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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO INTERDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIÓN
PARA EL DESARROLLO INTEGRAL REGIONAL UNIDAD SINALOA
Bacterias antagonistas a Sclerotinia sclerotiorum como una alternativa biológica al
control del moho blanco en frijol
TESIS
QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRÍA EN RECURSOS NATURALES Y MEDIO AMBIENTE
PRESENTA:
ANDREYNA BÁEZ CAMACHO
Guasave, Sinaloa, México; Noviembre del 2017
ii
iii
iv
v
El presente trabajo se realizó en el Departamento de Biotecnología Agrícola en el
laboratorio de Interacción Microorganismo-Planta de Centro Interdisciplinario de
Investigación para el Desarrollo Integral Regional CIIDIR-IPN unidad Sinaloa del
Instituto Politécnico Nacional bajo la dirección de la Dra. Melina López Meyer. El
autor agradece el apoyo otorgado por el IPN a través del programa de becas
institucionales y del programa BEIFI, así como a CONACyT por el apoyo económico
otorgado (clave 709874) durante la realización de los estudios de Maestría y para
la realización del presente trabajo de tesis.
vi
Dedicatoria y agradecimientos
Primero que nada a Dios por estar siempre conmigo en toda ocasión y circunstancia,
y poner en mi camino a todas y cada una de las personas tan buenas que conocí
en el trayecto de mi maestría.
Con todo mi corazón para toda mi familia, la cual me ha ayudado a seguir adelante,
a mis padres Lidia y Andres por el apoyo que recibí de su parte, a mi hermano Raúl
Andres y en especial a mi hermanito pequeño Andres, quien me da alegría suprema
con sus pláticas y me hace sentir bien, muchas gracias!! Los amo con todo mi
corazón. A mi novio Roberto por apoyarme, alentarme y nunca dejarme sola en
cualquier situación, además de siempre demostrarme su amor, te amo por siempre
y para siempre. A mis tías Adelaida y Leonides las cuales me apoyaron
incondicionalmente y además me abrieron las puertas de su hogar para vivir en esta
Ciudad, de todo corazón, muchas gracias, las quiero mucho!!
A mis amigos Lorena y Omar, por siempre darme aliento y estar conmigo en toda
ocasión apoyándome para salir adelante, los amo con todo mi corazón, millones de
gracias por ser mis hermanos del alma, agradezco a Dios tenerlos conmigo.
A mis amigas y compañeras de CIIDIR Sandy y Yoldia, por su cariño y apoyo
incondicional, las amo y le agradezco profundamente a Dios por ponerlas en mi
camino. A mis amigos y compañeros de CIIDIR Carolina y Paúl por su amistad y
cariño.
A todas las personas de CIIDIR por su apoyo, en especial a mis directoras de tesis
la Dra. Melina López Meyer y la Dra. Claudia Castro Martínez, sin ellas no podría
haber logrado nada, gracias por ayudarme a crecer académicamente, y además por
su apoyo brindado en cualquier situación, a mi comité tutorial integrado por el Dr.
Ignacio Eduardo Maldonado Mendoza, el Dr. Sergio Medina Godoy y el Dr. Juan
Carlos Sainz Hernández, muchas gracias por sus acertadas aportaciones, a mis
maestros por sus clases tan buenas. A todos los integrantes del laboratorio
vii
Interacción Microorganismo-Planta, del laboratorio de Bioenergéticos y del
laboratorio de Ecología Molecular de la Rizosfera por su ayuda en mi proyecto.
A todos y cada uno de mis compañeros de maestría por su amistad brindada. A mis
compañeros de laboratorio, en especial a Sandy y Alán (bastardo) quienes hicieron
que mis jornadas laborales fueran más placenteras, gracias por su amistad.
A todas y cada una de las personas que forman parte de mi vida y que de alguna
u otra manera influyeron en este proceso, muchas gracias de corazón.
viii
Índice ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................................x
ÍNDICE DE CUADROS................................................................................................................... xii
GLOSARIO ...................................................................................................................................... xiii
RESUMEN ........................................................................................................................................ xv
ABSTRACT ..................................................................................................................................... xvi
1. INTRODUCCIÓN ...................................................................................................................... 1
2. ANTECEDENTES .................................................................................................................... 3
2.1. Frijol (Phaseolus vulgaris) ........................................................................................... 3
2.2. Sclerotinia sclerotiorum ............................................................................................... 3
2.3. Ciclo de vida de S. sclerotiorum ................................................................................ 5
2.4. Control de la enfermedad del moho blanco ............................................................ 6
2.5. Mecanismos de antagonismo bacteriano ................................................................ 7
2.5.1. Competencia por espacio y nutrientes .......................................................................... 7
2.5.2. Producción de antibióticos .............................................................................................. 8
2.5.3. Parasitismo directo ........................................................................................................... 9
2.5.4. Resistencia inducida en la planta ................................................................................ 10
2.5.5. Producción de compuestos volátiles orgánicos ......................................................... 10
3. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................................... 11
4. HIPÓTESIS ................................................................................................................................ 12
5. OBJETIVO GENERAL ........................................................................................................... 13
5.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................ 13
6. METODOLOGÍA ..................................................................................................................... 14
6.1. Estrategia general de trabajo .................................................................................... 14
6.2. Cultivo y mantenimiento de las cepas bacterianas ............................................ 15
6.3. Cultivo y mantenimiento de S. sclerotiorum ......................................................... 15
6.4. Perfil de crecimiento de S. sclerotiorum ................................................................ 15
6.4.1. Determinación de azúcares reductores del medio de S. sclerotiorum
(Técnica DNS) ............................................................................................................................ 16
6.5. Perfil de crecimiento de las cepas bacterianas ................................................... 16
6.6. Perfil de crecimiento y el consumo de ácido oxálico de Pseudomonas a
diferentes concentraciones de ácido oxálico sintético ................................................. 17
6.6.1. Perfil de crecimiento de S. sclerotiorum en cocultivo con Pseudomonas
(OX32) 17
ix
6.7. Efecto de las cepas bacterianas en la infección por S. sclerotiorum ............ 18
6.7.1. Efecto de las cepas bacterianas en la infección por S. sclerotiorum en
hojas 18
6.7.2. Efecto de las cepas bacterianas en la infección por S. sclerotiorum en
esclerocios ................................................................................................................................. 18
6.7.3. Efecto de las cepas bacterianas en la infección por S. sclerotiorum en
ascosporas................................................................................................................................. 19
6.8. Efecto de los COVs en la inhibición de S. sclerotiorum por B.
amyloliquefaciens (COD2) ..................................................................................................... 19
6.9. Genes biosintéticos de compuestos antifúngicos de B. amyloliquefaciens
(COD2) ......................................................................................................................................... 20
6.9.1. Confirmación de la identidad de B. amyloliquefaciens (COD2) ................... 21
7. RESULTADOS ........................................................................................................................... 22
7.1. Caracterización de los perfiles de crecimiento de las bacterias evaluadas y el
patógeno S. sclerotiorum ....................................................................................................... 22
7.1.1. Perfil de crecimiento de S. sclerotiorum .......................................................................... 22
7.1.2. Perfil de consumo de azúcares de S. sclerotiorum en medio líquido ......................... 23
7.1.3. pH en el perfil de crecimiento de S. sclerotiorum en medio líquido ............................ 23
7.1.4. Perfil de crecimiento de la bacteria OX32, en presencia y ausencia de ácido oxálico,
oxalato de potasio y glucosa ........................................................................................................ 24
7.1.5. Perfil de crecimiento de COD2, COD4 y BS105 ............................................................ 31
7.2. Efecto antagonista a S. sclerotiorum .......................................................................... 33
7.2.1. Efecto antagonista a S. sclerotiorum en hojas ............................................................... 33
7.2.2. Efecto antagonista a S. sclerotiorum en esclerocios ..................................................... 36
7.2.3. Efecto antagonista a S. sclerotiorum en ascosporas ..................................................... 39
7.3. Identificación de la cepa bacteriana COD2 como B. amyloliquefaciens ........... 40
7.4. Efecto de los COV en la inhibición de S. sclerotiorum por B.
amyloliquefaciens (COD2) ..................................................................................................... 42
7.5. Genes biosintéticos de compuestos antifúngicos de B. amyloliquefaciens
COD2............................................................................................................................................ 44
8. DISCUSIÓN ............................................................................................................................. 47
9. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 53
10. RECOMENDACIONES Y SUGERENCIAS .................................................................... 54
11. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 55
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Ciclo de vida de S. sclerotiorum…………………………………………14
Figura 2. Perfil de crecimiento de S. sclerotiorum en medio líquido……………28
Figura 3. Perfil de consumo de azúcares de S. sclerotiorum en medio líquido..29
Figura 4. pH del medio de cultivo durante el crecimiento de S. sclerotiorum en
medio líquido……………………………………………………………………………...30
Figura 5. Perfil de crecimiento de Pseudomonas OX32…………………………31
Figura 6. Perfil de crecimiento de Pseudomonas OX32 en diferentes
concentraciones de oxalato de potasio………………………………………………..32
Figura 7. Perfil de crecimiento de Pseudomonas OX32 en diferentes
concentraciones de ácido oxálico………………………………………………………33
Figura 8. Perfil de crecimiento de Pseudomonas OX32 en presencia de glucosa
(con y sin ácido oxálico)…………………………………………………………………34
Figura 9. Perfil de crecimiento de S. sclerotiorum en presencia y ausencia de la
cepa OX32………………………………………………………………………………..35
Figura 10. OX32 en medio Schlegel con ácido oxálico producido por S.
sclerotiorum………………………………………………………………………………36
Figura 11. pH del medio de cultivo durante el crecimiento en cocultivo de S.
sclerotiorum y OX32 en medio líquido…………………………………………………36
Figura 12. Perfil de crecimiento de Bacillus subtilis 105…………………………..37
Figura 13. Perfil de crecimiento de Bacillus subtilis COD4……………………….38
Figura 14. Perfil de crecimiento de Bacillus amyloliquefaciens
COD2……………………………………………………………………………………...38
Figura 15. Medida de lesión en hoja de frijol después de 70 h….…………........40
Figura 16. Hojas de frijol con los diferentes tratamientos después de 74 h en
presencia de S.
sclerotiorum…………………………………………………………………..41
Figura 17. Germinación de esclerocios con diferentes
tratamientos………………………………………………………………………………43
xi
Figura 18. Germinación de esclerocios con diferentes tratamientos al día
20…………………………………………………………………………………………..44
Figura 19. Germinación de esclerocios con diferentes tratamientos al día
20……………………………………………………………………………………….….45
Fig. 20. Antagonismo bacteriano en ascosporas de S. sclerotiorum.....................46
Figura. 21. Producto de PCR utilizando los oligonucleótidos GyrAF y GyraR con
DNA genómico como templado………………………………………………………...47
Fig. 22. Secuencia del fragmento amplificado por PCR del gen de la subnidad A de
la girasa……………………………………………………………………………………47
Fig. 23. Resultados del análisis de comparación de secuencias usando el programa
BLAST para la secuencia obtenida del PCR a partir de DNA de la COD2 y los
oligonucleótidos para el gen GyrA……………………………………………….48
Fig. 24. Área de infección de S. sclerotiorum en presencia y ausencia de COD2….49
Fig. 25. Efecto de compuestos volátiles orgánicos sobre el hongo S. sclerotiorum a
las 17 h de cultivo. Los círculos rojos corresponden al borde de crecimiento del
hongo en tratamientos…………………………………………………………………...50
Fig. 26. Productos de PCR de genes biosintéticos involucrados en las rutas de
síntesis de los diferentes antibióticos………………………………………………….51
Fig. 27. Porcentajes de identidad de cada uno de las secuencias de los productos
de PCR obtenidos ……………………………………………………………………….52
xii
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de Sclerotinia sclerotiorum……………..…..4
Cuadro 2. Antibióticos producidos por bacterias del género Bacillus……………9
Cuadro 3. Compuestos volátiles orgánicos producidos por bacterias…………..10
xiii
GLOSARIO
Antagonista. Microorganismo, ya sea hongo, bacteria o levadura con capacidad
de ejercer control sobre diferentes patógenos de plantas.
Antibiótico. Sustancia química producida por un ser vivo o derivado sintético, que
mata o impide el crecimiento de ciertas clases de microorganismos sensibles.
Apotecio. Ascocarpo abierto con forma de copa o plato que contiene las ascas,
en el cual el himenio está abierto y expuesto al llegar las ascosporas a la madurez.
Asca: Estructura en forma de saco, parecida al esporangio, mediante la cual se
reproducen sexualmente los hongos ascomicetos.
Ascospora: Espora sexual originada en el interior de un asco (saco).
Bacteria: Microorganismo unicelular sin núcleo diferenciado, algunas de cuyas
especies descomponen la materia orgánica, mientras que otras producen
enfermedades.
Esclerocios. Masa compacta de hifas de un hongo, protegidas por la membrana
engrosada de las células externas, capaz de sobrevivir bajo condiciones
ambientales desfavorables.
Fitopatógeno. Término que se aplica a los microorganismos que producen
enfermedades en las plantas.
Germinación carpogénica: Producción de ascosporas a partir de apotecios
surgidos de un esclerocio
(reproducción sexual).
xiv
Germinación miceliogénica: Producción de micelio a partir de un esclerocio
(reproducción asexual).
Hifa. Elementos filamentosos cilíndricos característicos de la mayoría de
los hongos. Están constituidos por una fila de células alargadas envueltas por la
pared celular que, reunidas, forman el micelio.
Metabolismo: Conjunto de reacciones químicas que efectúan las células de los
seres vivos con el fin de sintetizar o degradar sustancias.
Micelio. Aparato vegetativo de los hongos que le sirve para nutrirse y está
constituido por hifas.
Rizósfera. Parte del suelo inmediata a las raíces de las plantas donde existe una
interacción dinámica con los microorganismos.
xv
RESUMEN
En México, el frijol (Phaseolus vulgaris L.) es la guarnición más utilizada para
acompañar diferentes platillos. La producción y calidad de este cultivo se ve limitado
por diversas enfermedades. Una de las más importantes es el moho blanco causada
por S. sclerotiorum (Lib.) de Bary. Una característica de este patógeno es su capacidad
de producir y secretar ácido oxálico, el cual se considera un factor de virulencia. La
estrategia más utilizada para el control de esta enfermedad es el uso de productos
químicos. Sin embargo, el uso prolongado de estos productos genera resistencia del
hongo a fungicidas, además causan daños al medio ambiente y la salud humana. El
control biológico también representa una opción en el control de la enfermedad. En el
laboratorio de Interacción microorganismo-planta del CIIDIR-SIN, también se han
encontrado bacterias capaces de inhibir el crecimiento micelial de S. sclerotiorum, tales
como Pseudomonas sp. (OX32), con tentativa capacidad para metabolizar ácido
oxálico, B. amyloliquefaciens (COD2), B. subtilis (COD4), y B. subtilis (BS105). Sin
embargo, se desconoce el efecto de estos aislados en hojas de frijol, esclerocios y
ascosporas de S. sclerotiorum. El objetivode la presente tesis fue evaluar cepas
bacterianas antagonistas al crecimiento micelial de S. sclerotiorum in vitro, sobre
esclerocios y ascoporas del hongo, así como en hojas escindidas de frijol, para la
selección de la cepa que pueda ser considerada como una alternativa biológica al
control del moho blanco en frijol. Primeramente, se caracterizaron los perfiles de
crecimiento de las bacterias evaluadas y S. sclerotiorum. Para las cepas OX32, 105 y
COD4 se alcanzó la fase exponencial a las 10 horas, mientras que para la COD2,a las
20 horas. S. sclerotiorum alcanzó la fase exponencial de crecimiento a los 13 días de
cultivo.. Posteriormente se encontró que, en contraste a resultados previos, OX32 fue
incapaz de confirmar su capacidad de metabolizar ácido oxálico in vitro. Se evaluó el
efecto de las bacterias en la infección en hojas, y en la germinación de esclerocios y
ascosporas, siendo el aislado COD2 el que resultó más efectivo en todas las
condiciones probadas. Se determinó que la producción de compuestos volátiles por
COD2 es un mecanismo probable de antagonismo contra S. sclerotiorum. En este
trabajo se encontró también que COD2 contiene en su genoma genes relacionados con
la síntesis de los antibióticos fengicina, iturina, bacilisina y dificidina. Además, se
confirmó la identidad de COD2 como B. amyloliquefaciens mediante secuenciación del
gen GyrA. La cepa COD2 tiene potencial para ser utilizada como agente de control
biológico de S. sclerotiorum en campo.
xvi
ABSTRACT In Mexico, common bean (Phaseolus vulgaris L.) is one the most used side dishes in
Mexican cuisine. Various diseases limit the production and quality of this crop, andone
of the its important diseases is white mold, which is caused by S. sclerotiorum (Lib.) de
Bary. A feature of this pathogen is its ability to produce and secrete oxalic acid, which is
considered a virulence factor. The most used strategy for the control of this disease is
the use of chemical products. However, the continous use of these products generates
resistance of the fungus to such fungicides, as well as damages to the environment and
human health. The biological control represents an alternative to the control of the
disease. At the laboratory of microorganism-plant interaction in CIIDIR-SIN, several
bacteria strains have been found, which are capable of inhibiting the mycelial growth of
S. sclerotiorum, such as Pseudomonas sp. (OX32), which shown ability to metabolize
oxalic acid in vitro, B. amyloliquefaciens (COD2), B. subtilis (COD4), and B. subtilis
(BS105). However, the effect of these isolates on detached leaves of common bean,
sclerotia and ascospores of S. sclerotiorum is unknown. The objective of this thesis was
to evaluate antagonistic bacterial strains to the mycelial growth of S. sclerotiorum in
vitro, on sclerotia and ascopores of the fungus, as well as on detached leaves of
common beans, for the selection of the strain that could be considered as a biological
alternative to the control of white mold in common bean. First, the growth profiles of the
bacterial strains and S. sclerotiorum were characterized. For strains OX32, 105 and
COD4, the exponential phase was reached at 10 hours, whereas COD2, at 20 hours. S.
sclerotiorum reached exponential phase at 13 days. Then, and in contrast with previous
observations, OX32 was unable to confirm its ability to metabolize oxalic acid in vitro.
The effect of the bacteria on the infection on common bean leaves, and on germination
of sclerotia and ascospores was evaluated, being the isolate COD2 the one that was
more effective as antagonist to white mold in all the conditions tested. It was also
determined that the production of volatile compounds by COD2 is a probable
mechanism of antagonism against S. sclerotiorum. Additionally, it was found that COD2
contains in its genome genes related to the synthesis of the antibiotics fengycine, iturin,
bacilysin and difficidin. In addition, the identity of COD2 as B. amyloliquefaciens was
confirmed by sequencing of the GyrA gene. The strain COD2 has the potential to be
used as a biological control agent for S. sclerotiorum in the field.
1
1. INTRODUCCIÓN
En México, el frijol (Phaseolus vulgaris L.) es la guarnición más utilizada para
acompañar diferentes platillos. Además, representa una importante fuente de
proteínas, que se cultiva en casi todo el territorio nacional, y es uno de los cultivos
de más producción en el estado de Sinaloa, donde la principal actividad económica
es la agricultura (SIAP-SAGARPA, 2014). Sinaloa cuenta con una superficie
agrícola de 1,626,551 hectáreas, que representan el 28% de su superficie total
(INEGI, 2011). Se considera que en total existen 70 especies del género Phaseolus;
en México estás ascienden a 50, destacando cinco especies que se han
domesticado: P. vulgaris L. (frijol común), P. coccineus L. (frijol ayocote), P. lunatus
L. (frijol comba), P. dumosus (frijol gordo) y P. acutifolius Gray (frijol tepari)
(Sangerman et al., 2010), siendo P. vulgaris L., el de mayor importancia agronómica
y económica. El frijol es una leguminosa anual perteneciente a la familia Fabaceae,
y es uno de los cultivos que más se producen en el estado, del cual en el ciclo
agrícola 2015-2016 se sembraron 64,197.01 hectáreas obteniendo una producción
promedio de 92,255.92 toneladas (SIAP-SAGARPA, 2016).
La producción y calidad de este cultivo se ve limitado por diversas enfermedades
de origen fungoso, bacteriano y viral. Una de las más importantes es el moho blanco
causada por Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary (Bueno et al., 2012). Este hongo
pertenece a la familia Sclerotiniaceae de la clase Ascomycotina (Duncan, 2003).
Sclerotinia sclerotiorum es un hongo fitopatógeno que habita de manera natural en
el suelo. Una de las características de este patógeno es su capacidad de producir y
secretar ácido oxálico, el cual se considera un factor de virulencia (Williams et al.,
2011). Este hongo puede ser devastador para cultivos de importancia económica y
ataca a más de 400 especies de plantas incluyendo a leguminosas, hortalizas,
plantas de ornato e incluso algunas malezas (Boland y Hall, 1994). La estrategia
más utilizada para el control de la enfermedad del moho blanco es el uso de
productos químicos. Aunque esta estrategia es efectiva, el uso prolongado de
productos de origen sintético genera resistencia por parte del hongo a fungicidas,
además de causar daños al medio ambiente y la salud humana. El control biológico
2
también representa una opción en el control de la enfermedad. En diversos estudios
se han encontrado microorganismos con capacidad antagónica a este patógeno
(Boland y Hunter, 1988; Yuen et al., 1994).
En el Laboratorio de Interacción Microorganismo-Planta del CIIDIR-SINALOA
también se han encontrado algunos aislados bacterianos capaces de inhibir el
crecimiento micelial de S. sclerotiorum. Estos aislados son: 1) Pseudomonas sp.,
denominado OX32, con una supuesta capacidad para metabolizar oxalato de calcio
como única fuente de carbono, 2) B. amyloliquefaciens (COD2) y B. subtilis (COD4)
aisladas de esclerocios de S. sclerotiorum, y B. subtilis (BS105) aislado de rizósfera
de tomate (López-Rodríguez, 2010). En el presente trabajo, se probó la capacidad
antagonista de cada una de estas cepas contra diferentes estados infectivos de S.
sclerotiorum: contra micelio en hojas de frijol y directamente sobre la germinación
de esclerocios y ascosporas del hongo. También se determinaron sus perfiles de
crecimiento en cultivo líquido y se realizaron análisis preliminares sobre los
potenciales mecanismos de acción de la bacteria COD2, la cual resultó la más
efectiva.
3
2. ANTECEDENTES
2.1. Frijol (Phaseolus vulgaris)
En México el frijol se considera un producto estratégico en el desarrollo rural y social
del país, ya que representa toda una tradición productiva y de consumo, cumpliendo
diversas funciones tanto de carácter alimentario como para el desarrollo
socioeconómico. Actualmente en el mundo se producen 25.1 millones de toneladas
al año de frijol (FAOSTAT, 2014). Este cultivo se realiza prácticamente en casi todas
las regiones del país y condiciones de suelo y clima. Por lo anterior, el frijol ocupa
el segundo lugar en importancia dentro de la superficie sembrada total a nivel
nacional, sólo después del maíz. México ocupa el quinto lugar a nivel mundial en
producción de frijol, con 969.1 miles de toneladas en promedio anual (FAOSTAT,
2014). Es además, una importante fuente de proteínas para todas aquellas
personas que lo consuman (SIAP, 2014).
El frijol es una leguminosa anual perteneciente a la familia Fabaceae. Se considera
que en total existen 70 especies; en México éstas ascienden a 50, destacan cinco
especies que se han domesticado P. vulgaris L. (frijol común), P. coccineus L. (frijol
ayocote), P. lunatus L. (frijol comba), P. dumosus (frijol gordo) y P. acutifolius Gray
(frijol tepari). (Sangerman et al., 2010). Siendo P. vulgaris L., el de mayor
importancia agronómica y económica.
2.2. Sclerotinia sclerotiorum
Sclerotinia sclerotiorum (lib.) de Bary, es un hongo fitopatógeno perteneciente a la
familia Sclerotiniaceae de la clase Ascomycotina (Duncan, 2003) (Cuadro 1). Habita
de manera natural en el suelo y causa una enfermedad llamada moho blanco, la
cual actualmente es considerada una de las enfermedades más importantes. Una
de las características de este patógeno es su capacidad de producir y secretar ácido
oxálico, el cual se considera un factor de virulencia (Williams et al., 2011). Sclerotinia
sclerotiorum causa daños en un gran número de especies y familias de plantas, por
4
lo que es considerado uno de los hongos patógenos más importantes
económicamente (Boland y Hall, 1994). Este hongo utiliza una estrategia de
infección basada en la acidificación del medio ambiente a través de la producción
de ácido oxálico (Magro et al., 1984). También se ha demostrado que el efecto del
ácido oxálico producido por S. sclerotiorum causa una inhibición de la producción
de peróxido de hidrógeno, el cual es un elemento de señalización en la inducción
de defensa por la planta (Cessna et al., 2000). Además, el ácido oxálico producido
por S. sclerotiorum causa la disminución del pH en el medio, es conocido que la
actividad de algunas hidrolasas fúngicas es óptima a pH ácido (Bueno et al., 2012).
Cuadro 1. Clasificación taxonómica de S. sclerotiorum.
Taxonomía
Reino: Fungi
Filo: Ascomycota
Subdivisión: Leotiomycetes
Clase: Dothideomycetes
Subclase: Leotiomycetidae
Orden: Helotiales
Familia: Sclerotiniaceae
Género: Sclerotinia
Especie: Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, (1884)
5
Entre los cultivos más afectados por este patógeno destacan alfalfa, girasol, tomate,
soya, cacahuate, lechuga, papa, col y principalmente frijol (Kolman y Kelly, 2000).
2.3. Ciclo de vida de S. sclerotiorum
El ciclo de vida de S. sclerotiorum consta de una fase carpogénica y una fase
miceliogénica. En la fase carpogénica, tras un período de acondicionamiento en un
ambiente con temperatura templada (10 a 20 °C) y alta humedad, los esclerocios
originados en el suelo por S. sclerotiorum producen apotecios y éstos a su vez
producen ascosporas. Las ascosporas son liberadas y llevadas por el aire hasta el
tejido vegetal. Las ascosporas de S. sclerotiorum no pueden infectar tejido
vegetativo sano, sino, solamente tejido senescentes. A medida que partes de la
planta infectada mueren y caen al suelo, también caen los esclerocios, donde
pueden sobrevivir hasta por cinco años manteniendo su infectividad. En la fase
miceliogénica, se necesita alta humedad y temperaturas de 12 a 24°C. En esta fase,
el esclerocio germina en el suelo y produce micelio, el cual, si se encuentra contiguo
a una planta, es capaz de infectarla. Esta infección se ve limitada a partes bajas de
la planta, cercanas al suelo (Negrillo et al., 2009).
6
Figura 1. Ciclo de vida de S. sclerotiorum (Negrillo et al., 2009).
2.4. Control de la enfermedad del moho blanco
La estrategia más utilizada para el control de la enfermedad del moho blanco es el
uso de productos químicos. Existen diferentes grupos de fungicidas recomendados
para el control de moho blanco, tal es el caso de los benzimidazoles y las
dicarboximidas. Los tratamientos químicos incluyen los siguientes ingredientes
activos: benomilo, captan, clorotalonil, dicloran, iprodiona, folpet, metil-tiofanato,
tiabendazol, vinclozolina y procimidona. Aunque no se puede negar su efectividad,
el uso prolongado de productos de origen sintético genera resistencia por parte del
7
hongo a fungicidas tales como benomilo, dicloran y procimidona (Porter y Phipps,
1985).
En el marco del control biológico, se han identificado más de 30 especies de hongos
y bacterias como antagonistas y micoparásitos de S. sclerotiorum (Adams y Ayers,
1979; Papavizas, 1985). Diversos autores mencionan el control biológico como
estrategia potencial para el manejo de S. sclerotiorum utilizando Trichoderma spp.
y Coniothyrium minitans (Steadman, 1979; Ferreira y Bolyle, 1992). Aunque muchos
de éstos aislados bacterianos son muy efectivos en experimentos in vitro, al ser
probados en campo no muestran la misma efectividad, en este sentido, estudios
realizados por Yuen et al. (1994) indicaron que es necesario que los aislados
alcancen un número mínimo de unidades formadoras de colonia por mililitro
(UFC/mL) sobre el tejido vegetal para poder ser efectivos contra la enfermedad del
moho blanco.
2.5. Mecanismos de antagonismo bacteriano
Bacterias pertenecientes al género Bacillus son habitualmente consideradas como
promotoras del crecimiento, estas pueden llevar a cabo su actividad promotora del
crecimiento a través de mecanismos directos o indirectos como: la mejora del
estado nutricional de la planta, producción de hormonas vegetales, competencia por
nutrientes y nicho con organismos fitopatógenos, inducción de la respuesta de
defensa sistémica por parte de la planta frente a patógenos, síntesis de enzimas
líticas frente a patógenos, producción de compuestos con actividades antibióticas
como compuestos volátiles orgánicos, fungicidas, péptidos ribosomales, policétidos,
entre otros (Mousa et al., 2015).
2.5.1. Competencia por espacio y nutrientes
La competencia surge cuando al menos dos organismos requieren para su
funcionamiento del mismo alimento. Se considera como principal mecanismo de
acción para la reducción de las poblaciones de patógenos a la competencia por
8
espacio y nutrientes entre microorganismos antagonistas y patógenos (Droby et al.,
1989). Para que los microorganismos puedan competir con éxito contra los
patógenos deben tener mejor adaptación a las diversas condiciones ambientales y
nutricionales presentes donde se desarrollen (El-Ghaouth et al., 2004). Los
microorganismos antagonistas deben tener la capacidad de crecer más
rápidamente que el agente patógeno, incluso deben tener la capacidad de sobrevivir
en condiciones favorables para el mismo (Droby et al., 1989). La competencia por
nutrientes, desempeña un papel importante en la capacidad de control biológico
contra el patógeno. Se ha demostrado a través de estudios in vitro que los
microorganismos antagonistas metabolizan más rápidamente los nutrientes que los
agentes patógenos y al establecerse más rápidamente inhiben el crecimiento de los
patógenos (Sharma et al., 2009).
2.5.2. Producción de antibióticos
La producción de antibióticos es uno de los mecanismos más importantes que
presentan algunos microorganismos antagonistas para suprimir a patógenos. Cada
microorganismo es capaz de producir diferentes tipos de antibióticos. En algunos
microorganismos antagonistas se han descrito la producción de antibióticos como
iturina, fengicina, dificidina, bacilisina y surfactina (Ongena y Jaques, 2007;
Arguelles-Arias et al., 2009; Rahman et al., 2016). Muchos compuestos antibióticos
son policétidos, los cuales son biosintetizados por la polimerización de
subunidades acetilo y propionilo obtenidas por descarboxilación de malonil
coenzima A o metilmalonil coenzima A. Los policétidos son sintetizados por
complejos enzimáticos denominados policétido sintasa, y pueden sufrir muchas
modificaciones, por lo cual es un grupo de compuestos muy diverso (Sattely et al.,
2008; Hertweck, 2009). En el Cuadro 2, se presentan los principales antibióticos
producidos por bacterias del género Bacillus.
9
Cuadro 2. Antibióticos producidos por bacterias del género Bacillus.
Antibiótico Tipo de compuesto Referencia como antagonista
Surfactina Lipopéptido
(surfactante)
Ongena & Jaques, 2007
Iturina Lipopéptido Ongena & Jaques, 2007; Yu et al., 2002
Fengicina Lipopéptido Ongena & Jaques, 2007; Hou et al., 2006;
Zhao et al., 2014
Bacilisina Dipéptido Arguelles-Arias et al., 2009; Zhao et al.,
2014
Bacilibactina Sideróforo de fierro Rahman et al., 2016
Bacillaene Policétido Rahman et al., 2016
Dificidina Policétido Arguelles-Arias et al., 2009; Chen et al.,
2009
2.5.3. Parasitismo directo
Microrganismos antagonistas se unen a las hifas del agente patógeno, causando un
aumento de volumen de sus hifas. Algunos microorganismos antagonistas pueden
infectar las hifas del agente patógeno, volviéndose sus parásitos (El-Ghaouth et al.,
1998) o tienen la capacidad de producir enzimas líticas como glucanasas,
quitinasas, y proteasas ocasionando la degradación de la pared celular de los
hongos fitopatógenos (Castoria et al., 2001).
10
2.5.4. Resistencia inducida en la planta
Algunos microorganismos antagonistas tienen la capacidad de encender
mecanismos de resistencia en las plantas, de tal manera que su acción sobre el
agente patógeno es indirecta, ya que no actúa sobre el mismo, sino sobre la planta
(Choudhary et al., 2009).
2.5.5. Producción de compuestos volátiles orgánicos
Se ha demostrado que algunas bacterias tienen un fuerte efecto antagónico al
crecimiento de algunos hongos fitopatógenos a través de la producción de algunos
compuestos orgánicos volátiles (COVs) (Xu et al., 2004; Zou et al., 2007). Aunque,
la identificación de dichos COVs y el estudio de su actividad antifúngica como
compuestos puros no siempre ha sido siempre posible (Kai et al., 2007; Liu et al.,
2008), ya existen algunos estudios, en los cuales se han identificado los compuestos
volátiles bioactivos (Cuadro 3).
Cuadro 3. Compuestos volátiles orgánicos producidos por bacterias.
Compuesto volátil Referencia
2,3- butanodiol y Acetoína Ryu et al., 2003
2-metil propanoico y 2-metil propanoico García- Juárez et al., 2010
Dimetilhexadecilamina López- Bucio et al., 2010
11
3. JUSTIFICACIÓN
S. sclerotiorum es un patógeno importante en Sinaloa, ya que afecta principalmente
al cultivo de frijol, causando la enfermedad del moho blanco. Este hongo es
principalmente controlado por medios químicos, lo cual no es compatible con una
estrategia de agricultura sustentable. Por esto, en el presente trabajo se propone el
análisis de cuatro aislados bacterianos: B. amyloliquefaciens (COD2) y B. subtilis
(COD4), los cuales fueron aislados de esclerocios, B. subtilis (BS105), aislado de la
rizosfera del tomate y Pseudomonas sp. (OX32), aislado de la rizosfera del frijol,
todos previamente identificados por su capacidad de antagonizar S. sclerotiorum a
nivel de crecimiento micelial, para determinar su capacidad de inhibir la germinación
de esclerocios y ascosporas, además de corroborar su capacidad de inhibir el
crecimiento micelial en hojas de frijol. Siendo el propósito de este trabajo el de
seleccionar la o las bacterias con capacidad de ser utilizadas para el control
biológico del moho blanco en frijol. Todo ésto en un esfuerzo por contribuir a la
sustentabilidad de la actividad agrícola en la región.
12
4. HIPÓTESIS
Al menos una de las cepas evaluadas que muestra antagonismo contra S.
sclerotiorum in vitro, tiene potencial para ser empleada como una alternativa
biológica de control a moho blanco.
13
5. OBJETIVO GENERAL
Evaluar cepas antagonistas al crecimiento micelial de S. sclerotiorum in vitro, sobre
esclerocios y ascosporas del hongo, así como en hojas escindidas de frijol, para la
selección de la cepa que represente una alternativa biológica al control del moho
blanco en frijol.
5.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Caracterizar los perfiles de crecimiento de las bacterias evaluadas y el
patógeno S. sclerotiorum.
2. Evaluar el efecto de las cepas antagonistas en la infección por S. sclerotiorum
en hojas, y en germinación de esclerocios y ascosporas.
3. Determinar si la producción de compuestos volátiles es un mecanismo
potencial de antagonismo al crecimiento micelial de S. scleorotiroum en la
cepa que mostró más efectividad en los ensayos anteriores.
4. Identificar genes biosintéticos relacionados con la síntesis de compuestos
antifúngicos en la cepa seleccionada.
5. Confirmar la identidad de la cepa seleccionada mediante secuenciación del
gen girasa subunidad A (GyrA).
14
6. METODOLOGÍA
6.1. Estrategia general de trabajo
8
Obj. 1 Caracterizar los perfiles de crecimiento de las bacterias evaluadas y el patógeno S. sclerotiorum
Cultivar S. sclerotiorum en medio
líquido. Evaluar crecimiento
Obj. 2. Evaluar el efecto de las bacterias antagonistas en la infección por S. sclerotiorum en hojas, y en germinación de esclerocios y ascosporas.
Obj. 4. Identificar genes biosintéticos relacionados con la síntesis de compuestos antifúngicos en la cepa seleccionada.
Identificar a nivel molecular la presencia de genes biosintéticos en el ADN de la cepa seleccionada.
Cultivar cepas bacterianas en medio
líquido. Evaluar crecimiento
Infectar con S. sclerotiorum hojas de frijol y aplicar cepas
bacterianas para determinar su efecto curativo
Inocular hojas de frijol con cepas bacterianas y
posteriormente infectarlas con S. sclerotiorum, para
determinar su efecto preventivo
Tratar esclerocios de S. sclerotiorum con OX32, COD2,
COD4 y BS105, y cuantificar germinación
Tratar in vitro ascosporas con OX32, COD2, COD4 y BS105,
y cuantificar germinación
Obj. 3. Determinar si la producción de compuestos volátiles es un mecanismo potencial de antagonismo al crecimiento micelial de S. scleorotiroum en la cepa que mostró
más efectividad en los ensayos anteriores.
Cocultivar ambos microorganismos en sistema cerrado, sin tener contacto uno con el otro.
Determinar el crecimiento de S. sclerotiorum
Identificar a nivel molecular la identidad de la cepa seleccionada.
Obj. 5. Confirmar la identidad de la cepa seleccionada mediante secuenciación del gen girasa subunidad A (GyrA).
15
6.2. Cultivo y mantenimiento de las cepas bacterianas
La cepa OX32 se encuentra actualmente criopreservada en medio tripticasa de soya
caldo (TS) con glicerol al 15% (v/v) a -80 ºC. Para su activación, la bacteria se
resembró en cajas Petri con medio TSA y se incubó a 28 °C. Las cepas BS105,
COD2 y COD4 se encuentran actualmente criopreservadas en medio LB con glicerol
al 15% (v/v) a -80 ºC. Para su activación, las bacterias se resembraron en cajas
Petri con medio LB agar y se incubaron a 28 °C.
6.3. Cultivo y mantenimiento de S. sclerotiorum
El cultivo del hongo S. sclerotiorum se inició a partir de esclerocios colectados en
campos de frijol en la región de Guasave. Los esclerocios se desinfectaron en
hipoclorito de sodio al 0.5 % durante un minuto, seguido por un minuto con agua
destilada estéril y secados perfectamente con papel estéril para ser sembrados en
cajas de Petri con PDA (medio papa-dextrosa-agar). Los esclerocios desinfectados
se incubaron a 19 °C para inducir su germinación miceliogénica. Para inducir la
producción de ascosporas, los esclerocios se incubaron a 4 ºC en agua con
aireación por tres semanas y posteriormente fueron sembrados en cajas de Petri
con arena estéril y mantenidos a 19 ºC hasta la producción de apotecios y
ascosporas. Las ascosporas se colectaron colocando un filtro de nylon humedecido
con agua estéril en la tapa superior de la caja de Petri, de tal manera que cuando
los apotecios liberaban las ascosporas, algunas de estas se quedaban adheridas al
filtro de nylon. Las ascosporas se almacenaron a 4 ºC hasta su utilización.
6.4. Perfil de crecimiento de S. sclerotiorum
Para determinar el perfil de crecimiento de S. sclerotiorum, primeramente se sembró
en una caja de Petri con medio PDA un disco de micelio y se dejó crecer por 2-3
días a temperatura ambiente. Posteriormente se tomó un disco de micelio activo de
0.5 mm de la placa, y se colocó en un matraz de 250 mL con un volumen de 50 mL
de medio líquido PD, y se incubó a 100 rpm a 20°C. La cinética se llevó a cabo
16
durante 14 días, muestreando tres matraces cada dos días, a los cuales se les
determinó crecimiento, azúcares reductores y pH.
6.4.1. Determinación de azúcares reductores del medio de S. sclerotiorum (Técnica DNS)
Se preparó DNS (NaOH, tartrato de sodio y potasio, ácido 3,5 dinitrosalicílico),
después de 12 horas de haberse preparado, se tomó cada una de las muestras del
medio donde creció S. sclerotiorum y se realizaron sus respectivas diluciones (1:40
y 1:20). Se tomaron 250 μL de cada dilución y se agregó 250 μL del DNS preparado,
se llevaron a ebullición por 10 minutos y después se pasó a hielo por 5 minutos, se
tomaron 200 μL de la reacción y se midió absorbancia a 570 nm, remplazando el
valor de absorbancia en la ecuación de la línea arrojada por la curva patrón de
glucosa se obtuvo la concentración de azúcares reductores.
6.5. Perfil de crecimiento de las cepas bacterianas
Se realizó una cinética de crecimiento de cada una de las bacterias, primeramente
se sembró en una caja Petri con medio sólido una colonia de cada bacteria, y se
creció por 24 horas a 30°C. Después se tomó de cada placa una colonia y se pasó
a un tubo de ensaye con 10 mL de medio líquido, siendo este el preinóculo y se
incubó por 10 horas a 28°C y 150 rpm. De este cultivo se tomaron 100 μL (1% del
volumen) para incubar 10 mL de medio líquido, siendo éste nuestro inóculo, mismo
que se incubó por 10 horas a 28°C y 200 rpm. De este cultivo se tomaron 500 μL
(1% del volumen) para inocular un matraz de 250 mL con 50 mL de medio líquido y
cultivarse a 28°C y 200 rpm por 48 horas. En estos cultivos se midió DO y UFC/mL
a lo largo del tiempo para determinar la cinética de crecimiento bacteriano.
17
6.6. Perfil de crecimiento y el consumo de ácido oxálico de
Pseudomonas a diferentes concentraciones de ácido oxálico
sintético
Se realizó una cinética de crecimiento de la cepa bacteriana de Pseudomonas
OX32. Se partió de un cultivo sólido de la cepa, del cual se transfirió una asada a
5 mL de medio de cultivo líquido S y se incubó 16 h a 28ºC para obtener un
preinóculo. Posteriormente, se colocó 1 mL del preinóculo en un matraz de 250 mL
con un volumen de 50 mL de medio líquido. Se muestrearon tres matraces (réplicas)
por cada punto de muestreo. El medio de cultivo fue adicionado con distintas
concentraciones de ácido oxálico (0, 10, 25 y 50 mM), y se ajustó el medio a pH de
4, y se incubó a una temperatura de 20°C y 200 rpm. El tiempo de cultivo fue de
seis días y el muestreo se realizó cada ocho horas. Las parámetros medidos de
crecimiento fueron densidad óptica (DO) y unidades formadoras de colonias por
mililitro (UFC/mL). Al medio de cultivo colectado se le determinó el pH.
6.6.1. Perfil de crecimiento de S. sclerotiorum en cocultivo con Pseudomonas (OX32)
A pesar de que la cepa Pseudomonas (OX32) no mostró crecimiento a diferentes
concentraciones de ácido oxálico sintético, decidimos llevar a cabo el experimento
de cocultivo, para investigar si la bacteria OX32 pudiera tomar el ácido oxálico
producido por el hongo S. sclerotiorum y promover su crecimiento. Se preparó
medio Schlegel (medio S) (57.80 g de Na2HPO4 ● 7H2O, 30 g de KH2PO4, 5 g de
NH4Cl, 20 g de MgSO4 ● 7H2O, 1.47 g de CaCl2 ● 2H2O, 0.05 g de NH4Fe citrato,
10 mg de ZnSO4 ● 7H2O, 3 mg de MnCl2 ● 4H2O, 30 mg de H3BO3, 20 mg de CoCl2
● 6H2O, 0.1 mg de CuCl2 ● 2H2O, 2 mg de NiCl2 ● 6H2O, 3 mg de Na2MoO4 ● 2H2O,
llevado a un pH de 7) (Aragno et al., 1992), la descripción de este medio se muestra
en el Anexo 2. Este medio se utilizó debido a que es un medio que no contiene
ninguna fuente de carbono) con glucosa (1% y 0.5% en matraces de 250 mL con
50 mL de medio, y se agregó un disco de micelio activo a cada matraz y 1 mL del
stock al 1%. Estos se incubaron a 100 rpm y 19°C por 13 días para dar oportunidad
18
a que el hongo se desarrollara. Pasados los 13 días se agregó la bacteria OX32 (en
fase exponencial) a la mitad de los matraces, la otra mitad se mantuvo como control.
Se agregó además glucosa del stock al 0.5% al medio para favorecer el crecimiento
de los microorganismos. El tiempo de cultivo fue de siete días y el muestreo se
realizó a los días 0, 3 y 7 de cocultivo. Las variables de respuesta fueron: peso seco
y peso fresco del hongo S. sclerotiorum y unidades formadoras de colonias (UFC)
del cultivo de Pseudomonas. Al medio de cultivo colectado se le determinó el pH.
6.7. Efecto de las cepas bacterianas en la infección por S. sclerotiorum
6.7.1. Efecto de las cepas bacterianas en la infección por S. sclerotiorum
en hojas
En estos experimentos se analizaron dos potenciales efectos de las cepas
bacterianas sobre la enfermedad del moho blanco: el curativo y el preventivo. Para
el curativo se colocaron discos con micelio en activo crecimiento de S. sclerotiorum
a hojas desprendidas de frijol y se incubaron a 19°C por 24 horas para que el
patógeno se estableciera. Posteriormente se agregaron aproximadamente 500 μL
de cada uno de los tratamientos por aspersión (H2O, COD2, COD4, BS105, OX32,
benomilo(0.5%) y se midió el diámetro de lesión cada 12 horas por 36 horas. Para
probar el efecto preventivo se agregó cada uno de los tratamientos en hojas de
frijol. A las 24 h se agregaron discos con micelio activo del hongo S. sclerotiorum, y
se midió el diámetro de lesión cada 12 horas por 36 horas.
6.7.2. Efecto de las cepas bacterianas en la infección por S. sclerotiorum
en esclerocios
Para este experimento obtuvimos primeramente biomasa de cada bacteria en su
fase exponencial: OX32, 105 y COD4 (10 horas de cultivo), y COD2 (20 horas de
cultivo). Los cultivo bacterianos fueron centrifugados a 10,000 rpm, 22°C por 10
minutos, para obtener así pastillas de bacterias, y sus sobrenadantes por separado.
19
Además se usaron dos tratamientos control (agua y benomilo al 0.5%). Las pastillas
fueron resuspendidas en 1 ml de agua destilada estéril. El experimento consistió en
embeber 10 esclerocios por cada tratamiento (biomasas bacterianas resuspendidas
en agua y los sobrenadantes), y se colocaron en recipientes con arena estéril
humedecida con agua destilada estéril. Posteriormente los contenedores se
cubrieron con plástico transparente. Se utilizaron cinco repeticiones por tratamiento.
Los esclerocios se observaron durante 20 días y se registró la cantidad de
esclerocios germinados en cada tratamiento.
6.7.3. Efecto de las cepas bacterianas en la infección por S. sclerotiorum
en ascosporas
Ascosporas de S. sclerotiorum fueron obtenidas de apotecios crecidos sobre
esclerocios de acuerdo a la metodología descrita por (Steadman, 1974). Se
agregaron 20 ascosporas y 1x106 UFC del cultivo bacteriano (de la fase exponencial
correspondiente a cada bacteria) en una caja Petri con medio sólido PDA, esto por
la técnica de extensión en placa. Los cultivos se incubaron a 19°C por 72 horas para
después hacer el conteo de ascosporas germinadas bajo el microscopio
estereoscópico.
6.8. Efecto de los COVs en la inhibición de S. sclerotiorum por B.
amyloliquefaciens (COD2)
Para determinar la existencia de COVs se usó un sistema cerrado, utilizando cajas
de plástico circulares de 9.7 cm de diámetro y 20 cm de altura, con medio PDA. Se
plaquearon 200 μL de medio con B. amyloliquefaciens (COD2) crecida por 40 horas
a 30°C, provenientes de un inóculo obtenido por incubación en 10 mL de medio LB
a una caja Petri, y se incubó por 20 horas a 30°C. Bajo condiciones estériles, la caja
de Petri sin tapa en donde se creció la bacteria, se colocó de manera invertida sobre
el medio PDA de la caja circular, la cual era de dimensiones ligeramente mayores a
las de la caja de Petri. Antes de colocar la caja de Petri invertida, se colocó en el
centro del medio PDA un círculo de agar con micelio de S. sclerotiorum. De esta
20
manera, se formó una cámara semicerrada en donde estaba el micelio del hongo
sobre el medio PDA, y la bacteria estaba en el “techo” de la caja creciendo en medio
PDA. Ambos microorganismos se mantuvieron en la misma cámara pero sin tocarse
físicamente. El sistema fue incubado a 25°C y se tomaron medidas del diámetro de
crecimiento de S. sclerotiorum sobre el medio PDA diariamente.
6.9. Genes biosintéticos de compuestos antifúngicos de B.
amyloliquefaciens (COD2)
DNA genómico del aislado COD2 fue extraído de acuerdo al protocolo del reactivo
DNAzol (Invitrogen, Cat. No. 10342020, Sao Paulo, Brasil). Para conocer si esta
cepa era potencialmente productora de ciertos antibióticos, se utilizaron
oligonucleótido de ocho diferentes genes previamente utilizados como
biomarcadores de estas rutas biosintéticas. Los genes son: iturina (ituA), bacilisina
(bacA), dificidina (dfnM), bacillaene (baeB), bacillibactina (dhbF), fengicina (fenA),
surfactina (sfp, srf) (Harada et al., 2016). Las reacciones de PCR contenían 4.4 μL
de H2O ultrapura, 0.5 μL de MgCl2 (de un stock 50 mM), 1 μL de buffer (de un stock
10X), 1 μL de desoxinucleótidos (dNTPs)(de un stock10 mM), 1 μL de cada uno de
los oligonucleótidos (de un stock 2 μM), 1 μL de DNA y 0.1 μL de Taq polimerasa
(5U/ μL), para un volumen total de reacción de 10 μL. El programa utilizado para los
pares de oligonucleótidos baeB, ituA y fenA fue 95°C por 5 minutos, 30 ciclos de
95°C por 30 segundos, 59°C por 30 segundos, 72°C por 1 minuto, y un paso final
de 72°C por 5 minutos. Se utilizó el mismo programa para las reacciones con los
oligonucleótidos bacA, dfnM, dhbF y srf, pero con una temperatura de anillamiento
de 55°C. Lo mismo para sfp, pero con una temperatura de anillamiento de 46°C.
Los productos de PCR fueron analizados por electroforesis en gel de agarosa al 1%
en buffer TAE, visualizados con bromuro de etidio en un transiluminador con luz UV,
y fotodocumentado. Los productos de PCR fueron purificados mediante el kit de
purificación QIAquick (Qiagen, Cat. No. 28104) y enviados a secuenciar a
LANGEBIO, CINVESTAV Irapuato.
21
6.9.1. Confirmación de la identidad de B. amyloliquefaciens (COD2)
DNA de la bacteria COD2 fue utilizado para llevar a cabo la amplificación del gen
girasa subunidad A con los oligonucleótidos GyrA, y el producto de PCR obtenido
fue purificado y enviado a secuenciar. Una vez obtenida la secuencia, ésta fue
comparada con las secuencias del GeneBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)
utilizando el programa BLAST-N y el algoritmo Megablast.
22
7. RESULTADOS
7.1. Caracterización de los perfiles de crecimiento de las bacterias evaluadas
y el patógeno S. sclerotiorum
7.1.1. Perfil de crecimiento de S. sclerotiorum
Originalmente, uno de los objetivos principales de este trabajo era el de estudiar
la interacción de algunas de las cepas bacterianas potencialmente antagonistas
al fitopatógeno S. sclerotiorum in vitro, particularmente la cepa OX32. Por lo que
se caracterizó el crecimiento de este hongo en dichas condiciones. El
crecimiento de S. sclerotiorum en matraces de 250 mL con 50 mL de medio PD
fue monitoreado durante 23 días. En la figura 2 se puede observar el crecimiento
tanto en biomasa base húmeda como en base seca del microorganismo. A los
12 días se alcanzó la fase estacionaria de crecimiento.
Fig. 2. Perfil de crecimiento en el tiempo de S. sclerotiorum en medio líquido (medio
PD, papa dextrosa). Línea azul: biomasa base húmeda. Línea naranja: biomasa
base seca. Las barras de desviación indican desviación estándar.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 5 10 15 20 25
Bio
masa b
ase s
eca (
g)
Bio
masa b
ase h
úm
ed
a (
g)
Tiempo de incubación (Días)
23
7.1.2. Perfil de consumo de azúcares de S. sclerotiorum en medio líquido
Además del crecimiento, se analizó el perfil de consumo de azúcares de S.
sclerotiorum a lo largo del ciclo de crecimiento. En la figura 3 se observa una
disminución de azúcares, hasta alcanzar aproximadamente 5 g/L a los 13 días y 2
g/L a los 23 días.
Fig. 3. Perfil de consumo de azúcares en el tiempo de S. sclerotiorum en medio
líquido (PD). Línea azul: azúcares reductores. Línea naranja: biomasa base seca.
Las barras de desviación indican desviación estándar.
7.1.3. pH en el perfil de crecimiento de S. sclerotiorum en medio líquido
El pH también fue determinado durante el cultivo de S. sclerotiorum. En la figura 4
se puede observar la relación entre el crecimiento de S. sclerotiorum y el pH del
medio. Hasta los primeros 6 días se observa una disminución del pH hasta cerca de
un valor de 2, pero a partir del día 7 el pH comenzó a incrementarse, a los 24 días
el pH fue de 2.5. De manera interesante, se observó que la estabilización del pH
coincide con la formación de esclerocios en el cultivo.
0
5
10
15
20
25
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 5 10 15 20 25
Azú
care
s r
ed
ucto
res (
g/L
)
Bio
masa b
ase s
eca (
g)
Tiempo de incubación (Días)
24
Fig. 4. Perfil de pH en el tiempo del medio de cultivo durante el crecimiento de S.
sclerotiorum en medio líquido (PD). Línea azul: pH. Línea naranja: biomasa base
seca. Las barras de desviación indican desviación estándar.
7.1.4. Perfil de crecimiento de la bacteria OX32, en presencia y ausencia de
ácido oxálico, oxalato de potasio y glucosa
Al igual que al hongo S. sclerotiorum, se determinó el crecimiento de la bacteria
OX32. En la figura 5 se observa el perfil de crecimiento de la bacteria Pseudomonas
OX32. Su fase exponencial se alcanza a las 10 horas de cultivo.
0
1
2
3
4
5
6
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 5 10 15 20 25
pH
Bio
masa b
ase s
eca (
g)
Tiempo de incubación (Días)
25
Fig. 5. Perfil de crecimiento en el tiempo de Pseudomonas OX32. Línea roja
punteada: fase exponencial de la bacteria. Línea azul: Logaritmo Natural de las
Unidades Formadoras de Colonias (UFC). Línea naranja: Logaritmo Natural de la
densidad óptica.
Ya que la cepa Pseudomonas OX32 fue aislada por su potencial capacidad de
metabolizar oxalato, se decidió medir el efecto en su crecimiento a distintas
concentraciones de oxalato de potasio. En la figura 6 se observa el crecimiento en
densidad óptica de la bacteria Pseudomonas OX32 en medio Schlegel a 0, 1, 10 y
25 mM de oxalato de potasio. Como control se incluyó un tratamiento con medio
tripticasa de soya (TS), el cual es un medio de cultivo completo. En el caso del medio
TS se observó el crecimiento normal de la bacteria, sin embargo, en presencia de
oxalato de potasio el crecimiento se inhibió por todas las concentraciones de oxalato
de potasio probadas, aún a las 150 h de cultivo.
26
Fig. 6. Perfil de crecimiento en el tiempo de Pseudomonas OX32 en diferentes
concentraciones de oxalato de potasio en medio Schelegel (medio S). Línea azul:
Densidad Óptica con 0 mM de oxalato de potasio. Línea naranja: Densidad Óptica
con 1 mM de oxalato de potasio. Línea gris: Densidad Óptica con 10 mM de oxalato
de potasio. Línea amarilla: Densidad Óptica con 25 mM de oxalato de potasio. Línea
verde: Densidad Óptica con medio rico tripticasa de soya (TS).
Se decidió también probar otra fuente de oxalato, por lo que se repitió el
experimento, pero utilizando ácido oxálico. Como se muestra en la figura 7 el
crecimiento tampoco fue capaz de ser inducido por el ácido oxálico.
0.01
0.1
1
10
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Den
sid
ad
óp
tica (
600 n
m)
Tiempo de incubación (horas)
27
Fig. 7. Perfil de crecimiento en el tiempo de Pseudomonas OX32 en diferentes
concentraciones de ácido oxálico en medio Schelegel. Línea azul: Densidad Óptica
con medio rico TS. Línea naranja: Densidad Óptica con 0 mM ácido oxálico. Línea
gris: Densidad Óptica con 1 mM ácido oxálico. Línea amarilla: Densidad Óptica con
10 mM ácido oxálico. Línea verde: Densidad Óptica con 25 mM ácido oxálico.
Debido a los resultados obtenidos, se decidió intentar crecer la bacteria en medio S
con ácido oxálico, pero adicionado con glucosa (10 g/L) El control fue el cultivo en
medio S sin ácido oxálico. En la figura 8 se observa que la bacteria Pseudomonas
OX32 presenta crecimiento en ausencia de ácido oxálico, sin embargo en presencia
de ácido oxálico no se observa crecimiento. Estos resultados indican no solamente
que Pseudomonas OX32 no puede metabolizar ácido oxálico, sino que su
crecimiento se ve inhibido por este compuesto.
0.1
1
10
0 20 40 60 80 100 120 140
Den
sid
ad
Óp
tica (
600 n
m)
Tiempo (horas)
28
Fig. 8. Perfil de crecimiento en el tiempo de Pseudomonas OX32 en medio S
adicionado con glucosa (10 g/L), con y sin ácido oxálico. Línea azul: Densidad
Óptica con 10 mM ácido oxálico. Línea naranja: Densidad Óptica sin ácido
oxálico.
A pesar de los resultados obtenidos, se decidió llevar a cabo el experimento de
cocultivo, esto para explorar la posibilidad de que la bacteria, a pesar de no crecer
en ácido oxálico sintético, pudiera crecer en el medio donde creciera S. sclerotiorum,
con el ácido oxálico producido por el hongo. En la figura 9 se puede observar que
no hay ninguna diferencia en el crecimiento del hongo S. sclerotiorum en presencia
y ausencia de la cepa OX32. La cepa OX32 no tiene ningún efecto en el crecimiento
de S. sclerotiorum.
0.01
0.1
1
0 10 20 30 40 50 60
Den
sid
ad
Op
tica (
600 n
m)
Tiempo de incubación (horas)
29
Fig. 9. Perfil de crecimiento en el tiempo de S. sclerotiorum en presencia y ausencia
de la cepa OX32 en medio S. Línea azul: peso seco de S. sclerotiorum en ausencia
de la cepa OX32. Línea naranja: peso seco de S. sclerotiorum en presencia de la
cepa OX32.
Además de determinar el crecimiento del hongo, se realizó un conteo de UFC para
observar si la Pseudomonas OX32 presentaba algún crecimiento. En la figura 10 se
puede observar que la cepa OX32 muestra un crecimiento mínimo a los tres días
de cultivo, sin embargo, el conteo de UFC regresó a sus niveles basales al día 7 de
cultivo.
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
1 2 3 4 5 6 7 8
Pe
so
se
co
(g
)
Tiempo de incubación (Días)
30
Fig. 10. Perfil de crecimiento en el tiempo de Pseudomonas OX32 en medio
Schlegel en cocultivo con S. sclerotiorum. Línea azul: Unidades Formadoras de
Colonias por mL.
En cuanto a la determinación del pH del experimento de cocultivo se puede observar
que la bacteria Pseudomonas OX32 disminuye el pH del medio de cultivo
posiblemente por la producción de algún ácido orgánico (figura 11).
Fig. 11. Perfil de pH en el tiempo del medio de cultivo durante el cocultivo de S.
sclerotiorum y Pseudomonas OX32 en medio S. Línea azul: pH del medio en
presencia de la cepa OX32. Línea naranja: pH del medio en ausencia de la cepa
OX32.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
1 2 3 4 5 6 7
Bio
masa U
FC
/mL
x 1
0^
6
Tiempo de incubación (Días)
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
0 1 2 3 4 5 6 7 8
pH
Tiempo de incubación (Días)
31
7.1.5. Perfil de crecimiento de COD2, COD4 y BS105
El perfil de crecimiento de las bacterias antagonistas a S. sclerotiorum (COD2,
COD4 y BS105) se realizó con la finalidad de conocer el tiempo al que cada una de
estas bacterias se encuentra en fase exponencial de crecimiento. Esta fase se
caracteriza por una activa duplicación celular, y un consumo máximo de los
nutrientes del medio. En la figura 12 se observa el crecimiento de la bacteria B.
subtilis 105 y en la figura 13 se observa el comportamiento de la bacteria B. subtilis
COD4. Ambas cepas bacterianas se encuentran en su fase exponencial alrededor
de las 10 horas de cultivo. En la figura 14 se muestra el comportamiento de la
bacteria B. amyloliquefaciens COD2. La caracterización de esta cepa no fue posible
mediante la determinación por DO, ya que esta cepa forma conglomerados
celulares al crecer, por lo tanto su crecimiento se caracterizó por UFC. La cepa
COD2 se encuentra en fase exponencial alrededor de las 20 horas de cultivo.
Fig. 12. Perfil de crecimiento en el tiempo de B. subtilis 105. Línea roja punteada:
fase exponencial de la bacteria. Línea azul: Logaritmo Natural de las Unidades
Formadoras de Colonias. Línea naranja: Logaritmo Natural de la densidad óptica.
1
10
100
1000
10000
0.01
0.1
1
10
0 10 20 30 40 50 60
LN B
iom
asa
(UFC
/mL)
Den
sid
ad Ó
pti
ca (
60
0n
m)
Tiempo de incubación (h)
32
Fig. 13. Perfil de crecimiento en el tiempo de B. subtilis COD4. Línea roja punteada:
fase exponencial de la bacteria. Línea azul: Logaritmo Natural de las Unidades
Formadoras de Colonias. Línea naranja: Logaritmo Natural de la densidad óptica.
Fig. 14. Perfil de crecimiento en el tiempo de B. amyloliquefaciens COD2. Línea
roja punteada: fase exponencial de la bacteria. Línea azul: biomasa base húmeda.
Línea naranja: biomasa base seca.
1
10
100
1000
0.01
0.1
1
0 10 20 30 40 50 60
LN B
iom
asa
(UFC
/mL)
Den
sid
ad Ó
pti
ca (
60
0n
m)
Tiempo de incubación (h)
DO UFC
33
7.2. Efecto antagonista a S. sclerotiorum
7.2.1. Efecto antagonista a S. sclerotiorum en hojas
Este experimento se realizó con el fin de determinar el efecto que tienen las cepas
bacterianas en estudio (OX32, COD2, COD4 y BS105) en el desarrollo del moho
blanco causado por S. sclerotiorum en hojas de frijol. Con el objetivo de estudiar el
efecto curativo de las cepas bacterianas, éstas fueron aplicada a hojas de frijol
después de 24 h de haber sido infectadas con micelio de S. sclerotiorum. Por otro
lado, para estudiar el efecto preventivo de las cepas bacterianas, éstas fueron
aplicadas 24 h antes de exponerse el tejido a la infección por el patógeno. El
desarrollo del halo de infección fue monitoreado a lo largo del tiempo en ensayos
de hojas desprendidas. Los resultados se muestran en la figura 15. Se puede
observar que se obtuvieron mejores resultados con el efecto preventivo, lo que
indica que una vez que el hongo empieza su desarrollo es más difícil detenerlo. La
cepa que mostró mejores resultados fue la bacteria COD2. Por otra parte, las
bacterias COD4, OX32 y BS105 mostraron un comportamiento similar al control
agua. Mientras que el fungicida benomilo inhibió de manera importante al hongo, tal
como se esperaba.
34
A
B
Fig. 15. Áreas de lesión en hoja de frijol después de 70 horas de infección con S.
sclerotiorum. A). Efecto curativo de las cepas bacterianas. B) Efecto preventivo de
las cepas bacterianas. Letras diferentes indican diferencias significativas. Barras de
error significan desviación estándar.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
Agua Benomilo OX32 BS105 COD4 COD2
Áre
a d
e l
esió
n (
mm
2)
Tratamientos
a
a
a
c
b
a
0
200
400
600
800
1000
1200
Agua Benomilo OX32 BS105 COD4 COD2
Áre
a d
e l
esió
n (
mm
2)
Tratamientos
c
a
b
35
En la figura 16 se muestra una fotografía con los ensayos de infección realizados
en el experimento para estudiar el efecto preventivo y en la cual se puede observar
que el área de la lesión de S. sclerotiorum en presencia de la bacteria COD2 es
menor que el de las otras bacterias probadas.
H2O
Benomilo
OX32
BS105
COD4
COD2 Fig. 16. Hojas de frijol infectadas con S. sclerotiorum por 70 horas después de haber
sido embebidas en las diferentes suspensiones bacterianas, además del fungicida
benomilo (0.5%) y agua como controles negativo y positivo a la infección,
respectivamente. Ensayo de hoja desprendida con una n=5.
36
7.2.2. Efecto antagonista a S. sclerotiorum en esclerocios
Este experimento se diseñó para determinar el efecto de las bacterias antagonistas
a la germinación de los esclerocios. Para esto, se probaron en un primer
experimento la biomasa celular separada por centrifugación del medio de cultivo en
el que creció y resuspendida en agua de cada una de las cepas, y por separado, los
medios de cultivo de cada cepa bacteriana sin la biomasa celular. Los esclerocios
fueron embebidos tanto en las suspensiones bacterianas como en sus medios de
cultivos y se registró el número de esclerocios germinados a los 20 días. La figura
17 muestra la cinética de germinación de los esclerocios en cada uno de los
tratamientos. Los esclerocios en el tratamiento control con agua fueron los que
germinaron en mayor cantidad y más rápidamente, mientras que los que fueron
tratados con el fungicida benomilo germinaron más lentamente y en menor cantidad.
En los demás tratamientos, los esclerocios presentaron un comportamiento
intermedio entre los controles positivo y negativo. Resalta en particular, el
tratamiento del medio de cultivo de la bacteria COD2, ya que su cinética de
germinación de esclerocios fue muy similar a la del benomilo. En la figura 18, se
comparan únicamente los valores de germinación al día 20. El análisis estadístico
muestra que solamente el tratamiento con el medio de cultivo de la bacteria COD2
mostró una diferencia significativa con el control de agua, siendo igual al control del
fungicida. Esta observación indica que el medio de la bacteria COD2 presenta un
mecanismo que incide en el proceso de germinación del esclerocio, secretando
posiblemente un compuesto antagonista a S. sclerotiorum.
37
Fig. 17. Perfil de Germinación en el tiempo de esclerocios con diferentes
tratamientos de bacterias suspendidas en agua y en sus medios de cultivo. Línea
azul: control agua. Línea naranja: control benomilo. Línea gris: bacteria BS105.
Línea amarilla: bacteria OX32. Línea negra punto azul: bacteria COD2. Línea azul
punto gris: bacteria COD4. Línea verde: Medio de la bacteria BS105. Línea café:
medio de la bacteria OX32. Línea roja punto gris: medio de la bacteria COD2. Línea
verde: medio bacteria COD4.
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Nú
me
ro d
e e
scle
roc
ios g
erm
ina
do
s
Tíempo de incubación (Días)
38
Fig. 18. Germinación de esclerocios con diferentes tratamientos al día 20.
Controles: agua y benomilo al 0.5%(fungicida comercial). Tratamientos con letras
diferentes indican diferencias significativas. ANOVA (programa SAS), prueba de
medias Duncan con un α= 0.05.
Se llevó a cabo un experimento adicional en donde se probaron los cultivos
bacterianos sin separar la biomasa del medio de cultivo y crecidas en su fase
exponencial. En la figura 19 se observan los resultados de este experimento. De
manera similar al experimento anterior, el tratamiento con la bacteria COD2 mostró
el mismo comportamiento de inhibición de la germinación de esclerocios. Los
resultados fueron tratados estadísticamente con un ANOVA en el programa SAS, y
posteriormente con una prueba de medias de Duncan con una α= 0.05.
De manera interesante se observó que para el día 20 todos los tratamientos tenían
apotecios, con la excepción de los tratamientos con benomilo y con la bacteria
COD2.
Tratamientos
Biomasa en agua Sobrenadante
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Nú
mero
de e
scle
rocio
s g
erm
inad
os
a a
a
a
a
a a a
b b
39
Fig. 19. Germinación de esclerocios con diferentes tratamientos (cultivos
bacterianos) al día 20 de cultivo. Controles: agua y benomilo 0.5% (fungicida
comercial). Tratamientos con letras diferentes indican diferencias significativa.
ANOVA (programa SAS), prueba de medias de Duncan con una α= 0.05.
7.2.3. Efecto antagonista a S. sclerotiorum en ascosporas
Este experimento se realizó con el fin de determinar el efecto de las bacterias
antagonistas en la germinación de las ascosporas, para lo cual las ascosporas
fueron cocultivadas en cajas de cultivo con medio PDA junto con las diferentes
cepas bacterianas. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 20.
Las cepas COD4, COD2 y BS105 mostraron un efecto inhibitorio a la germinación
de ascosporas de S. sclerotiorum a nivel in vitro comparados con el control de agua.
La bacteria OX32 no mostró efecto inhibitorio.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Agua COD4 BS105 OX32 COD2 Benomilo
Nú
mero
de e
scle
rocio
s g
erm
inad
os
Tratamientos (cultivos bacterianos)
a a
b
a
c c
40
Fig. 20. Antagonismo bacteriano en ascosporas de S. sclerotiorum. Ascosporas
germinadas después de tratamiento con diferentes cultivos bacterianos y agua
como control. Tratamientos con letras diferentes indican diferencias significativa.
ANOVA (programa SAS), prueba de medias de Duncan con un α= 0.05.
7.3. Identificación de la cepa bacteriana COD2 como B. amyloliquefaciens
Ya que la cepa bacteriana COD2 resultó ser la única efectiva para inhibir la
germinación de esclerocios y ascosporas de S. sclerotiorum y de micelio infectando
hojas, resultó de interés confirmar la identificación de esta cepa bacteriana. COD2
ya había sido tentativamente identificada por la secuenciación del gen 16S
ribosomal como B. amyloliquefaciens. En el presente trabajo se decidió utilizar una
secuencia codificante del gen de la subunidad A de la girasa, para llevar a cabo la
identificación molecular. Para esto se utilizaron los oligonucleótidos gyrA F/gyrA R
y se llevó a cabo una reacción de PCR utilizando DNA genómico de la bacteria
COD2. El fragmento amplificado se muestra en la figura 21.
0
5
10
15
20
25
30
Control OX32 BS105 COD2 COD4
Nú
me
ro d
e a
sco
sp
ora
s g
erm
ina
das
Tratamientos
aa
b
b b
41
Fig. 21. Producto de PCR utilizando los oligonucleótidos GyrAF y GyrAR con DNA genómico como templado. MM, marcadores de peso molecular (escalera 1 kb plus, Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 10787018) Este producto de PCR obtenido fue enviado a secuenciar. La secuencia se presenta
en la figura 22.
5’CCCCGTCATGCATGAGCGTTATCGTATCCCGGGCGCTTCCGGATGTGCGTGACGGTCTGAAGCCGGTTCACAGACGGATT
TTGTACGCAATGAATGATTTAGGCATGACCAGTGACAAACCATATAAAAAATCTGCCCGTATCGTCGGTGAAGTTATCGGT
AAGTACCACCCGCACGGTGACTCAGCGGTTTACGAATCAATGGTCAGAATGGCGCAGGATTTTAACTACCGCTACATGCTT
GTTGACGGACACGGCAACTTCGGGTCGGTTGACGGCGACTCAGCGGCCGCGATGCGTTACACAGAAGCGAGGATGTCAAAA
ATCGCAATGGAAATTCTGCGTGACATTACGAAAGACACGATTGACTATCAAGATAACTATGACGGTTCAGAAAGAGAACCT
GCCGTCATGCCTTCGAGATTTCCGAATCTGCTCGTAAACGGAGCTGCCGGTATTGCGGTCGGAATGGCGACAAATATTCCT
CCGCATCAGCTTGGGGAAGTCATTGAAGGCGTGCTTGCCGTAAGTGAGAATCCTGAGATTACAAACCAGGAGCTGATGGAA
TACATCCCGGGCCCGGATTTTCCGACTGCAGGTCAGATTTTGGGCCGGAGCGGCATCCGCAAGGCATATGAATCCGGACGG
GGATCAATCACAATCCGGGCTAAAGCTGAAATCGAAGAGACATCATCGGGAAAAGAAAGAATTATTGTCACAGAACTTCCT
TATCAGGTGAACAAAGCGAGATTAATTGAAAAAATCGCAGATCTTGTCCGGGACAAAAAATCGAAGGATTACCGATCTGCG
TGACGAATCCGACCGTAACGGATGAGATCGTATGAGATCGCGTGACGCATGCTCACGTCATTTGATACTTTACAACAACGC
CCTGCAGACGTCTTCCGATCACTGCTGCGCTCGTGACGACAGCGAGTACTAGCTGAAGCATGCTAGCGCGTTATTCTTATT
GTTTTATGTGGGGGG3’
Fig. 22. Secuencia del fragmento amplificado por PCR del gen de la subnidad A de
la girasa.
Gyr
A
1000 pb
MM
42
Una vez obtenida la secuencia, ésta fue comparada con las secuencias del
GeneBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) utilizando el programa BLAST-N y el
algoritmo Megablast. La figura 23 muestra las secuencias de mayor homología que
arrojó el análisis. Estos resultados confirman la identidad de la cepa bacteriana
COD2 como Bacillus amyloliquefaciens.
Fig. 23. Resultados del análisis de comparación de secuencias usando el
programa BLAST para la secuencia obtenida del PCR a partir de DNA de la
bacteria COD2 y los oligonucleótidos para el gen GyrA.
7.4. Efecto de los COV en la inhibición de S. sclerotiorum por B.
amyloliquefaciens (COD2)
Existe evidencia en la literatura de que algunas cepas de B. amyloliquefaciens son
capaces de producir compuestos orgánicos volátiles o COVs y que estos
compuestos pueden tener efecto inhibitorio en el crecimiento de algunos
microrganismos (Asari et al., 2016). Por esta razón, en este trabajo se planteó un
experimento para investigar si B. amyloliquefaciens COD2 tiene la capacidad de
producir COV inhibitorios a S. sclerotiorum. Para esto se ideó un sistema en el que
la bacteria compartiría la misma atmósfera que el hongo, pero sin estar en contacto
43
físico. El crecimiento del hongo fue registrado en los sistemas con y sin bacteria por
54 horas y comparados entre sí. Como se observa en la figura 21, el área de
crecimiento de S. sclerotiorum en presencia de B. amyloliquefaciens COD2 es
mucho menor que en su ausencia. En las figuras 24 y 25, podemos observar el
efecto de los compuestos volátiles orgánicos producidos por B. amyloliquefaciens
COD2 sobre el hongo S. sclerotiorum, a las 17 horas después de estar
compartiendo la atmósfera.
Fig. 24. Área de crecimiento de S. sclerotiorum en ausencia (control) y presencia de COD2. ANOVA (programa SAS), análisis de medias por Duncan con un α= 0.05.
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Agua (control) COD2
Dia
me
tro
de
cre
cim
ien
tom
ice
lial
(mm
2)
b
a
44
a)
b)
Fig. 25. Efecto de compuestos volátiles orgánicos sobre el hongo S. sclerotiorum a
las 17 horas de cultivo. a) Sistema empleado, b) parte inferior de sistema mostrando
el crecimiento del hongo. Los círculos rojos corresponden al borde de crecimiento
del hongo.
7.5. Genes biosintéticos de compuestos antifúngicos de B. amyloliquefaciens
COD2.
Existen reportes en la literatura en los que se describe la capacidad de algunas cepa
de B. amyloliquefaciens para producir algunos metabolitos con capacidad
antibiótica, lo cual podría explicar en parte su capacidad antagonista a
microorganismos patógenos (Ongena y Jaques, 2007; Arguelles-Arias et al., 2009;
Rahman et al., 2016). Con base en esta literatura, se investigó si la cepa B.
amyloliquefaciens COD2 contenía en su genoma la presencia de genes
biosintéticos de los compuestos antibióticos bacillaene, fengicina, iturina, bacilisina,
dificidina, bacilbactina, surfactina A y surfactina B. Esto se hizo por PCR utilizando
Sclerotinia
Bacteria antagonista
45
olinucleótidos específicos para genes marcadores de las rutas biosintéticas de cada
uno de estos compuestos (Asari et al., 2016) utilizando DNA genómico aislado de
B. amyloliquefaciens COD2 como templado. En la figura 26 se presentan los
productos de PCR de cada una de estas reacciones. De acuerdo a estos resultados,
los genes biosintéticos presentes en B. amyloliquefaciens COD2, pertenecen a las
rutas de síntesis de fengicina, iturina, bacilisina y dificidina.
Fig. 26. Productos de PCR de genes biosintéticos involucrados en las rutas de
síntesis de los diferentes antibióticos. MM, marcadores de peso molecular, 1 kb plus,
invitrogen).
Los productos de PCR de genes biosintéticos de B. amyloliquefaciens fueron
secuenciados, para posteriormente hacer un análisis BLAST. Los resultados se
muestran en la figura 27. Las secuencias de cada producto de PCR se presentan
en el Anexo 1.
2000
pb1500
pb
1500
pb
1800
pb
46
Fig. 27. Porcentajes de identidad de cada uno de las secuencias de los productos
de PCR obtenidos, confirmaron su identidad como genes biosintéticos de los
diferentes antibióticos.
47
8. DISCUSIÓN
La caracterización del perfil de crecimiento del patógeno S. sclerotiorum permitió
obtener más información acerca de este hongo fitopatógeno. En este trabajo se
logró describir el perfil de crecimiento del hongo en medio líquido con agitación. El
crecimiento de S. sclerotiorum ya ha sido descrito por otros investigadores, aunque
en dichos experimentos, los cultivos se llevaron a cabo en estado estacionario
(Wang et al., 1971). Estos autores midieron también los azúcares reductores, con
el objeto de comprobar que el hongo estaba consumiendo la glucosa del medio de
cultivo. También describieron el perfil de pH, e interpretaron la disminución del
mismo como indicador de la producción de ácido oxálico. El ácido oxálico es un
factor de virulencia de este hongo. Mutantes de S. sclerotiorum incapaces de
producir ácido oxálico, son inefectivos para causar infecciones (Godoy et al., 1990;
Williams et al., 2011). La disminución en el pH a lo largo del cultivo de S.
sclerotiorum observado en el presente trabajo (figura 4), es coincidente con los
trabajos previamente reportados. Aunque en la presente tesis no se determinó ácido
oxálico, suponemos que la disminución del pH es una indicación de que S.
sclerotiorum produjo ácido oxálico.
La cepa OX32 (Pseudomonas sp.) fue seleccionada anteriormente en el laboratorio
de Interacción Microorganismo-Planta a partir de la rizósfera de frijol (López-
Rodríguez, 2010) por su aparente capacidad de consumir ácido oxálico. Esta cepa,
al cultivarse en medio Schlegel (Schoonbeek et al., 2007), el cual presenta una
apariencia turbia por contener oxalato de calcio insoluble como única fuente de
carbono, fue capaz de crecer y formar un halo clarificado rodeando a la bacteria, lo
cual se interpretó como que esta cepa tiene la capacidad para metabolizar oxalato
de calcio insoluble (López-Rodríguez, 2010).
La cepa OX32 fue entonces seleccionada para llevar a cabo ensayos de interacción
con el hongo S. sclerotiorum in vitro, por lo que se estudió su perfil de crecimiento
tanto en medio rico como en medio S. Con el objetivo de tener información sobre el
efecto del oxalato sintético sobre el crecimiento de OX32, se cultivó la bacteria en
48
medio S con diferentes concentraciones de ácido oxálico con la hipótesis de que a
mayor concentración de oxalato en el medio, mayor crecimiento bacteriano. Sin
embargo, y de manera sorpresiva, éste no fue el caso, y al contrario, los resultados
obtenidos indican que el oxalato de calcio y el ácido oxálico no solamente no
inducen el crecimiento de la OX32, sino que lo inhiben.
A pesar de esto se decidió llevar a cabo el experimento de cocultivo de S.
sclerotiorum y OX32, observándose de nuevo que la OX32 no podía metabolizar
ácido oxálico.
Ante estos resultados, se repitió el experimento inicial de López-Rodríguez (2010)
en el que se cultivaba la bacteria en medio S con agar para observar su crecimiento
y la formación del halo de solubilización de oxalato. Sin embargo, el resultado fue
negativo. Ya que la bacteria OX32 estuvo en estado de criopreservación por varios
años, se sospecha que de alguna manera, la capacidad para metabolizar oxalato,
se perdió, quizás por mutación de la cepa. El hecho de que bacterias puedan ser
afectadas cuando son almacenadas por largo tiempo aún bajo condiciones de
congelación y posteriormente reactivadas ya ha sido reportado con anterioridad
(Simione, 1992).
Debido a estos resultados se decidió tomar en cuenta a otras bacterias del género
Bacillus que mostraron antagonismo contra micelio de S. sclerotiorum in vitro. Estas
fueron COD2 (tentativamente identificada como B. amyloliquefaciens), COD4 (B.
subtilis), BS105 (B. subtilis). El perfil de crecimiento de estas cepas fue también
analizado mediante el monitoreo de UFC y DO (excepto para COD2) y se determinó
que los cultivos BS105 y COD4 se encontraban en fase exponencial a las 10 h,
mientras que COD2 a las 20 h de cultivo. De manera interesante, la cepa COD2
creció en conglomerados, y su crecimiento no pudo medirse por UFC y OD, por lo
que se realizó por peso seco y peso fresco.
Una vez caracterizado el crecimiento de las cepas bacterianas, se procedió a
probar su antagonismo ante el hongo S. sclerotiorum, tanto contra micelio
infectando hojas de frijol en ensayos de hoja desprendida (Mora-Romero et al.,
2015), como en la germinación de esclerocios y ascosporas. El ensayo en hoja
49
desprendida se realizó de dos maneras, el primero fue llamado efecto correctivo, en
este se colocó primero el hongo y se dejó establecer para después colocar las
bacterias y observar si estas tenían algún efecto sobre el hongo S.sclerotiorum, el
segundo fue llamado efecto preventivo, en este primero se colocaron las bacterias
y se dejaron establecer para después agregar el hongo y ver el efecto, en cuanto a
estos ensayos se obtuvieron mejores resultados por parte del efecto preventivo, en
particular con la bacteria COD2. Esto indica que la utilización de estos
microogranismos antagonistas podría ser efectiva aplicándose de manera
preventivas, es decir, antes de que las condiciones sean propicias para el desarrollo
de la enfermedad en el cultivo. Se ha descrito que S. sclerotiorum se ve favorecido
en campo cuando las temperaturas ambientales oscilan entre 12 y 20°C y las
humedades son altas y por periodos prolongados (Steadman, 1983).
Los esclerocios de S. sclerotiorum son estructuras de resistencia cruciales en la
efectividad de este patógeno porque pueden permanecer viables en el suelo por
varios años y porque forman estructuras productoras de ascosporas, las cuales
tienen una capacidad amplia de dispersión e infección (Steadman, 1983). Por lo
tanto, lograr inhibir la germinación de esclerocios es una estrategia que pudiera
resultar efectiva para el control de este patógeno. El hongo C. minitans, es la base
de un fungicida biológico dirigido a inhibir la germinación de esclerocios en campo
(Zeng et al., 2012). Sin embargo, este agente de biocontrol es efectivo en zonas
templadas. Por lo tanto es deseable contar con agentes efectivos en ambientes más
cálidos como los de Sinaloa. Lo anterior dio pauta a evaluar las cepas bacterianas
en cuanto a su efectividad para inhibir la germinación de esclerocios.
Los resultados muestran que una de las cepas probadas (COD2), fue efectiva para
inhibir la germinación de esclerocios, preferentemente cuando se utilizó el
sobrenadante (figura 18), y cuando se aplicó el cultivo bacteriano completo (figura
19), a niveles similares que el fungicida sintético utilizado como control. Esto sugiere
que compuestos secretados al medio de cultivo son los responsables de causar la
inhibición al crecimiento del hongo. Existe bastante evidencia en la literatura de que
antibióticos secretados por cepas bacterianas al medio cultivo son responsables del
50
efecto antagonista (Ongena y Jaques, 2007; Arguelles-Arias et al., 2009; Harada et
al., 2016; Rahman et al., 2016; Asari et al., 2016, entre otros).
Las ascosporas son la principal forma de dispersión de S. sclerotiorum. Su blanco
de infección principal son las flores, ya que las ascosporas solamente pueden
germinar en tejidos senescentes, tales como flores dehiscentes. Una posible
aplicación de una cepa efectiva para inhibir la germinación de ascosporas, sería la
aspersión de una formulación biotecnológica en flores, lo cual detendría el ataque
por el patógeno. Esta estrategia ya ha sido vislumbrada con anterioridad por
Fernando et al. (2007), en donde se identificó una cepa de Pseudomonas
chlororaphis para inhibir el desarrollo de la enfermedad en flores de canola.
En el presente trabajo se ideó y estableció un sistema in vitro para probar el efecto
de las cepas bacterianas sobre la germinación de las ascosporas. Una alícuota del
cultivo bacteriano fue co-cultivada con ascosporas de S. sclerotiorum en medio de
PDA adicionado con un indicador de pH para visualizar más fácilmente la
germinación de las ascosporas con la consiguiente producción de ácido oxálico, la
acidificación del medio y el vire del color morado a amarillo por el cambio de pH
(Peres et al., 2002). De manera interesante, tres de las cepas bacterianas probadas
resultaron efectivas contra la germinación de ascosporas, BS105, COD4 y COD2.
De estas, solamente la COD2 fue efectiva contra la germinación de esclerocios, lo
que indica que las ascosporas son estructuras más susceptibles a la acción de
antagonistas bacterianos. Esta característica puede ser importante al momento de
decidir el blanco del fungicida biológico a utilizar.
Ya que la cepa COD2 fue efectiva en todas las condiciones probadas, partir de aquí
se decidió trabajar exclusivamente con esta cepa. La identificación molecular
confirmó que la bacteria COD2 es de la especie B. amyloliquefaciens.
Ha sido reportado con anterioridad que este especie de Bacillus es capaz de
producir no solo antibióticos solubles (Harada et al., 2016), sino también
51
compuestos volátiles orgánicos, los cuales no solo fueron efectivos contra S.
sclerotiorum, sino también contra otros patógenos (Asari et al., 2016).
Utilizando un sistema cerrado en donde la bacteria COD2 y el hongo Sclerotinia
compartían una misma atmósfera, pero no tenían contacto físico ni un medio sólido
en el cual pudiera haber difusión de compuestos solubles, se observó la inhibición
del crecimiento del hongo. Esto indica que la COD2 es capaz de inhibir al hongo
mediante la producción de compuestos volátiles de manera muy efectiva. Esta
característica de COD2 es posible que sea una de las razones por las que esta cepa
es tan efectiva contra S. sclerotiorum. En otros trabajos se ha reportado la
producción de compuestos volátiles orgánicos como 2,3-butanodiol, 3-hidroxi-2-
butanona, 2-metil propanoico, 3-metil butanol (Amavizca-Valdez, 2014), acetoína
(Meng, 2014) y dimetilhexadecilamina (López-Bucio, 2010) con capacidad de inhibir
el crecimiento de microorganismos. Aunque en el presente trabajo no se
identificaron químicamente los compuestos volátiles producidos por COD2, el hecho
de reconocer su existencia es importante para considerarlo como una característica
más de esta bacteria como antagonista.
Además de producir compuestos volátiles orgánicos, ha sido reportado que la
especie B. amyloliquefaciens produce diferentes tipos de antibióticos (Ongena y
Jaques, 2007; Arguelles-Arias et al., 2009; Rahman et al., 2016). Además de la
purificación química convencional, una estrategia utilizada para investigar qué
antibióticos puede producir un microorganismo, es la detección de genes
involucrados en la síntesis de dichos compuestos. Rahman y colaboradores en 2016
diseñaron oligonucleótidos para la amplificación de genes biosintéticos para ocho
antibióticos distintos. En el presente trabajo, se demostró que cuatro de esos genes
están presentes en el genoma de B. amyloliquefaciens (COD2), lo cual indica que
es muy probable que estos antibióticos (fengicina, iturina, bacilicina y dificidina)
estén siendo producidos por esta cepa bacteriana. Las secuencias amplificadas
fueron secuenciadas y en todos los casos, la secuencia resultó arriba del 97%
homóloga con la secuencia del gen biosintético esperado.
En este trabajo demostramos que la cepa B. amyloliquefaciens COD2 posee al
menos dos mecanismos de inhibición de S. sclerotiorum: la producción de
52
antibióticos, posiblemente fengicina, iturina, bacilicina y/o dificidina, así como de
compuestos volátiles, lo cual la hace efectiva para inhibir el crecimiento de micelio
infectivo en hojas de frijol, y la germinación de las estructuras fúngicas de
esclerocios y ascosporas. Por lo tanto, la cepa de B. amyloliquefaciens COD2 tiene
potencial de ser utilizada biotecnológicamente como antagonista al hongo
fitopatógeno S. sclerotiorum y en particular al desarrollo de la enfermedad del moho
blanco en frijol.
53
9. CONCLUSIONES
La cepa OX32, fue incapaz de confirmar su capacidad de metabolizar acido oxálico
in vitro, por lo que fue descartado para utilizarse como alternativa para el control
biológico de este hongo fitopatógeno. Es posible que dicha característica se haya
perdido debido a los años que se mantuvo en congelación.
La cepa COD2 mostró inhibición de crecimiento micelial en hojas de frijol,
germinación de esclerocios y germinación de ascosporas de S. sclerotiorum,
resultando el aislado más efectivo contra este patógeno de los analizados.
La cepa COD2 mostró capacidad de producir compuestos orgánicos volátiles con
actividad inhibitoria al crecimiento micelial de S. sclerotiorum in vitro.
La cepa COD2 contiene en su genoma genes relacionados con la síntesis de los
antibióticos fengicina, iturina, bacilisina y dificidina, los cuales podrían estar
contribuyendo al antagonismo presentado.
La identificación preliminar del aislado COD2 como B. amyloliquefaciens fue
confirmado mediante la secuenciación del gen girasa subunidad A (GyrA).
La cepa de B. amyloliquefaciens aislado COD2 tiene potencial para ser utilizada
como agente de control biológico de S. sclerotiorum en campo.
54
10. RECOMENDACIONES Y SUGERENCIAS
Buscar otras bacterias que puedan metabolizar ácido oxálico, para poder
explorar la estrategia de control sobre S. sclerotiorum.
Optimizar las condiciones de crecimiento de la cepa COD2 para su mejor
aplicación biotecnológica.
Probar el efecto de la cepa COD2 en la germinación de ascosporas sobre
tejido floral.
Realizar ensayos COD2 en suelos con esclerocios bajo condiciones de
campo.
Investigar la naturaleza química de los compuestos volátiles orgánicos
producidos por la cepa COD2.
Investigar la naturaleza química de los antibióticos producidos por la cepa
COD2.
Probar la efectividad de la cepa COD2 para reducir la incidencia y severidad
del moho blanco en frijol a nivel de campo.
55
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60
ANEXOS Anexo 1
Secuencias obtenidas a partir de los productos de PCR
1. BacA (Bacilisina)
Oligonucleótido BacA F 5´CTAGACCATTGTAGCGCGATGTCGGACAACCGTCCTTCACTCTTTTCGCGGCTGCGCTC
GTTGAGTTCACCAGATCAAACGTGACATCTTTACGGGTAAAATACTTAATCAAATTGATAG
GAGACGGGTGGGATACGATGACAGCCTGTTCAAGCATGTCATCCGTATATTCAAAACCGGG
CCGGACAGCCAGGCCGTACATCGGGGTGTCGCACCTGAAAATTTGCAGAAGCTGCAGATCC
GGTCTCATGTAGAAGTGCTTAATGCCGTCATACGCGTGAGGCACAATTGTGTATTCCAGCG
GACTTTGAAGCGTTTTTTCAATGCACGATTCAAATGTATCATGCAGTGATAATTTGCTGTT
CACCCCTTGGAGAAGGGTAAAATTGGTGATGAAGTTTTTTGCTGCGTACTCACTGCTTGTC
CCTTCAGGACCGAGCGTGTTGATCGTAATCAGTTTAGATATTGAATAAGCCTTGCTTTTCG
TTTGAATGCTATTATCCAATATAATCATGAGCACCAACCAATCTGTTAAATTTTAAGTAAA
TATTATCCATAGACGTTCAAGCTGTCAATATTATTTGAAAATATTGATAATTATTCCTATA
TATTAGAAAACACCTTAAAATATAAGGTGTTAAAATTAACATTTACAAAATTATAGAAACT
TTATTTTACCGATACAATGATTGGTCGGCCTGATGCTCATATTTCCCATACCTTCTGTATG
CGAAAACGCTGAAGACAAAGCCGATGAGGGTGACGGCCGCACAGATAAATCCGACAGCTGC
ATATCCGTATCCGACATAGACCGGACCCATGACAGCAGAACCCAAGTGACGGCCAAATTGG
ACGCCAGACTGTAAATGCCATGATTTGCCCGGCGGCTCTGTGAGCATCACTTAAAATGTGC
TGAGCAGTCACGTCAGCTTGCATCATCCCAGACGATACCCGATGACAAAACGCATGATGAC
GCGCATAGCCAGACAGAAGGCATATGCTGATCACGCATGCGCGATCAGAGCGCATTCCCGC
TTATCTGCGATTTCGGTGAACCGCTCATGAATCGAATCGTAACATGATCAGATCTGACCGC
GCGAGTTTTTATTATACACC 3´
Oligonucleótido BacA R 5´AGGTTTTTTGAGATCGTGCGAAGTCGGAGTCGGTTTTTCCATGAGCGTGTTCACCGGAA
AAATCGCAGATAAGGCGGGGAAAATGCGCTCTTTGATCGCGGCATTGGCCGTGATCAGCAT
ATGGCTTTCCTGTCTCGCCTATGCGCCGTCATCAATGCCGTTTTTGGTCATCGGGTTATTC
GTCTGGGGATTGATGCAAAGCCTGACGGTGACCTTGCTCAGCACCATTTTAAGTGATTGCT
CACAGAGCCGCCGGGGCAAAATCATGGCATTTTACAGTCTGGCGTCCAATTTGGCCGTCAC
CTTGGGTTCTGCTGTCATGGGTCCGGTCTATGTCGGATACGGATATGCAGCTGTCGGATTT
ATCTGTGCGGCCGTCACCCTCATCGGCTTTGTCTTCAGCGTTTTCGCATACAGAAGGTATG
GGAAATATGAGCATCAGGCCGACCAATCATTGTATCGGTAAAATAAAGTTTCTATAATTTT
GTAAATGTTAATTTTAACACCTTATATTTTAAGGTGTTTTCTAATATATAGGAATAATTAT
CAATATTTTCAAATAATATTGACAGCTTGAACGTCTATGGATAATATTTACTTAAAATTTA
ACAGATTGGTTGGTGCTCATGATTATATTGGATAATAGCATTCAAACGAAAAGCAAGGCTT
ATTCAATATCTAAACTGATTACGATCAACACGCTCGGTCCTGAAGGGACAAGCAGTGAGTA
CGCAGCAAAAAACTTCATCACCAATTTTACCCTTCTCCAAGGGGTGAACAGCAAATTATCA
61
CTGCATGATACATTTGAATCGTGCATTGAAAAAACGCTTCAAAGTCCGCTGGAATACACAA
TTGTGCCTCACGCGTATGACGGCATTAAGCACTTCTACATGAGACCGGATCTGCAGCTTCT
GCAAATTTTCAGTGCGACACCCGATGTACGGCCTGGCTGTCCGGCCCGGTTTGAATATACG
GATGACATGCTTGACAGCTGTCATCGTATCCCACCCGTCTCTATCATTTGATAGTATTTTA
CCGTAAGATGTCACGTTTGATCTGGTGACTCACGAGCGCCAGCCGCGAAAAGAGTGAGACG
TTGTCCGACTCGCGCTGACATTGACTGCGAAAGACAAGAGACTTTCAATAATAAAACGACG
AAGCGTGCCGTGATTCACCTACAAAACACCAGAT 3´
2. DfnM (Dificidina)
Oligonucleótido DfnM F 5´GTAACTTTTAGCATACCGACATTCTCGTTCTCGCCTTTAAACCGAAAGATGCGGCAGAA
AGCATTGAGAACATTCGCGAATACGTGAAAGATCAGCTTGTGATTTCTGTCATCGCAGGGC
TGACGATTCACACGATTCAGCAATATTTCGGCAGAAAGCTCACCATCATCCGGGCGATGCC
GAATACATCCGCGGCCATTCAGCAATCGGCGACCGGTTTTTCCGCAAGCTCCGAGGCGAGT
GAAGCTGAAATCCGGACGGCAAAAGAGCTTCTGGAAACAATCGGAGAAGCGACGCGCTTTG
AAGAAAAACACCTTGACGCCGTCACAGCCATTGCCGGAAGCGGTCCCGCCTATGTGTACCG
GTATGTCGAAGCAATGGAAAAGGCCGCCCTTCAAGCCGGCCTGCCGGAAGAAACGGCAAAA
GAGCTGATTTTACAAACCATGGCCGGGGCGACGGAAATGCTCAGAACAAGCAGCAAACGGC
CTGAACGCCTGCGCAAGGAAATCACAAGCCCGGGCGGCACGACTGAAGCAGGCCTTCGCGC
ATTAGAAGAGCGCCGCTTTGAAGAAGCCATCATGCACTGCATCGCAGAAACCGCAGCCCGG
AGCGCCGAAATTAAAAAACAATTCGCAGGCTCCGTTCTGCAAAAGACGGACCAGTGATAAA
GCATGGGGCTTCCCATGCTTTTTTCATTCTGTTTAACTGCCGTATAAGCGGCTGATTCTCT
CTTTTACTTCAGGAAGATGGAATGTGGCTTCGTGCATGTTCACCTCTTCCTCAACCGCTTT
TGTCAGCTCTCTTTTGATCCGTGCGGTCACATTGGTTTTCAGCGCAACCAGTGAGGCTCTC
GGTTTATCCGCCAGCAGCCGGGCTAATTCGCGGCCTCTTTGAAGGACGTCTTTTTCGGCAG
CACTTCAAACGGAACTCCCGTTTTCCAGAGCGGCGCGCTGAAGTTCGCGGCGTAACAGCAT
TTCTTCCCGAGACATCCCAGTTTTCAGCACAATATACGTCGCGCCATCCCGTGTAAATCGT
ACTCCATATATACAAGATAAAACTCTCTCTGCTAAATCACGGATTCGGCTCAACGGATGTA
AAGCGGTTCGATCGCATGCCTTGCATGGCGAATTCACGATACTGATCATAAGACTGGATCT
ATGATGGACATGCTGCCGACTCTCAAGTCGATGTA 3´
Oligonucleótido DfnM F R 5´AGGGGTCGGATTAGCTTCACAGTCTTTTATTGGATTGCAGGATTCCCGTGATTTCTGCC
ATGCAGGGGCATGCGATCGGAGCCGGCTTTACAATCGGTCTGAGCTCGGATTTCGTGATTT
TAAGCAGAGAGAGTTTTTATTCTTGTAATTATATGAAGTACGGATTTACACCGGGAATGGG
CGCGACGTATATTGTGCCTGAAAAACTGGGAATTGTCCTCGGGGAAGAAATGCTGTTTACG
GCCGCGAATTTCAGCGGCGCCGCTCTGGAAAAACGGGGAGTTCCGTTTGAAGTGCTGCCGA
AAAAAGACGTCCTTCAAAGAGGCCGCGAATTAGCCCGGCTGCTGGCGGATAAACCGAGAGC
CTCACTGGTTGCGCTGAAAACCAATGTGACCGCACGGATCAAAAGAGAGCTGACAAAAGCG
GTTGAGGAAGAGGTGAACATGCACGAAGCCACATTCCATCTTCCTGAAGTAAAAGAGAGAA
TCAGCCGCTTATACGGCAGTTAAACAGAATGAAAAAAGCATGGGAAGCCCCATGCTTTATC
ACTGGTCCGTCTTTTGCAGAACGGAGCCTGCGAATTGTTTTTTAATTTCGGCGCTCCGGGC
TGCGGTTTCTGCGATGCAGTGCATGATGGCTTCTTCAAAGCGGCGCTCTTCTAATGCGCGA
62
AGGCCTGCTTCAGTCGTGCCGCCCGGGCTTGTGATTTCCTTGCGCAGGCGTTCAGGCCGTT
TGCTGCTTGTTCTGAGCATTTCCGTCGCCCCGGCCATGGTTTGTAAAATCAGCTCTTTTGC
CGTTTCTTCCGGCAGGCCGGCTTGAAGGGCGGCCTTTTCCATTGCTTCGACATACCGGGTA
CACATAGGCGGGACCGCTTCCGGCAATGGCTGTGACGGCGTCAGGTGTTTTTCTTCAAGCG
CGTCGCTTCTCCGATTGTTTCCAGAAGCTCTTTTTGCCGTCCGGATTTCAGCTTCACTCGC
TCGGAGCTTGCGAAAAACGGTCGCGATGCTGAATGGCCGCGATGTATCGGCATCGCCGGAT
GATGGTGAGCTTTCTGCGAAATATGCTGATCGTGTGATTCGTCAGCCTGCGATGACGGAAT
CCAGCCTGAATCTTTCACGTATTCGCCGATTTTTCTCATGCCTTCTGCGCGTACTTTCGGT
TAGCGAACAGGAATGTCGAATCAGCTGAAACTCCTCTTATCTGA 3´
3. FenA (Fengicina)
Oligonucleótido FenA F 5´ACGGTCCTGAGCTGATGCGAGCAGGTTGAGCGAGATGCCGTCCATGATAATATGGTGAA
ATTTTGAATAAAGCCAAACTTCTTCGTCTGACATGACAAGCAGAGTAAATTGATACAGAGG
TGAATGAAACAGCTTGAACGGAACACGGGTCTGCGTGTCAATCCATGCGTCCCGCTCTGCC
TGATCAGTATGAGTAAAATCAACAGTCTCTAGAGAAATCGGCCGATGCCCCGCCAGATACA
GCTGGGGTTCTGATCCGTCCCCTTCTGTCAGTTGAAACCTGAGCGAATCATTTTGCGAGAT
AGAAAAATCTAAAGCATGGCGCAGTACGTCAAAATCGATGTCCCCCCTGAATTTGACGCAT
GCCGCGAGATTGCAGATACTTGTGCCCGGTTCGAGCAGCTCCGTAAACCACACTCTTCTTT
GTGCGTGAGTTAAAGAATAAACAGTGTTCTCCAATGGAATCCCTCCGCTTCAATTTAAGAG
GATAAGAAAGTGAAATAATTACAATTAAATTTCGACAGCATATGACTTAATCATCCATATA
AGCATTATTTTAAAACATATTTTAGAAATCACAATAAAAAATTAAATTTTCTCTAACATTT
TTTAGAATATAGTATATATTCCTCACTTCACTTCTTCATTTCTATAATCTTTATACCATGT
AAAACGGTATGTATGCATACTATAAACTGGTTCTTAAACACTATAATAAGGAATAAAATGT
ATAATTAATTGCGCTTTTAAAAAGGTTTTCCTCCCGAAAAGAAGTTTTATGTTAAAAAATG
AATAATCGGTGAACATGTAAGAAAGCGGTATGTAAAAAAAAGGAAGGGTATTGACGATATT
ACTTTTTGAAAAGATTGATTCATAATCGCAATATAATGTTTTACAGACATCAAAAAAGCCG
AATCCTCTAGGATTCGGCCCTTCTTATTGATTTGCCAGCACGACTGCGATTTTGTCTTCAT
GTCTTTTCCGTCATCTCGTCAGCAGCCCGTTTTGAGCACGAAAAATAGCGTATTCTCTGTT
TTTGTGTCTGCATAGCCGGCATCGACCTGACTGATGGTAGTGACCCGATTTCGCTTAATTT
GCTTCTGGCCGGCATCTTCAGCGATTCGAGGATTCTCCGTCAATTCTGTGCATGGACGGGC
ACGAGACACGTATGTAGCCGATTACACACACTTTCTTTCG 3´
Oligonucleótido FenA R 5´TCCTATAGGCACATACCTGCCGGCTCGGCACAGGCGAGAGAATTGGGCGGCAGTGTGGG
ATCCGTCGTCCTATGCTTTAGATTTATGGAAACAAGCGCTTACTAAACAGGGTATAACTGT
AAAAGGGAAAATCAGAACAGGGCGAATGCCGCACCGCACCCAGCTCGTCACATCACGGACA
TCCATGCCTCTTTCAGAATTATTGATCCCGTTTATGAAACTGAGCAACAACGGGCACGCCG
AAATTCTGATCAAGGAAATGGGAAAAGTGAAAAAAGGGGAGGGCAGCTGGGAAAAGGGCTT
GGACGTGATGAAATCGGAGCTCAAATCGTTCGGGCTGAATCCGGATGAATTGATTGCAAGA
GACGGATCCGGCGTTTCTCATATTAACGGCGTAACCGCCGGGCAAATCGGAGAGCTTTTGT
ATGCGGTTCAGAAAGAAAAGTGGTACCCGGCTTTCCTTCGTTCGCTCCCTGTCGCCGGTGC
AAGCGACAGAATGACGGGAGGAACCCTTCGGAACCGGCTGAAGAATACTCCGGCAGAAGGC
AAAATTAAAGCGAAAACCGGGTCACTAACATCAGTCAGTTCGATTGCCGGCTATGCAGACA
63
CAAAAACAGGAGATACGCTTATTTTTTCCGTGCTTCAAAACGGGCTGCTTGACGAAGATGA
CGGAAAAGACATTGAAGACAAAATCGCAGTCGTGCTGGCAAATCAATAAGAAGGGCCGAAT
CCTTAGAGGATTCGGCTTTTTTTGATGTCTGTAAAACATTATATTGCGATTATGAATCAAT
CTTTTCAAAAAGTAATATCGTCAATACCCTTCCTTTTTTTTACATACCGCTTTCTTACATG
TTCACCGATTATTCATTTTTTAACATAAAACTTCTTTTCGGGAGGAAAACCTTTTTAAAAG
CGCAATTAATTATACATTTTATTCCTTATTATAGTGTTTAGACCAGTTTATAGTATGCATA
CATACCGTTTACATGTATAAGATATAGAAATGAGAGTGAGTGAGATATATACTATATTCTA
AAAATGTTAGAAGAAATTATTTTTATTGTGATTTCTAAAAATTTGTTTTAAAATAATGCCT
TATATGATGATCAGTCATATGCCTGTCGATCATTGCATATTCACTTCCTTATCCTCTTAAT
GGACGAGATCATGTAGAACCGTATCTCAATTCACGCGAAGGAGTAG 3´
4. ItuA (Iturina)
Oligonucleótido ItuA F 5´CTCGAACTCTGCTTCGTCCTATTTTGTCCATCTGGAGCATATGCCGTTAACGTCCAACG
GGAAAATAAACCGTAAGGCACTGCCTGCACCGGAATCGAGTCTGCAGCAGACAGCTGAATA
TGTTCCGCCGGGTAATGAGACGGAGTCCAAACTGACAGATTTATGGAAGGAAGTGCTCGGA
ATAAGCCATGCGGGGATCAAACATAATTTCTTTGATCTCGGAGGCAACTCCATCCGAGCGG
CTGCCCTAGCCGCCAGAATTCACAAAGAGCTGGATGTGAATCTGTCTCTCAAAGACATATT
CAAGTTTCCTACCATTGAACAATTGGCTGACAAGGCGTTACACATGGACAAAAATCGATAT
GTACCGATTCCGGCTGCAAAGGAAATGCCATATTATCCGGTTTCTTCAGCTCAGAGGCGGA
TGTATTTATTAAGTCACACAGAAGGCGGCGAGCTGACTTACAATATGACGGGTGCCATGAA
TGTGGAAGGGACGATCGATCCCGAACGGTTAAACGCCGCTTTCCGAAAATTAATCGCGCGT
CATGAAGCGTTGCGGACCAGCTTTGATTTATATGAAGGCGAGCCGGCACAGCGTATTCATC
AGTACGTCGACTTTACGATAGAACGGATTCAAGCAAGCGAAGAAGAAGCGGAAGACCGTGT
GCTTGATTTCATCAAAGCGTTTGACTTAGCCAAACCGCCGCTGATGCGGGCCGGACTGATT
GAAATTGAACCTGCGCGGCACGTGCTTGTGGTTGATATGCATCATATCATTTCTGACGGCG
TGTCCGTCATATTCTGATGAAAGATTTAAGCCGAATCTACGAGGGGACGACCGGGCCGCTC
TTCTATTCATATAAAGACTTGCAGTTTGCAGCATCGACTTCAGAACGGACATCAGAGCAGA
GCGTATGCTGATCAGTTCACGTGATATCTGTACTGATATGCTGCGAATATGACGACTGCCA
TACGCGATTACGAAGCGAATCATTGATCTAACGACCCTGGACAGCGTTAGCCAATGAGAGA
CCAGACAACTGTATGATATGCAGCTTTCGATCTTACATACCGGCAGAGATACTAGAGCCAC
TGCGCGACTGATAGAACGCTGAGCTCCATACTAGGAT 3´
Oligonucleótido ItuA R 5´TCCCATTGTCATGATTCTTTGAGATACTTCCGGAGATAAGGAACGGCAGATGCATTTTT
CCTGGTAGCCGGTACGGGCCAACGACGCTTTATCCGCTGCTTTAAAGTAAGGGAATGCGCT
TAGGCCGTCTTCTTCATCAAACAGGTTTTCCCAGTACGTTTCTTGAGTTTTAAATACCGAC
ATTGGAGCACCTCATTTTATATATTTTAAAGAAATAATGCTTTTCCCTAAAAGTTCAATTG
AATAGAATCAAGCGCGTTCTCTTCTTCCTCATTGCTGCCGCTCAATCCGATATGTTCGATT
AGAATGCTTGGCTGTTCCAAAATCGCCGATAGGATGTGTAAGTAGTCGTTTGATAAAACCT
CGATTCTGCTTTTCTTAAACAGTTTTTTCGAATATTCAAACAGTCCGTGATAGTTGTCGCG
GTCCGCCTGAATCGACAAGGTCAAATCGAATTTGGCAACCGGATGATGAAATGGATACGGC
TTGAGTTGAAGGGAATCGAAAGTCAATTCAGCATGATCGAGATTTTGCAGCACAAACATCG
TATCGAATAAAGGATTGCGGCTTGAATCTTTTGGAAGATGCAGATGCTGAATTAATTCTTC
64
CAACGGATAGTCTTGATTTTTATAGGCGTTCAGCATGTTTTCTTTTACTTCGTTTAAGTAG
GCATCAAATGTTTTACGGCCCGCCGGGTGATTGCGAATGACTAACGTATTGACGAACATTC
CCACGACTGGCTCTACATCCAAATGAGTCCGCCCGGCAGATGGCGTTCCTACGATAATATC
TTCTTGTCCGCTGTATTTGGATAAAAGAATCGTATAGGCTGCCAATAAAATCATATACAGT
GTGCTCCTGTGTCTTCTTCATTTGGCTAAACGCTGTTCAAGTGTCGGGTATAAGAAATCAA
TGATCGCTCGTATCGCGTATGCAGTCGCTCATATCGCAGCATATCAGTACAGATATCACGT
GACTGATCCAGCCATACGCTCTGCTCTGATGTCCGTCTGAGGTCCGATGCTGCCACTGCAG
TCTTAAATGAATAGAGAGGCGGTCTTCGTCCTCGTGAATCGGCTAAATCTTCATCGAATGA
CGAACGCGCTCGAGTATGTAGCATACCAGCTGCCGAGTCATCACAGTCGTCGACTAATAGC
G 3´
65
Anexo 2 Medio Schlegel para el crecimiento de bacterias degradantes del oxalato
Solución A
Na2HPO4 x 7H2O 57.80 g
KH2PO4 30 g
Llevar a 400 ml con H2O destilada, disolviendo con un agitador magnético.
Esterilizar a 121°C por 20 minutos en autoclave.
Solución B
NH4Cl 5 g
Llevar a 500 ml con H2O destilada, disolviendo con un agitador magnético.
Esterilizar a 121°C por 20 minutos en autoclave.
Solución C
MgSO4 x 7H2O 20 g
Llevar a 100 ml con H2O destilada, disolviendo con un agitador magnético.
Esterilizar con las mismas condiciones.
Solución D
CaCl2 x 2H2O 1.47 g
Llevar a 1000 ml de H2O destilada, disolviendo con un agitador magnético.
Esterilizar con las mismas condiciones.
Solución E
Tomar los 1000 ml de solución D y agregar 0.05 g de citrato de amonio férrico
(NH4Fe citrate).
Solución F
ZnSO4x 7H2O 10 mg
MnCl2x 4H2O 3 mg
H3BO3 30 mg
CoCl2x 6H2O 20 mg
CuCl2x 2H2O 0.1 mg
NiCl2x 6H2O 2 mg
Na2MoO4x 2H2O 3 mg
(pH 3-4)
66
Llevar a 100 ml con H2O destilada, disolviendo con un agitador magnético,
agregando un componente después del otro. Esterilizar con las mismas
condiciones.
Solución final
Solución A 20 ml
Solución B 100 ml
Solución F 1 ml
Solución C 1 ml
Solución E 100 ml
Stock oxalato de K
Llevar a 1000 ml con H2O destilada estéril, disolviendo con un agitador magnético
por 3 minutos.
Solución de Oxalato (Stock)
1. Oxalato de K 36.846 g
Llevar a 200 ml con H2O destilada, disolviendo con un agitador magnético.
Esterilizar por filtración. Y almacenar en tubos falcon en nevera.
2. Oxalato de K 92.115 g
Llevar a 500 ml con H2O destilada, disolviendo con un agitador magnético.
Esterilizar por filtración. Y almacenar en tubos falcon en nevera.
Para agregar a la solución final diferentes concentraciones de oxalato de
potasio se tomara del Stock (1) las diferentes unidades de volumen.
ml 0 mM 1 mM 10 mM 25 mM
200 0 ml 1 ml 10 ml 25 ml
400 0 ml 2 ml 20 ml 50 ml
600 0 ml 3 ml 30 ml 75 ml
800 0 ml 4 ml 40 ml 100 ml
1000 0 ml 5 ml 50 ml 125 ml
67
Para agregar a la solución final diferentes concentraciones de oxalato de
potasio se tomara del Stock (2) las diferentes unidades de volumen.
ml 0 mM 1 mM 10 mM 25 mM
500 0 ml 1 ml 10 ml 25 ml
1000 0 ml 2 ml 20 ml 50 ml
1500 0 ml 3 ml 30 ml 75 ml
2000 0 ml 4 ml 40 ml 100 ml
2500 0 ml 5 ml 50 ml 125 ml
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