26

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Penelitian ini bersifat eksperimen. Menurut Nazir (1999),

penelitian eksperimental adalah penelitian yang dilakukan dengan

mengadakan manipulasi terhadap objek penelitian serta adanya kontrol.

B. Desain Penelitian

Desain penelitian yang digunakan pada Uji Antagonisme adalah

Rancangan Acak Lengkap (RAL), karena dilakukan di Laboratorium

dengan kondisi yang relatif homogen. Jumlah perlakuan yang digunakan

adalah 2 perlakuan dengan menggunakan variasi isolat yang berbeda

dengan 1 kontrol. Adapun isolat Pseudomonas spp. yang digunakan

dalam penelitian ini sebanyak 2 isolat, satu isolat berasal dari isolasi

rizosfer bawang daun dan diberi nama Isolat B1 serta isolat yang berasal

dari kultur murni yang sudah tersedia di Laboratorium Balitsa dan diberi

nama Isolat G1.

Banyaknya pengulangan untuk setiap perlakuan diperoleh

berdasarkan rumus pengulangan Gomez dan Gomez (1995), dengan rumus

T ( r-1 ) ≥ 20, dimana T adalah perlakuan atau treatment dan r adalah

banyaknya replikasi (pengulangan).

27

T(r -1) ≥ 20

3(r-1) ≥ 20

3r –3 ≥ 20

3r ≥ 23

r ≥ 7.6

r ~ 8

Berdasarkan perhitungan di atas, setelah nilai akhirnya dibulatkan

maka banyaknya pengulangan yang harus dilakukan paling sedikit

delapan kali. Oleh sebab itu, dalam penelitian ini dilakukan pengulangan

sebanyak delapan kali. Pada penelitian ini terdapat dua variabel yaitu

variasi isolat bakteri sebagai variabel bebas dan pertumbuhan diameter

jamur yang ditumbuhkan pada medium PDA yang telah diinokulasikan

dengan suspensi bakteri sebagai variabel terikat.

C. Populasi dan Sampel

1. Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah jamur Fusarium sp.

yang ditumbuhkan dalam medium PDA pada cawan Petri.

2. Sampel yang digunakan dalam penelitian ini diambil dari isolasi

biakan jamur Fusarium sp. yang akan diberi perlakuan dengan variasi

isolat bakteri Pseudomonas spp.

28

D. Waktu dan Lokasi Penelitian

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Desember 2007 sampai

bulan Juni 2008 bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan

Pendidikan Biologi UPI, Jl. Setiabudhi no. 229 – Bandung.

E. Alat dan Bahan Penelitian

Peralatan yang digunakan pada penelitiaan ini terdapat di

Laboratorium Mikrobiologi Universitas Pendidikan Indonesia. Alat-alat

yang digunakan selama penelitian ini terdapat pada Tabel 3.1, sedangkan

daftar bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini terdapat pada

Tabel 3.2.

Tabel 3.1. Daftar alat-alat yang akan digunakan dalam penelitian

No. Nama Alat Jumlah Spesifikasi

1. Mikroskop binokuler 1 buah Merk Shimadzu S12 –D180 F

2. Hot plate and Magnetic stirrer 1 buah Merk EYELA, RSCH - 3

3. High Performance UV Transilluminator

1 buah UVP Upland, CA.

4. Autoclave 1 buah Merk Hirayama Mode HC36At

5. Vorteks 1 buah Merk SIBATA

6. Waterbath shaker 1 buah UNI Thermoshaker NTS-1300

7. Timbangan Analitik 1 buah Merk AND, HF 300

8. Spectrophotometer 1 buah Milton Roy Spectronic 20D

9. Transfer box 1 buah PT 25.221.03.019BM

10. Penggaris 1 buah Milimeter (mm)

11. Cawan Petri 30 buah Pyrex; = 9 cm

29

12. Lup inokulasi 1 buah P = 22,5 cm; = 5 mm

13. Tabung reaksi 50 buah Pyrex

14. Rak tabung 3 buah -

15. Gelas ukur 10 mL 1 buah Pyrex

16. Gelas ukur 50 mL 1 buah Pyrex

17. Gelas kimia 500 mL 1 buah Pyrex

18. Makropipet 1 ml 30 buah Merk SIBATA

19. Lemari pendingin 1 buah PT25.221.03.021.BM

20. Batang pengaduk 2 buah P = 29,5 cm

21. Spatula 2 buah Logam

22. Pelubang gabus 1 buah = 6 mm

23. Botol sampel 4 buah Volume 100 ml

Tabel 3.2 Daftar bahan-bahan penelitian

No. Nama Bahan Jumlah

1. Alkohol 70 % 1 liter

2. Akuades 5 liter

3. Medium King’s B 10 gram

4. Kristal violet 3 ml

5. Lugol 3 ml

6. Safranin O 3 ml

7. Gelatin 5 gram

8. Pati 5 gram

9. H2O2 1 ml

10. Nutrien Agar (NA) 10 gram

11. Kultur jamur Fusarium sp. 1 cawan Petri

12. Kultur bakteri Pseudomonas spp. 8 tabung

13. Medium PDA (Potato Dextrose Agar) 39 gram

30

14. Medium PDB (Potato Dextrose Broth) 250 ml

F. Prosedur Penelitian

1. Persiapan Penelitian

Persiapan awal penelitian ini meliputi penyediaan kultur murni

bakteri Pseudomonas spp. dan kultur murni jamur Fusarium sp.

dari Balitsa, Lembang, Bandung. Penyediaan alat-alat yang

dibutuhkan penelitian, pembuatan berbagai jenis medium yang

dibutuhkan dalam penelitian (medium PDA, PDB, King’s B, NA,

kaldu laktosa, kaldu sukrosa, kaldu dekstrosa, medium pati, medium

gelatin,medium lipid). Pembuatan larutan zat warna dan reagen

(larutan zat warna lugol, safranin O, crystal violet, reagen uji

katalase dan reagen uji oksidase). Subkultur jamur Fusarium sp.

pada medium PDA dan subkultur beberapa isolat bakteri murni dari

Balitsa pada medium NA miring.

2. Isolasi Bakteri

Salah satu isolat yang akan digunakan dalam penelitian ini

berasal dari tanah di sekitar akar (rizosfer) tanaman bawang daun.

Pengisolasian mikroba diutamakan untuk memperoleh bakteri

Pseudomonas spp. yang berpendar jika ditanam pada medium

Kings’B. Isolasi mikroba ini dilakukan dengan teknik pengenceran

dan menanam langsung sampel pada medium (Machmud et al.,

2003). Untuk isolasi dengan teknik pengenceran diambil sebanyak 1

31

gram tanah di sekitar tanaman bawang daun dimasukkan ke dalam

botol yang berisi akuades steril dan divorteks selama satu menit,

sehingga membentuk suspensi bakteri. Kemudian diencerkan dari

10-1 sampai 10-6, serta diambil 1 ml suspensi bakteri untuk di

tuangkan pada medium Kings’B. Bakteri diinkubasi pada suhu ruang

selama 1-2 x 24 jam dan dari koloni yang berpendar ketika disinari

di bawah UV dibuat kultur murninya.

3. Penapisan Bakteri

Metode yang digunakan untuk menguji kemampuan isolat-

isolat bakteri dalam menghambat pertumbuhan jamur secara in vitro

adalah uji biakan ganda, dimana semua isolat bakteri diuji

kemampuan antagonistiknya dalam menghambat pertumbuhan

jamur pada medium PDA (Johnson & Curl, 1972). Uji biakan ganda

pada penelitian ini meliputi uji penapisan dan uji antagonisme.

Untuk uji penapisan, metode uji biakan ganda didasarkan pada

penelitian yang dilakukan oleh Maria dan Widodo (2004). Potongan

medium PDA berdiameter 6 mm yang telah ditumbuhi jamur

Fusarium sp. umur 7 hari diletakkan di tengah - tengah cawan Petri

dan diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar. Selanjutnya pada

empat sisi yang berlawanan dengan koloni jamur digoreskan koloni

bakteri dari contoh isolat yang berbeda dengan jarak 2 cm dari tepi

32

koloni jamur. Perkembangan jamur diamati dengan melihat ada

tidaknya zona bening selama dua minggu.

Daya hambat isolat bakteri yang diuji dikelompokkan

berdasarkan pada tidak menunjukkan kemampuan antibiosis yang

ditandai dengan simbol negatif (-). Kemampuan antibiosis rendah

yang ditandai dengan adanya zona bening diantara koloni bakteri dan

jamur Fusarium sampai satu minggu, kemudian koloni jamur

Fusarium mampu melewati koloni bakteri yang ditandai dengan

simbol positif satu (+) dan kemampuan antibiosis tinggi yang

ditandai dengan adanya zona bening di antara koloni bakteri dan

Fusarium, koloni jamur Fusarium tidak mampu melewati koloni

bakteri sampai dua minggu yang ditandai dengan simbol positif dua

(++). Gambar 3.1 menunjukkan uji penapisan yang dilakukan.

Gambar 3.1 Isolat B3 dengan kriteria ++ pada inkubasi dua minggu Pada uji selanjutnya, bakteri yang mempunyai kemampuan

untuk menghambat jamur dengan kriteria ++ , diuji kembali untuk

menghitung persentase daya hambat dan lebar zona beningnya.

Potongan medium PDA berdiameter 6 mm yang telah ditumbuhi

Isolat B3

33

jamur Fusarium sp. diletakkan pada cawan Petri yang berisi medium

PDA dengan jarak 3 cm dari pinggir cawan yang berdiameter 9 cm

dan diinkubasi selama dua hari pada suhu kamar, selanjutnya satu

isolat bakteri digoreskan pada sisi yang berlawanan dengan jarak 3

cm dari pinggir cawan, lalu diinkubasikan pada suhu kamar. Sebagai

kontrol, ditumbuhkan hanya jamur tanpa bakteri. Setelah salah satu

sisi koloni jamur pada kontrol ke arah 3 cm telah mencapai pinggir

cawan (± 7 hari), dilakukan pengukuran zona bening antara koloni

jamur dan bakteri. Hasil uji lanjut ini dapat dilihat pada gambar 3.2

berikut :

Gambar 3.2 Uji lanjut Isolat B2 umur 7 hari Persentase penghambatan tertinggi, baik dari isolat bakteri

koleksi Balitsa maupun hasil isolasi sendiri akan digunakan dalam

uji antagonisme selanjutnya. Isolat terpilih bakteri hasil isolasi

sendiri yang diuji antagonisme selanjutnya akan diidentifikasi.

4. Identifikasi Bakteri

Kontrol Isolat B2

34

Metode yang digunakan untuk mengetahui karakteristik dari

bakteri yang akan diuji yaitu metode yang dikemukakan oleh

Cappucino dan Sherman (1983). Uji-uji yang dilakukan adalah

sebagai berikut :

a. Pewarnaan Gram

Membuat sediaan mikroskopik untuk biakan bakteri yang akan

diwarnai. Sediaan bakteri tersebut ditetesi dengan crystal violet,

diamkan selama 3 menit. Zat warna yang berlebihan dibuang

dengan menggunakan akuades yang mengalir. Sediaan bakteri

tersebut diteteskan dengan larutan lugol, diamkan selama 45-60

detik. Kemudian sediaan bakteri dimasukkan ke dalam staining jar

yang berisi alkohol 96 %, lalu digoyang-goyangkan selama 1

menit. Sediaan bakteri dibilas dengan menggunakan akuades yang

mengalir kemudian dikeringkan dengan menggunakan kertas isap.

Setelah itu, sediaan diteteskan larutan Safranin O, diamkan selama

3 menit, lalu dibilas dengan akuades dan dikeringkan, biakan

diamati di bawah mikroskop.

b. Uji Hidrolisis Pati

Menginokulasikan bakteri pada medium pati, kemudian

diinkubasikan pada suhu 22-28 oC selama 24 jam. Setelah terlihat

adanya pertumbuhan, larutan Lugol dituangkan dan biarkan

beberapa menit, perubahan warna yang terjadi diamati. Uji positif

35

ditandai dengan tampaknya area jernih di sekitar pertumbuhan

bakteri yang diinokulasikan.

c. Hidrolisis Lipid

Menginokulasikan bakteri pada medium lipid, kemudian

diinkubasikan pada suhu 22-28 oC selama 24 jam, amati

perubahan warna koloni bakteri. Uji positif ditandai dengan warna

medium di sekitar koloni bakteri yang berwarna merah.

d. Uji Hidrolisis Gelatin

Menginokulasikan bakteri pada medium gelatin, kemudian

diinkubasikan pada suhu 22-28 oC selama 24 jam, simpan di

inkubator suhu 4 0C selama 30 menit, cair tidaknya medium

diamati. Uji positif ditandai dengan cairnya medium gelatin

setelah diinokulasikan bakteri.

e. Uji Produksi Katalase

Bakteri diinokulasikan pada medium NA miring. Kemudian

diinkubasikan pada suhu 28 oC selama 24 jam, di atas permukaan

kultur diteteskan 3 tetes H2O2 3%, uji positif ditandai oleh

terbentuknya gelembung udara di atas permukaan kultur.

f. Uji Produksi Oksidase

Bakteri diinokulasikan pada medium NA miring. Kemudian

diinkubasikan pada suhu 28 oC selama 24 jam, setelah itu

digenangi dengan reagen uji oksidase, uji positif ditandai dengan

36

berubahnya koloni bakteri menjadi merah muda, lalu merah tua,

merah gelap dan akhirnya hitam.

g. Uji Fermentasi Karbohidrat

Bakteri diinokulasikan pada medium :

a. Kaldu laktosa 10 ml bersama tabung Durham yang terbalik

b. Kaldu dekstrosa 10 ml bersama tabung Durham yang

terbalik

c. Kaldu sukrosa 10 ml bersama tabung Durham yang terbalik

Masing-masing medium yang telah diinokulasi bakteri

diinkubasikan selama 24 jam. Uji positif ditandai dengan

berubahnya warna media menjadi kuning serta diikuti oleh

terbentuknya gas yang dapat diamati pada tabung Durham.

5. Pembuatan Kurva Tumbuh dan Kurva Baku Bakteri

Pseudomonas spp. Isolat B1 dan Isolat G1

Metode yang digunakan untuk membuat kurva tumbuh

adalah metode Turbidimetri (Cappucino dan Sherman, 1983), dengan

cara melihat kekeruhan bakteri (Optical Density / OD), dengan

menggunakan alat Spectrofotometer.

Sebelum melakukan pengukuran terhadap kekeruhan bakteri

bakteri, diperlukan pengaktifan kultur terlebih dahulu. Aktivasi

dilakukan secara bertahap dengan menggunakan medium PDB.

37

Masing-masing isolat bakteri diinokulasikan sebanyak satu ose ke

dalam 10 ml medium PDB dan dikocok pada kecepatan 120 rpm

selama 24 jam pada suhu 28 0C dengan menggunakan Waterbath

shaker.

Kultur cair pada masing-masing isolat bakteri yang

digunakan untuk membuat kurva tumbuh adalah kultur hasil aktivasi

pada 10 ml medium PDB yang telah dikocok selama 24 jam,

kemudian dimasukkan ke dalam 90 ml medium PDB, dikocok pada

kecepatan 120 rpm pada suhu 28 0C. Setiap interval waktu 2 jam

diambil sampel kultur sebanyak 5 ml untuk mengetahui harga OD

masing-masing isolat bakteri yang terlarut dalam medium biakan,

kemudian dimasukkan ke dalam kuvet. Kekeruhan bakteri pada kuvet

diukur dengan menggunakan Spectrofotometer pada panjang

gelombang 620 nm. Kurva tumbuh dapat dibuat berdasarkan hasil

korelasi antara harga OD (sumbu Y) terhadap selang waktu tertentu

(sumbu X).

Kurva baku dibuat berdasarkan waktu logaritmik bakteri

yang dapat diketahui dari kurva tumbuh. Masing-masing isolat bakteri

diaktivasi terlebih dahulu dengan cara menginokulasikan satu ose

biakan bakteri ke dalam 10 ml medium PDB dan dikocok pada

kecepatan 120 rpm selama 24 jam pada suhu 28 0C dengan

menggunakan Waterbath shaker. Setelah 24 jam, sampel kultur 10 ml

dimasukkan ke dalam 90 ml medium PDB, dikocok kembali pada

38

kecepatan 120 rpm selama waktu yang diperlukan bakteri untuk

mencapai fase log, kemudian ditentukan batas waktu yang akan

ditentukan harga OD-nya. Berdasarkan kurva tumbuh masing-masing

isolat bakteri, batas waktu yang ditentukan harga OD-nya adalah

sebagai berikut :

a. Untuk bakteri isolat B1 , batas waktu yang digunakan untuk

menentukan harga OD-nya yaitu pada jam ke-2, jam ke-4 dan

jam ke-6.

b. Untuk bakteri isolat G1 , batas waktu yang digunakan untuk

menentukan harga OD-nya yaitu pada jam ke-6, jam ke-8 dan

jam ke-10.

Pada jam-jam tersebut di atas, diambil sebanyak 5 ml kultur

ke dalam kuvet untuk diukur absorbansinya dengan menggunakan alat

Spectrofotometer. Pada waktu yang sama, kultur diambil juga

sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi 9

ml akuades steril untuk pengenceran 10-1, begitu seterusnya sampai

pengenceran 10-10, dilakukan secara berurutan. Pada pengenceran 10-8,

10-9 dan 10-10, diambil 1 ml untuk ditumbuhkan pada medium PDA

dengan menggunakan metode cawan tuang. Biakan diinkubasi selama

24 jam pada suhu kamar, kemudian koloni bakteri yang tumbuh

dihitung dengan menggunakan alat Colony counter. Dengan diketahui

jumlah bakteri dan harga OD-nya maka dapat dibuat kurva baku.

39

Kurva baku merupakan hasil regresi linier yang

menghubungkan antara kerapatan optik (optical density) suspensi

bakteri sebagai sumbu X dengan hasil perhitungan jumlah koloni

bakteri yang tumbuh pada medium PDA sebagai sumbu Y.

6. Membuat Suspensi Bakteri Pseudomonas spp. Isolat B1 dan

Isolat G1 sebagai Sumber Inokulum

Konsentrasi suspensi bakteri sebagai sumber inokulum yang

akan digunakan untuk perlakuan adalah 1011cfu/ml. Konsentrasi ini

diperoleh dari perhitungan persamaan regresi linear pada kurva baku,

dengan memasukan harga OD pada persamaan linear tersebut, maka

akan diperoleh konsentrasi yang diperlukan. Masing-masing isolat

bakteri diinokulasi berdasarkan kurva tumbuh, yaitu pada fase

stasioner. Pengambilan pada fase ini dikarenakan pengeluaran

antibiotik sebagai metabolit sekunder bakteri biasanya dieksresikan

pada fase stasioner. Suspensi bakteri dibuat dengan cara

menginokulasikan satu ose koloni bakteri pada 10 ml medium PDB,

dan dikocok pada kecepatan 120 rpm selama 24 jam pada suhu 28 0C

dengan menggunakan Waterbath shaker.

Setelah 24 jam, sampel kultur 10 ml dimasukkan ke dalam 90

ml medium PDB, dikocok kembali pada kecepatan 120 rpm selama

waktu yang diperlukan bakteri untuk mencapai fase stasioner,

40

tepatnya pada jam ke – 14. Penentuan waktu ini didasarkan pada

kurva baku dari kedua bakteri tersebut.

7. Uji Antagonisme

Metode uji biakan ganda pada uji antagonisme didasarkan

pada penelitian yang dilakukan oleh Yusriadi (2004) yang telah

dimodifikasi. Uji antagonisme bakteri Pseudomonas spp. dengan

jamur Fusarium sp. dilakukan dengan cara meletakkan biakan murni

jamur Fusarium sp. yang berumur 7 hari (Djatnika dan Nuryani,

1993) pada medium PDA dengan menggunakan pelubang gabus

berdiameter 6 milimeter dan diletakkan pada tengah-tengah

permukaan medium PDA pada cawan petri yang sebelumnya

diinokulasi suspensi bakteri, dengan konsentrasi inokulum sebesar

1011 cfu/ ml. Perlakuan ini diinkubasi selama 7 hari. Peubah yang

diamati adalah diameter pertumbuhan koloni jamur yang terbentuk

dengan menggunakan mistar.

G. Analisis Data

1. Penentuan Kurva Tumbuh dan Kurva Baku

Data yang diperoleh pada kurva tumbuh berupa harga OD bakteri

yang menunjukkan fase-fase pertumbuhan populasi bakteri. Fase – fase

pertumbuhan bakteri tersebut adalah fase lag, fase eksponensial, fase

stasioner dan fase kematian.

41

Hasil kurva tumbuh berupa grafik pertumbuhan hasil korelasi antara

harga OD (sumbu Y) pada selang waktu tertentu (sumbu X). Data ini

diolah dengan menggunakan software Microsoft Excel sehingga dapat

ditentukan fase-fase pertumbuhan bakteri, selain itu dapat diketahui

umur biakan pada saat mencapai fase stasioner untuk pembuatan

inokulum.

Pada penentuan kurva baku, data yang diperoleh berupa korelasi

antara harga OD sebagai variabel bebas (sumbu X) terhadap jumlah

bakteri yang dilogaritmakan sebagai variabel terikat (sumbu Y).

Hubungan kedua variabel ini dapat dimodelkan dalam persamaan

matematik, yaitu : y = bx + a. Dengan menggunakan software Microsoft

Excel dapat ditentukan persamaan regresinya.

2. Uji Daya Hambat pada Penapisan Bakteri

Data yang diperoleh berupa data kualitatif dapat menghambat

atau tidaknya dari semua isolat bakteri yang diujikan dan data

kuantitatif uji lanjut yang berupa persentase daya hambat yang

didasarkan pada rumus Fokkema dan van deur Meulen (1976, dalam

Maria dan Widodo, 2004), yaitu :

I = R1- R 2 X 100 % R1 Keterangan :

I = persentase hambatan

R1 = jari-jari koloni jamur Fusarium sp. pada kontrol

42

R2 = jari-jari koloni jamur Fusarium sp. yang berhadapan dengan

goresan bakteri

3. Analisis Data Uji Antagonisme

Data yang diperoleh berupa pertumbuhan diameter jamur

Fusarium sp. setelah diberi perlakuan suspensi bakteri yang berbeda

setelah diinkubasi selama 7 hari. Data yang diperoleh dianalisis

menggunakan analisis statistika dengan program software statistika

SPSS 12.0 for windows. Uji pertama yang dilakukan adalah uji

homogenitas varians dengan menggunakan uji Levene’s statistik,

kemudian dilanjutkan dengan uji normalitas Kolmogorov-Smirnov.

Hasil pengujian menunjukkan bahwa data homogen dan berdistribusi

normal maka pengujian hipotesis dilanjutkan dengan menggunakan one

way ANOVA. Hasil uji one way ANOVA menjelaskan bahwa terdapat

perbedaan yang signifikan antara variasi isolat bakteri dengan diameter

pertumbuhan jamur Fusarium sp. Untuk membandingkan perbedaan

signifikan antara kelompok data yang satu dengan kelompok data yang

lainnya, maka uji lanjut yang digunakan adalah Uji Tukey.

43

H. Alur Penelitian

Persiapan penelitian : 1. Penyediaan kultur murni bakteri 2. Penyediaan kultur murni jamur 3. Pembuatan medium yang

diperlukan 4. Pembuatan larutan zat warna dan

reagen yang diperlukan 5. Subkultur jamur dan bakteri

Isolasi bakteri dari rizosfer bawang daun

Uji penapisan bakteri Pseudomonas spp.

Identifikasi bakteri Pseudomonas spp.

Pembuatan kurva tumbuh dan kurva baku bakteri

Pseudomonas spp.

Uji Antagonisme Pseudomonas spp.

terhadap Fusarium sp. pada cawan petri

44

..........

Lanjutan bagan

Gambar 3.3 Bagan alur penelitian

Pengamatan

Analisis Data

Penyusunan Laporan

Uji Antagonisme Pseudomonas spp.

terhadap Fusarium sp. pada cawan petri