotuftsin hordozó, Ac-[TKPKG]4-NH2
Ac-TKPKG TKPKG TKPKG TKPKG-NH2
Peptid Inkubációs
idő (óra)Kontroll
OT20 1 98,7±0,58
4 96,5±2,18
98,1±1,18 98,5±1,05 98,3±2,93
91,7±3,56 93,7±2,04 92,2±1,83
0,0015 0,015 0,05
Koncentráció (mg/mL)
Nem toxikus egér lépsejteken
Nagyon jó oldékonyságú, higroszkópos peptid Kalászi AdriánReményi Judit
Mező G. és mtsai: Biopolymers (2004) 73, 645-656
Oligotuftsin hordozó (OT20)
Oligotuftsin hordozó, Ac-[TKPKG]4-NH2
Ac-TKPKG TKPKG TKPKG TKPKG-NH2
0
50
100
150
200
250
300
Tuftsin OT20TKPKG
10 10101.0 1.01.0 0.10.10.1 mg/kgPF
C/1
06
lép
se
jtek
ko
ntr
oll
ho
z
vis
zo
nyít
ott
me
nn
yis
ég
e(%
)
Immunstimuláló hatás
Dózis-hatás összefüggés: immunválasz SRBC
antigén ellen BDF1 egerekben
0
20
40
60
80
100
tite
r
IgM
IgG
1 2
Immunizáció
Nem immunogén
Ciklikus HSV gD-1 epitóp peptid kapcsolása oligotuftsin hordozóhoz
kemoszelektív ligációs technikával
Ac-[TKPKG]4-NH2
ClCH2-CO-OT20(ClAc)4
CH2CO-LKNleADPNRFRGKDLAhxKAhxC-NH2
Ac-CGFLG
Ac-[TKPKG]4-NH2
CH2-CO-
-CH2CO-LKNleADPNRFRGKDLAhxKAhxC-NH2
Ac-CGFLG-
112 aminosav (46 kapcsolási ciklus + 2 ligációs lépés): 12902 Da
-HCl
Jakab Annamária
Jakab A. és mtsai: (2009) Bioconjugate Chemistry 20, 683-692
Konjugáció követése HPLC-vel és tömegsektrometriával (MS)
28,3
19,5
t = 5 perc
603,74+
804,53+
1206,0
0
1
2
3
4
x107
Intens.
250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 m/z
2+MWcalc.: 2410,48
MWexp.: 2410,60
MWcalc.: 2659,22
MWexp.: 2658,60
665,74+
887,13+
0
1
2
3
4x106
Intens.
250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 m/z
10 20 30 40 50
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Ab
s 220 n
m
Idő (perc)
735,314+
791,813+
857,612+ 935,5
11+
1028,910+
1143,19+
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
x107
Intens.
400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 m/z
25,6
26,9
27,5
27,8
28,4
29,4
630,28+
720,17+
839,96+
1007,75+
0
2
4
6
8
x106
Intens.
400 600 800 1000 1200 1400 m/z
639,112+
697,111+
766,610+
851,79+
958,08+
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
x107
Intens.
400 600 800 1000 1200 1400 m/z
t = 3 óra
„2 epitóp kópiát“- tartalmazó
konjugátum
MWcalc.: 7657,00
MWexp.: 7656,30
MWcalc.: 5034,24
MWexp.: 5033,50
MWcalc.:10279,76
MWexp.:10279,50
16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Ab
s 220 n
m
Idő (perc)
27,8
29,4
28,4
591,69+
665,58+
760,47+
887,06+
1064,15+
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
x107
Intens.
400 600 800 1000 1200 1400 m/z
861,215+
922,614+
993,513+
1076,212+
1173,911+
1291,110+
1434,59+
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
x107
Intens.
600 800 1000 1200 1400 1600 m/z
MWcalc.: 5316,42
MWexp.: 5315,80
MWcalc.: 12902,52
MWexp.: 12902,20
t = 24 óra
10 20 30 40 50
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
Ab
s 220 n
m
Idő (perc)
861,215+
922,714+
993,613+
1076,212+
1173,911+
1291,210+
0.0
0.5
1.0
1.5
x107
Intens.
400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z
27,8
MWcalc.: 12902,52
MWexp.: 12902,70
A tisztított OT20-HSV epitóp konjugátum jellemzése
CH2CO
Ac-[TKPKG]4-NH2
CH2CO-LKNleADPNRFRGKDLAhxKAhxC-NH2
Ac-CGFLG H-LKMADPNRFRGKDL-NH2
Ellenanyag felismerés (A16 mAb; kompetíciós ELISA)
7,2 pmol 4,2 pmol
10 20 30 40 50
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Ab
s 220 n
m
Idő (perc)
Hordozó
Ciklikus
B-sejt
epitóp
127 aminosav: 14762 Da
Promiscuous T-sejt epitóp Tetanus toxoidból: 593-599 szekvencia (YSYFPSV)
Herpes simplex vírus elleni szintetikus vakcina
K
Ciklikus
B-sejt
epitóp
Ciklikus
B-sejt
epitóp
Ciklikus
B-sejt
epitóp
HordozóK
Irányító
molekulaIrányító
molekula
Irányító
molekulaIrányító
molekuladrog
drog
„Chemotactic Drug Targeting”
Kőhidai LászlóBai Katalin Boglárka
Kemoattraktáns hatású irányító peptidek:
For-Met-Leu-Phe
For-Nle-Leu-Phe
For-Thr-Lys-Pro-Arg
Ac-Thr-Lys-Pro-Lys-Gly
Thr-Lys-Pro-Arg
Thr-Lys-Pro-Lys-Gly
Mező G. és mtsai: (2006) J. Pept. Sci. 12, 328-336
Bai K.B. és mtsai: (2008) Bioconjugate Chemistry 19, 2260-2269
CH2CO-K(CH2CO)-[TKPK(H-TKPKG)G]4-NH2
Mtx-GFLGC-NH2
Mtx-GFLGC-NH2
CH2CO-K(CH2CO)-[TKPK(Ac-TKPKG)G]4-NH2
Mtx-GFLGC-NH2
Mtx-GFLGC-NH2
CH2CO-K(CH2CO)-[TKPK(H-TKPR)G]4-NH2
Mtx-GFLGC-NH2
Mtx-GFLGC-NH2
CH2CO-K(CH2CO)-[TKPK(For-TKPR)G]4-NH2
Mtx-GFLGC-NH2
Mtx-GFLGC-NH2
Metotrexátot tartalmazó oligotuftsin alapú biokonjugátumok
Metotrexát tartalmú oligotuftsin konjugátumok
kemotaktikus aktivitása THP-1 monocitákon
(Mtx-GFLGC)2-K-OT20(TKPKG)4
0
50
100
150
200
250
-11 -10 -9 -8 -7 -6
lg c [M]
ctx
.in
d.%
(Mtx-GFLGC)2-K-OT20(Ac-TKPKG)4
0
50
100
150
200
250
-11 -10 -9 -8 -7 -6
lg c [M]
ctx
.in
d.%
x
0
50
100
150
200
250
- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6
0
50
100
150
200
250
- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6
xx
0
50
100
150
200
250
- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6
0
50
100
150
200
250
- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6
0
50
100
150
200
250
- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6
ctx
.in
d.%
log c [M]
(Mtx-GFLGC)2-K-OT20(TKPR)4
0
50
100
150
200
250
- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6
0
50
100
150
200
250
- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6
0
50
100
150
200
250
- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6
0
50
100
150
200
250
- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6
0
50
100
150
200
250
- 11 - 10 - 9 - 8 - 7 - 6
ctx
.in
d.%
log c [M]
(Mtx-GFLGC)2-K-OT20(For-TKPR)4
Korreláció a kemotaktikus aktivitás, a sejtfelvétel és a citosztatikus hatás között.
Köszönjük!
SOTE
KOKI
ELTE
OOI
Creative CellSoft Flow
Universities:
(Konstanz, Barcelona, Oxford, Ioannina, Palermo,
Groningen, Nottingham)Bose Institute, Calcutta
PKCS
MetriMed
Bay Zoltán Intézet
MikroVákuum
TKI