17

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret hingga September 2013.

Sampling Gracilaria sp., Sargassum sp. dan air laut dilakukan di perairan Santolo

dan Sancang, Garut Selatan dan pengukuran parameter lingkungan dilakukan

langsung di lokasi. Pengidentifikasian bakteri melalui uji biokimia dilakukan di

Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut

Teknologi Bandung dan penelitian utama dilakukan di Laboratorium Bioteknologi

Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

1. Sampling dan pengamatan parameter fisika dan kimiawi lingkungan

Alat :

Gunting untuk memotong dan mengambil sampel rumput laut.

Plastik dan botol sebagai wadah sampel.

Alat pengukur pH (pH meter) untuk mengukur derajat keasaman air laut

dengan ketelitian 0,1.

Kertas label untuk memberi tanda pada sampel.

Kontainer pendingin atau cool box untuk menjaga agar sampel tidak

membusuk.

Termometer skala 0°C-100°C untuk mengukur suhu air laut dengan

ketelitian pengukuran 0,1°C.

Refraktometer untuk mengukur salinitas air dengan ketelitian

pengukuran 0,1.

GPS untuk mengetahui posisi sampling.

Kamera digital untuk dokumentasi kegiatan.

Bahan :

Air laut steril

Es batu

18

2. Isolasi dan pemurnian bakteri

Alat :

Autoklaf untuk mensterilisasi alat.

Cawan petri untuk tempat pembiakan bakteri.

Erlenmeyer volume 250 ml untuk wadah larutan media.

Plastik tahan panas untuk menjaga agar cairan hasil penguapan tidak

masuk ke dalam alat yang disterilisasi.

Kapas untuk menyumbat erlenmeyer.

Timbangan analitis dengan ketelitian 0,0001 gram untuk menimbang

bahan yang digunakan.

Jarum ose untuk melakukan pemindahan bakteri.

Bunsen untuk mensterilkan jarum ose.

Laminar flow cabinet tempat bekerja proses isolasi bakteri.

Kertas label untuk menamai cawan petri.

Hot plate untuk memanaskan larutan media.

Inkubator untuk menginkubasi bakteri biakan.

Tabung reaksi volume 5 ml sebagai wadah pengenceran dan

menyimpan air laut steril.

Mikropipet untuk mengambil cairan dari sampel yang dihaluskan dalam

jumlah kurang dari 1 ml.

Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi.

Gelas ukur volume 100 ml untuk mengukur volume larutan.

L Glass untuk meratakan hasil pengenceran pada medium.

Mortar untuk menghaluskan sampel.

Shaker Incubator untuk menghomogenkan dan menginkubasi bakteri

pada kultur cair.

Vortex untuk menghomogenkan larutan.

Plastik wrap untuk menutup cawan petri sehingga dapat meminimalisir

kontaminasi.

Aluminium foil untuk menutup erlenmeyer.

19

Bahan :

Medium bacto agar

Medium pepton bacteriologi

Air laut steril

Akuades steril

KNO3

Alkohol 70%

Sampel rumput laut Gracilaria sp., Sargassum sp. dan air laut

3. Pewarnaan bakteri

Alat :

Objek glass untuk tempat pembuatan preparat.

Pipet untuk meneteskan pewarna.

Mikroskop untuk mengamati preparat.

Bunsen untuk mencegah kontaminasi dan mengeringkan preparat.

Jarum ose untuk mengambil bakteri.

Plastik wrap untuk menutup cawan petri sehingga dapat meminimalisir

kontaminasi.

Bahan :

Alkohol 70%

Akuades

NaCl fisiologis

Pewarna gentian violet

Lugol

Pewarna air fuchsin

4. Pengujian aktivitas agarase

a. Secara Kualitatif

Alat :

Cawan petri untuk wadah medium dan pengujian.

20

Jarum ose untuk memindahkan isolat murni ke cawan petri yang berisi

medium.

Inkubator untuk menginkubasi bakteri.

Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri.

Mikropipet untuk meneteskan pereaksi.

Jangka sorong digital untuk mengukur diameter zona bening yang

dihasilkan bakteri.

Plastik wrap untuk menutup cawan petri sehingga dapat meminimalisir

kontaminasi.

Bahan :

Medium POR padat (1.5%)

Pereaksi lugol iodin

b. Secara Kuantitatif

Alat :

Tabung reaksi untuk wadah sampel dan larutan.

Jarum ose untuk memindahkan atau menginokulasi bakteri.

Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri.

Shaker incubator untuk tempat menginkubasi bakteri.

Rak tabung reaksi untuk tempat tabung reaksi.

Kuvet wadah larutan dalam pengujian aborbansi menggunakan

spektrofotometer.

Mikropipet untuk meneteskan pereaksi.

Spektrofotometer untuk mengukur aborbansi sampel yang akan diuji.

Laminar flow cabinet tempat bekerja ketika proses isolasi dilakukan.

Bahan :

Medium POR cair (0.1%)

Reagen A : natrium karbonat, natrium kalium tartrat, natrium

bikarbonat, natrium sulfat anhidrat dan air.

Reagen B : tembaga sulfat pentahidrat, air dan asam sulfat pekat.

21

Reagen C : ammonium molibdat, air, asam sulfat pekat, natrium

hidrogen arsenat heptahydrat dan arsenat.

5. Analisis molekuler 16S rRNA

a. Persiapan kultur cair

Alat :

Tabung reaksi wadah kultur cair.

Jarum ose untuk memindahkan bakteri.

Bunsen untuk mencegah kontaminasi saat pemindahan bakteri.

Shaker incubator untuk menginkubasi bakteri.

Laminar flow cabinet tempat bekerja ketika proses isolasi dilakukan.

Bahan :

Medium POR cair (0.1%)

Air laut steril

b. Isolasi DNA

Alat :

Mikro pipet untuk mengambil larutan DNA dan larutan kimia.

Sentrifugasi untuk memisahkan larutan.

Eppendorf untuk menyimpan ekstrak DNA.

Vortex untuk menghomogenkan larutan.

Bahan :

RNAse

TRIS HCl pH 8.5 [200 µM]

NaCl [250 µM]

EDTA [25 µM]

SDS 1%

Na asetat

Etanol absolut

Etanol 70%

TE

22

c. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Alat :

Thermal cycler untuk melakukan amplifikasi DNA.

Microtube untuk wadah komponen PCR.

Bahan :

DNA template

Primer forward F (9F) [10mM]

Primer reverse R (1541 dan 1492R) [10mM]

Nuclease free water

PCR master mix (KAPA2G fast ready mix PCR kit)

d. Elektroforesis gel agarosa

Alat :

Gelas ukur volume 100 ml untuk mengukur volume larutan TBE.

Timbangan analitik dengan ketelitian 0,0001 gram untuk menimbang

agarosa.

Cetakan gel agarosa untuk mencetak gel agarosa dan membuat sumur-

sumur.

Microwave untuk memanaskan larutan agarosa.

Alat elektroforesis untuk memisahkan pita DNA dengan bantuan arus

listrik.

Power supply untuk menyalurkan arus listrik.

Ultraviolet transilluminator untuk melihat hasil akhir elektroforesis.

Bahan :

Gel agarosa

Larutan pemberat dan pewarna (loading dye)

Larutan Tris-borat EDTA (TBE) [0.5x]

Ethidium Bromide (EtBr)

DNA ladder 1kb (biolabs)

Akuades

23

3.3 Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode eksploratif untuk

mendapatkan data yang diperlukan.

3.4 Prosedur Penelitian

Alur penelitian yang dilaksanakan adalah sebagai berikut :

Isolasi Bakteri Sampling

kultivasi

subkultur

Pengamatan morfologi (bentuk

koloni dan Gram)

Uji Aktivitas Agarase Kualitatif (indeks agarolitik)

pengambilan 6 isolat terbaik

Kuantitatif (konsentrasi gula

pereduksi)

pengambilan 2 isolat terbaik

Karakterisasi Bakteri Seleksi Uji biokimiawi (Bergey’s Manual

of Determinative Bacteriology

dan modifikasi media akan

kebutuhan pepton dan NaCl)

Analisis Molekuler Gen 16S

rRNA

isolasi DNA

analisis molekuler 16S rRNA

sekuensing

analisis bioinformatik

isolasi

isolat murni

2 kali pengulangan

2 kali pengulangan

24

3.4.1 Pengambilan Sampel

Sampling dilakukan di perairan Santolo dan Sancang, Garut Selatan (Tabel

1) dengan memotong dan mengambil rumput laut Sargassum sp., Gracillaria sp.

dan air laut. Sampel diambil ±10 meter dari tepi pantai dan dilakukan saat air

surut. Setelah rumput laut dipotong, sampel kemudian dimasukkan dalam plastik

steril dan botol steril serta ditempatkan dalam kontainer pendingin dan dibawa ke

laboratorium. Sampel disimpan di dalam freezer dengan suhu -23°C.

Dalam perjalanan menuju laboratorium sampel disimpan dalam air laut

steril untuk menjaga agar mikroorganismenya tidak mati. Transportasi

pengangkutan sampel ke laboratorium dilakukan sebelum 24 jam dari waktu

pengambilan sampel dan langsung dilakukan isolasi bakteri dari setiap sampel.

Hal ini dilakukan agar bakteri tidak berkembang dan mengeluarkan enzim tertentu

yang mungkin dapat membunuh bakteri tersebut.

Tabel 1. Data Lokasi Sampling

Jenis Makroalga Lokasi Waktu Suhu (°C) Salinitas pH

Gracilaria sp.

Perairan Santolo

09.00 29 34.5 8.05 S : 7°39’40”

E : 107°41’1.6”

Sargassum sp.

Perairan Sancang

12.00 33 35 7.34 S : 7°39’36”

E : 107°40’48”

Air Laut

Perairan Santolo

09.00 29 34.5 8 S : 7°39’40.1”

E : 107°41’1.7”

Pada Tabel 1 terlihat bahwa perbedaan salinitas dan pH antar perairan

tidak jauh berbeda. Oleh karena itu perbedaan lokasi pengambilan sampel tidak

terlalu berpengaruh terhadap kondisi sampel. Sedangkan suhu yang berbeda

antara perairan Santolo dan Sancang dikarenakan oleh waktu pengambilan

sampel yang berbeda.

25

3.4.2 Sterilisasi dan Pembuatan Media Pertumbuhan

1. Sterilisasi

Sebelum melakukan isolasi dan purifikasi bakteri, perlu dilakukan

sterilisasi alat terlebih dahulu untuk mencegah kontaminasi dari alat ataupun

medium yang digunakan. Dalam mikrobiologi, sterilisasi mutlak dilakukan agar

didapatkan objek yang diinginkan tanpa adanya kontaminasi. Sterilisasi dilakukan

dengan 2 cara, yaitu sterilisasi uap dengan menggunakan autoklaf dan sterilisasi

kering dengan menggunakan oven.

Sterilisasi uap dilakukan dengan cara menyimpan alat dan medium yang

telah dibungkus kertas dan plastik tahan panas didalam autoklaf, lalu autoklaf

dinyalakan hingga mencapai suhu 121˚C. Setelah mencapai suhu tersebut,

ditunggu selama 15 menit untuk membunuh kontaminan yang kemungkinan dapat

mengkontaminasi alat dan medium (Hadioetomo 1993).

Sterilisasi kering dilakukan dengan cara menyimpan alat yang telah

dibungkus kertas ke dalam oven dengan suhu 180˚C selama 2 jam. Kemudian

dikeluarkan dari dalam oven dan disimpan dalam rak khusus peralatan steril

(Hadioetomo 1993). Pemilihan sterilisasi uap dan sterilisasi kering bergantung

pada alat dan bahan yang akan disterilisasi.

2. Membuat media POR 1,5%

Sebanyak 1,5 gram bacto agar, 0,1 gram KNO3, dan 100 ml air laut

dimasukkan ke dalam Erlenmeyer (Lampiran 2). Erlenmeyer kemudian ditutup

dengan kapas lalu dipanaskan dengan hot plate menggunakan magnetic stirrer,

ditunggu sampai larutan tercampur homogen dan berwarna bening. Kemudian

larutan media disterilisasi. Sebelum dituang, media steril didiamkan hingga agak

dingin agar tidak terbentuk uap air pada tutup cawan petri pada saat penuangan.

Setelah dituangkan agar didiamkan pada suhu ruang sampai memadat. Proses

penuangan dilakukan didalam laminar flow cabinet agar media dan alat yang telah

disterilisasi tidak terpapar kontaminasi yang terbawa oleh udara. Proses

pembuatan media dapat dilihat di Lampiran 3.

26

3.4.3 Isolasi Bakteri

Isolasi bakteri adalah proses mengambil bakteri dari medium atau

lingkungan asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh

biakan murni. Salah satu metode pengisolasian bakteri ketika pertama kali

diisolasi dari sampel adalah pengenceran. Pengenceran ini bertujuan untuk

mengurangi jumlah bakteri didalam sampel sehingga dapat mempermudah

mendapatkan kultur murni.:

Sampel dihaluskan menggunakan mortar lalu diambil sebanyak 1 gram.

Sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi pertama yang berisi 4,5 ml

larutan air laut steril.

Tabung reaksi divortex agar larutan tercampur homogen.

Setelah homogen, larutan diambil sebanyak 0,5 ml dan dipindahkan ke

dalam tabung reaksi kedua yang berisi 5 ml air laut steril.

Tabung reaksi divortex agar larutan tercampur homogen.

Proses pengenceran dilakukan hingga memperoleh pengenceran 10-6

dan 10-7

(Lampiran 4).

Dari masing-masing pengenceran 10-6

dan 10-7

diambil sebanyak 0,1 ml.

Kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri yang telah berisi medium

POR.

Sampel diratakan menggunakan L Glass.

Cawan petri ditutup dan dilapisi dengan plastik wrap.

Disimpan dalam inkubator dengan suhu 30°C selama 3x24 jam.

Diamati setiap hari sampai terjadi pertumbuhan koloni bakteri pada

biakan campuran.

Semua proses isolasi bakteri dilakukan didalam laminar flow cabinet untuk

menghindari kontaminasi, baik alat maupun bahan, dari mikroorganisme yang

terbawa oleh udara. Proses isolasi bakteri dapat dilihat pada Lampiran 5.

27

3.4.4 Kultivasi dan Purifikasi Bakteri

Kultivasi adalah proses menumbuhkan bakteri dalam biakan murni. Agar

kultivasi berhasil, diperlukan suatu kombinasi nutrien serta lingkungan fisik yang

sesuai. Kondisi fisik yang dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri antara lain: suhu,

atmosfer gas dan keasaman atau kebasaan.

Purifikasi bakteri adalah proses kultivasi yang dilakukan berulang-ulang

sehingga didapat kultur murni atau isolat tunggal. Kultivasi dan purifikasi bakteri

dilakukan dengan cara:

Ditentukan bakteri mana yang akan dikultivasi berdasarkan koloninya..

Koloni bakteri yang akan dimurnikan diseleksi berdasarkan pada bentuk,

warna, dan kenampakan lainnya.

Setiap koloni dipindahkan ke dalam cawan petri yang berbeda.

Bakteri yang akan dimurnikan diambil menggunakan jarum ose.

Jarum ose dibakar dengan bunsen hingga berwarna merah.

Setelah jarum ose dingin, bakteri diambil dan dipindahkan ke cawan

petri yang berisi medium POR menggunakan metode gores (streak

method).

Dilakukan proses yang sama untuk setiap koloni.

Cawan petri ditutup dan dilapisi dengan plastik wrap.

Proses diulangi hingga didapatkan isolat murni dimana hanya terdapat

bakteri yang sama dalam isolat tersebut.

Isolasi dan purifikasi isolat bakteri dilakukan berdasar penampakan morfologis

dengan metode goresan (streak method) hingga diperoleh kultur murni (Cappucino

dan Sherman 2008). Proses purifikasi bakteri dapat dilihat pada Lampiran 6.

3.4.5 Pewarnaan Bakteri

Untuk memastikan bakteri telah murni dan untuk mengetahui bakteri

tersebut termasuk kedalam golongan bakteri gram positif atau negatif, maka

dilakukan pewarnaan dan pengamatan mikroskop dengan prosedur sebagai berikut

(Cappucino dan Sherman 2008) :

Objek glass dibasahi dengan alkohol lalu dikeringkan di atas bunsen.

28

NaCl fisiologis steril diteteskan sebanyak 1 tetes di atas objek glass.

Isolat bakteri yang akan diamati diambil dengan jarum ose.

Isolat dioleskan pada NaCl fisiologis steril yang ada pada objek glass

dan diratakan.

Bakteri dan NaCl yang tercampur dikeringkan di atas bunsen.

Diteteskan pewarna I (gentian violet) di atas NaCl dan bakteri yang

dikeringkan lalu diratakan dan didiamkan selama 1 menit.

Bilas pewarna I dengan akuades dan dikeringkan.

Diteteskan lugol dan diratakan lalu tunggu selama 1 menit.

Bilas lugol dengan akuades lalu dikeringkan di atas bunsen.

Bilas dengan alkohol kemudian dikeringkan.

Bilas dengan akuades kemudian dikeringkan.

Diteteskan pewarna II (air fuchsin) lalu diratakan dan didiamkan selama

45 detik.

Bilas dengan akuades kemudian dikeringkan di atas bunsen.

Bentuk koloni dan warna (Gram) diamati dengan menggunakan

mikroskop.

Proses pewarnaan Gram dapat dilihat pada Lampiran 7.

Dalam pengamatan menggunakan mikroskop, yang perlu diperhatikan adalah :

1 Bentuk sel bakteri

Jika semua sel bakteri berbentuk sama, berarti koloni bakteri tersebut sudah

murni.

2 Warna bakteri

Jika berwarna ungu, berarti bakteri termasuk ke dalam bakteri gram positif

dan jika berwarna merah, berarti bakteri tersebut termasuk ke dalam bakteri

gram negatif.

3.4.6 Uji Aktivitas Agarase

1 Uji Aktivitas Secara Kualitatif

Setelah didapat kultur murni dilakukan uji aktivitas agarase. Uji skrining

29

ini dilakukan pada media POR. Pengujian ini dilakukan dengan cara:

Bakteri yang ada pada isolat tunggal diambil menggunakan jarum ose.

Bakteri tersebut dipindahkan ke cawan petri lain yang berisi medium

POR.

Bakteri dikultivasi selama 3x24 jam.

Setelah bakteri tumbuh, dilakukan pewarnaan menggunakan Lugol

Iodin dengan cara menuangkannya sebanyak 2 ml ke dalam cawan petri.

Cawan petri digoyang-goyangkan hingga lugol iodin tersebar merata ke

seluruh permukaan medium.

Perendaman dilakukan selama 15 menit.

Setelah 15 menit, lugol iodin dibuang.

Luasan zona bening dan koloni yang dihasilkan diamati dan diukur

diameternya.

Dari seluruh isolat tunggal yang diuji aktivitas agarase, diambil 6 sampel

yang menghasilkan indeks agarase terbesar (Indeks agarase = rata-rata diameter

zona bening : rata-rata diameter bakteri). Proses pengujian aktivitas agarase secara

kualitatif dapat dilihat pada Lampiran 8.

2. Uji Aktivitas Secara Kuantitatif

Uji aktivitas ini dilakukan dengan cara menghitung kadar gula pereduksi

dari hasil hidrolisis. Penentuan kadar gula ini dilakukan dengan menggunakan

metode Somogyi-Nelson Alkaline Cooper. Untuk menggunakan metode ini

memerlukan 4 macam reagen yaitu ;

Reagen A :Sebanyak 25 g natrium karbonat, 25 g natrium-kalium tartrat, 20 g

natrium bikarbonat, dan 200 g natrium sulfat anhidrat, dilarutkan

dalam 1 L air.

Reagen B :Sebanyak 30 g tembaga sulfat pentahidrat dilarutkan dalam 200

ml air, kemudian ditambahkan 4 tetes asam sulfat pekat.

Reagen C :Sebanyak 25 g amonium molibdat dilarutkan dalam 450 mL air

yang mengandung 21 mL asam sulfat pekat dan 3 g natrium

hidrogen arsenat heptahydrat (Na2HAsO4.7H2O) dilarutkan dalam

30

25 mL air. Larutan arsenat secara perlahan ditambahkan ke dalam

larutan amonium molibdat, yang diencerkan sampai 500 mL dan

dipanaskan secara hati-hati pada suhu 55o

C selama 30 menit atau

37o

C selama 12-15 jam, kemudian disimpan dalam botol berwarna

coklat.

Reagen D :Sebanyak 1 mL reagen B dicampurkan dengan 25 mL reagen A.

Reagen D harus dibuat segar pada saat akan dilakukan pengujian gula pereduksi.

Sedangkan reagen yang lain bisa disimpan dan masih dapat digunakan

dikemudian hari.

Sebelum dilakukan pengujian, dilakukan persiapan sebelum pengujian :

Kultur bakteri yang telah diuji indeks agarase secara kualitatif, dipindahkan ke

dalam tabung reaksi berisi POR 0.1%. Kemudian dikultivasi didalam incubator

shaker dengan suhu 30˚C. Bakteri diinkubasi selama 3x24 jam.

Pengujian secara kuantitatif dilakukan dengan cara :

Dicampurkan sebanyak 1 ml sampel dan 1 ml reagen D ke dalam tabung

reaksi.

Larutan dipanaskan pada air mendidih selama 20 menit

Didinginkan pada air mengalir selama 5 menit

Ditambahkan 1 mL reagen C lalu dikocok sampai tidak terdapat

gelembung gas.

Larutan dibiarkan selama 10 menit.

Disentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 6000 rpm.

Kemudian larutan diukur absorbansinya dengan spektrofotometer dengan

panjang gelombang 540 nm.

Nilai absorbansi yang dihasilkan harus dikurangi dengan absorbansi

blanko (media cair) agar didapatkan absorbansi murni dari sampel (tanpa

ada kandungan absorbansi dari blanko).

Jumlah gula pereduksi ditentukan melalui persamaan yang diperoleh dari

kurva standar glukosa dan dinyatakan dalam mg/ml. Kurva standar glukosa dibuat

dengan pembuatan larutan glukosa dengan berbagai konsentrasi (0 mg/ml, 0,2

31

mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,6 mg/ml, 0,8 mg/ml dan 1 mg/ml). Proses pengujian aktivitas

agarase secara kuantitatif dapat dilihat pada Lampiran 9.

Sampel yang memiliki nilai gula pereduksi tertinggi, kemudian akan

dijadikan sebagai kandidat utama sebagai penghasil enzim agarase terbesar. Dari

hasil spektrofotometer, akan diambil 2 nilai tertinggi yang kemudian akan

dikarakterisasi secara biokimia dan dianalisis molekuler dengan metode 16s rRNA.

3.4.7 Modifikasi Media Pertumbuhan

Modifikasi media pertumbuhan dilakukan untuk mengetahui kebutuhan

bakteri target terhadap pepton sebagai sumber karbon alternatif dan NaCl untuk

mengetahui kebutuhan bakteri terhadap ion Na dan Cl yang menjadi ciri bakteri

laut.

1. Membuat media POR 1,5% dan modifikasi media dengan menggunakan

air tawar atau akuades

Sebanyak 1,5 gram bacto agar, 0,1 gram KNO3, dan 100 ml air tawar atau

akuades dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Ditutup dengan kapas lalu dipanaskan

dengan hot plate menggunakan magnetic stirrer, tunggu sampai larutan tercampur

homogen dan berwarna bening. Kemudian larutan media disterilisasi. Sebelum

dituang, media steril didiamkan hingga agak dingin agar tidak terbentuk uap air

pada tutup cawan petri pada saat penuangan. Setelah dituangkan, diamkan pada

suhu ruang sampai memadat.

2. Membuat media POR 1,5% dan modifikasi media dengan menggunakan

pepton 1%

Sebanyak 1,5 gram bacto agar, 0,1 gram KNO3, bubuk pepton 1 gram dan

100 ml air laut dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Ditutup dengan kapas lalu

dipanaskan dengan hot plate menggunakan magnetic stirrer, tunggu sampai

larutan tercampur homogen dan berwarna bening. Kemudian larutan media

disterilisasi. Sebelum dituang, media steril didiamkan hingga agak dingin agar

tidak terbentuk uap air pada tutup cawan petri pada saat penuangan. Setelah

dituangkan, diamkan pada suhu ruang sampai memadat.

32

3.4.8 Identifikasi Bakteri Agarolitik

1. Karakterisasi Biokimia

Karakterisasi bakteri dilakukan secara mikrobiologis meliputi karakter

morfologi, fisiologi dan uji biokimiawi (Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology) sebagai pendukung data identifikasi secara molekuler. Uji biokimia

dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan enzim yang dihasilkannya.

Enzim tersebut terdiri dari enzim ekstraselular dan intraselular. Berikut

merupakan uji yang dilakukan terhadap bakteri target :

2. Analisis Molekuler 16S rRNA

Analisis ini bertujuan untuk mengidentifikasi 2 isolat bakteri yang

memiliki aktivitas agarase tertinggi. Analisis ini dilakukan dengan cara :

1. Persiapan bakteri menggunakan kultur cair

Sebelum melakukan isolasi DNA genom dari bakteri, dilakukan kultur cair

untuk memperbanyak bakteri. Tahap-tahapnya adalah (Lampiran 10):

Isolat terpilih ditumbuhkan ke dalam kultur cair (POR 0.1%)

Hidrolisis Pati

Hidrolisis Lemak

Hidrolisis Gelatin

Hidrolisis Casein

Enzim ekstraselular

Indol

Metil Red

Voges Proskauer

Sitrat

Enzim intraselular Uji IMViC

Fermentasi Karbohidrat

Reduksi Nitrat

Uji Urease

Uji Katalase

Uji Gula-Gula

Glukosa

Laktosa

Sukrosa

33

Dilakukan inkubasi selama 3x24 jam dengan suhu 37˚C.

2. Isolasi DNA genom bakteri

Isolasi DNA genom dilakukan untuk mendapatkan DNA genom dari

isolate. Metode isolasi DNA genom bakteri yang digunakan adalah metode

Alkaline Lysis yang telah dimodifikasi (Sambrook 1989) yang dijelaskan

sebagai berikut (Lampiran 11):

Bakteri hasil kultur cair dipindahkan ke dalam tabung ependorf 1,5 ml

dan dilakukan sentrifugasi selama 5 menit dengan kecepatan tinggi

(12.000 rpm).

Pellet DNA diambil dari hasil sentrifugasi dengan cara membuang

supernatannya.

Ditambahkan 300 µl buffer ekstraksi (Lampiran 16) dan 3 µl RNAse

ke dalam setiap tabung lalu tabung ditutup dan dilakukan resuspensi

menggunakan vortex selama 5 menit sampai pellet larut.

Ditambahkan 150 µl Na asetat lalu dihomogenkan dengan cara

membolak-balik tabung dan diamkan selama 10 menit pada suhu

ruang agar proses lysis terjadi.

Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 5 menit.

Supernatan dipindahkan ke dalam tabung ependorf 1,5 ml yang baru.

Dilakukan presipitasi dengan menambahkan etanol absolute sebanyak

450 µl.

Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 10 menit.

Dilakukan pencucian dengan etanol 70% sebanyak 450 µl. Lalu di-flix

agar larutan tercampur.

Dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm selama 30 detik.

Genom DNA dikeringkan dengan cara mengambil supernatannya.

Dibiarkan selama 10 menit agar genom DNA sudah benar-benar

kering.

Setelah kering, ditambahkan TE buffer sebanyak 30 µl dan di-flix

34

sampai genom larut. Hasil isolasi disimpan pada suhu -20°C.

3. Amplifikasi DNA dengan PCR

Amplifikasi gen pengkode 16S rRNA dilakukan dengan PCR untuk

mendapatkan sekuen 16S rRNA yang akan digunakan sebagai bahan sekuensing

untuk menentukan jenis bakteri (Lampiran 12). Amplifikasi dimaksudkan untuk

meningkatkan jumlah DNA target yang ada sehingga dapat dideteksi dengan

elektroforesis. Amplifikasi DNA dilakukan dengan bantuan thermocycler atau

yang lebih dikenal dengan alat PCR.

Dalam proses amplifkasi DNA perlu diketahui primer yang tepat (Tabel 2),

komponen yang digunakan (Tabel 3) dan pengaturan program PCR (Tabel 4).

Primer disebut juga oligonukleotida yang berarti sejumlah kecil nukleotida.

Primer diproduksi secara sintetis biasanya berupa urutan DNA dengan panjang

sekitar 20 nukleotida. DNA polymerase akan menambahkan nukleotida ke 3’-OH

bebas dari primer ini sesuai dengan aturan dasar pasangan yang normal

(MCPherson and Moller 2006).

Tabel 2. Primer 16S rRNA Universal

Primer Urutan Nukleotida (5’ – 3’)

9F F: GAGTTTGATCCTGGCTC

1541R R: AAGGAGGTGATCCAGCC

1492R R: GGCTACCTTGTTACGACTT

Sumber : Lewaru 2012

Tabel 3. Komponen Reaksi PCR

Komponen PCR Konsentrasi Akhir Volume (µl)

Nuclease free water - 9

KAPA2G Fast Ready Mix 1x 12,5

Primer forward 0,5 µM 1,25

Primer reverse 0,5 µM 1,25

DNA template - 1

Sumber : Lewaru 2012

35

Pengaturan dasar program PCR bersifat tentatif. Pengaturan program dasar

PCR biasanya sama tetapi ketika pita DNA yang diharapkan tidak keluar dan/atau

double band maka perlu dilakukan optimasi dengan cara mengubah suhu dan

waktu proses annealing.

Tabel 4. Pengaturan Program PCR

Siklus Suhu Waktu Jumlah

Siklus

Inisisasi 95°C 2 menit 1

Denaturasi 95°C 30 detik

30 Annealing 58°C 30 detik

Elongasi 75°C 1 menit

Final elongasi 75°C 5 menit 1

Final hold 4°C - 1

Sumber : Lewaru 2012 yang dimodifikasi

4. Elektroforesis

Tahap – tahap elektroforesis :

a. Persiapan elektroforesis (Lampiran 13)

Gel agarose dibuat (konsentrasi 1%) dan dilarutkan pada TE buffer.

Dipanaskan di atas hot plate.

Gel dituangkan ke atas lempeng atau plate.

Lembaran perspex tipis yang menyerupai sisir ditancapkan saat agar

masih dalam keadaan panas dan belum memadat.

Lembaran perspex dicabut setelah agarose memadat.

Gel agarose dimasukkan ke dalam tangki yang berisi buffer. Buffer

yang digunakan adalah tris-borat-EDTA (TBE) 0,5x.

b. Pelaksanaan elektroforesis (Lampiran 14)

Hasil amplifikasi DNA dan marker masing-masing sebanyak 2µl dan

1µl dimasukkan pada setiap sumur.

Tangki ditutup dan diberi aliran listrik dengan cara manyambungkan

kabel ke stop kontak.

36

Sisi yang berisi hasil amplifikasi diberi arus negatif. Besarnya arus

elektroforesis adalah 75 volt selama 60 menit.

Setelah selesai, dilakukan perendaman dengan EtBr selama 30 menit.

Dilakukan perendaman kembali dengan akuades selama 10 menit.

Lalu gel diangkat menggunakan spatula dan ditiriskan.

Pita DNA dilihat dengan alat ultraviolet transilluminator.

3.5 Parameter Pengamatan

Hal yang diamati dalam penelitian ini adalah :

1. Morfologi koloni bakteri

Morfologi koloni bakteri dilihat berdasarkan ukuran, warna dan bentuk

koloni. Ukuran koloni terbagi menjadi pinpoint, kecil, sedang dan besar.

Bentuk koloni dapat dilihat dari pinggiran, elevasi dan bentuk koloni

tersebut.

Gambar 6. Bentuk Koloni Bakteri

(Sumber : Cappucino 2008)

2. Bentuk dan warna sel bakteri

Bentuk sel bakteri dapat dilihat setelah dilakukan proses pewarnaan Gram.

Bentuk sel bakteri terdiri dari bulat (coccus), batang (basil) dan spiral

(spirilia). Bakteri Gram positif ditunjukkan dengan warna ungu dan bakteri

Gram negatif ditunjukkan dengan warna merah. Umur isolat saat dilakukan

37

pewarnaan adalah 3x24 jam.

3. Aktivitas agarase yang dihasilkan oleh bakteri

Aktivitas agarase dapat dilihat dengan pengujian baik secara kuantitatif dan

kualitatif. Secara kualitatif pengujian dilakukan menggunakan pereaksi

Lugol Iodin. Indeks agarolitik dihitung dengan membagi nilai rata-rata

diameter zona bening dengan nilai rata-rata diameter bakteri. Secara

kuantitatif, pengujian dilakukan dengan menggunakan metode Somogyi

Nelson Alkaline Cooper untuk mencari nilai konsentrasi gula pereduksi

yang merupakan hasil dari hidrolisis enzim agarase

4. Karakteristik bakteri setelah dilakukan pengujian secara biokimia.

5. Hasil sekuensing yang dianalisis secara bioinformatif

3.6 Analisis Data

3.6.1 Analisis Aktivitas Agarase Secara Kualitatif dan Kuantitatif

Pengujian aktivitas agarase secara kualitatif menggunakan metode difusi

pereaksi pada media agar dengan penambahan pereaksi Lugol Iodin untuk

mengamati diameter zona bening yang terbentuk. Kemampuan bakteri dalam

memproduksi enzim agarase dapat dilihat dengan menghitung indeks

agarolitiknya, yaitu diameter zona bening : diameter koloni bakteri. Indeks

tersebut akan dianalisis secara deskriptif dengan menyertakan tabel dan gambar

untuk mengetahui isolat yang memiliki indeks agarolitik tertinggi.

Analisis aktivitas agarase secara kuantitatif dilakukan dengan menghitung

konsentrasi gula pereduksi yang terbentuk. Terlebih dahulu dibuat kurva standar

glukosa. Pembuatan kurva standar bertujuan untuk menentukan nilai regresi linear

sebagai rumus yang menjadi dasar untuk perhitungan kadar gula pereduksi pada

sampel. Adapun rumus regresi linear yang diperoleh adalah sebagai berikut :

Keterangan : a = 0.082

b = 0.037

Y = aX - b

Y = absorbansi

X = kadar gula pereduksi

38

Rumus yang didapat adalah Y = 0,082X – 0,037 dengan nilai R2 (regresi

linier) adalah 0,987. Kemudian sampel yang telah diuji menggunakan meode

Nelson Simogyi diukur nilai absorbansinya pada OD 540. Nilai absorbansi tersebut

akan menjadi nilai Y. Dengan demikian nilai kadar gula pereduksi (X) dapat

didapatkan. Nilai kadar gula pereduksi tersebut akan dianalisis secara deskriptif

dengan menyertakan tabel untuk mengetahui isolat yang memiliki nilai gula

pereduksi tertinggi.

3.6.2 Analisis Bioinformatik

Setelah mendapatkan data hasil sekuensing, berupa deret nukleotida dari

setiap primer dalam format abi, data disejajarkan dan diedit menggunakan program

BioEdit (Lampiran 17) sehingga diperoleh konstruksi gen lengkap 16S rRNA

berupa konsensus. Hasil konsensus tersebut dimasukkan ke website

www.ncbi.nlm.nih.gov. Program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)

yang terdapat di dalam situs akan mencocokkan hasil sekuensing dengan data

yang terdapat di genbank untuk mendapatkan daftar mikroorganisme yang basa

nitrogennya (nukleotida) dianggap paling mirip (Lampiran 18). Data-data

mikroorganisme dengan kemiripan terdekat, berupa urutan nukleotida, disimpan

dan diberi nama. Diambil sebanyak 15 data urutan nukleotida untuk setiap isolat.

Konstruksi pohon filogenetik (dendogram) dilakukan dengan bantuan

program MEGA5.2. Data-data urutan 16S rRNA dari isolat yang hendak dicari

posisinya pada pohon filogenetik serta data-data dari hasil olahan program

BLAST dimasukkan ke dalam program MEGA5.2 (Lampiran 19). Kemudian

dicari model yang paling tepat untuk menentukan pohon filogenetik tersebut

dengan cara menekan menu models → find best DNA/protein models. Visualisasi

pohon filogenetik dilakukan dengan menekan menu phylogeny. Hasil yang telah

diperoleh kemudian dianalisis secara deskriptif disertai tabel dan gambar.