Upload
others
View
1
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
43
BAB IV
METODE PENELITIAN
4.1 Rancangan Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental untuk menguji aktivitas
antibakteri pada sediaan peel-off mask kombinasi tea tree oil dan niasinamida
terhadap pertumbuhan bakteri Propionibacterium acnes.
4.2 Skema Kerja Penelitian
Kombinasi tea tree oil dan
niasinamida pada sediaan peel-off
mask
Uji aktivitas antibakteri
Formulasi sediaan peel-off mask kombinasi tea tree oil dan niasinamida
Formulasi 1
PVA 5 %
Formulasi 2
PVA 10 %
Formulasi 3
PVA 15 %
Kontrol
positif
Kontrol
negatif
Uji sediaan masker wajah peel-off
Uji karakteristik dan
kimia sediaan :
Organoleptis
(Bau, warna, tekstur)
a. Tipe emulgel
b. pH sediaan
c. Daya sebar
d. Viskositas
e. Uji homogenitas
Uji waktu mengering
sediaan
Uji stabilitas
sediaan
Analisis data
Gambar 4.1 Skema Kerja Penelitian
Keterangan :
Kontrol positif : Clindamycin gel Kontrol negatif : Sediaan peel-off mask tanpa bahan aktif
44
4.3 Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di laboratorium Mikrobiologi dan
Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.
Penelitian yang dilakukan ialah uji efektivitas antibakteri sediaan peel-off
mask kombinasi tea tree oil dan niasinamida terhadap pertumbuhan
bakteri Propionibacterium acnes.
4.4 Variabel Penelitian
4.4.1 Variabel Bebas
Variabel bebas pada penelitian ini adalah penggunaan polivinil
alkohol (PVA) pada konsentrasi 5%, 10%, dan 15% dalam sediaan
emulgel.
4.4.2 Variabel Tergantung
Variabel tergantung dari penelitian ini yaitu tingkat kekeruhan atau
kejernihan yang dihasilkan dari masing-masing formula yang telah dibuat
dengan metode dilusi cair. Serta karakteristik fisik sediaan emulgel tea
tree oil.
4.5 Alat dan Bahan Penelitian
4.5.1 Bahan Penelitian
Bahan yang akan digunakan pada penelitian ini adalah Niasinamida
PT. Sumber Berlian Kimia, Polivinil Alkohol (PT. Bractaco), Propilen
Glikol (PT. Bractaco, Metil Paraben (PT. Bractaco), Sodium Lauryl Sulfat
(CV. Makmur Sejati), Carbopol 940 (PT. Sumber Berlian Kimia),TEA
(CV. Makmur Sejati), BHT (PT. Bractaco), Aquadest (CV. Makmur
Sejati).
4.5.2 Bakteri Uji
Bakteri uji yang digunakan pada penelitian ini adalah
Propionbacterium acnes. Bakteri ini diperoleh dari Laboratorium
Biomedik Universitas Muhammadiyah Malang.
45
4.5.3 Alat Penelitian
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi:
- Tabung reaksi - Mikro pipet
- Kaca objek - Beaker glass
- Bunsen - Tisu
- Mikroskop - Beaker glass
- Pipet - Batang pengaduk
- Kaca petri - Timbangan analitik
- Ose - Spatula besi
- Rak tabung - Pinset
4.5.4 Bahan Formulasi Peel-off Mask
- Tea tree oil - Niasinamida
- PVA - Caebomer 940
- TEA - Propilengikol
- Methyl paraben - Sodium lauryl sulfat
- BHT - Aquadest
4.5.5 Formulasi Peel-off Mask
Tabel IV.1 Formula Masker peel-off Mask
No Bahan Fungsi
Formula I
b/b
Formula
II
b/b
Formula III
b/b
1 Tea Tree Oil Bahan Aktif 5% 5% 5%
2 Niasinamida Bahan Aktif 5% 5% 5%
3 PVA Pembentuk
lapisan film/
Gelling agent
5% 10% 15%
4 Carbomer 940 Gelling agent 0,5% 0,5% 0,5%
5 TEA Pembasa 0,5% 0,5% 0,5%
6 Propilene glikol Humectan 10% 10% 10%
7 Methyl paraben Pengawet 0,2% 0,2% 0,2%
8 Sodium lauryl
sulfate
Lubrikan 2% 2% 2%
9 BHT Antioksidant 0,5% 0,5% 0,5%
10 Aquadest Pelarut Ad 100 Ad 100 Ad 100
46
4.5.6 Skema Cara Pembuatan Peel-off Mask
Cara peraciakan peel off mask kombinasi Tea Tree Oil dan Niasinamida dengan variasi
kadar PVA (Polivinil alkohol)
Formula III dengan
PVA (15%)
Formula II dengan
PVA (10%)
Formula I dengan
PVA (5%)
Evaluasi Sediaan
Evaluasi tipe emulgel
Uji karakteristik fisik dan kimia sediaan :
Organoleptis (warna, bau, tekstur)
pH sediaan
Viskositas
Uji homogenitas
Uji waktu mengering sediaan
Uji daya sebar
Uji Stabilitas sediaan
Freeze Thaw
Uji Aseptabilitas
Analisi Data
Gambar 4.2 Skema Cara Peracikan Peel-off Mask
47
4.6. Tahap Persiapan
4.6.1 Pewarnaan Bakteri Uji
Perwarnaan bakteri uji dilakukan dengan metode pewarnaan Gram.
Perwarnaan bakteri dilakukan untuk identifikasi dan memastikan tidak ada
kontaminan pada kultur kerja nantinya (Hafsan et. al., 2015).
Digunakan objek kaca yang dibersihkan menggunakan alkohol 96%
dan dikeringkan. Kemudian tambahkan aquadest 1 tetes di atas objek kaca,
keudian ambil biakan bakteri yang akan dilakukan pewarnaan dengan ose
steril (biakan bakteri yang diambil hanya 1 koloni saja), kemudian ratakan
biakan bakteri di permukaan objek kaca yang telah berisi aquadest.
Kemudian fiksasi dengan api bunsen (lewatkan di atas api 2-3 kali).
Setelah kering, pertema tetesi dengan pewarna Crystal Violet kemudian
tunggu 1 menit, bilas dengan aquadest. Kedua, tetesi dengan Lugol dan
tunggu 1 menit, bilas dengan aquadest. Ketiga, bilas dengan alkohol 96%
biarkan selama 5 detik kemudian dibilas lagi dengan aquadest. Keempat,
tetesi dengan pewarna Safranin dan tunggu 1 menit, bilas dengan aquadest
kemudian keringkan dengan tisu (Hafsan et. al., 2015).
Periksa dengan mikroskop (perbesaran 100 x 10), bakteri yang tetap
berwarna ungu digolongkan kedalam bakteri Gram positif. Sedangkan
bakteri Gram negatif juga berwarna ungu tetapi penggunaan Safranin akan
mewarnai sel Gram negatif menjadi berwarna merah, sedangkan Gram
positif tidak terpengaruh karena memiliki jumlah peptidoglikan yang lebih
banyak, sehingga akan lebih mengikat warna pertama (crystal violet) yang
berwarna ungu dan ketika pewarnaan tidak mudah dihilangkan (Hafsan et.
al., 2015).
4.6.2 Preparasi Media
1. Nutrient Agar
Dalam penelitian ini digunakan satu media yakni Mueller Hinton
Agar (MHA). Pembuatan media Mueller Hinton Agar (MHA) dengan
melarutkan bahan sebanyak 38 gram (dengan komposisi : Meat infusion
solid form 300g/l, Casein acid hydrolysate 17,5 g/l, Starch 1.5 g/l dan Agar
15 g/l) kedalam 1 L aquadest pada erlenmeyer dengan kapasitas 1 L.
48
Erlenmeyer tersebut diletakkan diatas hot plate kemudian masukkan magnetic
stirer ke dalam erlenmeyer untuk mempercepat pelarutan sampai didapatkan
larutan media menjadi berwarna kuning jernih. Setelah itu erlenmeyer ditutup
dengan aluminium foil kemudian disterilisasi dengan autoklaf selama 15
menit pada suhu 121°C. Dituang media steril ke cawan petri steril secara
aseptis (Hafsan et. al., 2015).
2. Nutrient Broth
Media nutrient broth dibuat dengan melarutkan bahan nutrient broth
(Beef infusion form, starch, casein acid hydrolysate) sebanyak 21 gram
kedalam 1 L aquadest dan dipanaskan sambil dikocok dengan
menggunakan pengaduk magnetik hingga homogen. Larutan tersebut
dimasukkan kedalam labu erlenmeyer dan ditutup dengan kapas dan
aluminim foil kemudian di sterilkan dengan autoklaf selama 15 menit pada
suhu 121 °C.
4.6.3 Pembuatan Standart Mc Farland
Diambil aquadest kira-kira setengah dari tabung reaksi. Kemudian
tambahkan H2SO4 1% sebanyak 9950 μL dan BaCl2 1% sebanyak 50μl.
Campur kedua larutan dalam tabung tersebut, dikocok sampai homogen
dan terbentuk larutan keruh. Kekeruhan ini dipakai sebagai suspensi
bakteri dengan tingkat kekeruhan 1,5 108CFU/ml (Anonim, 2015).
4.6.4 Preparasi Bakteri
Proses peremajaan bakteri yang berasal dari biakan murni diambil 3-
4 ose kemudian dioleskan pada media Mueller Hinton Broth (MHB).
Kemudian diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37°C. Sebelum
membuat suspensi bakteri, siapkan terlebih dahulu standar McFarland 0,5
yang setara dengan jumlah perkiraan suspensi bakteri yaitu 1,5 x 108
CFU/ml (Ningsih et. al., 2013).
Kemudian dilakukan pembuatan suspensi bakteri dengan teknik
dilusi (pengenceran). Bakteri uji diambil dari hasil peremajaan
menggunakan mikro pipet kemudian dimasukkan ke dalam 5 ml aquades
steril (tabung A), dikocok menggunakan vortex dan dibandingkan dengan
standar McFarland 1,5 x 108
CFU/ml (Ningsih et. al., 2013).
Pembuatan bahan uji ekstak n-Heksan biji Cerbera manghas
Persiapan konsentrasi biji Cerbera manghas
Preparasi Bakteri Propionibacterium acnes di LAF
Preparasi Media
Pengujian Difusi Cakram
Kelompok Uji :
Ekstrak n-Heksana biji Cerbera manghas
(20 mg/ml ; 40 mg/ml; 80 mg/ml)
Kelompok kontrol :
- Kontrol Positif (Clindamycin)
- Kontrol Negatif (DMSO)
Analisis Data
49
Untuk pengujian dilakukan proses pencampuran biakan pada media
MHA di cawan petri yang diambil sebanyak 1 ml menggunakan mikro pipet
kemudian diaduk secara merata. Lanjutkan prncampran sampai habis. Setelah
selesai bakteri diinkubasi pada suhu 37°C selama 24 jam (Hafsan et. al.,
2015).
4.7 Uji Aktivitas Antibakteri
4.7.1 Uji Daya Hambat Bakteri dengan Metode Sumuran
Pertama-tama dibuat 3 kelompok pengujian antara lain :
Kontrol negatif basis peel-off mask tanpa bahan aktif
Kontrol positif Clindamycin Gel 100 µL
Kelompok 1 : Perlakuan dengan formula 1 = konsentrasi PVA 5%
Kelompok 2 : Perlakuan dengan formula 2 = konsentrasi PVA 10%
Kelompok 3 : Perlakuan dengan formula 3 = konsentrasi PVA 15%
Uji daya hambat bakteri menggunakan metode sumuran agar
dengan prosedur sebagai berikut: Bakteri aktif sebanyak 100 μl diambil
dari suspensi bakteri dengan menggunakan mikropipet, kemudian
dimasukkan kedalam cawan petri. Suspensi bakteri dihomogenkan dan
diratakan dengan menggunakan spreader hingga memadat. Selanjutnya
media yang telah bercampur dengan bakteri dilubangi menggunakan cork
borer dengan diameter lubang 5 mm. Masukkan sampel uji ke dalam
lubang sumuran, diinkubasi suhu 37˚ C selama 24 jam.
Zona bening yang terbentuk disekitar lubang sumuran diamati dan
diukur menggunakan jangka sorong (Darsono dan Artemisia, 2003). Zona
bening yang terlihat di sekeliling lubang sumuran menandakan adanya
aktivitas antibakteri. Diameter zona bening yang dihasilkan dari sampel uji
kemudian dibandingkan dengan kelompok kontrol positif dan kontrol
negatif. Kontrol positif yang digunakan dalam penelitian ini adalah
Clindamycin Gel 100 µL sedangkan kontrol negatif yang digunakan adalah
basis peel-off mask tanpa bahan aktif.
50
4.8 Metode Analisis
Analisis data dilakukan secara deskriptif dengan melakukan
pengukuran terhadap diameter zona hambat dari daerah berwarna bening
dari masing-masing komponen senyawa pada sediaan peel-off mask tea
tree oil dan niasinamida terhadap bakteri Propionibacterium acnes dengan
menggunakan alat jangka sorong. Daerah berwarna bening di sekitar
cekungan diukur menggunakan jangka sorong dengan menghitung
diameter daerah yang berwarna bening. Hasil pengukuran tersebut
merupakan diameter zona hambat dari sediaan peel-off mask tea tree oil
dan niasinamida terhadap bakteri Propionibacterium acnes. Kemudian
dilakukan uji statistik dengan metode one way anova menggunakan
software Statistical Product and Service Solution (SPSS), dengan derajat
kepercayaan 95% (α = 0,05).