Bài 8: NHÓM ENZYME

1. Tổng quan

1.1. Nguyên liệu

- Dứa (thơm) có tên khoa học là Ananas comosus, là một loại quả nhiệt

đới. Quả dứa có hàm lượng acid hữu cơ cao (acid malic và acid citric).

Dứa là nguồn cung cấp mangan dồi dào cũng như hàm lượng Vitamin C

và Vitamin B1 khá cao.

- Giá trị dinh dưỡng trong 100g phần ăn được

Năng lượng 202 kJ (48kcal)

Cacbohydrat Đường

Chất xơ thực phẩm Chất béo Protein

Thiamin (Vit. B1) Riboflavin (Vit.B2)

Niacin (Vit.B3) Acid pantothenic (Vit. B5)

Vitamin B6 Acid folic (Vit. B9)

Vitamin C Canxi

Sắt Magie

Phosphor Kali

Kẽm

12.63 g 9.26 g

1.4 g 0.12 g 0.54 g

0.079 mg 0.031 mg

0.489 mg 0.205 mg

0.110 mg 15μg

36.2 mg

13 mg 0.28 mg

12 mg 8 mg 115 mg

0.10 mg

- Trong quả dứa có chứa enzyme bromelain, có thể phân hủy protein. Do

vậy, quả dứa được sử dụng trong chế biến món ăn như thịt bò xào, thịt vịt

xào giúp thịt nhanh mềm và tạo hương vị đặc trưng.

1.2. Phụ gia sử dụng

- Pectinase là một nhóm enzyme thủy phân các chất pectin, sản phẩm tạo

thành là acid galacturonic, galactose, metanol. Enzyme pectinase được

tìm thấy ở thực vật bậc cao, pectinase có nhiều trong lá, củ khoai tây,

trong chanh, cà chua dứa, cỏ ba lá.

- Lượng chế phẩm pectinase trên lượng nguyên liệu đem chế biến khoảng

0.03-0.05%, có khi lên tới 0.1%.

- Cơ chế tác dụng: Tùy vào từng loại enzyme mà có các cơ chế tác dụng

khác nhau

1.2.1. Pectinesterase

Pectinesterase còn được gọi là pectinmethyl hydrolase, xúc tác sự khử

ester hoá nhóm methoxyl của pectin, tạo thành acid pectic. Enzym này

hoạt động đặc hiệu với nhóm methyleste của acid galacturonic nằm bên

cạnh acid galacturonic không bị este hoá.

1.2.2. Protopectinase

Protopectinase hòa tan protopectin, tạo thành các pectin hòa tan có mức

độ polymer cao.

1.2.3. Các enzym khử mạch polymer

Chia làm 2 tiểu nhóm:

a. Enzym thủy phân liên kết glycoside (Hydrolase)

Polymethylgalacturonase (PMG): xúc tác thuỷ phân liên kết

α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá cao.

Polymethylgalacturonase gồm 2 loại:

- Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4-glycosid của

pectin.

- Endo-PMG: phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4-glycosid của

pectin.

Polygalacturonase (PG): xúc tác thuỷ phân liên kết α-1,4-

glycosid của acid pectic (acid polygalacturonic), gồm 2 loại:

- Endo-PG: còn gọi là poly (1,4-α-D-galacturonide)

glycanohydrolase, xúc tác thuỷ phân ngẫu nhiên liên kết α-1,4-

glycosid trong phân tử acid pectic.

- Exo-PG: còn gọi là poly (1,4-α-D-galacturonide)

glalacturonohydrolase, xúc tác thuỷ phân lần lượt liên kết α-

1,4-glycosid của acid pectic từ đầu không khử.

b. Enzyme cắt (Lyase)

Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): Xúc tác phá vỡ liên

kết α-1-4-glycosid đặc hiệu với pectin có mức độ ester hoá

cao, có hai loại:

- Endo-PMGL: còn gọi là poly(methoxygalacturonide) lyase,

xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4-glycosid của pectin.

- Exo- PMGL: xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin.

Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1,4-

glycosid của acid pectic. Có 2 loại:

- Endo- PGL: còn gọi là poly(1,4-α-D- galacturonide) lyase,

xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1,4-glycosid của acid

pectic.

- Exo- PGL: còn gọi là poly(1,4-α-D- galacturonide)

exolyase, xúc tác phân cắt lần lượt liên kết α-1,4-glycosid của

acid pectic từ đầu không khử.

2. Kết quả và biện luận

Thuyết minh qui trình:

- Xử lí:

Mục đích: Xử lí nguyên liệu nhằm tạo thuận lợi cho những khâu tiếp

theo, loại bỏ những phần không dùng được.

Thực hiện: Ta loại bỏ vỏ và mắt dứa, sau đó đem rửa nhằm loại sạch

nguyên liệu và loại bỏ bẩn bám trên nguyên liệu.

- Cắt nhỏ:

Mục đích: Làm nhỏ nguyên liệu, thuận lợi cho quá trình xay nhuyễn sau

này.

Thực hiện: Ta dùng dao cắt dứa thành những miếng nhỏ.

- Xay nhuyễn:

Mục đích: nhằm phá vỡ cấu trúc tế bào để tách chiết dịch được dễ dàng

hơn.

Thực hiện: Nguyên liệu sau khi được cắt nhỏ đem xay min bằng máy xay

sinh tố với tỉ lệ nước : dứa = 1:2.

- Lọc

Mục đích: nhằm tách loại bã để thu dịch quả.

Thực hiện: Lọc bằng máy lọc chân không.

80g dứa, 160g nước

M0

M1: 0.05% pectinase

M2: 0.1% pectinase

M0 M1 M2

Thể tích dịch lọc (ml)

189 201 206

Khối lượng bã lọc thu

được (g)

13.863 12.273 11.106

oBx

3.0 3.5 4

Độ nhớt (s)

20.03 19.13 14.18

pH

4 3.5 3.7

Màu sắc

Vàng tươi

nhất

Vàng nhạt Vàng nhạt

Trạng thái Đục nhất

Trong Trong nhất

Thời gian chảy của nước: 18s

Mức độ giảm độ nhớt của dung dịch khi sử dụng pectinase

𝑁(%) =𝐸𝑇0 − 𝐸𝑇𝑡

𝐸𝑇0 − 𝐸𝑇𝑤

× 100

Khi sử dụng 0.05% pectinase:

𝑁 = 20.03 − 19.18

20.03 − 18× 100 = 41.87%

Khi sử dụng 0.1% pectinase:

𝑁 =20.03 − 19

20.03 − 18× 100 = 50.74%

- Thể tích dịch sau khi lọc tăng từ mẫu M0, M1, M2 vì xử lí enzyme làm

tăng hiệu suất chiết rút dịch quả.

- Độ brix tăng vì xử lí enzyme làm tắng hàm lượng chất khô hòa tan vào

dịch quả nên làm cho độ Bx tăng.

- Độ nhớt giảm dần do dưới tác dụng của enzyme phân giải pectin thành

các chất hòa tan.

- Màu vàng càng nhạt, độ trong tăng dần dưới tác dụng của enzyme

pectinase phân giải protopectin thành dạng pectin hòa tan nên làm dịch

quả trong hơn, màu nhạt hơn.

3. Trả lời câu hỏi

3.1. Vai trò của enzyme pectinase

Enzyme pectinase là một nhóm enzyme thuỷ phân các chất pectin, sản phẩm

tạo thành là acid galacturonic, galactose, methanol… Sự phân hủy pectin

trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này có vai trò

hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả. Enzyme

pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong quá trình chế biến thực phẩm,

đặc biệt là khả năng làm trong nước quả. Việc kiểm soát hoạt động của

enzyme pectinase cũng có thể kiểm soát được độ nhớt của sản phẩm.

Vai trò của enzyme pectinase là hoạt động thủy phan pectin của enzyme đã

làm giảm độ nhớt trong nước trái cây vì thế nồng độ của các thành phần chất

tan trong dịch quả tăng lên vì thế mà tăng hiệu suất trích li và giá trị Brix của

sản phẩm cũng tăng lên.

3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme

- Nhiệt độ: Hoạt động thủy phân của enzyme pectinase ở 40 – 50oC là cao

nhất. Khi tăng hay giảm nhiệt độ thì hiệu suất thu hồi giảm.

- pH: Enzyme pectinase hoạt động mạnh nhất ở pH 4.5. Ở các khoảng còn

lại, lượng dịch thu được giảm.

- Nồng độ enzyme: Lượng dịch quả trung bình thu được ứng với các mức

nồng độ enzyme có sự khác biệt. Lượng dịch quả cao nhất ứng với mức

nồng độ enzyme sử dụng dao động trong khoảng từ 0.15% đến 0.2%.

Lượng dịch quả có xu hướng giảm dần khi nồng độ enzyme cao hơn hoặc

thấp hơn.

- Thời gian thủy phân: Cần có một khoảng thời gian tối thiểu để enzyme

hoạt động, tạo ra lượng dịch quả nhiều nhất.

- Chất ức chế hoặc hoạt hóa enzyme: một số chất như thuốc trừ sâu có thể

làm ức chế enzyme hay một số chất khác có thể liên kết với enzyme để

làm tăng hoạt tính.

3.3. Ngoài pectinase, có thể sử dụng enzyme nào để tăng hiệu suất thu

hồi dịch quả?

- Enzyme protease: Nó sử dụng cơ chất là pectin và sản phẩm sau khi thủy

phân là acid pectic và methanol trong quá trình bảo quản lạnh. Giảm tức

thời độ đục nhưng độ trong giảm khi bảo quản lạnh.

- Hemicellulose, cellulose…

- Các loại enzyme khác như: pectinex Smash, Enzeco…

3.4. Trình bày các tác hại có thể xảy ra khi sử dụng quá nhiều hoặc quá

ít enzyme.

Lượng dịch quả có xu hướng giảm dần khi nồng độ enzyme thấp hơn hoặc

cao hơn. Nếu quá nhiều enzyme sẽ làm cản trở vận tốc phản ứng, lãng phí

enzyme. Nếu quá ít enzyme thì thời gian thủy phân sẽ kéo dài và hiệu suất

thu hồi dịch quả kém.

3.5. Pectinase có thể ứng dụng trong những sản phẩm thực phẩm nào?

- Sản xuất nước quả

- Sản xuất rượu vang đỏ

- Lên men trà và cà phê: việc thêm pectinase cũng làm cải thiện đặc tính

của bột trà bằng cách phân hủy pectine trà. Trong cà phê sử dụng loại lớp

vỏ nhầy khỏi hạt cà phê.

- Sản xuất tinh dầu: sử dụng enzyme làm tăng sản lượng dầu ôliu do tác

dụng làm hóa lỏng thành cấu trúc của tế bào.

3.6. Tác hại có thể xảy ra khi sử dụng sai những phụ gia trong bài thí

nghiệm.

Có thể không làm trong được dịch quả sau khi lọc.

3.7. Phương pháp xác định pectinase

- Nuôi cấy thu nhận enzyme pectinase từ phương pháp nuôi cấy bề mặt.

- Xác định hoạt độ enzyme pectinase bằng phương pháp đo độ nhớt với

nhớt kế Borosil: hút 2ml dung dịch enzyme thô 5% (w/v) phản ứng với

18ml dung dịch pectin 1% ở pH 4.5 và nhiệt độ 40oC. Một đơn vị hoạt độ

pectinase (UI) là lượng enzyme cần thiết làm giảm 10% độ nhớt của hỗn

hợp chứa 180mg pectin dưới những điều kiện như trên.

- Hàm lượng protein của chế phẩm enzyme được xác định bằng phương

pháp Lowry.

- Phân tích chế phẩm enzyme bằng phương pháp lọc gel Bio Gel P30: Hòa

tan chế phẩm enzyme thô trong đệm Mc Ilvaine pH 4.5 ly tâm bỏ cặn thu

được dung dịch enzyme sau đó hút 0,5ml cho chạy qua cột Bio Gel P 30

(0.8 x 30cm) (hãng Biorad – Mỹ) được cân bằng với đệm Mc Ilvaine pH

4,5. Tốc độ chảy qua cột lần lượt là 30ml/giờ và 15ml/giờ. Mỗi phân

đoạn thu 2ml và 1,5ml. Đo độ hấp thu A của từng phân đoạn ở bước sóng

280nm. Vẽ đồ thị ghi nhận các peak tạo thành và xác định hiệu suất thu

hồi enzyme và hoạt độ tính tương ứng.

- Tinh sạch enzyme pectinase bằng phương pháp lọc màng (cross flow

membrance): Tiến hành tủa enzyme từ 500ml dịch chiết thu được bởi

ethanol 96o, nhiệt độ tủa 4oC, thời gian tủa là 1 giờ. Sau đó, ly tâm 5000

vòng/phút trong 15 phút thu enzyme thô. Hòa tan enzyme thô này trong

500ml dung dịch đệm Mc Ilvaine pH 4.5. Tiến hành lọc 500ml dung dịch

enzyme vừa hòa tan trên bằng hệ thống lọc QuixStand Benchtop Systems

(hãng Amersham Biosciences) với bộ lọc màng (membrane) có khoảng

phân đoạn 50kDa. Tốc độ bơm mẫu đầu vào lần lượt là 150rpm &

200rpm và điều chỉnh sao cho áp suất trên bề mặt màng không quá 5 Psi.

Thu dịch qua lọc và xác định hiệu suất thu hồi enzyme và hoạt độ tương

ứng.

3.8. Kể tên vài loại thực phẩm và enzyme bổ sung thường gặp

- Ứng dụng protease trong sản xuất bia: thủy phân protein trong hạt ngũ

cốc, tạo điều kiện xử lí bia tốt hơn.

- Ứng dụng protease trong sản xuất phomat từ sữa, sản xuất bánh từ bột

mì, chế phẩm giàu protein từ đậu tương.

- Ứng dụng pectinase trong sản xuất nước dứa, nước táo ép…

3.9. Nêu giá trị INS, ADI, ML của pectinase, protease?