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Fachbereich Agrarwirtschaft und Lebensmittelwissenschaften Studiengang Bioprodukttechnologie

Bachelor-Thesis

Zur Lipase-katalysierten Darstellung von Peroxycarbonsäuren mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid

Vorgelegt von: Jan-Niklas Franzen

Am: 23. Januar 2012

Betreuender Professor: Herr Prof. Dr. Mark Rüsch gen. Klaas

Korreferent: Frau Prof. Dr. Christine Wittmann

URN: urn:nbn:de:gbv:519-thesis 2012-0020-5

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Abstract

The chemo-enzymatic synthesis of peroxy acids has been optimized using Novozym 435, the

immobilized form of Candida antacrtica lipase B, and the complex urea-hydrogen peroxide.

Urea-hydrogen peroxide, an anhydrous form of hydrogen peroxide, has the potential of releasing

hydrogen peroxide in a controlled manner and thus avoids the need to add the aqueous hydrogen

peroxide slowly to the reaction micture. As a Solvent and reactant diethyl carbonate and ethyl

acetate were used, yields up to 6,34 mmol Peroxyacetic Acid and 1,23 mmol Peroxycarbonic

acid were reached. Further conversion-dominated factors were investigated for future prospects

in industrial or laboratory applications.

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Inhaltsverzeichnis

Abstract…………………………………………………………………………………………………………... 21. Einleitung……………………………………………………………………………………………………… 42. Stand der Wissenschaft und Technik…………………………………………………………………………... 5

2.1 Peroxycarbonsäuren………………………………………………………………………………………… 52.2 Novozym® 435 / Lipasen……………………………………………………………………….................... 72.3 Wasserstoffperoxid / Harnstoff-Wassertoffperoxid………………………………………………………… 8

3. Ziel der Arbeit………………………………………………………………………………………………….. 124. Material und Methoden………………………………………………………………………………………… 13

4.1 Chemikalien/Reagenzien…………………………………………………………………………………… 134.2 Methoden………………………………………………………………………………………………….... 13

4.2.1 Bestimmung der Konzentration des Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Adduktes………………………… 134.2.2 Enzymatisch katalysierte Synthese von Peroxycarbonsäuren………………………………………….. 144.2.3 Variationen der enzymatisch katalysierten Synthese von Peroxycarbonsäuren………………………... 144.2.4 Cerimetrische Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration und

iodometrische Bestimmung der Peroxycarbonsäurenkonzentration………………………………………….. …. 155. Versuchsergebnisse…………………………………………………………………………………………….. 16

5.1 Bestimmung der Konzentration des Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Adduktes…………………………….. 165.2 Enzymatisch katalysierte Synthese von Peroxycarbonsäuren; Reaktionskriterien nach Ernst (2011) 18

5.2.1 Synthese 1: Oxidation von Essigsäureethylester zu Peroxyessigsäure…………………………………. 185.2.1 Synthese 2: Oxidation von Diethylcarbonat zu Peroxykohlensäure……………………………………. 18

5.3 Variationen der enzymatisch katalysierten Synthese von Peroxycarbonsäuren……………………………. 195.3.1 Synthese 3: Reduktion der Reaktionszeit auf 2 und 4 Stunden………………………………………… 195.3.2 Synthese 4: Unterlassung der Filtration des Reaktionsmediums nach Abschluss der Reaktion……….. 205.3.3 Synthese 5: Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C……………………………………………... 225.3.4 Synthese 6: Hinzugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in Intervallen……………………………... 22

6. Diskussion…………………………………………………………………………………………………….... 236.1 Synthese 1: Oxidation von Essigsäureethylester zu Peroxyessigsäure……………………………………... 236.2 Synthese 2: Oxidation von Diethylcarbonat zu Peroxykohlensäure………………………………………... 26

6.3 Variationen der enzymatisch katalysierten Synthese von Peroxycarbonsäuren………………………............ 306.3.1 Synthese 3: Reduktion der Reaktionszeit auf 2 und 4 Stunden…………………………………………... 306.3.2 Synthese 4: Unterlassung der Filtration des Reaktionsmediums nach Abschluss der Reaktion…............. 316.3.3 Synthese 5: Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C………………………………………….......... 346.3.4 Synthese 6: Hinzugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in Intervallen………………………….......... 36

7. Schlussfolgerung und Ausblick………………………………………………………………………………... 388. Zusammenfassung……………………………………………………………………………………………... 399. Literatur………………………………………………………………………………………………………... 4110. Verwendete Abkürzungen……………………………………………………………………………………. 4311. Abbildungsverzeichnis………………………………………………………………………………………... 4412. Tabellenverzeichnis…………………………………………………………………………………………... 4613. Selbständigkeitserklärung…………………………………………………………………………………...... 4814. Anhang………………………………………………………………………………………………………... 49

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1. Einleitung

Chemo-enzymatische Verfahren zur Herstellung pharmazeutischer, chemischer und

lebensmitteltechnischer Produkte haben in den letzten Jahrzenten kontinuierlich an Bedeutung

gewonnen. Durch rapide Fortschritte in der Molekularbiologie werden Biotransformationen

zunehmend konkurrenzfähig zu konventionell-chemischen Verfahren. Dies ist vor allem auf die

verhältnismäßig kostengünstige Bereitstellung leistungsfähiger Enzyme zurückzuführen,

verbunden mit einem wachsenden Know-How bezüglich ihrer Einsatzgebiete abseits ihrer

biochemischen Rolle im Organismus. Während bis zu Beginn der 80er Jahre aus Kostengründen

größtenteils nur sehr komplexe Produkte (z.B. Antibiotika, Insulin) durch fermentative

Methoden hergestellt wurden, werden heutzutage auch vergleichsweise einfache Verbindungen

unter Zuhilfenahme isolierter Biokatalysatoren produziert. Da die meisten der kommerziell

erhältlichen Lipasenpräparationen im Vergleich zu anderen Enzymen immer noch

verhältnismäßig teuer angeboten werden, sind Lipasen-katalysierte Reaktionen hauptsächlich

dann industriell interessant, wenn sie zur Herstellung von Produkten guten kommerziellen

Wertes dienen (Bornscheuer, 1999).

Peroxycarbonsäuren als Produkt erfüllen dieses Kriterium. Neben ihrer industriellen Anwendung

als Bleichmittel und Desinfektionsmittel sind Peroxycarbonsäuren wichtige Oxidationsmittel in

der chemischen Industrie sowie in der organischen Laborsynthese. Die industrielle

Standardmethode für die Synthese von Peroxycarbonsäuren ist die Reaktion von Carbonsäuren

mit Wasserstoffperoxid, katalysiert durch eine starke Säure. Björking et al. (1990) entwickelte

als erstes eine chemo-eynzymatische Synthesemethode für Peroxycarbonsäuren, katalysiert

durch Novozym® 435, eine immobilisierte Lipase B von Candida antarctica. Ein störender

Aspekt bezüglich Effektivität und Ökonomität dieser Methode ist die Verwendung von

wässrigem Wasserstoffperoxid. Einerseits bergen die Lagerung und der Umgang gewisse

Risiken, was gerade bei industrieller Umsetzung mit Kosten verbunden ist. Andererseits

bewirken zu hohe Konzentrationen von Wasserstoffperoxid im Reaktionsmedium eine komplette

Denaturierung der Lipase B des Novozym® 435, weshalb eine kontinuierliche Zugabe von

Wasserstoffperoxid in Intervallen notwendig ist (Ankudey; Olivio; Peeples, 2007). In dieser

Arbeit wird deshalb auf den Einsatz von wässrigem Wasserstoffperoxid verzichtet, und

stattdessen Harnstoff-Wasserstoffperoxid, ein unstabiles nicht kovalentes Addukt aus Harnstoff

und Wasserstoffperoxid, verwendet. Harnstoff-Wasserstoffperoxid hat das Potential,

Wasserstoffperoxid in einer kontrollierbaren Art und Weise freizusetzen.

Das Ziel dieser Studie ist die Durchführung einer chemo-enzymatischen Synthese von

Peroxycarbonsäuren, katalysiert durch Novozym® 435, unter Verwendung von Harnstoff-

5

Wassertstoffperoxid als Oxidationsmittel. Als Edukte dienen Essigsäureethylester und

Diethylcarbonat, folglich werden als Produkte Peroxyessigsäure und

Monoperoxykohlensäuremonoethylester (Abk. Peroxykohlensäure) erwartet.

2. Stand der Wissenschaft und Technik

2.1 Peroxycarbonsäuren

Peroxycarbonsäuren (veraltet: Persäuren) sind Carbonsäuren, die eine Peroxogruppe (-O-O-)

besitzen. Sie können als Derivate des Wasserstoffperoxids angesehen werden und besitzen ein

starkes Oxidationsvermögen. Industrielle Anwendung finden sie hauptsächlich als Bleichmittel

und Desinfektionsmittel/Antiseptikum. Eines der meist verwendeten Desinfektionsmittel ist die

Peroxyessigsäure (Abb. 1), welche bereits 1902 untersucht wurde (www.kesla.de, 2011).

CH3

O

O

O

H

Abbildung 1: Peroxyessigsäure

Es hat sich herausgestellt, dass sie als Desinfektionsmittel keine Wirkungslücken oder Bereiche

abgeschwächter Wirkung zeigt, zusätzlich wird eine Resistenzentwicklung durch eine

unspezifische Wirkweise, eine Art „kaltes Verbrennen“ der Keime, vermieden. Sie besitzt die

schnellste Wirkungsgeschwindigkeit aller bekannten Mikrobizide und ist dazu umweltfreundlich,

da sie nach Anwendung in Sauerstoff und Essigsäure zerfällt (Patett, 2001).

In der organischen Laborsynthese finden Peroxycarbonsäuren ein breites Anwendungsspektrum

als Oxidationsmittel. Beispiele sind die C=C-Epoxidierung, Bayer-Villinger-Oxidation,

Hydroxilierung von aromatischen Ringen und die Oxidation von Aminen (Rüsch gen. Klaas;

Warwel, 2000). Der Epoxidierung kommt hier die größte Bedeutung zu, Björking et al. (1990)

beschrieb als erstes die chemo-enzymatische Epoxidation von Alkenen durch

Peroxycarbonsäuren.

Die Standardmethode für die Synthese von Peroxycarbonsäuren ist die Reaktion von

Carboxylsäuren mit Wasserstoffperoxid, katalysiert durch eine starke Säure (Abb. 2) (Rüsch gen.

Klaas; Warwel, 2000).

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O

R OH R

O

OOH+ H2O2

[H+]

+ H2O

Abbildung 2: Säurekatalytische Herstellung einer Peroxycarbonsäure (Rüsch gen. Klaas; Warwel, 2000)

Die Lage des Gleichgewichtes und die Geschwindigkeit der Gleichgewichtsstellung wird

beeinflusst durch die Größe des Restes „R“ der verwendeten Carbonsäure, demnach müssen

Reaktionsbedingungen wie Temperatur, Menge und Acidität des Katalysators entsprechend

angepasst werden. Da strukturempfindliche oder langkettige Substrate und vor allem die

entstehenden Peroxycarbonsäuren unter den dann erforderlichen Bedingungen meist nicht stabil

bleiben, ist diese Methode für Substrate dieser Art nicht geeignet (Patett, 2001). Andere

Verfahren für die Synthese von einzelnen Peroxycarbonsäuren (Folli, 1968) sind meist zu teuer

und komplex für einen weitfassenden Gebrauch, es besteht also ein Bedarf für eine neue, simple

und vielseitig anwendbare Methode. Eine diesen Ansprüchen entsprechende Synthesemethode

wurde als erstes von Björkling, Kirk und Kollegenschaft entwickelt, einer Gruppe, angestellt

beim weltweit führenden dänischen Enzymhersteller Novo Nordisk A/S. Sie publizierten, dass

mittelkettige Fettsäuren mit Wasserstoffperoxid zu den entsprechenden Peroxycarbonsäuren mit

Umsätzen von 33-54% oxidiert werden können, sofern die Reaktion durch die immobilisierte

Lipase-B des Mikroorganismus Candida antarctica (Novozym® 435) katalysiert wird (Rüsch

gen. Klaas; Warwel, 2000). Am „Institut für Biochemie und Technologie der Fette“ in Münster

wurde diese Methode in diverse Richtungen weiterentwickelt, wodurch viele neue

Peroxycarbonsäuren durch mildere und schonendere Reaktionsbedingungen synthetisiert wurden

konnten (Patett, 2001). Durch die Verwendung eines Esters als Lösungsmittel ließen sich mit

dieser Methode die besten Ergebnisse erzielen, eine allgemeine Reaktionsgleichung der

enzymatisch katalysierten Herstellung von Peroxycarbonsäuren ist in Abbildung 3 dargestellt:

R1

O

OR2

+ H2O2 [Novozym ® 435]R1

O

OOH

in Ester

R2OH+

Abbildung 3: Allgemeine Reaktionsgleichung enzymatisch katalysierter Synthese von Peroxycarbonsäuren (Rüsch gen. Klaas; Warwel, 2000)

Rüsch gen. Klaas und Warwel (2000) publizierten, dass die enzymatische Peroxycarbonsäuren-

Synthese aus Essigsäureethylester und Essigsäuremethylester unter gleichen

7

Reaktionsbedingungen effektiver ist als die enzymatische Peroxycarbonsäuren-Synthese aus

Essigsäure. Unter anderem aus diesem Grund werden in dieser Arbeit Ester als Edukte

verwendet.

2.2 Novozym® 435 / Lipasen

Das von Björking et al. (1990) bei der chemo-enzymatischen Peroxycarbonsäurensynthese

verwendete Novozym® 435 (EC: 3.1.1.3) ist eine immobilisierte Lipase-B des Mikroorganismus

Candida antarctica. Zur Herstellung wird das Gen von Candida antarctica, welches Lipase-B

codiert, in einen Wirt-Mikroorganismus, aspergillus oryzae geklont. Das exprimierte Enzym

wird anschließend auf einem makroporösem Polyacrylharz immobilisiert (Ankudey; Olivio;

Peeples, 2006). Lipasen (systematischer Name: Triacylglycerol-Acylhydrolasen) können neben

Mikroorganismen auch aus Pflanzen, Pilzen, und Säugetierorganismen isoliert werden.

Natürliche Substrate der Lipasen sind Triacylglyceride und abgeleitete Verbindungen wie Di-

und Monoacylglyceride, wie alle Hydrolasen benötigen sie keine Coenzyme. Lipase-B von

Candida antarctica hat gemeinsam mit einer Cutinase aus Fusarium solani pisi als einzige

bekannte Lipasen keine bewegliche Oligopeptideinheit („Deckel“) über dem aktivem Zentrum

aufzuweisen. Diese Eigenschaft und ihre Fähigkeit zur Konformationsänderung ermöglicht es

ihr, ein sehr breites Substratspektrum, auch abseits der Tri-, Di- und Monoacylglyceride, zu

akzeptieren (Bornscheuer, 1998).

Hauptsächliche Einsatzgebiete von Novozym® 435 in Industrie und Forschung sind die

Veresterung, die Umesterung und die Hydrolyse (Bornscheuer et al., 1998). Amkudey, Olivio

und Peeples (2006) stellten fest, dass Novozym® 435 die Perhydrolysis von Octansäure

effektiver als eine Menge anderer getesteter Enzyme katalysiert. Rüsch gen. Klaas und Warwel

(2000) kamen ebenfalls zu der Erkenntnis, dass Novozym® 435, neben 30 anderen getesteten

Lipasen, für die Peroxysäurensynthese aus Fettsäuren mit Wasserstoffperoxid am besten

geeignet ist.

Auch zur enzymatischen Synthese von Peroxyessigsäure aus Essigsäureethylester hat sich

Novozym® 435 gegenüber Novonymes NS-40054 und Novonymes NS-40079 als bester

Katalysator herausgestellt (Ernst, 2011). Aus diesem Grund wird es in dieser Studie eingesetzt.

Lipase-B von Candida antarctica ist wie alle Lipasen eine Serin-Esterase. Katalysiert werden

Reaktionen durch die drei Aminosäuren Serin, Histidin und Asparaginsäure („katalytische

Triade“). In Abbildung 4 sind die katalysierenden Aminosäuren der Lipase-B aus Candida

antarctica dargestellt.

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Abbildung 4: Katalytische Triade mit der Aminosäuren-Nummerierung des aktiven Zentrums der Lipase-B aus Candida antarctica (Rüsch gen. Klaas; Warwel, 2000)

Bei der enzymatischen Synthese einer Peroxycarbonsäure aus einem Ester findet als erster

Schritt eine Hydrolyse statt. Bei einer Hydrolyse eines Esters durch Lipase-B Candida antarctica

wird der Substratester vom Serin im aktiven Zentrum unter Ausbildung eines tetrahedralen

Intermediates nukleophil angegriffen. Im Anschluss entsteht unter Abspaltung eines Alkohols

ein Acyl-Enzym-Komplex, unterstützt durch das Carboxylatanion des Asparaginsäureesters und

durch den Imidazolrest des Histidins, welcher das freiwerdende Proton des Serinrestes

übernimmt. Das negativ geladene Intermediat wird durch mehrere Aminosäurereste in der

Oxyaniontasche stablisiert. Das Acyl-Enzym wird schließlich von einem Nukleophil angegriffen

und ein zweites tetrahedrales Intermediat wird gebildet. Dieses Intermediat zerfällt anschließend

wieder in das freie Enzym und das zu erwartende Produkt.

Dient Wasser im Reaktionsmedium als Nukleophil, so entsteht als Produkt eine Säure, bei

Wasserstoffperoxid entsprechend eine Peroxysäure. Wird ein Alkohol als Nukleophil verwendet,

entsteht ein neuer Ester, auch Umesterung genannt (Bornscheuer, 1998).

2.2 Wasserstoffperoxid / Harnstoff-Wassertoffperoxid

Wie bereits erwähnt, ist ein störender Aspekt hinsichtlich Effektivität und Ökonomität der

enzymatisch katalysierten Synthese von Peroxycarbonsäuren die Verwendung von wässrigem

Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel. Zwar ist der Umgang mit Wasserstoffperoxid immer

noch wesentlich sicherer als zum Beispiel der Umgang mit flüssigem Sauerstoff, dennoch

kommt es immer wieder zu Unfällen beim Einsatz sowie bei der Lagerung (Jones, 1999).

Wasserstoffperoxid in allen Formen ist thermodynamisch instabil und zersetzt sich

kontinuierlich zu Wasser und Sauerstoff. Obwohl 20 Tonnen wässriges 70 % Wasserstoffperoxid

durchschnittlich nur 0,3 % des aktiven Sauerstoffs pro Jahr verlieren, entwickeln sich dadurch 13

dm3 Sauerstoff pro Tag. Dies ist genug, um bei der Lagerung beschichtetes Material gefährlich

HO- NH

O

N

N

O NH-

H O

O

O-HN

Aspartat 105

Histidin 224

Serin 1050.

9

unter Druck zu setzen oder für eine Sauerstoffanreicherung im oberen Gasraum des

Lagercontainers zu sorgen. Dies kann die Explosionsgefahr drastisch steigern.

Des Weiteren kann Wasserstoffperoxid in Konzentrationen über 40 % explosive Gemische mit

organischen Komponenten bilden. Solche Mixturen können konventionellen Sprengstoffen in

ihrer Sprengkraft gleichen und sind zusätzlich wesentlich sensitiver bezüglich der Auslösung

einer Detonation (Tabelle 1) (Jones, 1999).

Tabelle 1: Vergleich der Explosivkraft und Sensitivität konventioneller Sprengstoffe mit Wasserstoffperoxid Gemischen(Jones, 1999)

Stoff Sprengkraft SensitivitätNitroglycerin 52 2-585 % mol/mol Wasserstoffperoxid/Glycerin 46 10-1570 % mol/mol Wasserstoffperoxid/ Polyethylen 30 22Pikrinsäure 32 75Trinitrotoluol (TNT) 30 15097 % mol/mol Wasserstoffperoxid/Wasser 17 nicht sensitiv

Besondere Vorsicht ist beim Erhitzen von Wasserstoffperoxid geboten. Die Zersetzungsrate

erhöht sich bei Temperaturanstieg etwa um den Faktor 2,3 per 10°C, zusätzlich ist

Wasserstoffperoxiddampf in Konzentrationen über 39 % schon unter Atmosphärendruck

explosiv (Jones, 1999; Hudlický, 1990).

Der wohl störendste Aspekt hinsichtlich der Verwendung von Wasserstoffperoxid in der

enzymatisch katalysierten Synthese von Peroxycarbonsäuren ist allerdings nicht die unter

Umständen gefährliche Lagerung oder der mit Gefahren verbundene Einsatz. Bereits Björking

(1990) berichtete, dass zu hohe Konzentrationen von wässrigem Wasserstoffperoxid zu einer

kompletten Denaturierung der Lipase-B von Candida antarctica führen. Dies ist auf die Tatsache

zurückzuführen, dass durch Oxidationsreaktionen, ausgelöst durch Wasserstoffperoxid, die

Tertiärstruktur des Enzyms irreparabel geschädigt wird. Für eine nachhaltige und effiziente

Synthese ist es aus diesem Grund zwingend notwendig, das wässrige Wasserstoffperoxid der

Reaktion in angepassten Mengen und Zeitintervallen hinzuzugeben (Ankudey et al, 2006). Das

Ziel ist hierbei, die Konzentration von frei verfügbarem Wasserstoffperoxid möglichst konstant

auf einem Level zu halten. Einerseits soll so eine funktionierende Synthese sichergestellt

werden, andererseits eine Denaturierung der Lipase verhindert werden. Übertragen auf die

industrielle Anwendung ist diese Tatsache alles andere als optimal. Die kontinuierliche Zugabe

ist einerseits mit entsprechenden Kosten verbunden, andererseits birgt ein kontinuierlicher

Batch-Reaktor, der dem Reaktionsmedium selbstständig wässriges Wasserstoffperoxid

hinzugibt, seinerseits neue Sicherheitsrisiken.

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In dieser Studie wird, um diese Problemstellung zu umgehen, Wasserstoffperoxid durch

Harnstoff-Wasserstoffperoxid (Abb.5) als Oxidationsmittel ersetzt.

Abbildung 5: Harnstoff-Wasserstoffperoxid (auch Carbamidperoxid; Percarbamid)

Harnstoff-Wasserstoffperoxid (auch Carbamidperoxid oder Percarbamid) ist eine nicht

kovalente, wasserfreie Additionsverbindung zwischen Harnstoff und Wasserstoffperoxid. Die

Summenformel lautet CO(NH2)2.H2O2 (1:1). Man spricht auch von " festem

Wasserstoffperoxid", da es in kristalliner Form vorliegt. Der Schmelzpunkt, welcher in diesem

Fall zur Zersetzung in Harnstoff und Wasserstoffperoxid führt, beträgt 80-90°C

(www.chemicalland21.com).

Harnstoff-Wasserstoffperoxid hat das Potential, Wasserstoffperoxid in einer kontrollierbaren Art

und Weise freizusetzen. Hierdurch fällt die Notwendigkeit weg, das wässrige Wassertoffperoxid

dem Reaktionsmedium der enzymatisch katalysierten Synthese von Peroxycarbonsäuren in

Intervallen hinzuzugeben. Die Abwesenheit von Wasser im Reaktionsmedium ist auch von

Vorteil, da es unerwünschte Reaktionen der Edukte und Produkte minimiert.

Auch eine im Vergleich zu wässrigem Wasserstoffperoxid verhältnismäßig sichere Lagerung

und Handhabung ist gegeben. Harnstoff-Wasserstoffperoxid ist zwar als starkes Oxidationsmittel

feuergefährlich, bei Vermischung mit organischen Substanzen, z.B. Ether oder Aceton, können

durch Oxidationsvorgänge von freigesetztem Wasserstoffperoxid weiterhin explosive Lösungen

entstehen. Wird jedoch bei der Lagerung und Handhabung darauf geachtet, dass das Addukt

nicht mit Feuchtigkeit in Kontakt kommt und eine kühle Lagertemperatur von 2-8 °C eingehalten

wird, verläuft die Zersetzung in Harnstoff und Wasserstoffperoxid sehr langsam. Dies stellt eine

deutliche Risikominimierung im Vergleich von wässrigem Wasserstoffeproxid dar. Zusätze von

Natrium- oder Ammoniumdihydrogenphosphat bzw. Zinksulfat verbessern die Wärmestabilität,

Harnstoff-Wasserstoffperoxid kommt auch mit Stärke tablettiert in den Handel

(www.chemicalland21.com). Industriell wird es unter einer Vielzahl von Produktbezeichnungen

unter anderem zur Desinfektion bei der Wundbehandlung, zum Haarefärben/Blondieren, als

Bleichmittel für Zähne und als Entwickler für Blaupausen eingesetzt (Römpp, 1995). Prinzipiell

O

NH2 NH2

HO

OH

11

findet es überall dort Anwendung, wo eine kontrollierbare, automatische Freisetzung von

Wasserstoffperoxid von Nöten ist, bzw. gegenüber der manuellen Zugabe in Intervallen von

Vorteil ist.

Ankudey, Olivo und Peeples (2006) untersuchten erstmals erfolgreich die Lipasen-katalysierte

Epoxidation von diversen Alkenen unter Verwendung von Harnstoff-Wasserstoffperoxid als

Oxidationsmittel. Sie stellten fest, dass sich die besten Umsätze mit Essigsäureethylester als

Lösungsmittel und Edukt erreichen ließen. Hierzu wurde Peroxyessigsäure aus

Essigsäureethylester synthetisiert, katalysiert durch Novozym® 435. Wasserfreies Harnstoff-

Wasserstoffperoxid wurde genutzt als Oxidator, welcher einmalig in angepasster Menge am

Anfang der Reaktion hinzugegeben wurde. Die entstehende Peroxyessigsäure wurde in situ als

Oxidationsmittel genutzt, um im Reaktionsmedium enthaltene Alkene zu den entsprechenden

Epoxiden zu oxidieren.

Ríos, Salazar und Olivo (2007) führten in Folge unter Zuhilfenahme von Harnstoff-

Wasserstoffperoxid eine Bayer-Villinger-Oxidation von substituierten Cyclohexanonen durch.

Wieder wurde hierzu, enzymatisch katalysiert, Peroxyessigsäure aus Essigsäureethylester in situ

produziert, um im Reaktionsmedium enthaltene Cyclohexanone zu den jeweiligen Lactonen zu

oxidieren. Wasserfreies Harnstoff-Wasserstoffperoxid wurde einmalig in angepasster Menge am

Anfang der Reaktion hinzugegeben. Sowohl die Gruppe um Ankudey (2006) als auch die

Gruppe um Ríos (2007) waren erfolgreich mit ihrem Vorhaben und setzten Harnstoff-

Wasserstoffperoxid effektiv als Oxidant in der in situ Synthese von Peroxyessigsäure aus

Essigsäureethylester ein.

Um den Effekt der eventuellen Denaturierung des Novozym® 435 durch Harnstoff-

Wasserstoffperoxid zu untersuchen, recycelten Ankudey, Olivo und Peeples (2006) das Enzym

nach jeder Epoxidations-Reaktion durch Filtration und verwendeten es erneut. Es stellte sich

heraus, dass das Enzym seine Aktivität bei bis zu 6 Runden von Alken Epoxidationen beibehielt,

wobei weiterhin Umsätze von 75-100 % erreicht wurden. Dies unterstreicht die Nachhaltigkeit

und das Potential des Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Addukts, Wasserstoffperoxid in für

enzymatisch katalysierte Reaktionen geeigneten Konzentrationen und Zeitintervallen

freizusetzen.

12

3. Ziel der Arbeit

Unter Berücksichtigung und vergleichend mit der Studie der enzymatisch katalysierten

Herstellung von Peroxyessigsäure mit wässrigem Wasserstoffperoxid (Ernst, 2011), ist das Ziel

der Arbeit die Untersuchung der Durchführung einer enzymatischen Synthese von

Peroxycarbonsäuren, katalysiert durch Novozym® 435, unter Verwendung von Harnstoff-

Wassertstoffperoxid als Oxidationsmittel.

Als Lösungsmittel und gleichzeitig als Edukte dienen Essigsäureethylester oder Diethylcarbonat,

erwartet wird die Synthese von Peroxyessigsäure bzw. Peroxykohlensäure. Die Reaktions-

gleichung der zu erwartenden Synthese der Peroxyessigsäure ist in Abbildung 6 dargestellt:

Abbildung 6: Reaktionsgleichung der enzymatisch katalysierten Synthese von Peroxyessigsäure aus Essigsäureethylester, unter Verwendung von Harnstoff-Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel

Die Reaktionsgleichung der durchzuführenden Synthese von Peroxykohlensäure aus Diethylcarbonat

setzt sich wie folgt zusammen (Abb. 7):

Abbildung 7: Reaktionsgleichung der enzymatisch katalysierten Synthese von Peroxykohlensäure aus Diethylcarbonat, unter Verwendung von Harnstoff-Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel

Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf der Realisierbarkeit der Durchführung dieser beiden

Synthesen. Zusätzlich werden umsatzbestimmende Kriterien wie Reaktionsdauer, Abfiltration

des Enzyms nach Abschluss der Reaktion, Reaktionstemperatur und die die schrittweise

Hinzugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid, im Vergleich zur anfänglichen Gesamtzugabe,

untersucht.

CH3

O

O OHCH3

O

O CH3+ CO(NH2)2 [Novozym® 435]

+ C2H6O + CO(NH2)2. H2O2

+ CO(NH2)2 [Novozym® 435]+ C2H6O + CO(NH2)2. H2O2

O

O

O

C2H5

C2H5

O

O

O

OH

C2H5

13

4. Material und Methoden

4.1 Chemikalien/Reagenzien

Für alle enzymatisch katalysierten Peroxysäurensynthesen wird das Harnstoff-

Wasserstoffperoxid-Addukt des Herstellers Alfa Aesar GmbH & Co (CAS: 124-43-6; Charge:

10159973) verwendet. Als Edukte dienen Essigsäureethylester ( %) des Herstellers Carl

Roth GmbH & Co (CAS: 141-78-6; Charge: 30360285), sowie Diethylcarbonat des Herstellers

Merck Schuchardt OHG (CAS: 105-58-8; Charge: 56210898). als Katalysator wird in allen

Synthesen Novozym® 435 des Herstellers Codexis Inc. (CAS: 9001-62-1; Lot: LC200219)

genutzt.

Für die cerimetrische Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration nach Abschluss der

Reaktion wird Ferroinlösung des Herstellers Merck Schuchardt OHG (Charge: 0CC602981),

Schwefelsäure (10 %) des Herstellers Carl Roth GmbH & Co (CAS: 7664-93-9; Charge:

46575509), sowie Cer(IV)-sulfatlösung (0,1 M) des Herstellers Carl Roth GmbH & Co (CAS:

13590-82-4 [Wasserfrei]; Charge: 1111695) verwendet.

Für die obligatorisch im Anschluss folgende iodometrische Bestimmung der

Peroxysäurenkonzentration wird Iod-Kaliumiodid-Lösung (30 %) des Herstellers Merck

Schuchardt OHG (CAS: 7553-56-2; Charge: 58310992), Stärkelösung (1 %) (Lösliche Stärke

nach Zulkowsky) des Herstellers Merck Schuchardt OHG (Lot: 823E940857) sowie

Natriumthiosulfatlösung (0,1 M) des Herstellers Sigma-Aldrich Co. LLC (CAS: 7772-98-7

[Wasserfrei]; Charge: SZE92950) verwendet.

4.2 Methoden

4.2.1 Bestimmung der Konzentration des Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Adduktes

Das in dieser Studie angewendete Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Addukt wird vom Hersteller

Alfa Aesar GmbH & Co mit einer Konzentration von 97 % angegeben. Es wird empfohlen, das

Addukt trocken und kühl (2-8°C) zu lagern. Aufgrund von unangemessener Lagerung

(Raumtemperatur; ø 21°C) bis zum Beginn des Projektes, wird vermutet, dass die vom

Hersteller angegebene Konzentration nicht mehr gegeben ist. Zur Kontrolle wird die

Wasserstoffperoxidkonzentration des Adduktes cerimetrisch bestimmt (siehe Kap. 4.2.4). Da es

sich um ein 1:1 Addukt handelt, ist diese Konzentration äquivalent zur Harnstoff-

Wasserstoffperoxid-Konzentration im Produkt.

14

4.2.2 Enzymatisch katalysierte Synthese von Peroxycarbonsäuren

Alle in dieser Thesis durchgeführten enzymatisch katalysierten Synthesen von

Peroxycarbonsäuren orientieren sich vom Versuchsaufbau an der Studie der enzymatisch

katalysierten Darstellung von Peroxyessigsäure mit wässrigem Wasserstoffperoxid von Ernst

(2011). Bis auf wenige Abweichungen werden sie nach identischem Schema durchgeführt. Als

Reaktionsgefäß wird ein 100 ml Erlenmeyerkolben verwendet. In diesem erfolgt, entsprechend

der zu synthetisierenden Peroxycarbonsäure, die Zugabe von 20 ml Essigsäureethylester (

%), oder 20 ml Diethylcarbonat. Im Anschluss erfolgt die Zugabe von 0,40 g Novozym® 435

und 1,9924 g Harnstoff-Wasserstoffperoxid. Der Erlenmeyerkolben wird mit einem Stopfen

luftdicht verschlossen. Unter Anwendung eines Magnetrührers wird die Probe bei einer

Umdrehung von 7,5/s exakt 6 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der Versuchsaufbau ist in

Abbildung 8 wiedergegeben.

Abbildung 8: Versuchsaufbau; Peroxysäuresynthese Abbildung 9: Versuchsaufbau; Abfiltration des Enzyms

Im Anschluss wird das Novozym® 435 mit Hilfe eines Glastrichters mit Filterpapier des

Herstellers Macherey-Nagel (MN 615. ø 70mm) abfiltriert und die Lösung in einen zweiten 100

ml Erlenmeyerkolben überführt (Abb. 9).

Die Wasserstoffperoxidkonzentration der filtrierten Lösung wird cerimetrisch bestimmt, die

abschließende Bestimmung der Peroxysäurenkonzentration erfolgt iodometrisch (siehe Kap.

4.2.4).

4.2.3 Variationen der enzymatisch katalysierten Synthese von Peroxycarbonsäuren

In dieser Studie werden u.a. Variationen des Versuchsaufbaus der enzymatisch katalysierten

Synthese von Peroxycarbonsäuren vorgenommen, um umsatzbestimmende Kriterien der

Reaktion zu untersuchen. Untersucht werden eine Veränderung der Reaktionszeit, das

100 ml Erlenmeyerkolben

Glastrichter

1

2

3

45 6

7

8

9

1 10

2

3

45 6

7

8

9

11

100 ml Erlenmeyerkolben

Stopfen

Magnetrührer mit Heizfunktion

Magnetrührkern

15

Unterlassen der Abfiltration des Enzyms nach Abschluss der Reaktion, eine Erhöhung der

Reaktionstemperatur und die schrittweise Hinzugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid zum

Reaktionsmedium, im Vergleich zur anfänglichen Gesamtzugabe. Eine Veränderung der

Reaktionszeit wird vorgenommen, um Erkenntnisse über die Mikrokinetik der Reaktion zu

gewinnen. Der Versuchsaufbau ist identisch mit dem des Kap. 4.2.2, als einzige Änderung wird

die Reaktionszeit von 6 Stunden auf 4, sowie auf 2 Stunden reduziert. Das Unterlassen der

Abfiltration des Enzyms nach Abschluss der Reaktion dient dazu, zu untersuchen, ob neben dem

Enzym auch andere Stoffe, wie z.B. Wasserstoffperoxid oder Peroxysäuren, durch das

Abfiltrieren teilweise nicht in der Lösung verbleiben. Der Versuchsaufbau ist identisch mit dem

des Kap. 4.2.2, mit dem Unterschied, dass die cerimetrische und iodometrische Bestimmung der

Wasserstoffperoxid- und Peroxysäurenkonzentration ohne vorherige Filtration des

Reaktionsmediums stattfindet. Eine Erhöhung der Reaktionstemperatur wird angewendet, um

mögliche Folgeeffekte, wie eine schnellere Zersetzung des Harnstoff-Wasserstoffperoxid-

Adduktes, eine verbesserte Enzymaktivität oder eine zu vermeidende Zersetzung der

entstandenen Peroxysäuren zu untersuchen. Der Versuchsaufbau ist analog zu dem des Kap.

4.2.2, allerdings wird der als Reaktionsgefäß dienende Erlenmeyerkolben von dem Magnetrührer

mit einem Heizfeld von 50°C erhitzt. Die schrittweise Hinzugabe von Harnstoff-

Wasserstoffperoxid zum Reaktionsmedium wird durchgeführt, um zu untersuchen, ob die

dadurch veränderte Konzentration von freiem Wasserstoffperoxid einen Einfluss auf den Umsatz

an Peroxycarbonsäuren hat. Der Versuchsaufbau ist identisch mit dem des Kap. 4.2.2, allerdings

werden die benötigten 1,9924 g Harnstoff-Wasserstoffperoxid in 5 äquivalente Teilmengen von

0,3985 g separiert. Eine Teilmenge wird dem Reaktionsmedium zu Anfang hinzugegeben, die

Zugabe der anderen Teilmengen erfolgt stündlich über den Zeitraum von 4 Stunden.

4.2.4 Cerimetrische Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration und iodometrische

Bestimmung der Peroxycarbonsäurenkonzentration

Die Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration wird in dieser Studie in allen Synthesen

cerimetrisch durchgeführt, die Bestimmung der Peroxycarbonsäurenkonzentration erfolgt

iodometrisch. Für die cerimetrische Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration wird die

zu bestimmende Probe zur Verdünnung in einen 100 ml Erlenmeyerkolben eingewogen, welcher

mit 50 ml dest. Wasser aufgefüllt wird. Die Menge der eingewogenen Probe und der

Verdünnungsfaktor variieren nach zu erwartender Wasserstoffperoxid- und

16

Peroxysäurenkonzentration. Es erfolgt die Zugabe von 3 Tropfen Ferroinlösung und 5 ml

Schwefelsäure (10 %).

Die Lösungen werden über eine Bürette mit Cer(IV)-sulfatlösung (0.1 M) unter Anwendung

eines Magnetrührers bis zum Farbumschlag titriert. Die molare Wasserstoffperoxidkonzentration

der Probe kann nun kalkulatorisch bestimmt werden (siehe Formel, Anhang). Der

Versuchsaufbau der Titration via Bürette ist in Abbildung 10 dargestellt.

Abbildung 10: Versuchsaufbau; Titration via Bürette

Mit der austitrierten Lösung kann nun eine iodometrische Bestimmung der

Peroxysäurenkonzentration durchgeführt werden. Hierzu wird der Lösung zusätzlich 1,5 ml Iod-

Kaliumiodid-Lösung (30 %) mittels Dispenser zugesetzt, anschließend werden 2,5 ml

Stärkelösung (1 %) in den Erlenmeyerkolben pipettiert.

Die Lösung wird über eine Bürette unter Anwendung eines Magnetrührers mit

Natriumthiosulfatlösung (0,1 M) bis zum Farbumschlag titriert (Abb. 10). Die molare

Peroxysäurenkonzentration der Probe kann nun kalkulatorisch bestimmt werden (siehe Formel,

Anhang).

5. Versuchsergebnisse

5.1 Bestimmungen der Konzentration des Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Adduktes

Zur Bestimmung der Konzentration des Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Adduktes wurde die

Wasserstoffperoxidkonzentration des Adduktes cerimetrisch nach Kap. 4.2.4 bestimmt. Da es

50

40

30

20

10

0

1234 5 6 7

89

1 10

234 5 6 7

8911

Titrationslösung

verdünnte Probenlösung

Bürette

17

sich um ein 1:1 Addukt handelt, ist diese molare Konzentration äquivalent zur molaren

Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Konzentration im Produkt.

Zur Verdünnung wurde 1 g des Adduktes in 10 ml dest. Wasser gelöst. Für eine

Dreifachbestimmung wurde von 3 Äquivalenten von dieser Lösung von 0,5 ml, gelöst in 50 ml

dest. Wasser, cerimetrisch die Wasserstoffperoxidkonzentration bestimmt. Die Messergebnisse

sind in Tabelle 2 wiedergegeben:

Tabelle 2: Messergebnisse; Bestimmung der Konzentration des Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Adduktes

cH2O2 [mol/l] cH2O2 [%] cCO(NH2)2.H2O2 [%]

1. Messung 1,00 94,10 94,10

2. Messung 1,00 94,10 94,10

3. Messung 1,00 94,10 94,10

Standard-

abweichung s

0 - -

Eine Wasserstoffperoxidkonzentration von 94,10 % wurde bestimmt, was bedeutet, dass das in

dieser Studie angewendete Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Addukt eine analoge Konzentration

von 94,10 % besitzt. Durch unsachgemäße Lagerung bei Raumtemperatur hat das Addukt 2,90

% seiner vom Hersteller angegebenen Konzentration von 97 % verloren.

Alle Syntheseversuche in dieser Studie orientieren sich vom Mengenverhältnis der Reagenzien

an den Synthesen der enzymatisch katalysierten Herstellung von Peroxyessigsäure mit

wässrigem Wasserstoffperoxid (Ernst, 2011). Ernst verwendete pro Synthesereaktion 960 μl 60

% Wasserstoffperoxid in Intervallen von 40 μl und 0,40 g Novozym® 435 bezogen auf ein

Reaktionsmedium von 20 ml Essigsäureethylester.

960 μl 60 % Wasserstoffperoxid entsprechen genau 20 mmol reinem Wasserstoffperoxid. Unter

Berücksichtigung der bestimmten Konzentration von 94,10 % hat 21,18 mmol des verwendeten

Harnstoff-Wasserstoffperoxid-Adduktes die äquivalente Menge an verfügbarem

Wasserstoffperoxid. Multipliziert mit dem Molekulargewicht des Adduktes von 94,07 g ergibt

sich eine Menge von 1,9924 g. Diese Masse Harnstoff-Wasserstoffperoxid wird in dieser Studie

in allen Synthesen eingesetzt, da diese eine identische Menge an verfügbarem

Wasserstoffperoxid zu 960 μl 60 % Wasserstoffperoxid aufweist.

18

5.2 Enzymatisch katalysierte Synthese von Peroxycarbonsäuren; Reaktionskriterien nach

Ernst (2011)

5.2.1 Synthese 1: Oxidation von Essigsäureethylester zu Peroxyessigsäure

Für einen Direkten Vergleich der Effizienz der Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-

Wasserstoffperoxid im Vergleich zu der Peroxyessigsäuresynthese mit konventionellem

wässrigem Wasserstoffperoxid, wurde in Synthese 1 Essigsäureethylester zu Peroxyessigsäure

nach Kapitel 4.2.2 oxidiert.

Nach einer dreifachen cerimetrischen Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration sowie

dreifacher iodometrischer Bestimmung der Peroxyessigsäurekonzentration, ergab der Mittelwert

der molaren Wasserstoffperoxidkonzentration 0,1550 [mol/l], der Mittelwert der molaren

Peroxyessigsäurekonzentration 0,3170 [mol/l]. Die entsprechenden Messergebnisse und

kalkulierten Stoffmengen sind in Tabelle 3 wiedergegeben:

Tabelle 3: Synthese 1; Messergebnisse; Oxidation von Essigsäureethylester zu Peroxyessigsäure

cH2O2

[mol/l]

nH2O2

[mmol]

cPeroxyessigsäure

[mol/l]

nPeroxyessigsäure

[mmol]

1. Messung 0,1600 3,20 0,3100 6,20

2. Messung 0,1550 3,10 0,3200 6,40

3. Messung 0,1500 3,00 0,3210 6,42

Mittelwert x̄ 0,1550 3,10 0,3170 6,34

Standard-

abweichung s

4,08*10-3 - 4,97*10-3 -

5.2.2 Synthese 2: Oxidation von Diethylcarbonat zu Peroxykohlensäure

Da die in Synthese 1 angewendete Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid

zufriedenstellend verlief, wurde in Synthese 2 nach gleichem Versuchsablauf Diethylcarbonat zu

Peroxykohlensäure oxidiert.

Nach Abschluss der Reaktion wurde die Wasserstoffperoxidkonzentration dreifach cerimetrisch

und die Peroxysäurekonzentration dreifach iodometrisch bestimmt. Der Mittelwert der molaren

Wasserstoffperoxidkonzentration ergab 0,0493 [mol/l], der Mittelwert der molaren

19

Peroxykohlensäurekonzentration 0,0393 [mol/l]. Die entsprechenden Messergebnisse und


Tabelle 4: Synthese 2; Messergebnisse; Oxidation von Diethylcarbonat zu Peroxykohlensäure

cH2O2

[mol/l]

nH2O2

[mmol]

cPeroxykohlensäure

[mol/l]

nPeroxykohlensäure

[mmol]

1. Messung 0,0500 1,00 0,0400 0,80

2. Messung 0,0460 0,92 0,0380 0,76

3. Messung 0,0520 1,04 0,0400 0,80

Mittelwert x̄ 0,0493 0,99 0,0393 0,79

Standard-

abweichung s

2,49*10-3 - 0,943*10-3 -

5.3 Variationen der enzymatisch katalysierten Synthese von Peroxycarbonsäuren

5.3.1 Synthese 3: Reduktion der Reaktionszeit auf 2 und 4 Stunden

Um Erkenntnisse über den Reaktionsablauf zu gewinnen, wurde in Synthese 3 Diethylcarbonat,

in 2 externen Reaktionen, nach Kapitel 4.2.2 zu Peroxykohlensäure oxidiert. Die erste Reaktion

wurde nach 2 Stunden durch Abfiltration des Enzyms beendet, die zweite Reaktion

gleichermaßen nach 4 Stunden.

Der Mittelwert der molaren Wasserstoffperoxidkonzentration der Reaktion mit 2 Stunden

Reaktionsdauer ergab nach dreifacher cerimetrischer Bestimmung 0,0433 [mol/l], der Mittelwert

der Reaktion mit 4 Stunden 0,0483 [mol/l]. Der Mittelwert der molaren

Peroxykohlensäurekonzentration der Reaktion mit 2 Stunden ergab nach dreifacher

iodometrischer Bestimmung 0,0100 [mol/l], der Mittelwert der Reaktion mit 4 Stunden 0,0160

[mol/l]. Die entsprechenden Messergebnisse und kalkulierten Stoffmengen der Reaktion mit 2

Stunden Reaktionszeit sind in Tabelle 5 wiedergegeben, entsprechende Werte der Reaktion mit 4

Stunden Reaktionszeit sind in Tabelle 6 dargestellt.

20

Tabelle 5: Synthese 3; Messergebnisse; Oxidation von Diethylcarbonat zu Peroxykohlensäure; Reduktion der Reaktionszeit auf 2 Stunden

cH2O2

[mol/l]

nH2O2

[mmol]

cPeroxykohlensäure

[mol/l]

nPeroxykohlensäure

[mmol]

1. Messung 0,0400 0,80 0,0100 0,20

2. Messung 0,0450 0,90 0,0100 0,20

3. Messung 0,0450 0,90 0,0100 0,20

Mittelwert x̄ 0,0433 0,87 0,0100 0,20

Standard-

abweichung s

2,36*10-3 - 0 -

Tabelle 6: Synthese 3; Messergebnisse; Oxidation von Diethylcarbonat zu Peroxykohlensäure; Reduktion der Reaktionszeit auf 4 Stunden

cH2O2

[mol/l]

nH2O2

[mmol]

cPeroxykohlensäure

[mol/l]

nPeroxykohlensäure

[mmol]

1. Messung 0,0450 0,90 0,0180 0,36

2. Messung 0,0500 1,00 0,0150 0,30

3. Messung 0,0500 1,00 0,0150 0,30

Mittelwert x̄ 0,0483 0,97 0,0160 0,32

Standard-

abweichung s

2,36*10-3 - 1,41*10-3 -

Aufgrund der bei dieser Synthese entstandenen geringen Peroxysäurenkonzentrationen und den

damit verbundenen zur Titration benötigten geringen Mengen Natriumthiosulfatlösung, ist das

Ergebnis dieser Synthese nur von bedingter Aussagekraft. Dennoch ist ein Trend der

Reaktionskinetik zu erkennen.

5.3.2 Synthese 4: Unterlassung der Filtration des Reaktionsmediums nach Abschluss der

Reaktion

Zur Überprüfung ob neben dem Enzym auch andere Stoffe, wie z.B. Wasserstoffperoxid oder

Peroxysäuren, durch das Abfiltrieren teilweise nicht in der Lösung verbleiben, wurde in

Synthese 4 Essigsäureethylester und Diethylcarbonat nach Kapitel 4.2.2 zu Peroxyessigsäure

bzw. Peroxykohlensäure oxidiert. Nach Abschluss der Reaktion wurde die Wasserstoffperoxid-

21

sowie Peroxysäurekonzentration direkt dreifach cerimetrisch und iodometrisch, ohne die

obligatorische Filtration, bestimmt.

Der Mittelwert der molaren Wasserstoffperoxidkonzentration der Reaktion mit

Essigsäureethylester ergab 0,2483 [mol/l], der Mittelwert der molaren

Peroxyessigsäurekonzentration 0,3116 [mol/l]. Die Messergebnisse und kalkulierten

Stoffmengen der Reaktion mit Essigsäureethylester sind in Tabelle 7 wiedergegeben:

Tabelle 7: Synthese 4; Messergebnisse; Oxidation von Essigsäureethylester zu Peroxyessigsäure; Unterlassung der Filtration des Reaktionsmediums nach Abschluss der Reaktion

cH2O2

[mol/l]

nH2O2

[mmol]

cPeroxyessigsäure

[mol/l]

nPeroxyessigsäure

[mmol]

1. Messung 0,2450 4,90 0,3100 6,20

2. Messung 0,2500 5,00 0,3100 6,20

3. Messung 0,2500 5,00 0,3150 6,30

Mittelwert x̄ 0,2483 4,97 0,3116 6,23

Standard-

abweichung s

2,36*10-3 - 2,36*10-3 -

Der Mittelwert der molaren Wasserstoffperoxidkonzentration der Reaktion mit Diethylcarbonat

ergab 0,0683 [mol/l], der Mittelwert der molaren Peroxykohlensäurekonzentration 0,0353

[mol/l]. Die Messergebnisse und kalkulierten Stoffmengen der Reaktion mit Diethylcarbonat

sind in Tabelle 8 dargestellt:

Tabelle 8: Synthese 4; Messergebnisse; Oxidation von Diethylcarbonat zu Peroxykohlensäure; Unterlassung der Filtration des Reaktionsmediums nach Abschluss der Reaktion

cH2O2

[mol/l]

nH2O2

[mmol]

cPeroxykohlensäure

[mol/l]

nPeroxykohlensäure

[mmol]

1. Messung 0,0700 1,40 0,0360 0,72

2. Messung 0,0650 1,30 0,0350 0,70

3. Messung 0,0700 1,40 0,0350 0,70

Mittelwert x̄ 0,0683 1,37 0,0353 0,71

Standard-

abweichung s

2,36*10-3 - 0,47*10-3 -

22

5.3.3 Synthese 5: Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C

Um temperaturabhängige Reaktionskriterien wie eine schnellere Zersetzung des Harnstoff-

Wasserstoffperoxid-Adduktes, eine verbesserte Enzymaktivität oder eine zu vermeidende

Zersetzung der zu synthetisierenden Peroxycarbonsäuren zu untersuchen, wurde in Synthese 5

die Reaktionstemperatur auf 50° C erhöht. Als Edukt diente Diethylcarbonat, welches, unter

angesprochener Temperaturerhöhung, nach Kapitel 4.2.2 zu Peroxykohlensäure oxidiert wurde.

Nach dreifacher cerimetrischer Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration ergab der

Mittelwert 0,0667 [mol/l], der Mittelwert der molaren Peroxykohlensäurekonzentration ergab

nach dreifacher iodometrischer Bestimmung 0,0616 [mol/l]. Die entsprechenden

Messergebnisse und kalkulierten Stoffmengen sind in Tabelle 9 wiedergegeben:

Tabelle 9: Synthese 5; Messergebnisse; Oxidation von Diethylcarbonat zu Peroxykohlensäure; 50°C

cH2O2

[mol/l]

nH2O2

[mmol]

cPeroxykohlensäure

[mol/l]

nPeroxykohlensäure

[mmol]

1. Messung 0,0700 1,40 0,0650 1,30

2. Messung 0,0650 1,30 0,0600 1,20

3. Messung 0,0650 1,30 0,0600 1,20

Mittelwert x̄ 0,0667 1,33 0,0616 1,23

Standard-

abweichung s

2,36*10-3 - 2,36*10-3 -

5.3.4 Synthese 6: Hinzugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in Intervallen

Um Kenntnisse über die Zersetzungsgeschwindigkeit des Harnstoff-Wasserstoffperoxids und

damit verbundene Änderungen der Ausbeute zu gewinnen, wurde in Synthese 6 das Addukt dem

Reaktionsmedium in 5 Intervallen zugegeben. Durchgeführt wurde der Synthese sowohl mit

Essigsäureethylester als auch mit Diethylcarbonat als Edukt, bis auf die Zugabe in Intervallen

war der Versuchsaufbau äquivalent zu Kapitel 4.2.2.

In der Reaktion mit Essigsäureethylester ergab der Mittelwert der molaren

Wasserstoffperoxidkonzentration 0,2667 [mol/l], der Mittelwert der molaren

Peroxyessigsäurekonzentration ergab 0,2930 [mol/l]. Die entsprechenden Messergebnisse und


23

Tabelle 10: Synthese 6; Messergebnisse; Oxidation von Essigsäureethylester zu Peroxyessigsäure; Hinzugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in Intervallen

cH2O2

[mol/l]

nH2O2

[mmol]

cPeroxyessigsäure

[mol/l]

nPeroxyessigsäure

[mmol]

1. Messung 0,2600 5,20 0,3000 6,00

2. Messung 0,2760 5,52 0,2900 5,80

3. Messung 0,2700 5,40 0,2900 5,80

Mittelwert x̄ 0,2667 5,33 0,2930 5,86

Standard-

abweichung s

6,89*10-3 - 4,73*10-3 -

Der Mittelwert der molaren Wasserstoffperoxidkonzentration der Reaktion mit Diethylcarbonat

ergab 0,0617 [mol/l], der Mittelwert der molaren Peroxykohlensäurekonzentration 0,0253

[mol/l]. Die entsprechenden Messergebnisse und kalkulierten Stoffmengen sind in Tabelle 11

dargestellt:

Tabelle 11: Synthese 6; Messergebnisse; Oxidation von Diethylcarbonat zu Peroxykohlensäure; Hinzugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in Intervallen

cH2O2

[mol/l]

nH2O2

[mmol]

cPeroxykohlensäure

[mol/l]

nPeroxykohlensäure

[mmol]

1. Messung 0,0650 1,30 0,0260 0,52

2. Messung 0,0600 1,20 0,0250 0,50

3. Messung 0,0600 1,20 0,0250 0,50

Mittelwert x̄ 0,0617 1,23 0,0253 0,51

Standard-

abweichung s

2,36*10-3 - 4,73*10-4 -

6. Diskussion

6.1 Synthese 1: Oxidation von Essigsäureethylester zu Peroxyessigsäure

Die Auswertung von Synthese 1 bestätigt die Durchführbarkeit der enzymatischen Synthese von

Peroxyessigsäure mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel. Der gemessene

Mittelwert der synthetisierten Stoffmenge Peroxyessigsäure von 6,34 mmol zeugt von einem den

Erwartungen entsprechenden Reaktionsablauf.

24

Es zeigt sich, dass das Harnstoff-Wasserstoffperoxid Addukt sich in für diese Reaktion

geeignetem Maße zersetzt. Der Zerfall von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in freien Harnstoff und

Wasserstoffperoxid erfolgt in Lösung in Essigsäureethylester einem chemischen Gleichgewicht.

Während der Zerfall des Adduktes in kristalliner, „fester“ Form unter geeigneten

Lagerbedingungen nur sehr langsam voranschreitet, scheint in Lösung in Essigsäureethylester

das chemische Gleichgewicht von freiem Harnstoff und Wasserstoffperoxid, zu dem nicht

kovalent gebundenem Addukt, für die enzymatische Synthese von Peroxyessigsäure geeignet zu

sein. Dies bedeutet, dass einerseits genug freies Wasserstoffperoxid in Lösung ist um mit Acyl-

Enzym-Komplexen zu reagieren um Peroxyessigsäure entstehen zu lassen, andererseits die

Konzentration niedrig genug ist um eine zu hohe Denaturierung des Novozym® 435 zu

verhindern.

Eine solche Gleichgewichtsstellung war zu erwarten. Bereits Ankudey, Olivio und Peeples

(2006), welche Epoxidationen in Essigsäureethylester unter Verwendung von Harnstoff-

Wasserstoffperoxid durch eine enzymatische in situ Synthese von Peroxyessigsäure

durchführten, stellten bei anschließendem Recylcling des Enzyms Novozym® 435 fest, dass es

seine Aktivität bei bis zu 6 aufeinanderfolgenden Epoxidationsreaktionen nahezu unverändert

beibehielt. Dies lässt darauf schließen, dass eine Denaturierung einer kleinen Konzentration der

Lipase stattfindet. Allerdings ist diese, im technischen Maßstab, verglichen mit dem

Mehraufwand der kontinuierlichen Zugabe von wässrigem Wasserstoffperoxid bei der

konventionellen enzymatischen Peroxysäurensynthese, zu vernachlässigen. Nicht zuletzt lässt

sich gerade bei der kontinuierlichen Zugabe von wässrigem Wasserstoffperoxid eine

Denaturierung einer großen Menge des Enzyms nicht verhindern. Schließlich ist es im

technischen Maßstab nahezu unmöglich, dem Reaktionsmedium jeweils exakt die Konzentration

an Wasserstoffperoxid hinzuzugeben, welche der jeweiligen Konzentration der verfügbaren

Acyl-Enzym-Komplexe entspricht.

Ein Vergleich der in Synthese 1 synthetisierten Stoffmenge an Peroxyessigsäure und der

Stoffmenge Wasserstoffperoxid zu Ende der Reaktion, bezogen zu den selben Werten der

enzymatischen Peroxyessigsäuresynthese mit wässrigem Wasserstoffperoxid nach Ernst (2011),

ist in Tabelle 12 wiedergegeben. Bis auf die kontinuierliche Zugabe von wässrigem

Wasserstoffperoxid statt der anfänglichen Zugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid, wurde die

Synthese von Ernst ebenfalls nach Kapitel 4.2.2 durchgeführt.

25

Tabelle 12: Vergleich von Peroxyessigsäuresynthese aus Essigsäureethylester mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid zu Peroxyessigsäuresynthese aus Essigsäureethylester mit wässrigem Wasserstoffperoxid (60%) (Ernst, 2011)

Peroxyessigsäuresynthese mit

wässrigem Wasserstoffperoxid

(60%) (Ernst, 2011)

Synthese 1:

Peroxyessigsäuresynthese mit

Harnstoff-Wasserstoffperoxid

nWasserstoffperoxid [mmol] 13,92 3,10nPeroxyessigsäure [mmol] 9,17 6,34

Ernst bestimmte nach Abschluss der Reaktion eine Stoffmenge Wasserstoffperoxid von 13,92

mmol. Diese erscheint im Verhältnis zu der in der Synthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid

bestimmten Stoffmenge von 3,10 mmol sehr hoch. Die verhältnismäßig hohe Konzentration lässt

vermuten, dass die von Ernst alle 15 Minuten zugefügten Mengen von 40 µl 60 %

Wasserstoffperoxid sehr hoch dosiert waren. Geht man davon aus, dass während der gesamten

Reaktion ein ähnlicher Überschuss von 13,92 mmol bzw. eine Konzentration von 0,6960 [mol/l]

Wasserstoffperoxid im Medium vorherrschte, ist diese Methode aufgrund der entsprechenden

Denaturierungsrate des Novozyms® 435 wirtschaftlich suboptimal.

In der Synthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid hingegen wurde nach Abschluss der Reaktion

eine Stoffmenge Wasserstoffperoxid von 3,10 mmol bestimmt. Dies lässt keinen direkten

Rückschluss auf die Stoffmenge an freiem Wasserstoffperoxid zu, da bei der cerimetrischen

Titration auch das gebundene Harnstoff-Wassertoffperoxid mit einbezogen wird (siehe Kap.

5.1). Allerdings lässt sich hieraus ableiten, dass von den 21,18 mmol Harnstoff-

Wasserstoffperoxid, welche zu Anfang der Reaktion hinzugegeben wurden, nach Abschluss der

Reaktion weniger als 3,10 mmol in seiner gebundenen Form vorliegt. Der hohe Verbrauch des

Adduktes lässt auf einen hohen Umsatz schließen. Dies muss allerdings relativiert werden,

vergleicht man die Peroxyessigsäureausbeute von Ernst (9,17 mmol) mit der Ausbeute aus der

Synthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid (6,34 mmol). Zu erklären ist dies aller

Wahrscheinlichkeit nach durch Eigenzerfall des Wasserstoffperoxids. Dieser muss teilweise

nach Trennung des Adduktes stattgefunden haben, sodass dem Enzym nur ein Teil des

anfänglich im Addukt gebundenen Wasserstoffperoxids zur Verfügung stand.

Zur Visualisierung ist die in Synthese 1 synthetisierte Stoffmenge an Peroxyessigsäure und die

Wasserstoffperoxidmenge zu Ende der Reaktion, verglichen mit den selben Messwerten der

enzymatischen Peroxyessigsäuresynthese mit wässrigem Wasserstoffperoxid von Ernst, in

Abbildung 11 dargestellt:

26

Abbildung 11: Vergleich von Peroxyessigsäuresynthese aus Essigsäureethylester mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid zu Peroxyessigsäuresynthese aus Essigsäureethylester mit wässrigem Wasserstoffperoxid (60%) (Ernst, 2011)

Eine niedrigere Ausbeute an Peroxyessigsäure bezogen auf die Synthese von Ernst, war zu

erwarten. Auch Ankudey, Olivio und Peeples (2006) publizierten, dass bei der Lipase-

katalysierten Epoxidation von diversen Alkenen durch in situ Synthese von Peroxyessigsäure

unter Verwendung von Harnstoff-Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel, generell niedrigere

Umsätze zustande kamen, wie bei äquivalenten Epoxidationen mit wässrigem

Wasserstoffperoxid. Folglich scheint das Enzym bei Verwendung von wässrigem

Wasserstoffperoxid größeren Konzentrationen von freiem Wasserstoffperoxid ausgesetzt zu sein.

Dies führte einerseits dazu, dass die Reaktion aufgrund der besseren Verfügbarkeit schneller

voranschreitet, andererseits steigt die Denaturierungsrate des Enzyms entsprechend. Unter

Berücksichtigung der Recycelbarkeit des Novozym® 435 ist deshalb die schonendere

Synthesemethode unter Verwendung von Harnstoff-Wasserstoffperoxid der konventionellen

enzymatischen Synthesemethode durchaus vorzuziehen.

6.2 Synthese 2: Oxidation von Diethylcarbonat zu Peroxykohlensäure

Die Auswertung von Synthese 2 bestätigt, dass auch die Durchführung der enzymatischen

Synthese von Peroxykohlensäure mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel möglich

ist. Der gemessene Mittelwert der synthetisierten Stoffmenge Peroxykohlensäure von 0,79 mmol

ist zwar im Vergleich zu der in Synthese 1 erzeugten Stoffmenge von 6,34 mmol

Peroxyessigsäure relativ gering, zeugt aber von einem funktionierenden Reaktionsablauf. Eine

0123456789

101112131415

Peroxyessigsäuresynthese aus Essigsäureethylester mit

wässrigem Wasserstoffperoxid (60%) (Ernst, 2011)

Synthese 1: Peroxyessigsäuresynthese aus

Essigsäureethylester mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid

nWasserstoffperoxid [mmol]

nPeroxyessigsäure [mmol]

27

Umsatzeinbuße bei Verwendung eines anderen Lösungsmittel und Eduktes als

Essigsäureethylester war zu erwarten. Schließlich publizierten Ankudey, Olivo und Peeples

(2006), dass bei der Alken-Epoxidation mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid, Essigsäureethylester

als Lösungsmittel und Edukt für die in situ Peroxysäuresynthese mit Abstand die besten Umsätze

hervorbrachte. Auch Ríos, Salazar und Olivo (2007) wählten bei der Oxidation von

substituierten Cyclohexanonen durch enzymatisch katalysierte in situ Peroxysäuresynthese

Essigsäureethylester als am besten geeignetes Lösungsmittel und Edukt.

Durch den Überschuss an Diethylcarbonat im Reaktionsmedium entsteht in Synthese 2

ausschließlich Monoperoxykohlensäuremonoethylester (siehe Abb. 7). Erst im theoretischen

Fall, dass alle Diethylcarbonat Moleküle zu Monoperoxykohlensäuremonoethylester (hier:

Peroxykohlensäure) oxidiert worden wären, würde Novozym® 435 die Oxidation zu der

Diperoxykohlensäure katalysieren. Ein Problem bei der Peroxysäurensynthese aus

Diethylcarbonat ist die Unstabilität der Peroxykohlensäure. Der bezogen auf die

Peroxyessigsäuresynthese verhältnismäßig geringe Umsatz könnte deswegen darin begründet

sein, dass Peroxykohlensäure zwar in größeren Stoffmengen entsteht, ein großer Teil aber nach 6

Stunden Reaktionszeit bereits wieder in Ethanol, Wasser, Kohlenstoffdioxid und Sauerstoff

zerfallen ist. Eine andere Möglichkeit könnte eine schlechtere Substratspezifität des Novozym®

435 bezogen auf Diethylcarbonat sein. So könnte es für die katalytischen Triaden der Lipase

energetisch und/oder räumlich aufwändiger sein, dass im Gegensatz zu Essigsäureethylester 2

Esterverbindungen aufweisende Diethylcarbonatmolekül, vom Serin im aktivem Zentrum unter

Ausbildung eines tetrahedralen Intermediates nukleophil anzugreifen (Kap 2.2).

Nach Abschluss der Reaktion wurde eine Stoffmenge Wasserstoffperoxid von 0,986 mmol

bestimmt, was nur ein Drittel der bestimmten Stoffmenge Wasserstoffperoxid von 3,10 mmol

aus Synthese 1 entspricht. Generell sind in allen enzymatischen Peroxykohlensäurensynthesen

dieser Studie deutlich geringere Wasserstoffperoxidkonzentrationen gemessen worden als bei

entsprechenden Peroxyessigsäuresynthesen. Der Grund hierfür könnte in dem teilweisen Zerfall

der Peroxykohlensäure liegen. Zersetzt sich diese bereits vor der cerimetrischen Titration in

Ethanol, Wasser, Kohlenstoffdioxid und Sauerstoff, so geht in der Summe Wasserstoffperoxid

im Reaktionsmedium verloren.

Zum Vergleich der enzymatischen Synthese von Peroxykohlensäure mit Harnstoff-

Wasserstoffperoxid, zu der enzymatischen Synthese von Peroxykohlensäure mit wässrigem

Wasserstoffperoxid, sind in Tabelle 13 die Messwerte von Synthese 2 mit den Messwerten einer

Peroxykohlensäuresynthese, durchgeführt durch Trojan (2010), dargestellt. Trojan verwendete

ebenfalls 20 ml Diethylcarbonat und 0,40 g Novozym® 435, setzte aber statt Harnstoff-

28

Wasserstoffperoxid äquivalent zu Ernst 960 μl 60 % Wasserstoffperoxid ein. Über eine

Reaktionszeit von 24 h fügte er dem Reaktionsmedium per Dosierpumpe im Abstand von 48 min

jeweils eine Menge von 0,04 μl der wässrigen Wasserstoffperoxidlösung zu.

Tabelle 13: Vergleich von Peroxykohlensäuresynthese aus Diethylcarbonat mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid [6h ] zu Peroxykohlensäuresynthese aus Diethylcarbonat mit wässrigem Wasserstoffperoxid (60%) [24h] (Trojan, 2011)

Peroxykohlensäuresynthese mit

wässrigem Wasserstoffperoxid (60%)

[24h] (Trojan, 2010)

Synthese 2: Peroxykohlensäuresynthese mit


[6h ]

nWasserstoffperoxid

[mmol]23,48 0,99

nPeroxykohlensäure

[mmol]1,10 0,79

Trojan (2010) bestimmte nach Abschluss der Reaktion eine Stoffmenge Wasserstoffperoxid von

23,48 mmol. Diese erscheint selbst im Verhältnis zu der in der Peroxyessigsäuresynthese mit

wässrigem Wasserstoffperoxid von Ernst (2011) gemessenen Stoffmenge von 13,92 mmol

erstaunlich hoch. Trojan wendete im Vergleich zu Ernst eine 6-fache Reaktionszeit an, erhöhte

die Anzahl der Zugabeintervalle des wässrigen Wasserstoffperoxids und reduzierte die

Intervallvolumen um das Zehnfache. Der hohe Wasserstoffperoxid Wert zu Ende der Reaktion

ist also höchst wahrscheinlich in einer fehlerhaften Dosierung oder fehlerhaften Titration

begründet, da die gemessene Stoffmenge von 23,48 mmol höher ist als die 21 mmol, welche dem

Reaktionsmedium ursprünglich insgesamt zugefügt werden sollten. Gleichwohl ist auch diese

von Trojan angewendete Methode der Peroxykohlensäuresynthese, aufgrund der entsprechend zu

Ernst noch höheren Denaturierungsrate des Novozyms® 435, wirtschaftlich suboptimal.

Wie bereits erwähnt, wurde in Synthese 2 mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid nach Abschluss der

Reaktion eine Stoffmenge Wasserstoffperoxid von 0,99 mmol bestimmt. Diese lässt, wie auch

bei Synthese 1, keinen direkten Rückschluss auf die Stoffmenge an freiem Wasserstoffperoxid

zu. Allerdings ist davon auszugehen, dass der im Verhältnis zur Synthese von Trojan sehr

geringe Wert, einen nachhaltigen Umgang mit dem Enzym erleichtert. Trojan erzielte mit einer

synthetisierten Stoffmenge von 1,10 mmol Peroxykohlensäure, bezogen auf Synthese 2, eine

höhere Ausbeute von 39,24 %. Dennoch ist unter Berücksichtigung der Reaktionszeit von 24 h

und einer zu Synthese 2 äquivalenten Menge von 0,4 g Novozym® 435, nach Abschluss der

Reaktion wahrscheinlich ein großer Teil der Lipase denaturiert.

Zur Visualisierung ist die in Synthese 2 synthetisierte Stoffmenge Peroxykohlensäure und die

Wasserstoffperoxidmenge zu Ende der Reaktion, verglichen mit den selben Messwerten der

29

enzymatischen Peroxykohlensäuresynthese mit wässrigem Wasserstoffperoxid von Trojan, in

Abbildung 11 dargestellt:

Abbildung 12: Vergleich von Peroxykohlensäuresynthese aus Diethylcarbonat mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid zu Peroxykohlensäuresynthese aus Diethylcarbonat mit wässrigem Wasserstoffperoxid (60%) (Trojan, 2011)

Ein Hindernis trat bei Synthese 2 bei der Durchführung der cerimetrischen Bestimmung der

Wasserstoffperoxidkonzentration, sowie bei der iodometrischen Bestimmung der

Peroxykohlensäurekonzentration nach Kapitel 4.2.4 auf. Als entsprechende Proben zur

Verdünnung in einen 100 ml Erlenmeyerkolben mit dest. Wasser aufgefüllt wurden, war ein 2-

Phasen-System klar ersichtlich. Während bei der Peroxyessigsäuresynthese in Synthese 1 alle

verwendeten Chemikalien gut bis sehr gut in Wasser löslich sind, ist Diethylcarbonat als

„praktisch unlöslich in Wasser“ angegeben (Römmp, 1995). Da alle anderen verwendeten wie

entstandenen Chemikalien in Synthese 2 wasserlöslich sind, ist davon auszugehen, dass das 2-

Phasen-System ausschließlich durch das Diethylcarbonat verursacht wurde. Um trotzdem eine

möglichst genaue iodometrische wie cerimetrische Bestimmung sicherzustellen, wurde das 2-

Phasen-System mit Hilfe einer Pipette gründlich gerührt, bevor die zu bestimmende Probe

genommen wurde.

02468

1012141618202224

Peroxykohlensäuresynthese aus Diethylcarbonat mit wässrigem

Wasserstoffperoxid (60%) [Reaktionszeit 24h] (Trojan, 2011)

Synthese 2: Peroxykohlensäuresynthese aus Diethylcarbonat mit Harnstoff-

Wasserstoffperoxid


nPeroxykohlensäure [mmol]

30

6.3 Variationen der enzymatisch katalysierten Synthese von Peroxycarbonsäuren

6.3.1 Synthese 3: Reduktion der Reaktionszeit auf 2 und 4 Stunden

Die Auswertung von Synthese 3 ermöglicht eine grobe Einsicht in den Reaktionsablauf der in

Synthese 2 durchgeführten Peroxykohlensäuresynthese aus Diethylcarbonat. Zum Vergleich sind

die kalkulierten Stoffmengen der in Synthese 3 durchgeführten Peroxykohlensäuresynthese mit 2

und 4 Stunden Reaktionszeit, sowie die Stoffmengen aus Synthese 2 mit 6 Stunden Reaktionszeit

in Tabelle 14 wiedergegeben. Für eine Übersicht des Reaktionsablaufes sind die entsprechenden

Stoffmengen in Abbildung 13 in einem Liniendiagramm aufgeführt.

Tabelle 14: Vergleich der Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit 2, 4 und 6 Stunden Reaktionszeit

Synthese 3:

Peroxykohlensäuresynthese

mit Harnstoff-

Wasserstoffperoxid [2 h]

Synthese 3:


mit Harnstoff-


Synthese 2:


mit Harnstoff-


nWasserstoffperoxid

[mmol]0,87 0,97 0,99

nPeroxykohlensäure

[mmol]0,20 0,32 0,79

Abbildung 13: Vergleich der Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit 2, 4 und 6 Stunden Reaktionszeit

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 2 4 6 8

Stof

fmen

ge [m

mol

]

Zeit [h]

Wasserstoffperoxid

Peroxykohlensäure

Linear (Wasserstoffperoxid)

Expon. (Peroxykohlensäure)

31

Wie schon erwähnt, ist aufgrund der bei dieser Synthese entstandenen geringen

Peroxykohlensäurekonzentrationen und den damit verbundenen zur Titration benötigten

geringen Mengen Natriumthiosulfatlösung, das Ergebnis dieser Reaktion nur von bedingter

Aussagekraft. Dennoch lässt sich über den Zeitraum von 4 h ein exponentieller Anstieg der

Stoffmenge Peroxykohlensäure im Reaktionsmedium beobachten. Ausgehend von der

gemessenen Stoffmenge von 0,20 mmol nach 2 Stunden Reaktionszeit, steigert sich die

Stoffmenge nach 6 Stunden Reaktionszeit um 395 % auf 0,79 mmol. Hieraus lässt sich ableiten,

dass sich die Peroxykohlensäureausbeute, bei Verlängerung der Reaktionszeit, unter Umständen

weiter exponentiell ausweiten ließe.

Die Stoffmenge Wasserstoffperoxid steigt über den Zeitraum von 4 h linear von 0,87 mmol auf

0,99 mmol, was einem Anstieg von 13,79 % entspricht. Theoretisch ist es nicht möglich, dass die

Konzentration bei einer anfänglichen Gesamtzugabe des Adduktes während der Reaktion steigt.

Der Anstieg könnte deshalb darin begründet sein, dass zu Anfang nicht die komplette Zugabe im

Reaktionsmedium gelöst war. Zu beobachten war dies an leichten Rückstanden am

Reaktionsgefäß. Erst durch das kontinuierliche Rühren des Magnetrührers gingen diese

Rückstände nach und nach in Lösung, was den gemessenen Anstieg zur Folge gehabt haben

könnte. Dennoch unterstreicht die verhältnismäßig niedrige Konzentration über den gesamten

Reaktionszeitraum die Nachhaltigkeit der Synthesemethode, bezogen auf eine mögliche

Denaturierung bzw. Wiederverwendbarkeit des Enzyms.

6.3.2 Synthese 4: Unterlassung der Filtration des Reaktionsmediums nach Abschluss der

Reaktion

Bis auf Synthese 4 wurden alle Peroxysäurensynthesen nach Kapitel 4.2.2 nach

Reaktionsabschluss filtriert, um das Enzym vom Reaktionsmedium zu trennen und die Reaktion

zu beenden. Verwendet wurde stets Filterpapier des Herstellers Macherey-Nagel (MN 615. ø 70

mm). Die Auswertung von Synthese 4 zeigt geringe Auswirkungen auf die Stoffmengen von

Wasserstoffperoxid und Peroxysäuren zu Ende der Reaktion, wenn die cerimetrische und

iodometrische Titration ohne vorherige Filtration erfolgen. Hierfür wurde das Reaktionsgefäß

vor einer Probennahme ca. 5 min stehen gelassen, um eine Sedimentation des Enzyms zu

erreichen. Für eine genaue Titration ist es wichtig, dass möglichst wenig bis gar kein Enzym in

der Probe vorhanden ist. Wenn dies der Fall wäre, würde nach Verdünnung der Probe der hohe

Wassergehalt zu unerwünschten Enzymreaktionen führen.

32

Ein Vergleich der Stoffmengen von Wasserstoffperoxid und Peroxyessigsäure der Synthese 1,

mit den Stoffmengen der in Synthese 4 durchgeführten Peroxyessigsäuresynthese ohne

Filtration, ist in Tabelle 15 wiedergegeben. Für eine bessere Visualisierung sind dieselben Werte

in Abbildung 14 dargestellt.

Tabelle 15: Vergleich der Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit und ohne Filtration

Synthese 1: Peroxyessigsäuresynthese

mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid


mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid (ohne

Filtration)

nWasserstoffperoxid

[mmol]3,10 4,97

nPeroxyessigsäure

[mmol]6,34 6,23

Abbildung 14: Vergleich der Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit und ohne Filtration

Die Ausbeute an Peroxyessigsäure liegt in Synthese 1 mit Filtration mit 6,34 mmol leicht höher

als die in Synthese 4 bestimmten 6,23 mmol. Aufgrund der sehr geringen Differenz ist es wenig

sinnvoll die Ursache in der Filtration zu begründen. Vielmehr kann davon ausgegangen werden,

dass die Differenz auf kleine Ungenauigkeiten bei der Methodenausführung zurückzuführen ist.

So ist festzustellen, dass die Filtration nach Reaktionsende bei der Peroxyessigsäuresynthese mit

Harnstoff-Wasserstoffperoxid keinen nennenswerten Einfluss auf den Umsatz ausübt.

Die Stoffmenge Wasserstoffperoxid hingegen, ist in Synthese 4 ohne Filtration mit 4,97 mmol

um 60,32 % höher als die in Synthese 1 bestimmte Stoffmenge von 3,10 mmol. Eine Ursache

hierfür könnten Rückstände Harnstoff-Wasserstoffperoxid sein, welche noch nicht in

0123456789

10

Synthese 1: Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid

Synthese 4: Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid

(ohne Filtration)



33

Essigsäureethylester gelöst waren. Wurden diese normalerweise nach Abschluss der Reaktion

per Filtration entfernt, so verblieben sie in Synthese 4 in der zu titrierenden Probe und wurden

zur Verdünnung mit dest. Wasser gemischt.

Auch bei der in Synthese 4 durchgeführten Peroxykohlensäuresynthese ohne Filtration ist die

Ausbeute an Peroxykohlensäure mit 0,71 mmol geringfügig kleiner, als die in der

Peroxykohlensäuresynthese in Synthese 2 bestimmten 0,79 mmol. Ein Vergleich der

Stoffmengen von Wasserstoffperoxid und Peroxykohlensäure der Synthese 2, mit den

Stoffmengen der in Synthese 4 durchgeführten Peroxykohlensäuresynthese ohne Filtration, ist in

Tabelle 16 wiedergegeben. Für eine bessere Visualisierung sind dieselben Werte in Abbildung

15 dargestellt:

Tabelle 16: Vergleich der Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit und ohne Filtration

Synthese 2: Peroxykohlensäuresynthese



mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid (ohne

Filtration)

nWasserstoffperoxid

[mmol]0,99 1,37

nPeroxykohlensäure

[mmol]0,79 0,71

Abbildung 15: Vergleich der Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit und ohne Filtration

Auch die Differenz von 0,08 mmol der Ausbeute der Peroxykohlensäuresynthese mit und ohne

Filtration ist nicht ausreichend, um einen direkten Effekt der Filtration auf die Ausbeute

0

1

2

3




Harnstoff-Wasserstoffperoxid (ohne Filtration)



34

nachzuweisen. Allerdings wirkt sich, wie auch bei der Peroxyessigsäuresynthese, die

Unterlassung der Filtration entscheidend auf die molare Stoffmenge Wasserstoffperoxid zu Ende

der Reaktion aus. Im Vergleich zu Synthese 2, bei der eine Stoffmenge von 0,99 mmol gemessen

wurde, beträgt der Anstieg der Stoffmenge in Synthese 4 mit 1,37 mmol rund 38,38 %. Als

Ursache werden auch hier Rückstände Harnstoff-Wasserstoffperoxid vermutet, welche noch

nicht in Diethylcarbonat gelöst waren und durch Unterlassung der Filtration mit in die zu

titrierende Probe gelangten.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass Synthese 4 gezeigt hat, dass sowohl bei der

Peroxyessigsäuresynthese als auch bei der Peroxykohlensäuresynthese, die abschließende

Filtration durch Filterpapier des Herstellers Macherey-Nagel (MN 615. ø 70mm) keinen

relevanten Einfluss auf die Peroxysäureausbeute ausübt.

6.3.3 Synthese 5: Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50°C

Synthese 5 zeigt eine beachtliche Steigerung der Peroxykohlensäureausbeute bei Erhöhung der

Reaktionstemperatur von 21°C (Synthese 2) auf 50°C. Die bestimmten Stoffmengen

Wasserstoffperoxid und Peroxykohlensäure zu Ende der Reaktion von Synthese 5, sind,

verglichen mit den äquivalenten Werten aus Synthese 2, in Tabelle 17 angegeben. In Abbildung

16 sind die Stoffmengen diagrammatisch dargestellt.

Tabelle 17: Vergleich der Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid bei 21°C und 50°C Reaktionstemperatur



(21°C)



(50 °C)

nWasserstoffperoxid

[mmol]0,99 1,33

nPeroxykohlensäure

[mmol]0,79 1,23

35

Abbildung 16: Vergleich der Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid bei 21°C und 50°C Reaktionstemperatur

Die Peroxykohlensäureausbeute ließ sich, im Vergleich zu Synthese 2, durch eine Erhöhung um

29°C von 0,79 mmol auf 1,23 mmol um insgesamt 55,70 % steigern. Eine Ursache könnte eine

Annährung an das Temperaturoptimum der Lipase für diese Reaktion sein. Novozym® 435 wird,

u.a. aufgrund seiner Immobilisierung auf makroporösem Acrylharz, als relativ thermostabil

angegeben (www.sigmaaldrich.com). Ankudey et al (2007) nutzten bei der in situ

Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid stets eine Reaktionstemperatur von

27°C.

Eine andere oder auch ergänzende Ursache könnte darin begründet sein, dass der Zerfall des

Harnstoff-Wasserstoffperoxid Adduktes temperaturbedingt schneller und in größerem Maße

erfolgt. Dies hätte zur Folge, dass das Enzym verhältnismäßig größeren Mengen freien

Wasserstoffperoxids ausgesetzt ist. Einerseits würde hierdurch die Synthese beschleunigt,

andererseits würde es einen nachhaltigen Umgang mit dem Enzym erschweren. Generell ist eine

Reaktionstemperatur von 50°C in dieser Reaktion kritisch, da unerwünschte Reaktionen des

freien Wasserstoffperoxids mit dem Enzym, welche zur Denaturierung führen, begünstigt oder

beschleunigt werden können. Es würde sich deshalb anbieten, Synthese 2 und Synthese 5

mehrmals zu wiederholen, und dabei das Enzym zu recyceln und wiederzuverwenden. Unter

Berücksichtigung des Gesamtumsatzes und der Recyclingraten könnte so die Nachhaltigkeit der

beiden angewendeten Reaktionstemperaturen der Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-

Wasserstoffperoxid genauer untersucht werden.

0

1

2

3




Harnstoff-Wasserstoffperoxid (50°C)



36

6.3.4 Synthese 6: Hinzugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in Intervallen

Die Auswertung von Synthese 6 zeigt einen Umsatzverlust bei der Peroxyessigsäure- und

Peroxykohlensäuresynthese, wenn Harnstoff-Wasserstoffperoxid, statt in einer anfänglichen

Gesamtzugabe, dem Reaktionsmedium in Intervallen zugegeben wird.

Ein Vergleich der Stoffmengen von Wasserstoffperoxid und Peroxykohlensäure der Synthese 2,

mit den Stoffmengen der in Synthese 6 durchgeführten Peroxykohlensäuresynthese mit

Intervallzugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid, ist in Tabelle 18 und Abbildung 17

wiedergegeben:

Tabelle 18: Vergleich der Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit anfänglicher Gesamtzugabe zuZugabe in Intervallen



(anfängliche Gesamtzugabe)


mit Zugabe von Harnstoff-

Wasserstoffperoxid in Intervallen

nWasserstoffperoxid

[mmol]0,99 1,23

nPeroxykohlensäure

[mmol]0,79 0,51

Abbildung 17: Vergleich der Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit anfänglicher Gesamtzugabe zu Zugabe in Intervallen

Die Peroxykohlensäureausbeute verringerte sich in Synthese 6 mit 0,51 mmol gegenüber der

Ausbeute von 0,79 mmol von Synthese 2 um 35,44 %. Dies lässt darauf schließen, dass die 5

0

1

2

3


Harnstoff-Wasserstoffperoxid (anfängliche Gesamtzugabe)


Zugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in Intervallen



37

Teilmengen von 0,3985 g Harnstoff-Wasserstoffperoxid, welche stündlich zugegeben wurden,

die Konzentration an freiem Wasserstoffperoxid im Reaktionsmedium im Vergleich zu Synthese

2 eher niedrig hielten. Die Konzentration an freiem Wasserstoffperoxid stieg stündlich mit jeder

Zugabe aufgrund des sich neu einstellenden Gleichgewichtes von Harnstoff-Wasserstoffperoxid

zu freiem Harnstoff und Wasserstoffperoxid. Die so erzeugte, über den Reaktionszeitraum von 4

Stunden ansteigende Konzentration, scheint für die enzymatische Peroxykohlensäuresynthese

schlechter geeignet zu sein als die durch anfängliche Gesamtzugabe des Adduktes erzeugte

Konzentration. Dies unterstreicht zum einen die deutlich niedrigere Ausbeute, als auch die nach

Reaktionsende gemessene leicht höhere Stoffmenge Wasserstoffperoxid von 1,23 mmol.

Ein ähnlicher Rückschluss kann aus der in Synthese 6 durchgeführten Peroxyessigsäuresynthese

mit Zugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in Intervallen gezogen werden. Ein Vergleich der

Stoffmengen von Wasserstoffperoxid und Peroxyessigsäure der Synthese 1, mit den

Stoffmengen der Peroxykohlensäuresynthese mit Intervallzugabe, ist in Tabelle 19 und

Abbildung 18 wiedergegeben:

Tabelle 19: Vergleich der Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit anfänglicher Gesamtzugabe zuZugabe in Intervallen



(anfängliche Gesamtzugabe)


mit Zugabe von Harnstoff-

Wasserstoffperoxid in Intervallen

nWasserstoffperoxid

[mmol]3,10 5,33

nPeroessigsäure [mmol] 6,34 5,86

Abbildung 18: Vergleich der Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit anfänglicher Gesamtzugabe zuZugabe in Intervallen

0123456789

10

Synthese 1: Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid (anfängliche Gesamtzugabe)

Synthese 6: Peroxyessigsäuresynthese mit

Zugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in Intervallen



38

Die Peroxyessigsäureausbeute verringerte sich in Synthese 6 mit 5,86 mmol gegenüber der

Ausbeute von 6,34 mmol von Synthese 2 um 7,57 %. Dies ist zwar deutlich weniger als der

Ausbeuteverlust der Peroxykohlensäuresynthese mit Intervallzugabe von 35,44 %, dennoch wird

ersichtlich, dass auch bei der Peroxykohlensäuresynthese die anfängliche Gesamtzugabe von

Vorteil ist.

7. Schlussfolgerung und Ausblick

Die Ausführungen dieser Studie haben gezeigt, dass 20 ml Essigsäureethylester oder

Diethylcarbonat, unter Anwendung von 0,40 g Novozym® 435 und 1,9924 g Harnstoff-

Wasserstoffperoxid, mit Ausbeuten bis zu 6,34 mmol zu ihren entsprechenden Peroxysäuren

oxidiert werden können. Aus Gründen der Effizienz, Kosteneinsparung und Nachhaltigkeit wäre

es interessant zu untersuchen, wie sich eine Reduzierung der Enzymmenge im Reaktionsmedium

auf die Umsatzgeschwindigkeit und Denaturierungsrate auswirken würde. Ankudey, Olivio und

Peeples (2006) fanden heraus, dass eine Reduzierung der Enzymmenge bei der Epoxidation

durch in situ Synthesen von Peroxyessigsäure aus Essigsäureethylester mit Harnstoff-

Wasserstoffperoxid, geringfügige bis keine Änderungen beim Umsatz zur Folge hatte.

Epoxidationen führten sie in 3 ml Essigsäureethylester mit 1 mmol des zu epoxidierenden

Alkens, 1,10 mmol Harnstoff-Wasserstoffperoxid und 50 mg Novozym® 435 durch. Bei einer

Reduzierung der Enzymmenge bis zu 5 mg konnten keine Umsatzverluste festgestellt werden

(Tabelle 20) (Ankudey; Olivio; Peeples, 2006).

Tabelle 20: Einfluss der Reduzierung der Enzymmenge auf Umsatz bei der Epoxidation durch in situ Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid (Ankudey; Olivio; Peeples, 2006)

Enzym [mg] Reaktionszeit [h] Umsatz [%]

50 5 82

40 5 86

25 5 86

15 5 85

10 5 85

5 5 86

2 5 81

1 5 61

39

Aufgrund der ähnlichen Reaktionskriterien wie bei Synthesen dieser Studie, ist es

wahrscheinlich, dass auch diese mit wesentlich kleineren Enzymmengen zu ähnlichen Ausbeuten

führen würden. Zu beachten ist allerdings, dass durch kleinere Enzymmengen, welche dadurch

verhältnismäßig größeren Mengen freiem Wasserstoffperoxid ausgesetzt wären, die

Denaturierungsrate steigen könnte. Um dies zu überprüfen würde sich anbieten, in dieser Studie

durchgeführte Synthesen mit anschließendem Enzymrecycling zu wiederholen. Äquivalente

Synthesen mit kleineren Enzymmengen, welche ebenfalls mit anschließendem Enzymrecycling

wiederholt werden würden, könnten durch Vergleiche der möglichen Wiederholungen ohne

Umsatzverluste die Annahme bestätigen oder widerlegen.

Ebenfalls aus Gründen der Effizienz, Kosteneinsparung und Nachhaltigkeit wäre es lohnenswert,

den Einfluss der Reduzierung der verwendeten Menge Harnstoff-Wasserstoffperoxid auf die

Ausbeute zu untersuchen. Die in Synthesen dieser Studie verwendete Menge ist meist nie

komplett in Lösung gegangen, was an Rückständen im Reaktionsgefäß und den Messungen der

Wasserstoffperoxidkonzentrationen in Synthese 3 und 4 gut ersichtlich war. Aus diesem Grund

ist es wahrscheinlich, dass auch hier eine Reduzierung nicht zwanghaft zu Ausbeuteverlusten

führt.

8. Zusammenfassung

Unter Berücksichtigung und vergleichend mit der Studie der enzymatisch katalysierten Synthese

von Peroxyessigsäure mit wässrigem Wasserstoffperoxid (Ernst, 2011), zeigt diese Arbeit unter

gleichen Reaktionsbedingungen eine funktionierende Synthesemethode zur enzymatisch

katalysierten Darstellung von Peroxysäuren mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid. Bei der

enzymatischen Peroxysäurensynthese mit wässrigem Wasserstoffperoxid ist es notwendig, das

wässrige Wasserstoffperoxid dem Reaktionsmedium in Intervallen zuzugeben, um eine

Denaturierung des Enzyms zu verhindern. Diese Studie zeigt durch den Einsatz des Harnstoff-

Wasserstoffperoxiod-Adduktes eine Alternative auf, welche dem Reaktionsmedium durch eine

anfängliche Gesamtzugabe zugesetzt werden kann. Dies ist möglich, da Harnstoff-

Wasserstoffperoxid das Potential besitzt, Wasserstoffperoxid in einer kontrollierbaren Art und

Weise freizusetzen. Einerseits erleichtert dies die Durchführung, andererseits wird eine

niedrigere Denaturierungsrate vermutet. Unter Verwendung von 20 ml Essigsäureethylester oder

Diethylcarbonat als Lösungsmittel wie Edukt, werden mit 1,9924 g Harnstoff-

Wasserstoffperoxid, katalysiert durch 0,40 g Novozym® 435, Ausbeuten bis zu 6,34 mmol

Peroxyessigsäure und 1,23 mmol Peroxykohlensäure erreicht. Aufgrund der verringerten

40

Konzentration an freiem Wasserstoffperoxid im Reaktionsmedium fallen die Ausbeuten

geringfügig kleiner aus als bei äquivalenten Synthesen mit wässrigem Wasserstoffperoxid.

Allerdings haben die vergleichsweise geringen Mengen Wasserstoffperoxid im Medium eine

reduzierte Denaturierungsrate zur Folge, was die Synthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid zu

einer ernsthaften Alternative werden lässt. Die anfängliche Gesamtzugabe des Harnstoff-

Wasserstoffperoxids stellt sich, hinsichtlich der maximalen Ausbeute, sowohl bei der

Peroxyessigsäure- als auch bei der Peroxykohlensäuresynthese, gegenüber der Zugabe des

Adduktes in Intervallen als vorteilhaft heraus. Weitere Untersuchungen zeigen, dass die in dieser

Studie angewendete Filtration nach Abschluss der Reaktion, keinen Einfluss auf den Verbleib an

Peroxysäuren in der filtrierten Lösung hat. Um den Umsatz der enzymatischen

Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid zu steigern, würde eine

Verlängerung der in dieser Studie angewendeten Reaktionszeit von 6 Stunden in Erwägung

kommen. Dies unterlegen Messungen der Peroxykohlensäurekonzentration nach 2, 4 und 6

Stunden, welche einen exponentiellen Anstieg zeigen. Die Peroxykohlensäureausbeute lässt sich,

in ansonsten äquivalenten Synthesen, durch eine Erhöhung der Reaktionstemperatur von 21°C

auf 50°C um 55,70 % steigern. Diese Reaktionstemperatur ist allerdings insofern kritisch, da

unerwünschte Reaktionen des freien Wasserstoffperoxids mit dem Enzym, welche zur

Denaturierung führen, begünstigt oder beschleunigt werden können.

41

9. Literatur

Monografien

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Synthese. Aachen: Shaker, 1999

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hydrogen peroxide in ethyl acetate. Green Chemistry. DOI 10.1039/b604984b

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acetate. Green Chemistry. DOI 10.1039/b618175a

42

- Rüsch gen. Klaas, M., Warwel, S. (2000), Lipase-Catalyzed Peroxy Fatty Acid generation and

Lipid Oxidation. Bornscheuer, T.: Enzymes in Lipid Modification.Weinheim: Wiley-VCH, 2000

- Rüsch gen. Klaas, M., Warwel, S. (2000), New Percarboxylic Acids by Lipase Catalysis:

Preparation and Oxidation Properties. Adam, W.: Peroxide Chemistry – Mechanistic and

Preparative Aspects of Oxygen Transfer. Weinheim: Wiley-VCH, 2000

Internet

http://chemicalland21.com/industrialchem/inorganic/UREA%20HYDROGEN%20PEROXIDE.h

tm 15.12.2011

http://www.kesla.de/fobst.htm. 02.12.2011

http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?N4=L4777|SIGMA&N5=SEARCH_

CONCAT_PNO|BRAND_KEY&F=SPEC. 04.01.2012

Sonstige Quellen

- Ernst, R.: Enzymatische Herstellung von Percarbonsäuren – Versuche mit verschiedenen

Enzymen. Hausarbeit. Hochschule Neubrandenburg: nicht veröffentlicht, 2011

- Patett, N.: Untersuchungen zur Inaktivierung von Bakteriosporen mit neu synthetisierten

Persäuren. Diplomarbeit. Hochschule Neubrandenburg, 2001

- Trojan, P.: Die mikrobizide Wirkung von Percarbonsäuren. Studienarbeit. Hochschule

Neubrandenburg: nicht veröffentlicht, 2010

43

10. Verwendete Abkürzungen

Dest. Wasser – Destilliertes Wasser

Peroxykohlensäure - Monoperoxykohlensäuremonoethylester

44

11. Abbildungsverzeichnis

Abb. 1 : Peroxyessigsäure………………………………………………………………… 5

Abb. 2 : Säurekatalytische Herstellung einer Peroxycarbonsäure ………………….......... 6

Abb. 3 : Reaktionsgleichung enzymatisch katalysierter Synthese von

Peroxycarbonsäuren……………………………………………………………... 6

Abb. 4 : Katalytische Triade mit der Aminosäuren-Nummerierung des aktiven Zentrums

der Lipase-B aus Candida antarctica…………………………….......................... 8

Abb. 5 : Harnstoff-Wasserstoffperoxid (auch Carbamidperoxid; Percarbamid)…………. 10

Abb. 6 : Reaktionsgleichung der enzymatisch katalysierten Synthese von

Peroxyessigsäure aus Essigsäureethylester, unter Verwendung von Harnstoff-

Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel………………………........................... 12

Abb. 7 : Reaktionsgleichung der enzymatisch katalysierten Synthese von

Peroxykohlensäure aus Diethylcarbonat, unter Verwendung von Harnstoff-

Wasserstoffperoxid als Oxidationsmittel………………………………………... 12

Abb. 8 : Versuchsaufbau; Peroxysäurensynthese………………………………………… 14

Abb. 9 : Versuchsaufbau; Abfiltration des Enzyms………………………………………. 14

Abb. 10 : Versuchsaufbau; Titration via Bürette…………………………………………... 16

Abb. 11 : Vergleich von Peroxyessigsäuresynthese aus Essigsäureethylester mit

Harnstoff-Wasserstoffperoxid zu Peroxyessigsäuresynthese aus

Essigsäureethylester mit wässrigem Wasserstoffperoxid (60%)………….......... 26

Abb. 12 : Vergleich von Peroxykohlensäuresynthese aus Diethylcarbonat mit Harnstoff-

Wasserstoffperoxid zu Peroxykohlensäuresynthese aus Diethylcarbonat mit

wässrigem Wasserstoffperoxid (60%)…………………………………………... 29

Abb. 13 : Vergleich der Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid

mit 2, 4 und 6 Stunden Reaktionszeit…………………………………………… 30

Abb. 14 : Vergleich der Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit

und ohne Filtration………………………………................................................. 32


mit und ohne Filtration………………………………........................................... 33


bei 21°C und 50°C Reaktionstemperatur………………………………………... 35

45


mit anfänglicher Gesamtzugabe zu Zugabe in

Intervallen………………………………………………………………….......... 36

Abb. 18 : Vergleich der Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit

anfänglicher Gesamtzugabe zu Zugabe in

Intervallen………………………………………………………………….......... 37

46

12. Tabellenverzeichnis

Tab. 1 : Vergleich der Explosivkraft und Sensitivität konventioneller Sprengstoffe mit

Wasserstoffperoxid Gemischen………………………………………………... 9

Tab. 2 : Messergebnisse; Bestimmung der Konzentration des Harnstoff-

Wasserstoffperoxid-Adduktes…………………………………………………. 17

Tab. 3 : Synthese 1; Messergebnisse; Oxidation von Essigsäureethylester zu

Peroxyessigsäure……………………………………………………………….. 18

Tab. 4 : Synthese 2; Messergebnisse; Oxidation von Diethylcarbonat zu

Peroxykohlensäure……………………………………………………………... 19


Peroxykohlensäure; Reduktion der Reaktionszeit auf 2 Stunden……………… 20


Peroxykohlensäure; Reduktion der Reaktionszeit auf 4 Stunden……………… 20


Peroxyessigsäure; Unterlassung der Filtration des Reaktionsmediums nach

Abschluss der Reaktion………………………………………………………… 21


Peroxykohlensäure; Unterlassung der Filtration des Reaktionsmediums nach

Abschluss der Reaktion………………………………………………………… 21


Peroxykohlensäure; 50°C………………………………………………………. 22


Peroxyessigsäure; Hinzugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in Intervallen 23


Peroxykohlensäure; Hinzugabe von Harnstoff-Wasserstoffperoxid in

Intervallen………………………………………………………………………. 23

Tab. 12 : Vergleich von Peroxyessigsäuresynthese aus Essigsäureethylester mit

Harnstoff-Wasserstoffperoxid zu Peroxyessigsäuresynthese aus Essigsäure-

ethylester mit wässrigem Wasserstoffperoxid (60%)………………………….. 25

Tab. 13 : Vergleich von Peroxykohlensäuresynthese aus Diethylcarbonat mit Harnstoff-

Wasserstoffperoxid [6h ] zu Peroxykohlensäuresynthese aus Diethylcarbonat

mit wässrigem Wasserstoffperoxid (60%) [24h]……………………………… 28

47

Tab. 14 : Vergleich der Peroxykohlensäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid

mit 2, 4 und 6 Stunden Reaktionszeit…………………………………………... 30

Tab. 15 : Vergleich der Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit

und ohne Filtration…………………………………………………………. 32


mit und ohne Filtration…………………………………………………………. 33


bei 21°C und 50°C Reaktionstemperatur………………………………………. 34


mit anfänglicher Gesamtzugabe zu Zugabe in Intervallen……………………... 36

Tab. 19 : Vergleich der Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid mit

anfänglicher Gesamtzugabe zu Zugabe in Intervallen……………………... 37

Tab. 20 : Einfluss der Reduzierung der Enzymmenge auf Umsatz bei der Epoxidation

durch in situ Peroxyessigsäuresynthese mit Harnstoff-Wasserstoffperoxid…… 38

48

Selbstständigkeitserklärung

Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig angefertigt habe und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.

_____________________________ _____________________________ Ort, Datum Unterschrift

49

Anhang

Formel zu Bestimmung der Wasserstoffperoxidkonzentration bei der cerimetrischen

Titration:

cH202 [mol/l] = Verbrauch Cer(IV)-Sulfatlösung [ml] * 0,5 * 0,1[mol/l] * VerdünnungsfaktorVprobe[ml]

Formel zu Bestimmung der Peroxysäurenkonzentration bei der iodometrischen Titration:

cPersäure [mol/l] = Verbrauch Na2S2O3[ml] * 0,5 * 0,1[mol/l] * VerdünnungsfaktorVprobe[ml]

Documents

Bachelor-Thesis Zur Lipase-katalysierten Darstellung von ...digibib.hs-nb.de/.../Bachelorarbeit-Franzen-2015.pdf · ein Acyl-Enzym-Komplex, unterstützt durch das Carboxylatanion