BaigiangTHVisinhvathoc-Compresshinh

NHỮNG QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng đối với thí nghiệm vi sinh vật. Vi sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy được. Trong quá trình làm thí nghiệm, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật. Bên cạnh những giống, loài vi sinh vật có ích là những giống, loài có khả năng gây bệnh và có hại đối với sức khỏe con người. Mặt khác, trong quá trình thí nghiệm chúng ta cũng phải sử dụng nhiều loại hóa chất, trong đó có những hóa chất có độc tính. Chính vì thế, người làm thí nghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thủ các qui tắc cơ bản sau đây:

1. Những qui định chung: - Những người không có nhiệm vụ không được vào phòng thí nghiệm.- Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng. - Không nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự. Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểm

nghiệm.- Mang khẩu trang, găng tay khi thao tác với vi sinh vật và hóa chất. - Trên bàn thí nghiệm chỉ để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép. Tất cả

các vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở,… phải để đúng nơi qui định. - Trước và sau khi kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn bằng các hóa chất sát

trùng cồn 70% hoặc dung dịch diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%) đã chuẩn bị sẵn và lau khô bằng giấy vệ sinh.

- Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người là thí nghiệm lên tất cả các hộp petri, ống nghiệm,…

- Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dấy lên quần áo, sách vở và dụng cụ cá nhân. Đồng thời cũng phải chú ý bảo vệ da và quần áo khỏi bị dính hóa chất và thuốc nhuộm.

- Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen. Tắt ngọn lửa khi chưa có nhu cầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác. Tuyệt đối không dùng đèn cồn để mồi lửa đèn cồn.

- Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), Tuyệt đối không hút bằng miệng.

- Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm khi chưa được hướng dẫn cụ thể. Sử dụng theo hướng dẫn, hết sức thận trọng, tránh làm đổ vỡ và hư hỏng.

- Tất cả các vật liệu bị nhiễm bẩn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần phải được khử trùng trước khi vứt bỏ hoặc sử dụng lại. Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần được ngâm vào dung dịch diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng.

- Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sử dụng theo đúng qui trình và sắp xếp vào đúng nơi qui định.

- Rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm. - Tất cả các trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán bộ hướng dẫn thí nghiệm để kịp

thời và xử lý. 2. Một số lưu ý với sinh viên nhằm đạt kết quả tốt trong thực hành vi sinh vật a. Trước khi thực hành - Cần đọc bài trước nội dung toàn bài để hình dung được khối lượng công việc sẽ làm. - Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích của các thí nghiệm. - Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệmb. Trong giờ thực hành:- Ghi chú cẩn thận những căn dặn của giảng viên về các thao tác và qui trình thực

hành.- Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của giảng viên. - Trong quá trình thí nghiệm có những thao tác, công đoạn không rõ cần hỏi lại giảng

viên hướng dẫn.

Trang 1

- Ghi chép cẩn thận các chú ý quan trọng của thí nghiệm và kết quả của mỗi thí nghiệm.

c. Kết thúc thực hành: - Làm báo cáo thực hành theo các yêu cầu trong mục 5 của từng bài thí nghiệm và

theo yêu cầu của giảng viên.

Trang 2

BÀI 1THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT

1. Thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật học1.1.Tủ sấy (vacuum oven): to từ 60oC – 200oC, dùng để sấy khô, khử trùng các loại

dụng cụ chịu được sức nóng khô, chủ yếu là dụng cụ thủy tinh, kim loại. Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy ở chế độ to và thời gian khác nhau, thường sấy ở 160oC/2 giờ, hoặc 180oC/30 phút.

Hình. Tủ sấy1.2.Tủ ấm (incubator or etuve): to từ 20oC – 60oC, có chế độ ổn định nhiệt độ, được

sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của chúng. Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ ở to khác nhau để vi sinh vật có thể phát triển tốt. Ví dụ: Coliform 30oC/24h – 48h, E. coli thích hợp ở 44oC/24h – 48h.

1.3. Tủ lạnh hay tủ mát (freezer): dùng bảo quản môi trường đã pha chế, giống vi khuẩn, các chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh,…), hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường.

1.4. Nồi hấp ướt (Autoclave): Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao (hơi nước bão hòa ở áp suất cao), được sử dụng để hấp khủ trùng môi trường, một số nguyên liệu và dụng cụ thí nghiệm. Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt độ và áp suất thích hợp, thường dùng ở 121oC/1 atm/ 15 phút. Hay 127oC/1.5 atm/30 phút với môi trường đất, 117oC/ 0.8 atm/15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường sữa……

Thể tích môi trường nuôi cấy (ml)

Thời gian hấp tiệt trùng tối thiểu (phút)

25 2050 25100 28250 31500 35 1000 402000 484000 63

Trang 3

Chỉ số áp kế của nồi áp suất (atm)

0,0 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,5 2,0

To sôi nước (oC) 100 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134

To sôi nước (oF) 212 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273

Hình. Nồi hấp cao áp (Autoclave)1.5. Cân phân tích điện tử (analytical balance): cân trọng lượng từ 100µg – 200g.

Độ chính xác 10-4 g. Cân kỹ thuật (technical balance): độ chính xác 10-2g. Dùng cân hóa chất, môi trường.

A B

Hình. Cân phân tích (A) và cân kỹ thuật (B)1.6. Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím (UV) (flux laminar ): Có không gian vô trùng

được sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thổi khí vô trùng.

1.7. Máy ly tâm (centrifuge): Dùng tách các chất ở các pha rắn-lỏng ra khỏi nhau như

Trang 4

Hình. Tủ cấy vô trùng

tách sinh khối tế bào ra khỏi môi trường nuôi cấy, tách hồng cầu, enzyme,…

Hình. Máy ly tâm1.8. Máy lắc (shaker): Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách

lắc các bình nuôi cấy theo các chiều khác nhau (lắc vòng và lắc ngang) một cách đều đặn để tăng lượng oxy hòa tan trong môi trường.

Hình. Máy lắc1.9. Kính hiển vi (microscope): có vai trò rất quan trọng nghiên cứu vi sinh vật.

Dùng nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năng phóng đại của kính (sẽ giới thiệu chi tiết ở bài sử dụng kính hiển vi).

Hình. Kính hiển vi quang học

1.10. Máy đo pH (pH meter): đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy vi sinh vật

Trang 5

A B

Hình. Máy đo pH để bàn (A), máy đo pH cầm tay (B)

1.11. Máy cất nước (single/ double water stills): dùng để cất nước.

Hình. Máy cất nước1.12. Bể ổn nhiệt (water bath): chứa nước và được cài đặt ở nhiệt độ nhất định để ổn

định nhiệt độ cho những thí nghiệm cần sự ổn định về nhiệt độ.

Hình. Bể ổn nhiệt

1.13. Nồi lên men (fermenter/Bioreactor): thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật trong điều kiện tối ưu hóa và điều chỉnh được các thông số môi trường nuôi cấy

Trang 6

Hình. Nồi lên men

1.14. Các thiết bị khác như: máy đếm vi sinh vật, máy quang phổ, sấy đông khô,…

2. Dụng cụ - Dụng cụ thủy tinh: có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác, ống

nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định mức,… yêu cầu phải sạch, trong, trung tính. Trước khi dùng đựng môi trường phải được sấy khô, làm nút bông và khử trùng trong tủ sấy khô.

- Đối với dụng cụ mới: cần ngâm nước hoặc dung dịch H2SO4 loãng trong 24 giờ. Sau đó mới rửa lại bằng nước hoặc xà phòng nhiều lần cho đến khi pH trung tính.

- Đối với dụng cụ đã qua sử dụng còn chứa môi trường và vi sinh vật, cần khử trùng rồi mới rửa sạch bằng xà phòng, phơi và sấy khô.

- Đối với dụng cụ bị bám bẩn, cần ngâm thêm với dung dịch sulfocromic vài giờ, sau đó rửa lại bằng nước sạch.

- Dụng cụ sạch khi đưa lên ánh sáng không có vết mờ và vết bợn. - Các dụng cụ khác: như đèn cồn, giá ống nghiệm, que cấy, kẹp, kéo, bơm tiêm nhựa,

đầu típ, bếp điện,… 3. Các phương pháp khử trùng vi sinh vật

* Nguyên tắcDiệt trùng hay khử trùng là phương pháp nhằm ức chế hoặc loại bỏ, cuối cùng là giết

chết các vi sinh vật không mong muốn. Người ta thường khử trùng bằng 2 phương pháp chính:

3.1. Phương pháp lý học* Nhiệt khô. - Đối với dụng cụ cấy kim loại, đôi khi cả thủy tinh, phương pháp thường dùng là đốt:

đốt trực tiếp trên ngọn lửa hoặc nhúng cồn đốt. - Đối với dụng cụ thủy tinh có thể gói giấy và sấy ở 160oC/ 1 giờ. Dụng cụ đưa vào

sấy phải chịu được nhiệt độ cao và không buộc dây nhựa hoặc thun. * Nhiệt ẩm. - Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt sẽ thấm nhanh vào mẫu vật

làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật. Tuy nhiên, chỉ diệt tế bào sinh dưỡng, bào tử vẫn còn.

- Phương pháp Pasteur: Chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh ( ký sinh ), không diệt bào tử và vi khuẩn hoại sinh. Phương pháp này không diệt hoàn toàn mầm bệnh mà chỉ chọn một vài vi sinh vật đối kháng mạnh nhất. Vì vậy, phải biết nhiệt độ và thời gian diệt trùng cho từng loại vi sinh vật.

- Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần ở nhiệt độ 70- 80oC, mỗi lần 30-60 phút và liên tiếp trong 3 ngày liền.

- Phương pháp hơi nước bảo hòa ở áp suất cao: dùng autoclave. * Diệt trùng bức xạ. - Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật. - Tia âm cực: dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm. Vật khử

Trang 7

trùng phải bao gói kín. * Diệt trùng bằng sóng. Sóng ngắn khi tác động với cường độ và thời gian thích hợp có thể phá vỡ tế bào vi

sinh vật, làm chết các tế bào sống.* Diệt trùng bằng cách lọc. - Dụng cụ lọc thường là những màng xốp bằng sứ, aminate, cellulose,… thường là

những vật phẩm lỏng không khử trùng bằng nhiệt được. - Đối với khử trùng không khí thì thiết bị khử trùng là một máy lọc khí có trang bị

màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn.3.2. Phương pháp hóa học.- Chất sát khuẩn ngoài da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu (phần lớn phẩm màu có tác

dụng sát khuẩn như: xanh methylene).- Chất diệt khuẩn và tẩy uế: phenol, formol, hợp chất Clor,…

4. Những điểm cần lưu ý- Không làm vụn bông không thấm khi làm nút đậy cho các dụng cụ như ống nghiệm,

bình tam giác.- Khi nút bông gòn vào đuôi pipette, độ chặt phải vừa đủ, phải kiểm tra khả năng hút

dung dịch của pipette sau khi nút xong.- Kích thước nút đậy của ống nghiệm, bình tam giác phải phù hợp, tiện dụng.

5. Báo cáo thực tập- Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật?- Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật?- Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật?

Trang 8

BÀI 2PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

VI SINH VẬT1. Nguyên tắc

Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào. Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trì thế oxi hoá khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường.

Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; có độ pH thích hợp; có độ nhớt nhất định; không chứa các yếu tố độc hại; hoàn toàn vô trùng đảm bảo sự phát triển ổn định của vi sinh vật.

Phân loại môi trường dinh dưỡng: người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loại môi trường

- Phân loại theo nguồn gốc+ Môi trường tự nhiên: dịch nước chiết thịt, nước chiết khoai tây, máu động

vật...+ Môi trường nhân tạo: Czapeck, Hansen, EMB...+ Môi trường bán tự nhiên: Potatoe glucose agar (PGA), giá đậu đường...

- Phân loại theo trạng thái vật lý:+ Môi trường lỏng: dạng lỏng, không có agar hay các chất làm giá thể khác

trong thành phần môi trường+ Môi trường rắn: mỗi 1000ml môi trường có 15-20g agar hay các chất làm giá

thể+ Môi trường bán lỏng (bán rắn): mỗi 1000ml môi trường có 3-5g agar hay các

chất làm giá thể khác.- Phân loại theo công dụng:

+ Môi trường phân lập+ Môi trường tăng sinh+ Môi trường lưu giữ giống+ Môi trường thử nghiệm sinh hóa

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha chế theo nguyên tắc:- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hoá các chất dinh

dưỡng của từng loại sinh vật.- Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vât

nên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường.- Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh

vật.

2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1. Dụng cụ

STTTên dụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên)Đơn vị tính Số lượng Ghi chú

1 Giá ống nghiệm Cái 1

2 Ống nghiệm Ф18 Cái 5

3 Bình tam giác Cái 1

4 Phễu thủy tinh Cái 1

5 Đũa khuấy thủy tinh Cái 1

Trang 9



6 Cốc 100ml Cái 3


8 Đĩa cân nhựa Cái 3

9 Bình tia Cái 1

10 Bếp điện Cái 1

STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú

1 Máy đo pH Cái 1

2 Cân kỹ thuật Cái 1

3 Cân phân tích Cái 1

4 Nồi hấp cao áp Cái 1

5 Tủ sấy Cái 1

2.2. Môi trường và hoá chất

* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

Môi trường cao thịt - peptone

- Cao thịt: 3g

- Peptone: 10g

- NaCl : 5g

- Agar: 20g

- Thêm nước cất cho đủ 1000ml.

Lắc đều, điều chỉnh pH=7,0±0,2

Nấu sôi nhẹ để tan agar, phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở 121oC trong 30 phút

* Môi trường nuôi cấy nấm men:

Môi trường Hansen

- Glucose, maltose (hoặc đường kính ): 50g

- Peptone:10g

- K2HPO4: 3g

- MgSO4.7H2O : 2 - 5g

- Agar: 20g

- Thêm nước cất đủ: 1000ml

Lắc đều, điều chỉnh pH=6,0±0,2

Trang 10

Nấu sôi nhẹ để tan agar, phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở 121oC trong 30 phút

* Môi trường nuôi cấy nấm mốc:

Môi trường Czapek

- Saccarose: 30g

- NaNO3: 30g

- K2HPO4:1 g

- MgSO4: 0,5g

- FeSO4: 0,01g

- Thạch (agar): 20g;

- Thêm nước cất đủ: 1000ml

pH = 6,0±0,2 khử trùng 1atm / 30 phút.

* Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn:

Môi trường Gauze 1

- Tinh bộ tan: 20g

- K2HPO4: 0,5g

- MgSO4.7H2O: 0,5g

- KNO3: 1,0g

- NaCl : 0,5g

- FeSO4 : 0,1g

- Agar: 20g

- Nước cất đủ: 1000 ml

pH = 7,2 ÷ 7,4 khử trùng 1atm/30 phút

* Môi trường nuôi cấy tảo

Môi trường Tamiya

- KNO3: 5,000

- MgSO4: 2,500

- KH2PO4: 1,250

- FeSO4.7H2O: 0,003 - EDTA: 0,037

- Vi lượng A5: 1 ml

- Agar: 20g

- Nước cất đủ 1.000 ml

Thành phần vi lượng A5

- H3BO3: 2,860

- MnCl2.4H2O: 1,810

- ZnSO4.7H2O: 0,222

- MoO3: 176,4

Trang 11

- NH4VO3: 229,6

- Nước cất đủ 1.000 ml

2.3. Nguyên liệu khác

- Giấy lọc

- Bông không thấm

- Bông thấm nước

3. Tiến hành thí nghiệmLàm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng

thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng.Các bước chế tạo môi trường dinh dưỡng:3.1. Chuẩn bị dụng cụtất cả các dụng cụ cần sử dụng trong suốt quá trình pha chế môi trường phải được

chuẩn bị đầy đủ. Các dụng cụ được rửa sạch, tráng bằng nước cất, sấy khô trước khi sử dụng.3.2. Cân đong hóa chất pha chế môi trường

Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự hướng dẫn trong tài liệu. Dùng đĩa cân nhựa hoặc cốc thủy tinh để cân đong các loại hóa chất dễ hút ẩm

3.3. Phối chế tạo môi trường nuôi cấy- Các thành phần của môi trường được hòa tan riêng rẽ trong nước cất trước khi phối

trộn.- Phối trộn các thành phần theo trình tự nhất định tránh sự tương tác trực tiếp của các

thành phần có thể phản ứng tạo kết tủa với nhau. Phối trộn dựa trên nguyên tắc thể tích tăng dần.

- Sau khi phối chế các thành phần, cần tiến hành lọc môi trường qua giấy lọc, bông thấm nước (đối với môi trường lỏng) hoặc vải màn (đối với môi trường đặc) để làm trong môi trường, đảm bảo việc quan sát vi sinh vật được dễ dàng.

- Đối với môi trường rắn, sau khi phối trộn các thành phần, phải tiến hành nấu sôi môi trường để làm tan hoàn toàn agar trước khi phân phối vào dụng cụ chứa.

3.4. Điều chỉnh độ pH của môi trường- Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường có thể dùng HCl 10 % hay NaCl 10 %. Ngoài

ra có thể dùng một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3 ...- Muốn kiểm tra độ pH của môi trường nên dùng máy đo pH (pH-metre). Phương pháp

này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao. Trong phòng thí nghiệm có thể dùng chỉ thị màu xanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH. Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng không cho độ chính xác cao.

3.5. Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa- Môi trường sau khi pha chế xong thường được phân phối môi trường vào ống

nghiệm, bình tam giác. Trình tự phân phối gồm các bước sau:+ Môi trường cần được đun cho hoá chất lỏng rồi đổ qua phễu thuỷ tinh vào các dụng

cụ.+ Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường, tay phải kẹp nút bông và kéo ra.+ Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại.- Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trường

cần được phân phối chiếm 1/4 thể tích của ống nghiệm. Nếu làm thạch đứng thì lượng môi trường cần được phân phối từ 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm.

- Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm 1/2 - 1/3 thể tích của bình.

- Đối với đĩa petri, môi trường chỉ được phân phối vào đĩa sau khi đã hấp tiệt trùng. Thể tích môi trường khoảng 12-15ml mỗi đĩa, lớp môi trường thạch dầy khoảng 2mm.

- Viết nhãn môi trường trên dụng cụ chứa, bao gồm các thông tin:

Trang 12

+ Tên môi trường+ Ngày khử trùng+ Người pha chế3.6. Khử trùng môi trường- Tuỳ theo tính chất và điều kiện cụ thể của từng loại môi trường mà có chế độ và

phương pháp khử trùng khác nhau. Môi trường thường được hấp tiệt trùng bằng nồi ấp cao áp. Thời gian hấp tiệt trùng môi trường ở nhiệt độ 121oC phụ thuộc vào lượng môi trường được phân phối vào dụng cụ chứa (xem bài 1).

- Đối với môi trường có các thành phần dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao (vitamin, chất kháng sinh, chất kích thích sinh trưởng...), cần hấp tiệt trùng môi trường trước, sau đó bổ sung các thành phần này sau khi hấp xong.

- Một số loại môi trường không được hấp tiệt trùng theo quy định của nhà sản xuất (ví dụ: môi trường Selenit cystine broth, Xylose lysin deoxycholate agar, Chromocult coliform agar...), cần chuẩn bị nước cất vô trùng trước, sau đó pha chế và sử dụng ngay.

3.7. Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri- Làm thạch nghiêng: cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc và

môi trường chưa đông đặc. Ống nghiệm được đặt nghiêng cố định trên giá đỡ. Phần đỉnh nghiêng phải cách nút đậy 3-5cm. Phần đáy phải có một phần thạch đứng 0,5-1cm.

- Làm thạch đứng: đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá ,để yên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc.

- Đổ thạch vào đĩa petri: môi trường vô trùng chứa trong ống nghiệm hoặc bình tam giác được rót vào phần đáy của đĩa petri. Toàn bộ quy trình đổ thạch vào đĩa petri đều thực hiện trong tủ cấy vô trùng hoặc trong phạm vi vô trùng của ngọn lửa đèn cồn.

3.8 Kiểm tra độ vô trùng và bảo quản- Môi trường sau khi pha chế xong, được đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng 24 giờ. Sau

thời gian này kiểm tra độ vô trùng của môi trường bằng cách quan sát trạng thái môi trường.- Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng,

nhiệt độ từ 0 - 50C và không để môi trường bị khô. Thời gian lưu trữ tối đa là 15 ngày.- Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặt

chúng vào tủ ấm 370C, trong 48 - 72h. Sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống có vi sinh vật phát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu.

Trang 13Đĩa thạch

Thạch đứng

Canh trường

Thạch nghiêng

Hình. Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và hộp petri

4. Những điểm cần lưu ý

- Khi pha chế môi trường rắn hoặc bán rắn, thành phần agar trong môi trường có thể bổ sung sau khi điều chỉnh pH của môi trường.

- Đối với môi trường rắn hoặc bán rắn, cần phải nấu sôi để làm tan agar hoàn toàn trước khi phân phối vào dụng cụ chứa.

- Khi điều chỉnh pH, cần dùng từng lượng nhỏ các dung dịch điều chỉnh (dung dịch NaOH, HCl) để tránh vượt quá pH cần. pH môi trường cần được kiểm tra trước và sau khi hấp tiệt trùng.

- Các thao tác phân phối môi trường vào dụng cụ phải nhanh, gọn, khéo léo để môi trường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xong trước khi môi trường bị đông đặc.

5. Báo các thực tập

- Trình bày khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật?

- Trình bày quy trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật?

- Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch đứng?

- Giải thích tạo sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng?

- Đĩa petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa? Tại sao?

Trang 14

BÀI 3PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT

1. Nguyên tắcQuá trình nuôi cấy vi sinh vật gồm 2 khâu: cấy và nuôi. Cấy là những thao tác chuyển

vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng. Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật. Hai khâu này luôn gắn bó với nhau trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật.

* Mục đích của việc nuôi cấy- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu và vật phẩm cần nghiên

cứu.- Tiến hành việc nhân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng.- Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết.- Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển của từng loại vi sinh vật.* Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật- Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễm

các vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài.- Môi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải được khử trùng triệt để.- Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, oxy...) để vi sinh vật

phát triển thuận lợi.


2.1. Dụng cụ







5 Đèn cồn Cái 1

6 Que cấy Cái 1

7 Bình tia Cái 1


1 Tủ ấm Cái 1

2 Tủ cấy vô trùng Cái 1

2.2. Môi trường, hóa chất- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: đã được chuẩn bị ở bài 2, bao gồm các loại

+ Môi trường cao thịt – pepton: nuôi cấy vi khuẩn+ Môi trường Hansen: nuôi cấy nấm men+ Môi trường Czapeck: nuôi cấy nấm mốc

- Cồn 96o

Trang 15

2.3. Chủng giống vi sinh vật- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea- Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini- Vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis


- Giấy lọc



3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏngCấy truyền là phương pháp lấy vi sinh vật từ ống nghiệm này sang một ống nghiệm

khác. Trước khi cấy, tiến hành dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm bên dưới nút ống nghiệm.

a. Cấy truyền bằng pipet Pasteur - Khử trùng pipet pasteur qua ngọn lửa đèn cồn- Tay trái cầm ống giống gốc, dùng ngón tay út phải mở nút bông của ống giống, hơ

và xoay miệng ống giống qua ngọn lửa đèn cồn để sát khuẩn.- Cho pipet pasteur vào ống giống lỏng để lấy dịch vi khuẩn (dịch dâng lên trong pipet

từ từ theo lực mao dẫn), nhanh chóng đặt ngón tay trỏ phải lên đầu pipet, rút pipet ra khỏi ống, đậy nút bông lại rồi đặt ống giống vào giá.

- Cầm ống môi trường mới bằng tay trái, mở nút bằng ngón tay út phải, khử khuẩn miệng ống, cho pipet vào tới khi đầu pipet chạm vào môi trường và để chảy ra vài giọt dịch chứa vi khuẩn. Rút pipet ra, khử trùng miệng ống, đậy nút.

- Đặt pipet vào bình đựng thuốc sát khuẩn.b. Cấy truyền bằng que cấy vòng- Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường.- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây

cấy.- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút

ống nghiệm ra.- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm.- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống

giống.- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi

trường. Khi đầu que cấy chạm vào môi trường thì lắc khẽ que cấy cho vi khuẩn tan trong môi trường.

- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút lại - Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong.* Chú ý- Nếu ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút canh trường thay

que cấy.- Thao tác khử trùng ống hút bắt đầu thực hiện ở đầu nhỏ của ống hút sau khi đã tháo

giấy bao gói.- Sử dụng xong cắm ống hút vào dung dịch sunfocromic để khử trùng.

Trang 16

Hình. Thao tác cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng3.2. Phương pháp cấy truyền trên môi trường thạcha. Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêngPhương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí. Gồm các thao tác như

sau: - Dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm.- Sử dụng que cấy đầu tròn thực hiện các thao tác cấy- Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường.- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây

cấy.- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút đậy ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo

nút đậy ra.- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm.- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống

giống.- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môi

trường để thực hiện thao táo cấy:- Hòa giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm.- Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu:

+ Hình chữ chi.+ Hình vòng xoắn.+ Hình vạch ngang song song.

- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông.- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong

Trang 17

* Đối với nấm mốc hoặc các vi sinh vật đa bào sinh bào tử khác, khi cấy trên ống nghiệm thạch nghiêng, dùng que cấy móc vô trùng lấy bào tử từ ống giống. Cấy truyền bào tử sang ống nghiệm môi trường mới theo 2 cách:

- Cấy điểm: cách cắm ngập đầu que cấy thành 3 điểm cách đều nhau trên bề mặt thạch- Cấy gõ: đưa que cấy có mang bào tử vào ống nghiệm môi trường, gõ nhẹ lưng que

cấy vào thành ống nghiệm đối diện với mặt thạch để rải bào tử xuống.

Hình. Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêngb. Cấy trên ống nghiệm thạch đứng- Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kỵ khí. - Sử dụng que cấy đầu nhọn.- Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hình

trụ.- Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sát

thành ống tùy yêu cầu.- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường.

Trang 18

Hình. Phương pháp cấy trên thạch đứngc. Cấy truyền trên thạch đĩa- Dùng que cấy đầu tròn, hoặc que trải thủy tinh.- Dùng que cấy đầu tròn lấy vi sinh vật bằng tay phải theo đúng quy cách đã hướng

dẫn ở trên.- Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn. Sau đó để cách đèn cồn

chừng 1 - 2cm, khẽ mở mở nghiêng một bên hộp (phần hơ lửa), sao cho vừa đủ để cho que cấy vào.

- Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo một trong các kiểu sau:+ Theo hình zig zac trên toàn bộ mặt thạch+ Theo những đường song song+ Theo hình zig zac 3 hoặc 4 góc.

- Khi dùng que trải, hút sẵn một lượng khoảng 0,1 dịch vi sinh vật nhỏ lên trên bề mặt thạch đĩa. Khử trùng que trải thủy tinh bằng cách nhúng vào cồn và đốt trên ngọn lửa. Làm nguội que trải và trải đều giọt dung dịch vi sinh vật lên khắp bề mặt môi trường thạch đĩa.

Hình. Các kiểu cấy truyền bằng que cấy trên thạch đĩa

Trang 19

(d)

Hình. Cấy truyền bằng que trải trên thạch đĩa3.3. Các điều kiện nuôi cấy của vi sinh vật- Nhiệt độ: Phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật. Duy trì sự ổn định của nhiệt độ đó

bằng tủ ủ vi sinh vật.- Độ ẩm: để duy trì độ ẩm, trong quá trình nuôi cần đảm bảo đủ lượng nước khi làm

môi trường. Trong điều kiện cần thiết có thể phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc để nước bốc hơi trong tủ ấm.

- Oxy: đối với vi sinh vật hiếu khí, cung cấp thường xuyên và đầy đủ oxy. Lớp môi trường nuôi cấy có độ dầy vừa phải. Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp thêm oxy cho vi sinh vật. Nếu nuôi cấy trong môi trường có khối lượng lớn phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ. Đối với vi sinh vật kỵ khí: hạn chế sự tiếp xúc với oxy bằng cách đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vaselin hoặc cấy trích sâu vào môi trường đặc, nuôi cấy trong bình hút chân không, nuôi trong ống nghiệm đặc biệt, sau khi rút hết không khí và hàn kín lại, đun sôi môi trường trong một thời gian để loại hết O2 . Để nguội 450C. Dùng pipet cấy vi sinh vật vào đáy ống nghệm. Làm nguội nhanh rồi đổ vaselin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với oxy.

3.4. Quan sát vi sinh vật sau khi nuôi cấySau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật ta thấy:- Trong môi trường lỏng: Vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường- Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng: Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên vệt

nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục. Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy. - Trong môi trường thạch đứng: Các vi khuẩn kỵ khí phát triển ở đáy của cột môi

trường..4. Những điểm cần lưu ý

- Môi trường thạch phải có bề mặt khô, phẳng. Nếu ống môi trường còn đọng nước cần dựng ống mới cấy vào giá ống nghiệm, tránh nước làm hoen vết cấy.

- Khi tiến hành cấy truyền tránh chạm đầu que cấy dùng để lấy vi khuẩn vào bất cứ vật gì.

- Nếu dịch vi khuẩn cấy truyền rơi xuống mặt bàn cần lau ngay bằng panh kẹp bông thấm cồn hoặc nước sát trùng.

- Khi cấy truyền vi khuẩn, dùng tay trái cầm hai ống nghiệm; ống có vi sinh vật ở xa và ống môi trường ở gần người thao tác. Trước và sau khi cấy truyền xong phải hơ que cấy trên ngọn lửa đèn cồn để vô trùng que cấy.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày phương pháp cấy truyền vi khuẩn, nấm men, nấm mốc?- Nêu các điều kiện nuôi ủ nấm men và vi khuẩn sau khi gieo cấy?- Đĩa petri sau khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa mặt thạch? Giải thích?- Khi cấy truyền vi sinh vật trên ống thạch nghiêng, giải thích tại sao phải ria que cấy

ngược từ đáy ống nghiệm lên phía trên?

Trang 20

BÀI 4PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIỂN

VI QUANG HỌC1. Nguyên tắc

1.1. Giới thiệu về các loại kính hiển via. Kính hiển vi nền đenÁnh sáng thường chiếu từ dưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu hắt vào xung

quanh tiêu bản, những tia sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật kính. Tiêu bản được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia sáng mạnh chiếu vào, giúp thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tia sáng chiếu vào. Chức năng: quan sát hình thái và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi thường khó quan sát.

b. Kính hiển vi đổi phaÁnh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ quang

kính, vật kính và thị kính. Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiên mao, các lớp màng.

c. Kính hiển vi huỳnh quangChùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm màu bằng các chất huỳnh quang.

Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau. Chức năng: quan sát và phân biệt được các cấu trúc khác nhau trong tế bào vi sinh vật.

d. Kính hiển vi điện tửChùm tia điện tử bước sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giải cao,

giúp phân biệt 2 điểm rất gần nhau. Chức năng: dùng quan sát virus, cấu trúc phân tử của tế bào.

e. Kính hiển vi quang họcDùng ánh sáng có bước sóng từ 500nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạo

năng suất phân ly lớn giúp phân biệt 2 điểm cách nhau khoảng 0.2 µm trở lên. Hệ thống phóng to của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận:

Vật kính (quay về phía vật quan sát) và thị kính (quay về phía mắt nhìn). Mỗi bộ phận này là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp, mẫu vật cần quan sát AB được đặt trước vật kính một khoảng cách lớn hơn tiêu cự của vật kính một chút. Ảnh thật đảo ngược A’B’ của vật sẽ thu được ở bên kia vật kính, nằm trong khoảng tiêu cự của thị kính. Thị kính hoạt động như một kính lúp. Qua thị kính, người ta sẽ thấy ảnh ảo A’’B’’ được phóng to lên của ảnh thật A’B’.

Hình. Nguyên tắc quang học của kính hiển viChức năng của kính hiển vi quang học dùng để quan sát tế bào vi sinh vật, ký sinh

trùng, tế bào động vật, thực vật. 1.2. Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang họcKính hiển vi quang học được cấu tạo gồm 2 phần:

Trang 21

Đế kính

Đèn

Tụ quangỐc chỉnh thô

Ốc chỉnh tinh Bàn mang mẫu vật

Tụ quang vật kính Vật kính

Thị kính

Ống kính

Thân kính

- Hệ thống cơ học: giá kính gồm chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính, ổ gắn và xoay vật kính, bàn kính, thanh trượt di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển thanh trượt, kẹp giữ tiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh sơ thô cấp, ốc điều chỉnh thứ cấp (vi cấp).

- Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màn chắn sáng, nguồn chiếu sáng (đèn điện chiếu sáng và/ hoặc kính chiếu sáng). Ngoài ra, ở kính dùng nguồn chiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện, cầu chì, mạch điện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng.

Hình. Cấu tạo kính hiển vi quang học* Nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học- Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng đại

mẫu vật. Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngoài cùng hướng vào tiêu bản có độ phóng đại lớn nhất. Độ phóng đại của kính phụ thuộc tiêu cự, tức bán kính cong của thấu kính. Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năng phóng đại càng lớn.

Có 2 loại vật kính:+ Vật kính khô độ phóng đại nhỏ như x4, x10, x15, x40,.+ Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như x90, x100.

- Thị kính cũng có cấu tạo phức tạp, gồm 2 thấu kính, một hướng về mắt người xem, một hướng về vật kính. Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh do vật kính thu vào, làm ảnh to lên, xem rõ hơn.

Độ phóng đại của kính = độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính.Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính: x100 , độ phóng đại của thị kính: x10 Như vậy: độ phóng đại của kính: 100 x 10 = 1.000 lần.Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính để

chọn kính hiển vi. Năng suất phân ly (độ phân giải) của kính hiển vi là đại lượng cho biết khả năng phân biệt hai điểm của vật quan sát nằm sát nhau. Nếu khoảng cách giữa 2 điểm nằm càng sát nhau mà vẫn có thể phân biệt được thì năng suất phân ly của kính càng cao.

Khoảng cách này phụ thuộc chiều dài sóng ánh sáng sử dụng và số lượng tia sáng đi vào vật kính, được biểu hiện bằng công thức:

Trang 22

Trong đó: λ: Độ dài bước sóng phát ra từ mẫu vật.n: Chỉ số chiết quang của môi trường giữa mẫu vật và vật kính. α: Nửa góc mở của vật kính. 2nsinα: Trị số mở của vật kính.

- Qua đó, ta thấy muốn có độ phân ly cao phải dùng ánh sáng có bước sóng thật ngắn, hoặc dùng vật kính có trị số mở lớn. Nếu dùng vật kính có trị số mở 0,65 và soi với ánh sáng trắng (có bước sóng trung bình α= 0,55 μm) thì khoảng cách nhỏ nhất có thể nhìn thấy rõ được là:

Bảng. Thông số của vật kính và thị kính

Ký hiệu ghi

trên vật kính

Độ phóng đại

của vật kính

Độ mở

(A)

Khoảng cách từ vật

kính đên tiêu bản (mm)

Đường kính vi trường

khi quan sát bằng thị

kính x10 (mm)

Vật kính khô

8 x 0,20 8 0,20 8,91 1,75

10 x 0,25 10 0,25 6,80

40 x 0,65 40 0,65 0,60 0,35

Vật kính dầu

90 x 1,25 90 1,25 0,15 0,15

100 x 1,25 100 1,25 0,12

Chiết suất ánh sáng của không khí nhỏ hơn thủy tinh, nên tia sáng khi đi qua tiêu bản thủy tinh sẽ bị khúc xạ một phần. Phần phía ngoài của tia sáng do bị khúc xạ nên không đi vào được vật kính. Vật kính có độ phóng đại lớn thì đường kính của thấu kính càng nhỏ, lượng tia sáng đi vào được vật kính rất ít, nên không thấy rõ ảnh. Để hạn chế nhược điểm này ta dùng dầu soi có chiết suất ánh sáng gần bằng thủy tinh, thủy tinh và dầu soi được xem như một môi trường đồng nhất. Ánh sáng đi qua không bị khúc xạ, nên tập trung đầy đủ vào vật kính, giúp xem rõ ảnh.

Trang 23

Độ mở

Độ phóng đại

Khoảng cách làm việc

Hình. Tương quan giữa độ phóng đại của vật kính với khoảng cách làm việc từ vật kính đến tiêu bản vi sinh vật

Hình. Nguyên lý của vật kính dầu


2.1. Dụng cụ







5 Que cấy Cái 1

6 Bình tia Cái 1

7 Lame (phiến kính) Tấm 5

8 Lamelle (lá kính) Tấm 5

9 Phiến kính lõm Tấm 1

10 Kính hiển vi Cái 1




2.2. Hóa chất- Cồn 96o

- Dịch xà phòng loãng

Trang 24

Nguồn sáng

Đèn tụ quang

Dầu soi kính

Ánh sáng bị khúc xạ nếu kkông có dầu soi kính

Ánh sáng không bị khúc xạ

Thấu kính của vật kính dầu

Tiểu bản

Con ngươi diaphragm

- Dung dịch Xylen2.3. Chủng giống vi sinh vật dùng quan sát- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea- Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini- Vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis


- Giấy lọc



3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Làm tiêu bản vi sinh vật sốnga. Làm tiêu bản giọt ép- Dùng que cấy hoặc ống hút chuyển giống vi sinh vật từ ống nghiệm nuôi cấy lên tấm

phiến kính. Nếu vi sinh vật được nuôi trên môi trườn thạch, khi làm tiêu bản, nhỏ sẵn một giọt nước muối sinh lý lên phiến kính, sau đó hòa sinh khối vi sinh vật vào giọt nước muối này.

- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí giữa hai tấm kinh. Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống.

- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10 rồi x40.- Chú ý:

+ Nếu giọt dịch nhiều quá, tràn ra phần ngoài tiếp xúc của phiến kính và lá kính ta dùng giấy thấm bớt nước đi.

+ Nếu cần quan sát tiêu bản lâu thì dùng vazơlin bôi quanh mép lá kính để giọt dịch khỏi bị khô.

b. Làm tiêu bản giọt treo Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di

động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích. - Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa. - Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính. - Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi dặt lên

phần lõm của phiến kính.- Chú ý không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào phần đáy của phần lõm trên

phiến kính. - Đặt tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10 rồi x40.Ưu điểm của loại tiêu bản này so với tiêu bản giọt ép là giúp ta quan sát tế bào vi sinh

vật sống dễ dàng hơn và lâu hơn.

Hình. Tiêu bản giọt ép và tiêu bản giọt treo3.2. Sử dụng kính hiển vi quan sát tiêu bản vi sinh vật sống

Trang 25

Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm để lau các bộ phận của kính (Chú ý: chỉ lau bên ngoài, không tháo rời các bộ phận của kính), để kính ngay ngắn vừa với tầm ngồi, sau đó tiến hành tuần tự các bước tiếp theo để soi tiêu bản.

* Bước 1: Chuẩn bị kính. Cắm điện, bật công tắc kính, điều khiển núm chỉnh ánh sáng ở đế kính để có được

ánh sáng thích hợp. Xoay vật kính nhỏ nhất (vật kính 10x) về trục kính như trên.* Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính. - Trước khi đặt tiêu bản vào mâm kính, phải chọn mặt phải, mặt trái của tiêu bản. Mặt

phải của tiêu bản thường có dán lamen, dán nhãn (nếu có lamen và nhãn) hoặc làm giảm bớt độ lóa của gương khi để nghiêng soi ra ánh sáng (nếu không có lamen, không có nhãn).

- Để mặt phải của tiêu bản lên trên, tay phải mở kẹp tiêu bản, tay trái cầm phía đầu nhãn tiêu bản, đặt tiêu bản vào mâm kính và tay phải thả kẹp giữ tiêu bản ra. Tiêu bản được giữ chặt vào xe đẩy, trên mâm kính.

- Dùng ốc xe đẩy để điều chỉnh sao cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính (giữa lổ mâm kính)

Chú ý: Có thể dùng điểm sáng của hộp tụ quang để làm điểm chuẩn khi điều chỉnh mẫu vật về điểm trục kính, nếu mẫu vật nhỏ quá.

* Bước 3: Quan sát. Nguyên tắc bắt buộc khi quan sát là phải quan sát được ở vật kính có độ phóng đại

nhỏ, rồi mới chuyển sang quan sát ở vật kính có độ phóng đại lớn hơn kề nó. Xem tiêu bản ở vật kính X10- Hạ tụ quang kính xuống dưới (tức tăng khoảng cách tụ quang với tiêu bản, thị trường

mờ đi). - Xoay vật kính x10 vào khớp của ổ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang). Mắt nhìn vào bàn đặt tiêu bản (không nhìn vào thị kính), hai tay xoay ốc điều chỉnh sơ

cấp đưa dần vật kính hướng đến tiêu bản (không được chạm vào tiêu bản). - Đặt mắt hướng vào thị kính, hai tay xoay chậm ốc điều chỉnh sơ cấp hướng ra xa tiêu

bản đến khi mắt thấy rõ dần tiêu bản mẫu vật thì dừng lại. Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất.

- Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính với tiêu bản và màng chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất.

Xem tiêu bản ở vật kính X40- Nâng tụ quang kính lên vừa phải (thị trường sáng hơn).- Xoay vật kính X40 vào khớp của ổ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang). - Đặt mắt hướng vào thị kính, có thể nhìn thấy ngay hình thái của mẫu vật (đôi khi

không rõ lắm). Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnh cho ảnh rõ nhất. - Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kính

với tiêu bản và màng chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất.* Quan sát vi sinh vật- Xem chi tiết hình dáng, màu sắc của nấm mốc: khuẩn ty, vách ngăn khuẩn ty, cuống

bào tử, thể bọng, thể bình, túi bào tử, cách sắp xếp của bào tử,... Xem tổng thể hình dáng của nấm mốc ở vật kính x10, vẽ hình.

- Tế bào nấm men: Xem ở vật kính x40 quan sát hình dạng tế bào: tế bào đứng riêng lẻ hay kết dính tạo sợi giả - sợi thật, trạng thái nảy chồi. Vẽ hình một thị trường kính hiển vi ở vật kính X40, có các tế bào nấm men.

- Xem trạng thái của tế bào vi khuẩn: di động hay đứng yên, kiểu di động của tế bào, hình dạng của tế bào.

3.3. Bảo quản kính hiển vi- Sau khi sử dụng xong, xoay tất cả các vật kính ra trước, mở kẹp tiêu bản, lấy tiêu

bản ra trả về chỗ cũ, hạ mâm kính, hạ hộp tụ quang. Dùng hai tay bê kính cất vào tủ chống ẩm (tủ bảo quản kính hiển vi).

- Phải giữ gìn kính luôn luôn sạch sẽ, không để bụi bẩn và hóa chất dính vào. Luôn

Trang 26

luôn giữ kính ở nơi khô ráo, mát mẻ để các bộ phận quang học không bị mốc. - Khi lau kính, khi sử dụng kính, không được tháo rời các bộ phận của kính. Không

được dùng tay xoa trên mặt các thấu kính, mà nên dùng một bút lông nhỏ sạch để chải bụi ở các mặt kính hoặc dùng bông mềm, sạch để lau.

- Nếu sử dụng vật kính x100 thì phải dùng dung dịch phù hợp thấm vào giấy chuyên dụng để lau sạch dầu cede đầu vật kính x100.

- Tránh mọi sự va chạm mạnh vào kính, không đánh đổ, đánh rơi kính. Nếu di chuyển kính ra khỏi phòng thí nghiệm, nhất thiết phải đưa kính vào hộp của nó có chèn lót cẩn thận.

- Nếu phát hiện có 1 hư hỏng nào đó, nhất thiết không được tự ý tháo ra sửa chữa mà phải báo với cán bộ hướng dẫn biết để xử lý.4. Những điểm cần lưu ý

- Sau khi sử dụng xong phải vệ sinh cẩn thận kính hiển vi theo mục 3.3 trước khi giao trả.

- Trong quá trình sử dụng, nếu không quan sát thi phải tắt đèn của kính để tránh gây nóng và cháy đèn.

- Không được tháo rời các bộ phận của kính hiển vi.- Các tiêu bản vi sinh vật sống sau khi quan sát xong phải khử trùng trước khi rửa.- Không được nhúng các vật kính x4, x10, x40 vào trong giọt dầu khi quan sát.

5. Báo cáo thực tập- Trình bày cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi?- Vẽ hình các tiêu bản vi sinh vật quan sát? Chú thích hình vẽ?

Trang 27

BÀI 5PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VI SINH VẬT

1. Nguyên tắcNhuộm màu là quá trình làm cho tế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật có

màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm. Nhuộm màu vi sinh vật nhằm mục đích:- Giúp dễ dàng hóa việc quan sát hình dạng tế bào, các thành phần cấu trúc của tế bào

vi sinh vật trên kính hiển vi.- Giúp phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau do việc ăn màu khác nhau đối với các

loại thuốc nhuộm tạo điều kiện cho việc phân loại, định dang vi sinh vật (nhuộm màu Gram).Tùy theo từng loại vi sinh vật, tuỳ theo từng cấu trúc tế bào muốn nhuộm, ta có nhiều

phương pháp nhuộm màu khác nhau. Mỗi phương pháp nhuộm cũng có nguyên tắc nhuộm khác nhau.

Đối với các phương pháp nhuộm màu không cố định vi sinh vật, thường sử dụng các loại thuốc nhuộm không hoặc ít độc đối với vi sinh vật và được pha loãng đảm bảo cho vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm

Đối với các phương pháp nhuộm màu vi sinh vật được cố định, thường sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững.


2.1. Dụng cụ







5 Que cấy Cái 1

6 Bình tia Cái 1

7 Lame (phiến kính) Tấm 5

8 Lamelle (lá kính) Tấm 5

9 Phiến kính lõm Tấm 1

10 Chậu thủy tinh Cái 1

11 Que thủy tinh hình chữ U Cái 1


13 Phiến kính Tấm 5

14 Lá kính Tấm 5


Trang 28





- Dịch xà phòng loãng- Dung dịch Xylen- Thuốc nhuộm Fuchsin Zeihl loãng và đậm đặc- Thuốc nhuộm Safranin O- Thuốc nhuộm Crystal violet (tím kết tinh)- Dung dịch lugol- Dung dịch Xanh methylen- Dầu soi kính (dầu Bách hương – dầu cede)* Dung dịch tím kết tinh (crystal violet - C25H30N3Cl.9H2O = 570,11): 2g tím kết tinh

hoà tan trong 20 ml ethanol 95%; 0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất. Trộn hai dịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc. Bảo quản trong lọ tối, sử dụng trong vài tháng.

* Dung dịch lugol: Hoà tan 1g Iod trong 3-5 ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide), khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300 ml. Bảo quản trong lọ tối.

* Dung dịch tẩy màu: Ethanol 96% hoặc trộn hỗn hợp 70 ml ethanol 96% với 30 ml aceton hoặc trộn 100ml ethanol 96% với 4ml I2 10%.

* Dung dịch nhuộm bổ sung: Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O (C20H19N4Cl = 350,80) 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%. Hoặc chuẩn bị sẵn dung dịch Fuchsin Ziehl: fuchsin kiềm (C19H18N3Cl = 323,82) 1g, phenol 5g, ethanol 90% 10 ml, nước cất 200 ml (hòa tan fuchsin với ethanol; hòa tan phenol với nước cất sau đó trộn lại).

* Dung dịch xanh methylen: hoà 1g xanh methylen vào 10ml ethanol 96%. Bổ sung nước cất đủ 100ml.

* Dung dịch lục malachite 50%: hoà 5g lục malachite vào 100ml nước cất.* Thuốc nhuộm Nishikawa Kangen- Dung dịch A: hoà tan 5g acid tanic vào 100ml nước cất, vừa khuấy vừa bổ sung thêm

theo thứ tự 1,5g FeCl3, 2ml Formalin, 1ml NaOH4%. Giữ trong chai màu được 6 giờ.- Dung dịch B: hòa tan 2g AgNO3 vào 100ml nước cất. Lấy ra 10ml cho vào 1 cốc,

hêm từng giọt NH4OH, lắc đều cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt thì dừng lại (khoảng 5-6 giọt). Đổ dung dịch này vào phần còn lại của dung dịch B, lắc đều. Giữ trong chai màu.

* Dung dịch Carbon Fuchsin: - Dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà trong nước cất (10%): 10 ml- Dung dịch acid carbolic 5% trong nước cất: 100 ml Trộn đều 2 dung dịch với nhau2.3. Chủng giống vi sinh vật dùng quan sát- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea- Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini- Vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis2.4. Nguyên liệu khác- Giấy lọc- Bông không thấm- Bông thấm nước- Giấy lau kính

3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Làm tiêu bản nhuộm màu vi sinh vật không cố định- Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên phiến kính.

Trang 29

- Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật vào giọt thuốc nhuộm.

- Đậy lá kính lên giọt dịch.- Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40)3.2. Làm tiêu bản nhuộm màu vi sinh vật cố địnhCó hai cách nhuộm chính:- Nhuộm đơn : Chỉ dùng 1 loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản.- Nhuộm kép : Dùng đồng thời 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản (nhuộm

Gram, nhuộm bào tử, nhuộm Ziehl – Neelsen...)Quy trình nhuộm được thực hiện như saua. Tạo vết bôi và cố định vi sinh vật- Lau nhẹ tiêu bản sạch bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn. - Dùng bút chì mỡ hoặc bút lông ghi tên mẫu, và vẽ vòng tròn đường kính ≈15mm,

ở mặt dưới lame kính để đánh dấu vết khuẩn phía trên lame. - Đốt nóng đỏ que cấy (trước và sau khi thao tác), mở nút bông, hơ nhanh miệng ống

nghiệm. * Trường hợp 1: mẫu nuôi cấy trong canh dinh dưỡng, đưa đầu que cấy vào miệng

ống nghiệm (vẫn giữ gần ngọn lửa), nhúng vào dung dịch canh cấy, lấy 1 vòng que cấy. Lấy que cấy ra, hơ nhanh miệng ống nghiệm và nút bông, đậy nút bông lại. Phết canh khuẩn trên vòng que cấy vào mặt trên lam, giữa vòng tròn, dàn đều ra xung quanh.

* Trường hợp 2: mẫu nuôi cấy trong thạch dinh dưỡng, nhỏ giọt dung dịch NaCl 9‰ lên giữa vòng tròn (mặt trên lam). Thao tác giống trường hợp 1, nhưng dùng cạnh vòng tròn của đầu que cấy đặt nhẹ lên khuẩn lạc vi khuẩn, rồi đặt vào giọt NaCl 9‰ trên lam, dàn mỏng và đều.

- Cố định mẫu: Mục đích giết chết vi khuẩn, làm cho vi khuẩn bám chặt vào lame và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống . Cố định mẫu bằng cách để khô tự nhiên hoặc hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn

Trang 30

Vi sinh vật từ môi trường thạch

Vi sinh vật từ môi trường lỏng

1 giọt nước

1 ít vk phát triển

Que cấy thẳng

Que cấy vòng

1-2 vòng cấy vi khuẩn

Dàn trãi giọt huyền phù vi

khuẩn

Dàn trãi hỗn hợp nước –vi

khuẩn

Làm khô trong không khí

Cố định bằng nhiệt

Hình. Tạo vết bôi và cố định vi sinh vậtb. Nhuộm đơn- Đặt tiêu bản vi sinh vật cố định lên que thuỷ tinh hình chữ U (đặt nằm ngang miệng

một chậu thuỷ tinh).- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin Ziehl, để yên từ 1 - 2 phút.- Rửa vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹ

qua vết bôi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa - Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn - Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 40) rồi chuyển sang vật kính (x100) dùng dầu soi.

Hình. Quy trình nhuộm đơnc. Phương pháp nhuộm Gram Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn

thành 2 nhóm Gram dương (Gram positive) và Gram âm (Gram negative) dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 -1938). Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884, về sau được Hucker và nhiều người khác cải tiến. Quy trình nhuộm Gram như sau:

- Đặt tiêu bản vi sinh vật cố định lên que thuỷ tinh hình chữ U (đặt nằm ngang miệng một chậu thuỷ tinh). Đặt lên bề mặt vết bôi một tấm giấy thấm.

- Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước.- Cẩn màu tím kết tinh lên tế bào i sinh vật bằng cách thêm dung dịch lugol và giữ

trong 1 phút, rửa nước.

Trang 31

Giá đỡ chữ U

Bocan hoặc nơi để thích hợp

Bình đựng thuốc nhuộm

Bình đựng nước

Làm khô

http://vi.wikipedia.org/wiki/Vi_khu%E1%BA%A9n

http://vi.wikipedia.org/wiki/T%E1%BA%BF_b%C3%A0o

- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước. - Nhuộm bổ sung màu bằng dung dịch safranin O hoặc fuchsin Ziehl trong 1 phút, rửa

nước, làm khô. Lần nhuộm này cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm, nhưng vi khuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏ vàng (nhuộm safranin O) hay đỏ tía (Fuchsin Ziehl).

- Quan sát tiêu bản ở vật kính dầu x90 hay x100. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu xanh đen hay tím, Gram âm bắt màu đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía (fuchsin).

* Xem tiêu bản ở vật kính x90, x100- Nâng tụ quang kính lên sát tiêu bản, mở cường độ sáng tối đa (thị trường sáng

nhất). - Xoay vật kính x100 vào khớp của trụ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang).- Nhỏ một giọt dầu soi vào giữa tiêu bản. - Mắt nhìn vào bàn đặt tiêu bản (không nhìn vào thị kính), hai tay xoay ốc điều chỉnh

sơ cấp đưa dần vật kính hướng đến tiêu bản vừa chạm vào tiêu bản thì dừng lại. - Đặt mắt hướng vào thị kính, hai tay xoay chậm ốc điều chỉnh sơ cấp hướng ra xa tiêu

bản đến khi mắt thấy rõ dần tiêu bản mẫu vật thì dừng lại. - Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang

kính với tiêu bản và chỉnh màng chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất.

Hình . Sự biến đổi màu của vi khuẩn Gram dương, Gram âm khi nhuộm Gram

Trang 32

Tím kế tinh; 30 giây Rửa nước; 5 giây

Bổ sung dung dịch lugol; 30 giây Rửa nước; 5 giây

Rửa nước; 5 giâyTẩy màu; 15- 30 giây

Nhuộm safranin; 60-80 giây Rửa nước; 5 giây

Làm khô bằng giấy mềm

Hình. Quy trình nhuộm Gramd. Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen (Nhuộm kháng acid - Dùng phân biệt

vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis với các vi khuẩn khác)Do tế bào vi khuẩn kháng acid có lớp vỏ sáp bao bọc nên khi đã nhuộm được phức

hợp màu carbolfuchsin, phức hợp này sẽ không bị tẩy màu bởi dung dịch tẩy màu mạnh (acid, alcool acid). Tuy nhiên để phức hợp màu này có thể thấm xuyên qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn, có hai cách: (1) Đun nóng phết nhuộm với dung dịch màu carbolfuchin, nhờ đó mà carbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn; đây là phương pháp nhuộm nóng Ziehl - Neelsen. (2) Phương pháp thứ hai là phương pháp nhuộm lạnh còn gọi là phương pháp Kinyoun, trong phương pháp này người ta dùng dung dịch carbolfuchsin đậm đặc, nhờ vậy khi phủ dung dịch màu đậm đặc này lên phết nhuộm với thời gian lâu, carbolfuchsin vẫn có thể thấm qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn.

Quy trình nhuộm như sau:- Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U, đặt trên chậu

nhôm trên bếp điện.- Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính.- Nhỏ dung dịch Fuschin đậm đặc thấm ướt hết giấy lọc, đun nóng liên tục từ 5 – 7

phút (chú ý không được làm sôi thuốc nhuộm). - Trong khi đun phải nhỏ bổ sung thuốc nhuộm liên tục để giấy lọc luôn thấm ướt.- Rửa nước, thấm khô. - Tẩy cồn – acid đến khi không còn màu hồng của Fuschin đậm đặc (khoảng 30 giây).

Rửa nước.- Nhuộm bổ sung bằng xanh methylen trong thời gian 2 phút.- Rửa nước, thấm khô. - Quan sát bằng vật kính dầu x90 hay x100 - Vi khuẩn lao (vi khuẩn kháng acid) bắt màu hồng đỏ cánh sen của Fuschin, vi khuẩn

khác bắt màu xanh methylen.

Trang 33

Làm lạnh và rửa với nước; 30s

Rửa với nước; 5s

Nhỏ Fucshin làm ướt giấy lọc, đun nóng 5-7 phút (không để sôi)

Tẩy màu bằng hỗn hợp acid – alcolh đến mất màu hồng; 10-30s

Nhuộm bổ sung methyl blue; 2 phút

Rửa với nước; 30s

Làm khô với giấy mềm

Hình. Quy trình nhuộm Ziehl – Neelsene. Nhuộm bào tửMột số vi khuẩn như Bacillus hay Clostridium có khả năng tạo thành bào tử. Bào tử

có thể tồn tại trong môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chịu được nhiệt và một số các hóa chất mà thể sinh dưỡng không thể.

Bào tử rất khó nhuộm bởi đa số các thuốc nhuộm do màng bào tử dày, chắc, khó bắt màu và chứa nhiều lipid. Vì thế, cần thiết phải có những phương pháp nhuộm đặc biệt đối với bào tử. Tuy nhiên, đối với bất kì phương pháp nào thì tế bào trước hết được xử lý bằng nhiệt hay/và acid để tế bào chất bào tử dễ bắt màu. Sau đó, nhuộm cả tế bào chất của bào tử và tế bào với thuốc nhuộm có tính hoạt nhuộm mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất đi và nhuộm nó với một thuốc nhuộm phân biệt khác. Khi đó, tế bào chất sẽ mang một màu, và bào tử sẽ mang màu khác. Đôi khi bào tử được nhìn thấy bên trong tế bào. Hình thái của bào tử còn giúp nhận diện vi khuẩn. Hình dáng và kích thước bào tử phụ thuộc vào vị trí của nó trong tế bào và kích thước bề ngang của tế bào mang nó. Bào tử thường nằm trong tế bào sinh dưỡng ở ba vị trí khác nhau: nếu nằm ở tâm tế bào thì được gọi là bào tử kiểu Bacillus, nếu nằm lệch tâm – kiểu Clostridium và nếu nằm ở cực tế bào thì gọi là bào tử kiểu Plectidium. Ở một số giống vi khuẩn khác, các bào tử có thể tồn tại tự do bởi vì các tế bào xung quanh nó đã tan rã.

Có thể dùng 1 trong 3 hỗn hợp thuốc nhuộm sau để nhuộm bào tử:- Lục malachite và thuốc nhuộm safranin.- Fuschin, HCl 0.5%, H2SO4 1%, và xanh methylene (Loeffler).- Xanh methylene và đỏ trung tính.Quy trình nhuộm như sau:* Với thuốc nhuộm lục malachite và thuốc nhuộm safranin - Chẩn bị vết bôi trên phiến kính sạch và hơ nóng nhẹ. - Thêm 1 ít nước vào chậu nhôm và đun sôi. - Đặt giá nhuộm lên chậu nhôm rồi đặt phiến kính lên nó. - Đặt nhẹ mẫu giấy thấm (nhỏ hơn phấn kính một chút) lên trên phiến kính.Mẫu giấy

này sẽ giúp giữ thuốc nhuộm lại trên phiến kính.- Phủ phiến kính với thuốc nhuộm lục malachite và hơ hơi nước trong vòng 5 phút.- Tiếp tục thêm thuốc nhuộm để tránh tình trạng thuốc nhuộm bị khô trên phiến

kính.- Khử màu với nước trong 30 giây bằng cách cho nước chảy lên phiến kính. Các tế bào

sinh dưỡng sẽ bị mất màu, còn bào tử sẽ giữ màu lại. - Nhuộm lại với safranin trong 30 giây rồi rửa lại với nước trong 30 giây nữa. Thấm

khô cẩn thận. Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính đâu (x100). Bào tử sẽ có màu xanh còn tế bào sinh dưỡng sẽ có màu hồng. Ghi lại kết quả.

* Với thuốc nhuộm Fuschin, HCl 0,5, H2SO4 1% và xanh methylene

Trang 34

- Làm vết bôi trên mọt phiến kính sạch và để khô tự nhiên.- Nhỏ vài giọt HCl 0.5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho bốc hơi trong

2 phút rồi rửa với nước. - Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuschin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng cho đến khi

bốc hơi trong vòng 5 phút. - Rửa vết bôi bằng nước - Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút. - Rửa vết bôi bằng nước. - Nhuộm vết bôi bằng xanh methylene trong 5 – 15 phút. - Rửa lại với nước và để khô tự nhiên. - Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100). Bào tử sẽ có màu xanh còn tế

bào sinh dưỡng sẽ có màu xanh. Ghi lại kết quả. * Với thuốc nhuộm Xanh methylene và đỏ trung tính- Làm vết bôi trên một phiến kính sạch.- Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. - Nhuộm xanh methylene trong 1 phút có hơ nóng từ bên dưới - Rửa vết bôi bằng nước cho đến khi hết màu.- Nhuộm với đỏ trung tính 0.5% trong 1 phút.- Rửa lại bằng nước, để khô. - Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100).Bào tử sẽ có màu xanh còn tế bào

sinh dưỡng sẽ có màu đỏ. Ghi lại kết quả.

Hình. Quy trình nhuộm bào tửf. Phương pháp nhuộm tiêm maoTiên mao là cơ quan di động của vi khuẩn. Tiêm mao có kích thước rất mỏng, chiều

rộng khoảng 0,01-0,05 μm, chiều dài thay đổi tùy loài.Một số loài có một tiên mao (đơn mao), một số loài mỗi đầu có một sợi (song mao),

một số có một chùm ở một đầu hoặc mỗi đầu (chùm mao) và một số khác có tiên mao mọc khắp xung quanh tế bào (chu mao)…

Vì tiên mao rất mảnh nên phải nhuộm bằng phương pháp đặc biệt với nguyên tắc là

Trang 35

Nhỏ malachite green làm ướt giấy lọc và đun sôi 5 phút

Rửa với nước 30s

Rửa với nước 30sBổ sung safranin 60-90s

Làm khô với giấy mềm

tăng đường kính của tiên mao bằng cách trầm hiện hóa chất và thuốc nhuộm trên tiên mao. Thao tác phải rất nhẹ nhàng, thận trọng. Thường sử dụng hỗn hợp thuốc nhuộm Nishizawa Kangen. Quy trình nhuộm như sau:

- Chuẩn bị giống vi khuẩn nuôi trên môi trường thạch 16-18 giờ.- Chuẩn bị vết bôi vi sinh vật trên lame kính.- Để vết bôi khô tự nhiên trong không khí, không được đốt.- Nhuộm bằng dung dịch A trong 15 phút.- Rửa lame kính để làm sạch thuốc nhuộm: đặt nghiêng lame kính vào một cố nước

đầy. Nghiêng cốc nước về phía tấm kính để vòng thuốc nhuộm tách xa lame kính và rút từ từ lame kính lên.

- Nhuộm bằng dung dịch B trong 10-15 phút. Theo dõi đến khi thấy vết bôi bắt đầu nâu rõ thì dừng lại.

- Nhúng từ từ lame kính vào một cốc nước sạch, giữ 30 giây rồi lấy lame kính ra như ở trên.

- Để khô tự nhiên.- Quan sát với vật kính dầu x100. Tiêm mao vi khuẩn có màu hồng nâu.

4. Những điểm cần chú ý- Tuổi của giống phải thích hợp: cần chuẩn bị ống giống trước khi nhuộm từ 16 đến 24

giờ nuôi ở nhiệt độ thích hợp, vì tế bào già thường thường mất khả năng giữ màu thuốc nhuộm tím kết tinh khi tẩy bằng ethanol.

- Vỏ nhầy của một số vi khuẩn có ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Gram. Để nhuộm Gram cần nuôi chúng trong các môi trường chứa ít đường để hạn chế việc hình thành vỏ nhầy.

- Khử màu là bước quan trọng và cần kĩ năng nhất định, vì khả năng bắt màu Gram dương không phải là "tất cả hoặc không".

- Không được hơ tấm lam có vết bôi vi sinh vật quá nóng trên ngọn lửa, có thể làm cháy và làm thay đổi hình dạng tế bào vi sinh vật.5. Báo cáo thực tập

- Sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có màu đỏ vàng hay đỏ tía. Giải thich nguyên nhân?- Nếu không nhuộm bổ sung thuốc nhuộm safranin hoặc fuchsin, vi khuẩn Gram âm

có màu gì? Tại sao?- Vẽ hình thị trường kính hiển vi có vi sinh vật trong trường hợp nhuộm vi sinh vật

không cố định và nhuộm vi sinh vật cố định?

Trang 36

BÀI 6PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT

1. Nguyên tắcPhân lập vi khuẩn là một quá trình tách rời một loại vi sinh vật từ quần thể vi sinh vật,

sau đó gieo chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc. Sau khi ủ ở các điều kiện thích hợp các vi vi sinh vật sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể mọc riêng biệt gọi là khuẩn lạc. Một ít tế bào hoặc bào tử trong khuẩn lạc được cấy truyền vào ống môi trường giữ giống và ủ ở các điều kiện thích hợp để chúng phát triển thành quần thể mới. Quần thể vi sinh vật trong ống nghiệm này được gọi là một chủng vi sinh vật hoặc là ống giống. Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật.

Chủng vi sinh vật thuần khiết (hay còn gọi là chủng sạch) được hiểu là thế hệ con, cháu, dòng có nguồn gốc từ một tế bào riêng lẻ. Các chủng vi sinh vật được thu nhận từ khuẩn lạc phân lập lần đầu chưa chắc đã thuần khiết vì một khuẩn lạc có thể được hình thành bởi một hoặc nhiều tế bào, bào tử, vì thế phải làm sạch nhiều lần mới thu được chủng vi sinh vật thuần khiết.

Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết: Với hầu hết các loại mẫu nghiên cứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau:

- Lựa chọn nguồn phân lập vi sinh vật- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu.- Phân lập vi sinh vật thuần khiết.- Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc.


2.1. Dụng cụ










8 Bình tia Cái 1


10 Pipette 1ml Cái 2


12 Quả bóp cao su Cái 1

13 Micropipette 100-1000μl Cái 1

Trang 37



14 Đầu típ 1000μl Cái 10

15 Đĩa petri 90mm Cái 3

16 Que trải vi sinh vật Cái 1






5 Tủ sấy Cái 1

6 Tủ ấm Cái 1


- Môi trường cao thịt – pepton: dùng để nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

- Môi trường Hansen: dùng để nuôi cấy và phân lập nấm men

- Môi trường Czapeck: dùng để nuôi cấy và phân lập nấm mốc


- Đất vườn- Quả nho chín- Thị tươi- Bông không thấm- Bông thấm nước

3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Lựa chọn nguồn phân lập vi sinh vậta. Nguồn phân lập nấm mốc- Một số chủng nấm mốc như Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Mucor…có thể

phân lập các loài nấm mốc này trên cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô ít ngày.- Thông qua màu sắc của mốc để nhận diện.

+ Mốc có màu trắng: Có thể là Mucor hay Rhizopus.+ Mốc có màu đen là Aspergillus niger.+ Mốc có màu xanh lục là Penicillium italicum. Loại mốc này thường có trên

vỏ cam, chanh để lâu ngày b. Nguồn phân lập nấm men- Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ các môi trường như: bề mặt trái cây và dịch ép

một số trái cây như táo, lê, nho, dâu, mơ, dứa, trong rượu nếp, trong các bánh men rượu, trong bia, trong nước mía, trong hạt kefia

- Nấm men này khi quan sát trên kính hiển vi thường có dạng hình cầu hay hình trứng. Tế bào có kích thước lớn, có khả năng nảy chồi. Khuẩn lạc cho màu trắng sữa

c. Nguồn phân lập vi khuẩn- Có thể phân lập vi khuẩn từ đất, nước giải khát (nước mía), nước thải, thực phẩm

Trang 38

tươi (thịt, cá, sữa tươi, rau quả tươi…), thực phẩm bị ôi thiu…

Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch3.2. Kỹ thuật cuôi cấy tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trên các môi

trường phân lậpa. Yêu cầu- Nếu mẫu ban đầu ở dạng rắn phải đưa về dạng lỏng bằng cách:

+ Nghiền mẫu.+ Hoà tan mẫu trong nước cất vô trùng. Sau thực hiện như mẫu là dạng lỏng.+ Thực hiện sự pha loãng theo phưpưng pháp pha loãng thập phân cho đến khí

đạt được nồng độ cần thiết.+ Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó.

- Nếu nguồn mẫu phân lập ở dạng lỏng có thể cấy trực tiếp hoặc pha loãng để làm giảm mật độ.

Hình. Kỹ thuật pha loãng thập phânb. Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn các vi sinh vật hiệu khí - Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn. Một số

kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T, kỹ thuật ria bốn góc, kỹ thuật ria tia, kỹ thuật ria liên tục

Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn được thực hiện như sau:* Kỹ thuật hộp ria- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống.- Ria các đường trên đĩa pêtri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốn góc).

Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo.

- Bao gói đĩa pêtri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.

Trang 39

Nguồn mẫu phân lập

Hình dạng

Mép khuẩn lạc

Mặt bên

Dạng điểm Hình tròn Hình bất kìDạng sợi Rể giả Mọc dựng đứng

Dẹp Hình cái gốiDày Lồi Lồi nhấp nhô

Tròn đềù Nhăn Phân thùy Khe rảnh Dạng sợi xoăn

Hình. Kỹ thuật hộp ria* Kỹ thuật hộp trải- Dùng micropipette và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa

giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri.- Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 70o, hơ qua ngọn lửa để khử trùng.

Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.- Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu

thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bề mặt môi trường.

- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.

* Kỹ thuật hộp đổ- Dùng micropipette và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1 m dịch chứa giống

vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri.- Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguộ đến 45 - 550C vào đĩa

petri đã cấy mẫu.- Xoay nhẹ đia petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch

giống được trộn đều trong môi trường cấy.- Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên.c. Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn các vi sinh vật kị khí- Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khí

trong môi trường.- Để nguội môi trường còn 45 - 500C.- Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục

ống nghiệm.- Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật nhanh

nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí.- Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độ thích

hợp.- Nuôi trong bình yếm khí: sau khi cấy vi khuẩn xong, cho vào bình yếm khí. Thoa

một lớp parafin lỏng lên miệng bình, đốt đèn cồn hay đèn cầy lên và đặt vào bình, đậy nắp lại, hoặc dùng máy hút chân không hoặc dùng túi kỵ khí. Cho vào tủ ấm, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.

- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường, dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp.

Trang 40

Hình. Bình nuôi cấy kỵ khí và túi kỵ khí Gaspak3.3. Phân lập thuần khiết- Cấy vi sinh vật từ khuẩn lạc mọc tách rời trên đĩa petri vào ống môi trường thạch

nghiêng mới.- Nuôi vi sinh vật ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.- Loại bỏ các ống bị nhiễm, chọn ra các ống có các chủng thuần khiết.3.4. Kiểm tra độ tinh khiết của giống mới phân lậpCó nhiều cách kiểm tra a. Kiểm tra bằng cách quan sát vết cấy- Quan sát sự sinh trưởng của vi sinh vật qua vết cấy trên môi trường đặc.- Nếu vết cấy có bề mặt và màu sắc đồng đều, thuần nhất chứng tỏ giống mới phân lập

tinh khiết thì giữ lại.- Nếu vết cấy không thuần nhất thì loại bỏ.b. Kiểm tra lại độ thuần chủng của các loại khuẩn lạc- Chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trên môi trường thạch nghiêng.- Tách các khuẩn lạc này ra và hoà tan, pha loãng ở nồng độ cần thiết trong nước cất

vô trùng.- Nhỏ 1 giọt dịch trên vào đĩa pêtri có môi trường.- Dùng 1 que gạt phân phối giọt dịch đều khắp mặt thạch đĩa pêtri thứ nhất, rồi đĩa thứ

2, thứ 3.- Đặt các đĩa pêtri trên vào tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp tuỳ loại vi sinh

vật.- Sau lấy ra quan sát các khuẩn lạc riêng rẽ. Sự thuần khiết của khuẩn lạc là biểu hiện

sự thuần khiết của giống.c. Kiểm tra trên kính hiển vi- Lấy sinh khối vi sinh vật từ ống nghiệm phana lập, làm tiêu bản sống, tiêu bản

nhuộm màu quan sát trên kính hiển vi.- Sự đồng nhất về hình dạng, kích thước, màu sắc của các tế bào vi sinh vật là biểu

hiện sự thuần khiết của giống vi sinh vật vừa phân lập. 4. Những điểm cần lưu ý

- Các hộp thạch môi trường phải vô trùng có bề mặt khô nước và có độ rắn chắc, không gồ ghề, giúp các khuẩn lạc vi khuẩn mọc rời nhau ra.

- Để phòng sự nhiễm tạp do không khí bẩn, các thao tác phải tuyệt đối vô trùng.- Các chủng sau khi làm sạch cần được kiểm tra lại bằng cách quan sát hình dạng tế

bào dưới kính hiển vi cũng như xác định lại các hoạt tính đã biết.- Việc tạo ra một chủng vi khuẩn thuần khiết cũng như bảo quản khỏi bị tạp nhiễm là

việc làm có ý nghĩa rất lớn trong học tập, nghiên cứu cũng như sản xuất.

Trang 41

5. Báo cáo thực tập- Trình bày các nguyên tắc và phương pháp phân lập vi khuẩn thuần khiết?- Nguyên tắc của việc nuôi tích lũy?- Thế nào là chủng vi khuẩn thuần khiết (chủng sạch)?

Trang 42

BÀI 7PHƯƠNG PHÁP BẢO QUẢN GIỐNG VI SINH VẬT

1. Nguyên tắc

Bảo quản giống vi sinh vật là công việc hết sức cần thiết do chúng dễ bị thoái hoá nếu không được bảo quản đúng kỹ thuật. Bảo quản vi sinh vật có tầm quan trọng làm nền tảng cho các nghiên cứu cơ bản và ứng dụng liên quan đến nhiều lĩnh vực: sinh học, y học, nông nghiệp và môi trường.

Công việc bảo quản giống là thực hiện các kỹ thuật cần thiết để giữ cho vi sinh vật có tỷ lệ sống sót cao, các đặc tính di truyền không bị biến đổi và không bị tạp nhiễm bởi các vi sinh vật lạ.

Quá trình bảo quản giống vi sinh vật thường được thực hiện qua 4 bước:- Làm giàu số lượng vi sinh vật cần bảo quản.- Xử lý vi sinh vật trước khi bảo quản.- Thực hiện bảo quản giống vi sinh vật.- Kiểm tra định kỳ khả năng sống sót của vi sinh vật bảo quản.Các chủng vi sinh vật bảo quản sẽ được cung cấp cho người sử dụng, do đó nhiệm vụ

quan trọng bên cạnh việc bảo quản là thu thập và cung cấp các thông tin quan trọng của chủng vi sinh vật bảo quản cho người sử dụng như: môi trường nuôi cấy, nhiệt độ, nhu cầu dinh dưỡng, tính an toàn sinh học, tên phân loại v.v.2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1. Dụng cụ










8 Bình tia Cái 1





13 Que cấy Cái 1



Trang 43






5 Tủ sấy Cái 1

6 Tủ ấm Cái 1

7 Máy hút chân không Cái 1


- Môi trường cao thịt – pepton: dùng để bảo quản vi khuẩn

- Môi trường Hansen: dùng để bảo quản nấm men

- Môi trường Czapeck: dùng để bảo quản nấm mốc- Parafin lỏng2.3. Nguyên liệu khác- Cát sạch- Lúa hoặc bobo- Bông không thấm- Bông thấm nước

3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Phương pháp cấy truyền định kỳ lên môi trường mớiPhương pháp này áp dụng để bảo quản tất cả các loại vi sinh vật. Ưu điểm của phương

pháp này đơn giản, dễ làm, thời gian bảo quản không lâu. Tuy nhiên, nhược điểm là tốn môi trường, công sức và thời gian. Phẩm chất ban đầu của giống có thể bị thay đổi do nhiều nguyên nhân khó xác định cụ thể trong quá trình cấy truyền. Quy trình thực hiện như sau

- Thuần khiết lại chủng vi sinh vật bằng cách cấy trải hoặc ria trên thạch đĩa. - Cấy vi sinh vật từ khuẩn lạc điển hình lên ống nghiệm môi trường thạch nghiêng. - Nuôi trong tủ ấm 24-48 giờ- Lấy ống giống ra và cho vào tủ lạnh bảo quản ở 40C. - Định kỳ cấy truyền lại (nấm mốc 3-6 tháng, vi khuẩn và nấm men 1-2 tháng). - Có thể cho thêm 1% dầu thực vật vào môi trường nuôi cấy ban đầu khi pha chế để tránh mất nước.3.2. Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoángYêu cầu của phương pháp này là sử dụng dầu khoáng như parafin lỏng hay vazơlin

phải trung tính, có độ nhớt cao, không chứa các sản phẩm độc với vi sinh vật và vô trùng. Phương pháp này đơn giản nhưng hiệu quả cao nhờ khả năng làm chậm quá trình biến dưỡng và hô hấp nên vi sinh vật phát triển chậm lại. Môi trường không bị mất nước và khô. Quy trình thực hiện như sau:

- Khử trùng dầu khoáng bằng cách hấp ở 1210C trong 2h. Sau đó sấy khô ở tủ sấy (1700C) trong 1 - 2h; để nguội

- Đổ lên bề mặt môi trường trong ống nghiệmcó vi sinh vật phát triển tốt một lượng dầu cách mép trên ống nghiệm 1 cm.

- Dùng parafin đặc hàn kín miệng ống, bình nuôi vi sinh vật.- Giữ ống giống vi sinh vật ở 4oC.3.3. Phương pháp giữ giống trên đất, cát, hạt

Trang 44

a. Trên đất, cátDùng để bảo quản các chủng vi sinh vaajt tạo bào tử tiềm sinh (hoặc bào tử vô tính)

với thời gian bảo quản từ một đến nhiều năm. Quy trình thực hiện như sau:- Đất, cát đem rây để lấy hạt đều và ngâm trong HCl hay H2SO4 đậm đặc 8 - 12h để

loại bỏ các axit hữu cơ trong cát.- Rửa kỹ cát đến pH trung tính.- Sấy khô, thanh trùng cát và giữ ở điều kiện vô trùng.- Đổ đầy cát vào ống nghiệm có vi sinh vật phát triển trên môi trường thạch và lắc

thật đều.- Rót toàn bộ cát lẫn vi sinh vật vào 1 ống nghiệm khác.- Hàn kín miệng ống nghiệm, bảo quản ống nghiệm ở 4oC.b Trên hạtDùng để bảo quản các chủng có dạng hình sợi sinh bào tử hoặc không. Thời gian bảo

quản có thể tới 1 năm.Quy trình như sau:- Hạt ngũ cốc (lúa, bobo) được rửa sạch.- Nấu cho hạt vừa nứt, để ráo nước. Cho hạt vào ống nghiệm sạch, khoảng ½ ống- Phủ trên các hạt này một lớp bông thấm nước - Thanh trùng hạt ở 121oC trong 40 phút. - Thanh trùng 3 lần, mỗi lần cách nhau 24h. - Cấy giống vi sinh vật trên lớp bông cho mọc thật dầy. Hằng ngày lắc nhẹ.- Sau 8 – 10 ngày kiểm tra lại chất lượng của giống vi sinh vật- Gắn paraffin.- Giữ ở nhiệt độ 15 – 20oC. 3.4. Phương pháp đông khôPhương pháp này làm cho tế bào mất nước ở trạng thái tự do. Đồng thời làm giảm,

thậm chí làm ngừng hẳn quá trình phân chia của vi sinh vật. Nhờ đó chúng có khả năng chịu được nhiều tác động của ngoại cảnh. Phương pháp này dùng nhiều trong sản xuất, thời gian bảo quản lên tới vài chục năm.

- Sau khi nuôi cấy, vi sinh vật được trộn với chất bảo vệ để tránh kết tinh nước trong tế bào. Chất bảo vệ có thể là một trong những dung dịch sau:

+ Glycerin 10% + geletin 1% + pH trung tính+ Huyết thanh ngựa + geletin 1% + pH trung tính+ Ssaccharose 10% + geletin 1% + pH trung tính+ Dung dịch glucose 10%,+ Dung dịch lactose 10%.

- Phân hỗ hợp vi sinh vật vào vào ống nghiệm.- Cho ống nghiệm có chứa vi sinh vật vào chậu lạnh ở nhiệt độ (-)70 – (-)80oC, trong

1-5 phút. - Đưa vào thiết bị đông khô (áp suất = 10-4 mmHg, trong thời gian 8 – 14 giờ ). - Sau khi làm khô, độ ẩm còn 1 – 4%.- Kiểm tra lại hàm lượng ẩm bằng giấy tẩm CoCl2 3%. - Hàn kín ống nghiệm khô. - Bảo quản ở nhiệt độ 4oC

4. Những điểm cần lưu ý- Để việc bảo quản vi sinh vật có kết quả cần phải đảm bảo chọn giống thuần khiết,

chưa bị biến đổi các đặc tính do đột biến ngẫu nhiên đồng thời còn phải chọn giai đoạn tối ưu trong chu trình sống để bảo quản.

- Kiểm tra khả năng sống của mẫu vi sinh vật tại các thời điểm, trước và ngay sau khi bảo quản; sau 1 hoặc 5 năm bảo quản.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày nguyên tắc và ý nghĩa của việc bảo quản giống vi sinh vật?- Trình bày phương pháp bảo quản giống nấm mốc, nấm men và vi khuẩn?

Trang 45

- So sánh ưu và nhược điểm của các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật?

Trang 46

BÀI 8KHẢO SÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT – ĐƯỜNG

CONG SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT 1. Nguyên tắc

Sự sinh trưởng của vi sinh vật là sự gia tăng số lượng tế bào vi sinh vật trong quần thể và tốc độ tăng trưởng là sự sinh trưởng của vi sinh vật trong một đơn vị thời gian. Vi khuẩn thường sinh sản bằng phương thức phân đôi tạo thành hai tế bào con cùng kích thước, do vật làm tăng gấp đôi số lượng tế bào sống và mật độ tế bào trong quần thể sẽ liên tục tăng gấp đôi trong pha tăng trưởng cấp số mũ.

Sự sinh trưởng quần thể vi sinh vật được nghiên cứu bằng cách phân tích đường cong sinh trưởng trong một môi trường nuôi cấy vi sinh vật theo phương pháp nuôi cấy theo mẻ (batch culture) hoặc trong một hệ thống kín. Có nghĩa là vi sinh vật được nuôi cấy trong một thiết bị kín, trong quá trình nuôi cấy không thay đổi môi trường và thời gian nuôi cấy càng kéo dài thì nồng độ chất dinh dưỡng càng giảm sút, các chất phế thải của trao đổi chất càng tăng lên. Nếu lấy thời gian nuôi cấy là trục hoành và lấy số logarit của số lượng tế bào sống làm trục tung sẽ có thể vẽ được đường cong sinh trưởng của các vi sinh vật sinh sản bằng cách phân đôi. Đường cong này có 4 giai đoạn (phases) khác nhau.

Hình. Đường cong sinh trưởng trong hệ thống kín (Theo Harley và Klein)Tính toán nhịp độ sinh trưởng của vi sinh vật sẽ làm cơ sở cho các nghiên cứu về sinh

lý học, sinh thái học vi sinh vật, và còn để giải quyết một số vấn đề ứng dụng trong sản xuất công nghiệp.

Trong pha log (giai đoạn logarit) mỗi cá thể vi sinh vật tiến hành phân cắt trong một thời gian xác định. Số lượng tế bào tăng theo phương thức 2n. Thời gian giữa hai lần phân chia liên tiếp hay thời gian cần cho sự tăng đôi số tế bào được gọi là thời gian thế hệ (generation time hay doubling time). Ví dụ đưa một tế bào vào môi trường nuôi cấy, cứ 20 phút phân cắt một lần thì sau 20 phút có 2 tế bào, sau 40 phút có 4 tế bào và tiếp tục như vậy. Bảng. Ví dụ về sinh trưởng theo logarit

Thời gian (*) Số lần phân cắt 2 n Số lượng (N0 x 2 n ) lg10Nt0 0 20=1 1 0,00020 1 21=2 2 0,30140 2 22=4 4 0,60260 3 23=8 8 0,90380 4 24=16 16 1,204100 5 25=32 32 1,505120 6 26=64 64 1,806

Trang 47

Pha Log

Pha cân bằng động

Pha suy vong

Pha Lag

(*): Thời gian thế hệ là 20 phút, giả thiết là nuôi cấy từ 1 tế bào Số lượng logarit tế bào là 2n, n là số thế hệ. Có thể biểu thị các số liệu trong bảng bằng

công thức sau đây:N1 = N0 x 2x

Trong đó: N0 là số lượng tế bào ban đầu; Nt là số lượng tế bào ở thời gian t; n là số thế hệ.

Từ công thức trên có thể biến đổi như sau và số thế hệ n được tính bằng logarit thập phân:

Log N1 = logN0 + nlog2

Khi nuôi cấy phân mẻ (batch culture) tốc độ sinh trưởng trong giai đoạn logarit có thể biểu thị bằng hằng số tốc độ sinh trưởng bình quân k (mean growth rate constant k). Đó là số thế hệ sinh ra trong đơn vị thời gian, thường biểu thị bằng số thế hệ trong 1 giờ:

Thời gian cần thiết để tăng gấp đôi tổng số tế bào là thời gian thế hệ bình quân (mean generation time) hay thời gian tăn gấp đôi bình quân (mean doubling time) và được biểu thị bằng g. Nếu t=g thì N t= 2N0. Thay vào công thức trên ta có:

Thời gian thế hệ bình quân là đảo số của hằng số tốc độ sinh trưởng bình quân:

Thời gian thế hệ thay đổi tùy theo chủng loại vi sinh vật, điều kiện nuôi cấy. Một số vi khuẩn thời gian thế hệ không quá 10 phút (0,17h) trong khi ở một số vi sinh vật nhân thực (eucaryotic) lại dài tới vài ngày (Bảng 14.2). Thời gian thế hệ trong tự nhiên thường là dài hơn so với khi nuôi cấy. Bảng. Thời gian thế hệ của một số loài vi sinh vật

Vi sinh vật Nhiệt độ (0C) Thời gian thế hệ (giờ)Vi khuẩn và Vi khuẩn lamBeneckea natriegens 37 0,16Escherichia coli 40 0,35Bacillus subtilis 40 0,43Staphylococcus aureus 37 0,47Pseudomonas aeruginossa 37 0,58Clostridium botulinum 37 0,58Rhodospirillum rubrum 25 4,6-5,3Anabaena cylindrica 25 10,6Mycobacterium tuberculosis 37 Khoảng 12Treponema pallidum 37 33TảoScenedesmus quadricauda 25 5,9Chlorella pyrenoidosa 25 7,75Asterionella formosa 20 9,6

Trang 48

Euglena gracilis 25 10,9Ceratium tripos 20 82,8Động vật nguyên sinhTetrahymena geleii 24 2,2-4,2Leishmania donovani 26 10-12Paramecium caudatum 26 10,4Acanthamoeba castellanii 30 11-12Giardia lamblia 37 18NấmSaccharomyces cerevisiae 30 2Monilinia fructicola 25 30

2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất2.1. Dụng cụ










8 Bình tia Cái 1





13 Que cấy Cái 1






5 Tủ sấy Cái 1

Trang 49



6 Tủ ấm Cái 1

7 Máy so màu Cái 1

2.2. Môi trường và hoá chất- Môi trường NB (Nutrient broth)- Nước muối sinh lý vô trùng- Nước cất vô trùng2.3. Chủng giống vi sinh vật- Vi khuẩn Escherichia coli3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Xây dựng đường tương quan giữa mật độ vi sinh vật và độ đục của dung dịch

nuôi cấy.a. Pha loãng mẫu- Xác định độ đục của dung dịch vi khuẩn E.coli nuôi cấy trên môi trường NB sau 24

giờ (pha loãng nếu số đo vượt quá 1). Dùng dịch môi trường NB chưa nuôi cấy làm chứng không khi đo.

- Dựa vào số đo trên, pha loãng thành các phần 2,5ml huyền phù sao cho OD 610nm đạt được các giá trị lân cận 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 (không cầ đạt giá trị chính xác).

- Đo OD610nm của các huyền phù vừa được pha, ghi nhận số đo thực tế. Ở mỗi độ pha loãng nhất định, dùng môi trường chưa nuôi cấy được pha loãng bằng nước cất làm chứng không khi đo.

b. Xác định mật độ tế bào bằng phương pháp đếm khuẩn lạc- Tiến hành pha loãng bậc 10 liên tiếp mỗi dịch huyền phù có độ đục xác định ở trên

thành các độ pha loãng 10-6, 10-7, 10-8 trên các ống eppendorf. Dùng nước muối sinh lý 0,9% làm dung dịch pha loãng. Mỗi ống eppendorf dùng pha loãng, chứa sẵn 0,9ml dịch nước muối.

- Với mỗi huyền phù, chọn 3 độ pha loãng liên tiếp cuối cùng là 10-6, 10-7, 10-8 đem nuôi cấy. Dùng micropipette, hút 0,1ml dịch từ mỗi độ pha loãng đã chọn chuyển vào đĩa petri chứa môi trường NA. Trong điều kiện vô trùng, dùng que trải, trải đều dịch vi sinh vật này khắp bề mặt môi trường trong đĩa petri.

- Các đĩa petri được ủ ở 370C trong 24 giờ.- Sau thời gian này, đếm số khuẩn lạc vi khuẩn E.coli trên các đĩa petri ở tất cả các

nồng độ. Chỉ chọn những đĩa có lượng khuẩn lạc 25-250 khuẩn lạc/đĩa để tính số lượng.- Mật độ tế bào vi khuẩn E.coli trong các dịch huyền phù ở trên được xác định theo

công thức:

Với : N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu. (CFU: colony form units)C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn (có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25-250 khuẩn lạc/đĩa)ni : Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ idi: hệ số pha loãng tương ứng. v: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

c. Xây dựng đường tương quan giữa mật độ vi khuẩn và độ đục- Dựa vào số liệu CFU/ml dịch huyền phù thu được ở trên, tính giá trị log (N/ml) cho

mỗi giá trị mật độ CFU/ml tương ứng với mỗi dộ đục.- Vẽ đường biểu diễn của log (N/ml) (trục tung) theo OD610nm (trục hoành)

Trang 50

5.6

5.8

6

6.2

6.4

6.6

6.8

7

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

OD610nm

log

(N

/ml)

Hình. Đường tương quan tuyến tính giữa log (N/ml) và OD610nm

3.2. Nuôi cấy vi sinh vật trong hệ thống kín (môi trường nuôi cấy tĩnh)- Cấy 5ml dịch E.coli sau 1 giờ nuôi cấy vào bình tam giác chứa 50ml môi trường. - Cấy 2,5ml dịch E.coli nuôi cấy 24 giờ vào bình tam giác thứ hai chứa 50ml môi

trường.

- Lắc đều hai bình, dùng micropipette với đầu típ vô trùng hút 2ml dịch mẫu ở mỗi bình vào ống đo.

- Hai bình nuôi cấy được nuôi cấy lắc trên máy lắc, tốc độ lắc 120 vòng/phút, ở nhiệt độ 370C. Ghi nhận thời điểm bắt đầu của quá trình nuôi cấy.

- Dùng môi trường NB mới chưa nuôi cấy làm đối, đo độ đục của mẫu ở bước sống 610nm. Ghi nhận độ đục OD610nm (độ đục ở thời điểm t0).

- Tiến hành thu mẫu cách 10 phút trong khoảng thời gian 90 phút và đo độ đục như trên. Trường hợp độ đục tiếp cận giới hạn trên hoặc vượt quá thang độc, pha loãng mẫu 1/10 lần với nước cất vô trùng trước khi đo độ đục. Trong trường hợp này, dùng môi trường NB chưa nuôi cấy được pha loãng 1/10 lần làm đối chứng khi đo.

- Ghi nhận độ đục tại các thời điểm thu mẫu. - Từ giá độ độ đục đo được của mỗi thời điểm, dựa vào đường tương quan tuyến tính

giữa log (N/ml) và độ đục ở trên để xác định giá trị log (N/ml) tương ứng.- Với các giá trị log (N/ml) của các độ đục ở các thời điểm khác nhau, vẽ đường tương

quan giữa độ đục và thời gian nuoi cấy cho mỗi bình. Đây chính là đường cong sinh trưởng của vi khuẩn E.coli trong môi trường nuôi cấy tĩnh.4. Những điểm cần lưu ý

- Trước khi đo OD, máy được chứng không bằng dung dịch môi trường NB- Các thao tác hút chuyển vi sinh vật phải đảm bảo điều kiện vô trùng vì dịch huyền

phù con sử dụng cho quá trình nuôi cấy xác định mật độ- Đường tương quan tuyến tính phải là đường thẳng, qua càng nhiều điểm càng tốt.- Phải xác định khoảng tuyến tính trên đường tuyến tính sau khi vẽ xong đồ thị.- Nếu dung dịch nuôi cấy có giá trị OD610nm vượt quá khoảng tuyến tính, cần pha loãng

trước khi đo.5. Báo cáo thực tập

- Trong hệ thống nuôi cấy tĩnh (hệ thống nuôi cấy tĩnh), nên dừng quá trình nuôi cấy ở pha nào để thu nhận được sinh khối cao nhất?

- Giải thích sự tương quan giữa độ đục và mật độ vi sinh vật?- Vẽ đường tương quan tuyến tính giữa mật độ và độ đục?- Vẽ đường cong sinh trưởng của vi khuẩn E.coli trong môi trường nuôi cấy tĩnh?

Trang 51

Trang 52

BÀI 9KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ĐẾN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT

1. Nguyên tắcCác yếu tố môi trường hoặc tương tác của các yếu tố môi trường có tác dụng kiểm

soát tốc độ tăng trưởng hoặc suy tàn của vi sinh vật. Trong điều kiện tự nhiên, các yếu tố môi trường thường rất dao động, khó kiểm soát, do đó thường có sự thay đổi luân phiên quần thể vi sinh vật ưu thế theo sự thay đổi của điều kiện môi trường. Trong điều kiện phòng thí nghiệm, các điều kiện môi trường có thể được kiểm soát, điều chỉnh đề vi sinh vật có thể tăng trưởng với tốc độ tối đa, tạo nhiều sản phẩm biến dưỡng mong muốn.

Bên cạnh đó, với sự điều chỉnh các yếu tố môi trường, chúng ta có thể kiểm soát theo hướng kìm hãm hoặc loại bỏ hoàn toàn sự sinh trưởng của vi sinh vật.

Đối với mỗi yếu tố môi trường (nhiệt độ, pH, áp suất thẩm thấu, hàm lượng oxy...), các vi sinh vật có ngưỡng phát triển khác nhau. Trong ngưỡng phát triển này, vi sinh vật sinh trưởng phát triển thuận lợi và tối ưu tại điểm cực thuận của ngưỡng. Nếu vượt ngoài ngưỡng, vi sinh vật có thể bị kìm hãm hoặc bị tiêu diệt.

Khảo sát về sự ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đối với vi sinh vật là cơ sở quan trong trong việc tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy đảm bảo sự sinh trưởng thuận lợi của vi sinh vật hoặc kìm hãm loại bỏ hoàn toàn vi sinh vật.

Trong giới hạn của bài thực hành này, chỉ đi vào tìm hiểu về ảnh hưởng của 3 yếu tố môi trường là hàm lượng oxy, pH và áp suất thẩm thấu đến sự sinh trưởng của vi sinh vật.

* Oxy là thành phần hiện diện trong hầu hết các cấu trúc của tế bào, và có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng của một số vi sinh vật. Vi sinh vật hiếu khí cần (aerobe) cần O2 đề tăng trưởng, ngược lại vi sinh vật kỵ khí (anaerobe) không có khả năng sử dụng oxy. Nhiều vi sinh vật có khả năng sống trong điều kiện có hoặc không có oxy, được gọi là kỵ khí tuỳ ý (facultative anaerobe). Ngoài ra, các vi sinh vật chỉ tăng trưởng trong môi trường có nồng độ oxy thấp được gọi là vi hiếu khí (microaerophile).

* pH là giá trị đo nồng độ H+, có ản hưởng trực tiếp đến sự tăng trưởng của vi sinh vật. Hầu hết vi sinh vật tăng trưởng tối ưu ở pH trung tính. Sự tăng hoặc giảm nồng độ ion H+ là pH giảm hoặc tăng sẽ có hại cho vi sinh vật nói chung do làm thay đổi trạng thái ion hóa của các nhóm protein và sự sống sót của tế bào.

* Áp suất thẩm thấu là lực mà nước tác động lên màng tế bào do sự phân bố không đều của chất tan trong môi trường và trong tế bào chất. Tế bào tăng trưởng tốt nhất khi áp suất thẩm thấu bên ngoài thấp hơn bên trong do nước có thể tự do đi vào và làm dễ dàng sự tiếp nhận chất dinh dưỡng. Ngược lại, khi áp suất thẩm thấu bên ngoài cao hơn thì nước sẽ thoát khỏi tế bào làm tế bào mất nước gây bất lợi cho hoạt tính hoặc biến tính các enzyme dẫn đến tổn thương hoặc giết chế tế bào.


2.1. Dụng cụ







Trang 53




6 Que cấy Cái 1

7 Bình tia Cái 1

8 Đĩa petri Cái 3


1 Tủ ấm Cái 1


2.2. Môi trường, hóa chất- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Môi trường cao thịt – pepton nuôi cấy vi khuẩn- Cồn 96o

2.3. Chủng giống vi sinh vật- Vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Clostridium, Acetobacter aceti,

Vibrio perfringen2.4. Nguyên liệu khác- Giấy lọc- Bông không thấm- Bông thấm nước

3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Khảo sát ảnh hưởng của oxya. Chuẩn bị môi trường- Pha chế môi trường cao thịt – pepton rắn mềm có hàm lượng agar 1%. - Tạo môi trường thạch sâu trên ống nghiệm.- Môi trường sau khi hấp tiệt trùng được giữ ấm ở 40oC trong bếp đun cách thủy.b. Cấy vi sinh vật- Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối vi sinh vật, cấy đâm sâu vào ống thạch sâu. Cắm

đầu que cấy xuống đến đáy môi trường và rút nhẹ nhàng lên sao cho sinh khối vi sinh vật được cấy theo đường thẳng từ đáy đến bề mặt môi trường trong ống nghiệm.

- Thực hiện việc gieo cấy 3 chủng vi khuẩn: Clostridium, Escherichia coli và Acetobacter aceti vào 3 ống nghiệm.

- Làm nguội nhanh môi trường bằng cách đặt đứng ống nghiệm vào trong một cốc nước lạnh.

- Ủ ấm 37oC trong 24-48 giờ.- Sau thời gian này, quan sát và ghi nhận vị trí sinh khối vi khuẩn trong ống nghiệm.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của áp suất thẩm thấua. Chuẩn bị môi trường- Chuẩn bị môi trường cao thịt-pepton bổ sung muối NaCl lần lượt được các nồng độ:

0%, 5%, 10%, 20%.- Sau khi hấp tiệt trùng, rót môi trường vào các đĩa petri.- Chờ cho môi trường nguội và đông đặc hoàn toàn, lật ngược đĩa petri, dùng bút lông

dầu chia đĩa môi trường thành 4 phần.b. Gieo cấy vi sinh vật

Trang 54

- Mổi tổ sinh viên sẽ sử dụng 2 phần trên mỗi đĩa petri để cấy 2 chủng vi sinh vật vào: Escherichia coli, Staphylococcus aureus. Cấy ria zic-zag vi sinh vật vào mỗi phần và tránh không để lan đường cấy sang những phần khác.

- Tiến hành cấy tương tự cho tất cả các đĩa petri có 4 nồng độ khác nhau.- Hộp petri sau khi cấy xong, được lật ngược và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ.- Sau thời gian này, tiến hành so sánh sự sinh trưởng của vi sinh vật trên các môi

trường có nồng độ muối NaCl khác nhau. Nhận xét về khả năng chịu áp suất thẩm thấu của 2 chủng vi sinh vật nói trên. Khả năng sinh trưởng sẽ được đánh giá qua 4 mức:

+ Không phát triển: (-)+ Phát triển yếu: (+)+ Phát triển trung bình: (+ +)+ Phát triển tốt: (+ + +)

3.3. Khảo sát ảnh hưởng của pHa. Chuẩn bị môi trường- Chuẩn bị môi trường cao thịt-pepton được điều chỉnh pH lần lượt được các giá trị:

pH 4,5; pH 7; pH 9.- Sau khi hấp tiệt trùng, rót môi trường vào các đĩa petri.- Thực hiện đo lại giá trị pH của các môi trường sau khi hấp tiệt trùng bằng giấy đo

pH.- Chờ cho môi trường nguội và đông đặc hoàn toàn, lật ngược đĩa petri, dùng bút lông

dầu chia đĩa môi trường thành 4 phần.b. Gieo cấy vi sinh vật- Mổi tổ sinh viên sẽ sử dụng 2 phần trên mỗi đĩa petri để cấy 2 chủng vi sinh vật vào:

Escherichia coli, Vibrio perfringen. Cấy ria zic-zag vi sinh vật vào mỗi phần và tránh không để lan đường cấy sang những phần khác.

- Tiến hành cấy tương tự cho tất cả các đĩa petri có 3 giá trị pH khác nhau.- Hộp petri sau khi cấy xong, được lật ngược và ủ ở nhiệt độ 37oC trong 48 giờ.- Sau thời gian này, tiến hành so sánh sự sinh trưởng của vi sinh vật trên các môi

trường có giá trị khác nhau. Khả năng sinh trưởng sẽ được đánh giá qua 3 mức:+ Không phát triển: (-)+ Phát triển yếu: (+)+ Phát triển tốt: (+ +)

4. Những điểm cần lưu ý- Khi gieo cấy vào môi trường thạch sâu, đường cấy phải thẳng, tránh dao động làm

lan vi sinh vật sang những vùng khác.- Ở môi trường có giá trị pH acid, khả năng đông đặc của agar kém, do đó khi cấy,

tránh làm dao động mạnh môi trường để tránh vỡ thạch.- Ở những môi trường có nồng độ muối cao, sau khi hấp tiệt trùng, một lượng nhỏ

thành phần môi trường có thể bị tủa. Khi đổ môi trường vào đĩa petri, cần loại bỏ phần tủa này để tránh gây đục môi trường trên đĩa petri, ảnh hưởng đến việc quan sát.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày tác động của các yếu tố môi trường đến sự sinh trưởng của vi sinh vật?- Nhận xét sự sinh trưởng của vi sinh vật trên các môi trường có giá trị pH, áp suất

thẩm thấu và nồng độ oxy khác nhau? Trình bày theo bảng sau:

Nồng độ NaCl

Chủng vi sinh vật

0% 5% 10% 15% 20%

Escherichia coliStaphylococcus aureus

Trang 55

pH môi trường

Chủng vi sinh vật

4,5 7 9

Escherichia coliVibrio perfringen

Trang 56

BÀI 10KHẢO SÁT ĐẶC TÍNH SINH HÓA CỦA VI SINH VẬT

1. Nguyên tắcMỗi loài vi sinh vật có những đặc tính sinh lý, sinh hóa đặc trưng. Những đặc tính đó

giúp nó khác với những loài vi sinh vật khác. Do vậy, muốn định danh vi sinh vật, ta cần xác định một số đặc điểm sinh hóa đặc trưng của chúng. Các đặc điểm này biểu hiện sự trao đổi chất của vi sinh vật, thể hiện qua sự chuyển hóa các thành phần đã biết của môi trường dinh dưỡng dùng nuôi cấy vi sinh vật (chủ yếu là hoạt động của enzyme).

Các đặc tính sinh hóa của vi sinh vật có thể được xác định dựa vào những môi trường nuôi cấy chuyên biệt hoặc dùng các bộ KIT phân tích và gần đây là bằng các máy phân tích tự động.

Kết quả của một thử nghiệm xác định đặc tính sinh lý, sinh hóa của vi sinh vật hoặc là dương tính (ký hiệu: +) hoặc là âm tính (ký hiệu: -). Thử nghiệm là dương tính có nghĩa là vi sinh vật có thể sử dụng được một nguồn cơ chất, tạo thành một sản phẩm, một enzyme... Nếu thử nghiệm là âm tính thì ngược lại.

Kết quả của thử nghiệm xác định đặc tính của vi sinh vật có thể nhận biết bởi sự thay đổi màu của các chất chỉ thị, các thuốc thử và một số hiện tượng khác (hiện tưởng sủi bọt, hiện tượng hóa đông môi trường...)


2.1. Dụng cụ








6 Que cấy Cái 1

7 Bình tia Cái 1



1 Tủ ấm Cái 1



- Môi trường Phenol red base broth- Đường: glucose, lactose, frutose, saccharose, maltose- Môi trường MR-VP (môi trường Clark – Lubs)- Môi trường triptose broth

Trang 57

VSV

- Môi trường thạch chì- Môi trường NB- Môi trường gelatin- Môi trường nitrate broth- Môi trường MIU- Giấy thử oxidase- H2O2 30%- Môi trường Simmon citrate- Môi trường KIA- Huyết tương thỏ đông khô2.3. Chủng giống vi sinh vật- Vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Clostridium, Acetobacter aceti,

Vibrio perfringen2.4. Nguyên liệu khác- Giấy lọc- Bông không thấm- Bông thấm nước

3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Xác định khả năng sử dụng các nguồn chất hydrat carbonCác vi sinh vật được đặc trưng bằng khả năng sử dụng khác nhau nguồn hydrat carbon

để làm nguồn năng lượng. Các thử nghiệm này nhằm xác định các vi sinh vật sử dụng được nguồn carbon hydrat nào cho quá trình biến dưỡng của nó.

3.1.1. Khả năng lên men đườngThường sử dụng các loại đường glucose, lactose, galactose, frutose, saccharose,

maltose, rhamnose, và một số rượu như glycerin, mannit… a. Cơ chế

Các acid + CO2

Đường → Acid pyruvic → Các acid và không có CO2

Vi sinh vật có các enzyme phân giải các loại đường trên, tạo các acid hữu cơ, làm pH của môi trường nuôi cấy giảm, và có thể tạo một số chất khí như H2, CO2. pH của môi trường giảm, làm chỉ thị màu phenol red chuyển từ đỏ sang vàng. Các chất khí sinh ra sẽ tích tụ vào ống Durham, phát hiện được bằng mắt thường.

b.Môi trường- Canh dinh dưỡng (NB) bổ sung 1% đường, pH ≈ 7 ( môi trường lên men đường)

hoặc môi trường Phenol red base được bổ sung các nguồn đường cần kiểm tra.- Chỉ thị màu phenol red. - Ống Durham. c. Gieo cấy vi sinh vật- Cấy vi khuẩn Escherichia coli vào môi trường lên men đường.- Đem các ống nghiệm ủ ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 24 giờ.- Sau thời gian ủ, tiến hành quan sát và đọc kết quả. d.Kết quả- Lên men, sinh hơi: Phenol red trong ống môi trường chuyển từ đỏ sang vàng, ống

Durham có hơi. Ký hiệu: ( +, H ) hoặc (+, G).- Lên men, không sinh hơi: Phenol red trong ống môi trường chuyển từ đỏ sang

vàng, ống Durham không có hơi. Ký hiệu: (+).- Không lên men: Phenol red vẫn giữ nguyên màu đỏ. Tất nhiên, ống Durham không

có hơi. Ký hiệu: (-).

Trang 58

3.1.2. Phản ứng MR (Methyl Red).a. Cơ chếMột số nhóm đường ruột như E. coli, Salmonella,… chuyển hóa glucose thành acid

pyruvic.Rồi tiếp tục chuyển hóa acid pyruvic thành ethanol, acid acetic, acid lactic, acid succinic. Các acid tạo ra làm pH môi trường giảm mạnh, pH ≈ 4 – 4,5. Ở pH này methyl red màu đỏ, ngược lại, pH cao hơn thì Methyl red sẽ chuyển sang màu vàng.

Hình. Cơ chế sinh hóa của phản ứng methyl red ở chủng E. coli và Enterobacter aerogenesb. Môi trường và thuốc thử- Môi trường Clark – Lubs có pH ≈ 7- Thuốc thử Methyl redc. Gieo cấy vi sinh vật- Cấy vi khuẩn E. coli vào môi trường Clark – Lubs.- Ủ các ống nghiệm ở 37oC trong thời gian 48 giờ.- Sau đó, nhỏ thêm vào các ống nghiệm 5 – 10 giọt methyl red- Quan sát và đọc kết quả. d. Đọc kết quả- Phản ứng Methyl red dương tính: dung dịch Methyl red trong môi trường vẫn giữ

nguyên màu đỏ. Ký hiệu: MR (+).- Phản ứng Methyl red âm tính: dung dịch Methyl red trong môi trường chuyển từ đỏ

sang vàng. Ký hiệu: MR (-).

Trang 59

MR - MR +

Hình. Thử nghiệm khả năng lên men đường

Hình. Kết quả thử nghiệm methyl red3.1.3. Phản ứng VP (Voges – Proskauer)a. Cơ chếVi sinh vật chuyển hóa glucose thành acid pyruvic. Rồi tiếp tục chuyển hóa acid

pyruvic thành acetyl methyl carbinol (AMC). AMC tác dụng với α - naphtol trong môi trường kiềm tạo thành diacetyl. Diacetyl phản ứng với nhân guanidine (arginine) có trong pepton để cho hợp chất màu hồng đỏ.

Hình. Cơ chế sinh hóa của thử nghiệm VPb. Môi trường và thuốc thử- Môi trường Clark – Lubs có pH ≈ 7- Thuốc thử: bao gồm hỗn hợp NaOH 40% (KOH 10%) và α - naphtol 10% trong cồn. c. Gieo cấy vi sinh vật- Cấy vi khuẩn Bacillus anthracis, B. cereus vào môi trường Clark – Lubs.- Các ống nghiệm được ủ 37oC trong 24 giờ.- Sau thời gian này, nhỏ vào các ống nghiệm khoảng 10 giọt NaOH 40%, hơ nóng nhẹ,

nhỏ tiếp khoảng 10 – 15 giọt α - naphtol, lắcđều, để yên 5 – 10 phút. - Quan sát và đọc kết quả. d. Đọc kết quả-Phản ứng VP dương tính: môi trường chuyển màu đỏ cam. Ký hiệu: VP(+). -Phản ứng VP âm tính: môi trường có màu vàng hoặc màu nâu đất. Ký hiệu: VP(-).

Hình. Kết quả thử nghiệm VP3.2. Xác định khả năng phân giải các hợp chất chứa nitrogenCác hợp chất chứa nitrogen thường là nguồn cung cấp N cho sự tổng hợp protein của

tế bào vi sinh vật. Các vi sinh vật thường sản sinh các loại enzym tương ứng để phân giải chúng thành các chất dễ sử dụng như acid amin, NH3, …Đồng thời cũng có thể sinh ra các chất có tính độc như Indol, H2S,…

3.2.1. Khả năng tạo indola. Cơ chếVi sinh vật tiết enzym tryptophanase, chuyển hóa tryptophan thành indol. Indol sẽ kết

hợp với para – dimethylaminobenzaldehyd trong thuốc thử Kovac’s, tạo thành phức chất

Trang 60

VP +VP -

Rosindol màu đỏ. b.Môi trường và thuốc thử: - Môi trường NB, pH ≈ 7- Thuốc thử Kovac’s.c. Gieo cấy vi sinh vật- Cấy vi khuẩn E. coli vào canh NB, - Các ống nghiệm được ủ ở 37oC trong thời gian 24h- Sau thời gian này, nhỏ thêm vào mỗi ống nghiệm 3 -5 giọt Kovac’s. - Quan sát màu của thuốc thử và đọc kết quả.

d. Đọc kết quả - Phản ứng indol dương tính: lớp mặt môi trường xuất hiện vòng đỏ. Ký hiệu: I (+). - Phản ứng indol âm tính: lớp mặt môi trường có màu vàng chanh. Ký hiệu: I (-)3.2.2. Sự tạo thành H2Sa. Cơ chế - Vài loại vi khuẩn có khả năng phân giải một số acid amin chứa S như cystin,

cystein, methionin có trong môi trường nuôi cấy, tạo thành H2S. Có thể phát hiện H2S bằng nhiều cách, phạm vi giáo trình này chọn 2 cách.

+ Vi sinh vật phân giải các acid amin chứa S, tạo thành H2S. + H2S sinh ra trong môi trường thạch chì (hoặc trong môi trường canh, H2S↑) sẽ kết

hợp với Pb(CH3COO)2 tạo thành PbS màu đen.H2S + Pb(CH3COO)2→ PbS↓ ( đen ) + 2CH3COOH

b. Môi trường và thuốc thử- Môi trường thạch chì hay NB có gài giấy tẩm acetat chì trên miệng ống nghiệm. c. Gieo cấy vi sinh vật* Cách 1: môi trường thạch chì. - Dùng que cấy thẳng cấy vi sinh vật vào giữa ống nghiệm. - Cho các ống nghiệm vào tủ ấm 37oC, ủ trong 24- 48 giờ. * Cách 2: môi trường canh NB. - Dùng que cấy vòng lấy vi sinh vật cấy sang ống nghiệm môi trường canh NB.- Gài giấy lọc tẩm acetat Pb 20% (vô khuẩn) vào miệng ống nghiệm, dùng băng keo

trong bản nhỏ bịt kín miệng ống nghiệm. Trong khi thao tác, không được để dung dịch môi trường nuôi cấy chạm vào giấy

acetat Pb. Cho vào tủ ấm 37oC, ủ trong 24- 48 giờ.d. Đọc kết quả- Cách 1:

+ Môi trường chuyển màu đen (+). + Môi trường không chuyển màu (-).

- Cách 2: + Giấy tẩm chuyển màu đen (+).

+ Giấy tẩm không chuyển màu (-).

Trang 61

Hình. Kết quả thử nghiệm sinh indol

Indol +Indol -

3.2.3. Khả năng phân giải gelatina. Cơ chế- Một số vi khuẩn có khả năng tổng hợp enzyme gelatinase ngoại bào thủy phân

gelatin thành polypeptide và acid amin làm phá hủy đặc tính đông đặc của gelatin ngay khi ở to < 25oC và hóa lỏng ở to > 25oC.

b. Môi trườngMT canh NB bổ sung 10% gelatin, pH ≈ 7. c. Gieo cấy vi sinh vật- Dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn Bacillus cereus hoặc Bacillus anthracis vào môi

trường.- Ủ các ống nghiệm ở 37o trong 24 giờ- Thực hiện song song với ống đối chứng không cấy vi khuẩn. d. Đọc kết quảSau khi ủ lấy ra cho vào ngăn dưới tủ lạnh 30 phút – 1giờ. - Nếu môi trường hóa lỏng ( + ).- Nếu môi trường đông đặc (-).

3.2.4. Khả năng sử dụng nitrat ( khử NO3-)a. Cơ chếMột số vi khuẩn có khả năng sử dụng nitrat làm nguồn nhận hydro cơ chất trong quá

trình hô hấp kỵ khí đồng thời sử dụng nitrat làm nguồn nitơ do có khả năng tổng hợp enzyme nitratreductase. Nitrat bị khử thành nitrit và rồi có thể bị khử tiếp thành NH3 hoặc N2.

b. Gieo cấy vi sinh vật - Cấy vi khuẩn Staphylococcus aureus hoặc E. coli vào môi trường nitrat- Ủ các ống nghiệm ở 37o trong 24h. - Lấy ra nhỏ vào giọt thuốc thử Gress A (acid sulfanilic) và vài giọt Gress B (α-

naphthylamin ).c. Đọc kết quả- Môi trường có màu hồng đỏ (+): Trong môi trường xuất hiện nhóm NO2

- do NO3-

chuyển hóa. - Môi trường không đổi màu (-): Trong môi trường không có nhóm NO2

-.

Như vậy có 2 khả năng:- Trường hợp 1(-): NO3

- không chuyển thành NO2-.

- Trường hợp 2(+): NO3- chuyển thành NO2

-, sau đó nitrit tiếp tục chuyển thành NH3

hay N2 nên thuốc thử Gress A và Gress B không phát hiện được. Tiếp tục cho bột kẽm vào, nếu xuất hiện màu đỏ thì âm tính, nếu không đổi màu là dương tính.

Trang 62

Hình. Kết quả thử nghiệm phân giải gelatin

+-

Hình. Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng nitrat

+-

3.2.5. Khả năng phân giải urê –(NH)2COa. Cơ chế: Vài loài vi khuẩn có khả năng phân giải urê thành NH3, do có khả năng

tổng hợp enzyme urease. Sự phó thích NH3 làm tăng pH MT và có thể theo dõi qua sự đổi màu của chất chỉ thị.

b. Môi trường- Môi trường MIU sung urê- Chỉ thị màu phenol red, pH ≈ 7,2. c. Gieo cấy vi sinh vật- Cấy vi khuẩn Proteus spp. vào môi trường- Đem ủ ở 37o trong 24 giờ.- Sau đó, lấy quan sát và đọc kết quả. d. Đọc kết quả- Phenol red chuyển từ hồng sang đỏ cánh sen (+). - MT không đổi màu (-).

3.3. Xác định một số đặc tính sinh hóa khác3.3.1. Hoạt tính enzym oxydasea. Cơ chế: Các loài vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối có enzym oxydase ( cytochrom

oxydase ). Có thể phát hiện Oxydase bằng 2 cách. b. Môi trường: MT NA hoặc TSA, thuốc thử là giấy tẩm N-Dimethyl-Para

phenylenediamine hay dd thuốc thử tetra methyl-para phenylenediamine. c. Thao tácCách 1: Dùng que cấy vòng lấy vi khuẩn trong đĩa vi khuẩn đã nuôi cấy, phết lên giấy

tẩm thuốc thử. Đọc kết quả trong vòng 30 giây – 1 phút.Cách 2: Dùng ống nhỏ giọt, nhỏ 1 giọt Tetrs methyl-p-phenylenediamine lên

khuẩn lạc đã nuôi cấy vi khuẩn trong đĩa petri. Đọc kết quả từ 30 giây – 1 phút. d. Đọc kết quả- Phản ứng Oxydase dương: que giấy tẩm hoặc giọt thuốc thử chuyển sang màu tím

đen. Ký hiệu: Oxydase (+).- Phản ứng Oxydase âm: que giấy vẫn giữ màu trắng đục, hoặc thuốc thử vẫn màu

hồng. Ký hiệu: Oxydase (-).

Trang 63

Hình. Kết quả thử nghiệm khả năng phân giải urê

-+

catalase

Hình. Kết quả thử nghiệm oxidasse3.3.2. Hoạt tính Catalasea.Cơ chếEnzym catalase thường gặp ở vi khuẩn hiếu khí tuyệt đối hay tùy nghi. Catalase có

khả năng phân giải peroxyt tao O2 và nước.

H2O2 → H2O + ½O2↑b. Môi trườngĐĩa thạch TSA hoặc NA, pH ≈ 7,2 đã cấy vi khuẩn Staphyloccus aureus ủ ở 37oC

trong 24 giờ. c. Gieo cấy vi sinh vật và đọc kết quả- Dùng que cấy vòng, lấy đầy 1 vòng cấy vi khuẩn hòa vào giọt H2O2, quan sát.- Phản ứng Catalase dương: Giọt H2O2 sủi bọt mạnh hoặc yếu. Ký hiệu: Catalase (+). - Phản ứng Catalase âm: không có hiện tượng sủi bọt. Ký hiệu: Catalase (-).Lưu ý nếu lọ H2O2 3-10% không đậy kín, hoặc không bảo quản lạnh ≈ 4 – 8oC, hoặc

để quá lâu, thì kết quả sẽ sai (âm tính giả).

Hình. Kết quả thử nghiệm catalase3.3.3. Xác định khả năng di độnga. Cơ chếMột số vi khuẩn có tiêm mao (lagella) nên có khả năng di động trong môi trường bán

lỏng và làm đục môi trường hay mọc giống như rễ cây xung quanh đường cấy.Khi cần có thể dùng muối tetrazolium trong môi trường thử di động, tuy nhiên chất

này có tính ức chế vài loại vi sinh vật. Triphenyltetrazolium chloride (TTC) thường được pha trước với nồng độ 1%, thanh trùng bằng màng lọc vi khuẩn 0,45µm. Việc bổ sung TTC giúp phát hiện di động dễ dàng hơn, đặc biệt những trường hợp khó đọc kết quả.

b. Môi trường: Môi trường bán lỏng NA, để đứng. c. Gieo cấy vi sinh vật và đọc kết quả- Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn Bacillus subtilis, E.coli hoặc Salmonella từ ống

ống sang ống nghiệm thạch bán lỏng, trích thẳng từ trên xuống dưới ngay giữa ống môi trường.

- Cho vào tủ ấm 37oC, ủ trong 24 – 48 giờ. Đọc kết quả. - Phản ứng di động dương (+): Vi khuẩn mọc lan ra khỏi đường cấy, xa hay gần

tùy theo khả năng di động của vi khuẩn mạnh hay yếu. - Phản ứng di động âm (-): vi khuẩn chỉ mọc trên đường cấy.

Trang 64

+ -

(-) (+) (+)

Hình. Kết quả thử nghiệm khả năng di động3.3.4. Xác định khả năng sử dụng Citrata. Cơ chế- Một số vi sinh vật có enzyme citrat permease có khả năng sử dụng citrat trong MT

có Na.citrat làm nguồn cacbon duy nhất.- Khi sử dụng citrat chúng giải phóng ra môi trường ion Na+ làm tăng pH của môi

trường. Đồng thời những vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat làm nguồn cacbon thì cũng có khả năng sử dụng muối amonium vô cơ NH4H2PO4 làm nguồn nitơ tạo ra NH3 cũng làm kiềm hóa môi trường, sự thay đổi pH của môi trường được nhận biết nhờ chỉ thị màu Bromothymol blue.

b. Môi trường: môi trường Simomns Citrat, chỉ thị màu Bromothymol blue, pH ≈ 6.8 c. Gieo cấy vi sinh vật: - Cấy vi khuẩn Salmonella spp. vào môi trường theo đường zích –zắc- Đem ủ 37o trong 24 giờ. - Sau thời gian này, lấy đọc kết quả. d. Đọc kết quả- Phản ứng citrat ( +): xanh bromothymol chuyển từ màu lục sang màu xanh dương. - Phản ứng citrat âm (-): xanh bromothymol vẫn giữ màu lục.

Hình. Kết quả thử nghiệm khả năng sử dụng citrat 3.3.5. Xác định khả năng làm đông huyết tương

Trang 65

- +

a. Cơ chếMột số vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzym coagulase đặc biệt là các loài

thuộc giống Staphylococcus, enzyme này làm đông huyết tương người hoặc thỏ (enzyme này là một protein bền với to, có tính kháng nguyên yếu).

b. Môi trường: Huyết tương người hay thỏ đông khô dạng thương phẩm. Hoặc có thể tự điều chế như sau:

* Cách lấy huyết tương thỏDùng xylanh vô trùng hút 0,2ml dung dịch kháng đông citrat Na 3,8% (vô trùng), sau

đó rút lấy máu tim thỏ. Cho máu vào ống ly tâm, ly tâm 1500 vòng/phút/10 phút. Chiết lấy dịch trong là

huyết tương thỏ.c. Gieo cấy vi sinh vật và đọc kết quả- Phân huyết tương vào mỗi ống nghiệm nhỏ 0,5ml. Cấy vi sinh vật cần kiểm tra vào.

Ủ 37o trong thời gian 4-24 giờ. Lấy đọc kết quả. - Phản ứng Coagulase (+): huyết tương thỏ đông lại từ giờ thứ 4, thứ 8, thứ 12 hoặc 24

giờ. Phản ứng đông tụ âm (-): huyết tương vẫn lỏng sau 24 giờ nuôi cấy (như ống đối

chứng).

Hình. Kết quả thử nghiệm khả năng làm đông huyết tương

3.3.6.Thử nghiệm KIA (Kligler Iron Agar), TSI (Triple Sugar Iron Agar) a. Cơ chếđược sử dụng để thử nghiệm đồng thời 2 khả năng: các nguồn cacbon khác

nhau(glucose,lactose) và khả năng sinh H2S của vi sinh vật. Khi cấy vi sinh vật trên môi trường này, có 3 trường hợp xảy ra:

Chỉ sử dụng glucose: sau 18- 24h nuôi cấy phần nghiêng ( bề mặt) trở nên có pH kiềm và phần đứng (phần sâu trong ống nghiệm) có pH acid. Do glucose trên bề mặt của môi trường được vi sinh vật oxi hóa hoàn toàn thành CO2 và H2O để thu lấy năng lượng. Để đáp ứng nhu cầu năng lượng trong tăng trưởng, vi sinh vật tiếp tục dị hóa peptone qua đó giải phóng NH3 làm phần bề mặt của môi trường có pH kiềm. Trong khi đó, ở phần sâu trong môi trường có điều kiện oxy không đầy đủ, glucose được lên men kỵ khí sinh các acid hữu cơ làm pH môi trường giảm.

Sử dụng cả glucose và lactose: sau 18-24 giờ toàn bộ môi trường đều trở nên có pH acid vì sự biến dưỡng đồng thời cả 2 loại đường giúp vi sinh vật đủ năng lượng để tăng trưởng mà chưa cần sử dụng đến peptone. Nếu kéo dài thời gian nuôi cấy quá 24 giờ, bề mặt môi trường sẽ trở nên kiềm do hết nguồn cacbon và vi sinh vật phải sử dụng đến peptone.

Không sử dụng glucose, lactose: vi sinh vật sẽ biến dưỡng peptone để thu lấy năng lượng và vật chất cho sự tăng trưởng. Tuy nhiên, do peptone chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa môi trường chỉ diễn ra trên bề mặt của môi trường.

Khả năng sinh H2S: do trong môi trường sodium thiosulfat, vi sinh vật khử sunfate có thể khử chất này, nhờ có enzyme thiosunfat reductase để giải phóng H2S, H2S sẽ phản ứng với ion Fe2+ của chỉ thị ferric ammonium citrate tạo kết tủa màu đen FeS.

Trang 66

-

+

Trong các trường hợp trên, Nếu sự lên men đường tạo sản phẩm khí, thì khí sẽ kết tụ thành bọt khí trong ống nghiệm hay sẽ làm vỡ thạch

b. Môi trường- Môi trường KIA chứa 2 loại đường o.1% glucose, 1% lactose. - Tương tự, môi trường TSI có thành phần như môi trường KIA nhưng có thêm 1%

sucrose (saccharose).c. Gieo cấy vi sinh vật- Dùng que cấy thẳng lấy sinh khối Salmonella. E.coli, Shigella cấy thẳng sâu vào

ống nghiệm nhưng tránh chạm đáy ống,sau đó ria trên bề mặt thạch nghiêng.- Ủ 37oC trong18-24 giờd. Đọc kết quả- Đỏ/ vàng (kiềm/ acid): chỉ lên men đường glucose - Vàng/ vàng (acid/ acid): lên men glucose và lactose - Môi trường vẫn đỏ, phần bề mặt đỏ đậm hơn so với sự biến dưỡng peptone:

không lên men glucose và lactose- Nếu trong ống nghiệm sinh kết tủa màu đen: có khả năng sinh H2S. - Nếu có sự tích lũy khí, làm vỡ khối thạch hoặc đẩy khối thạch kên: có khả năng sinh

hơi.

Hình. Kết quả thử nghiệm KIA 4. Những điểm cần lưu ý

- Các chủng vi sinh vật sử dụng để khảo sát các đặc tính sinh hóa phải có độ tuổi sinh trưởng nhất định 18 – 24 giờ. Những chủng già cỗi, có thể có những đặc tính không đúng đặc trưng.

- Để việc nhận định kết quả chính xác nhất, các thử nghiệm phải được đọc kết quả đúng thời gian quy định.

- Một số môi trường thử nghiệm có chỉ thị màu thay đổi theo pH, cần điều chỉnh pH môi trường ban đầu chính xác.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày ý nghĩa của các thử nghiệm xác định đặc tính sinh hóa của vi sinh vật?- Giải thích cơ chế của các thử nghiệm xác định đặc tính của vi sinh vật?

Trang 67

BÀI 11KIỂM SOÁT SỰ SINH TRƯỞNG CỦA VI SINH VẬT

1. Nguyên tắc

Sự sinh trưởng của vi sinh vật bị giới hạn bởi một số yếu tố hóa lý của môi trường như nhiệt độ, năng lượng chiếu xạ, hóa chất..., dựa vào đó con người có thể kiểm soát được sự sinh trưởng của vi sinh vật không mong muốn.

Nhiệt độ cực đoan được sử dụng rộng rãi để kiểm soát vi sinh vật. Nhiệt độ cao có thể tiêu diệt vi sinh vật do tác dụng làm biến tính enzym, mất nước và oxy hóa các thành phần của tế bào. Nhiệt độ thấp ức chế sự sinh trưởng của chúng. Có thể khử trùng ở nhiệt độ cao bằng phương pháp nhiệt khô hoặc nhiệt ẩm.

Năng lượng chiếu xạ ở bước sóng ngắn (tia X, tia gamma) có khả năng ion hóa phân tử nước, tạo các gốc tự do có tác dụng phá hủy DNA, màng lipid, protein trong tế bào. Tia bức xạ có bước sóng dài hơn như tia tử ngoại không có tác dụng ion hóa nhưng có thể cảm ứng hình thành dimer gữa các base T trong acid nucleic tạo đột biến, có thể gây chết tế bào.

Ngoài ra, nhiều chất hóa học có khả năng kiểm soát sự sinh trưởng cua vi sinh vật như ethylen oxide, triethyl glycol, chất diệt khuẩn, chất kháng sinh... Chất kháng sinh là sản phẩm chuyển hóa được tạo thành bởi một nhóm các vi sinh vật, có tác dụng ức chế sự tăng trưởng hoặc tiêu diệt vi sinh vật khác. Ngày nay, kháng sinh được sử dụng phổ biến trong y học để điều trị các bệnh gây ra bởi vi sinh vật. Việc lựa chọn một chất kháng sinh để điều trị bệnh phụ thuộc vào các yếu tố: (1) độ mẫn cảm của vi sinh vật gây bệnh đối với chất kháng sinh; (2) tác dụng phụ của chất kháng sinh lên tế bào và lên hệ vi sinh vật đường ruột; (3) tốc độ chuyển hóa làm mất hoạt tính chất kháng sinh trong cơ thể; (4) đặc tính hóa học của chất kháng sinh cho phép vận chuyển và tính tụ tại cơ quan mục tiêu để tiêu diệt vi sinh vật. Tính mẫn cảm của vi sinh vật đối với kháng sinh có thể được xác định bằng kỹ thuật khánh sinh đồ (ví dụ: phương pháp khuếch tán kháng sinh trên thạch Kirby Bauer hoặc phương pháp MIC pha loãng kháng sinh liên tiếp tìm nồng độ ức chế tối thiểu...).

Hình. Sự đối kháng của chất kháng sinh nấm mốc đối với vi khuẩn


2.1. Dụng cụ




Trang 68







6 Que cấy Cái 1

7 Bình tia Cái 1



1 Tủ ấm Cái 1


2.2. Môi trường, hóa chất- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Môi trường cao thịt-pepton- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật làm kháng sinh đồ: Môi trường Mueller Hinton- Cồn 96o

- Đĩa giấy tẩm kháng sinh: ampicillin, streptomycin, chloramphenicol, kanamycin, tetracyclin, penicillin.

2.3. Chủng giống vi sinh vật- Vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococcus aureus2.4. Nguyên liệu khác- Giấy lọc- Bông không thấm- Bông thấm nước- Tăm bông vô trùng

3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Kiểm soát sự sinh trưởng của vi sinh vật bằng tia UVa. Chuẩn bị đèn UV- Đèn UV đặt úp, cách vật chiếu 10cm trong buồng chiếu. Dùng vải dày, xậm màu che

chắn kỹ, tránh tia UV chiếu vào mắt (có thể nhìn qua kính thủy tinh).- Bật đèn cho ổn định 30 phút trước khi chiếu.b. Thực hiện chiếu xạ- Thực hiện hút 1ml dịch huyền phù vi khuẩn E. coli cho vào hộp petri vô trùng chứa

9ml NaCl 0,9% có cá từ.- Đặt hộp petri lên máy khuấy từ ở dưới hộp đèn UV trong buồng chiếu. Điều chỉnh

tốc độ của cá từ ở mức vừa phải.- Mở nắp hộp petri, dung micropipette với đầu tip vô trùng thu 0,2ml dịch huyền phù

tế bào vào một ống Eppendorff. Đánh số 0 lên nắp ống.- Tiếp tục thu mẫu như trên sau mỗi 5 phút chiếu xạ cho đến 30 phút. Ghi nhận thời

gian chiếu xạ lên nắp ống Eppendorff chứa mẫu.c. Kiểm tra khả năng sống sót của vi khuẩn- Chuyển vô trùng 0,1ml huyền phù tế bào được chiếu xạ 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 lên

Trang 69

hộp petri chứa môi trường cao thịt-pepton.- Dùng que trải thủy tinh vô trùng trải đều dịch vi khuẩn lên khắp bề mặt thạch.- Nuôi ủ trong tối trong thời gian 24 giờ.- Ghi nhận sự sinh trưởng và đếm số khuẩn lạc trên mỗi đĩa.3.2. Ức chế sự sinh trưởng của vi sinh vật bằng chất kháng sinh- Mỗi tổ sinh viên chuẩn bị sẵn 2 đĩa petri chứa môi trường Mueller Hinton. Mỗi đĩa

sẽ dùng để cấy một chủng vi khuẩn là E.coli và Staphylococcus aureus.- Trong điều kiện vô trùng, nhúng đầu tăm bông vô trùng vào ống giống vi khuẩn (môi

trường nuôi cấy dạng lỏng). Vắt dịch giống vi khuẩn thừa bằng cách ép và xoay đầu que tăm bông vào thành ống nghiệm phía trên mực dung dịch trong ống.

- Chuyển đầu tăm bông sang đĩa petri, bôi đều đầu tăm bông lên bề mặt môi trường, để khô trong 5 phút. Dùng một que tăm bông và một hộp petri riêng cho mỗi giống vi khuẩn.

- Dùng bút đánh dầu chia hộp petri thành 6 phần bằng nhau.- Dùng kẹp inox vô trùng, gắp và đặt một đĩa giấy tẩm kháng sinh vào mọt phần trên

đĩa petri. Mỗi phần dùng cho một loại kháng sinh riêng. Ghi chú tên kháng sinh ở mỗi phần đĩa.

- Ủ các đĩa ở 370C trong 24-48 giờ.- Sau thời gian này, quan sát và đo đường kính vòng vô khuẩn tạo ra quanh đĩa giấy

kháng sinh.

Hình. Đĩa kháng sinh đồ thử nghiệm tính mẫn cảm của vi khuẩn với chất kháng sinh

4. Những điểm cần lưu ý- Tránh nhìn trực tiếp tia UV. Phải đeo kính lọc tia UV và mang găng tay khi thực

hiện chiếu xạ.- Các que tăm bông sau khi cấy dịch vi khuẩn lên đĩa petri phải được gom chung và

hấp khử trùng trước khi loại bỏ.- Ghi chú cẩn thận vị trí của các đĩa giấy tẩm các chất kháng sinh khác nhau để tránh

nhầm lẫn về kết quả khảo sát kháng sinh đồ.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày cơ chế tiêu diệt vi sinh vật bởi chất kháng sinh?- Xác định số lượng khuẩn lạc trên các đĩa petri được chiếu xạ với thời gian khác

nhau? Xác định thời gian chiếu xạ làm vi khuẩn chết hoàn toàn

Trang 70

- Đo đường kính vòng vô khuẩn của hai loài vi khuẩn theo các kháng sinh khác nhau? Nhận xét về tính mẫn cảm trên mỗi kháng sinh của mỗi vi sinh vật?

Trang 71

BÀI 12

XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG PHÂN GIẢI CELLULOSE VÀ HOẠT TÍNH ENZYME CELLULASE CỦA VI SINH VẬT

1. Nguyên tắc

Cellulose là thành phần cấu tạo cơ bản của thành tế bào thực vật. Hằng năm có một lượng lớn cellulose được đưa vào trong đất dưới dạng chất thải hữu cơ. Mặc dù là một hợp chất cao phân tử khá bền, chúng vẫn bị phân giải mạnh dưới ảnh hưởng của một số vi sinh vật trong điều kiện kỵ khí lẫn hiếu khí, môi trường kiềm hay acid, độ ẩm cao hoặc thấp ở các điều kiện khác nhau.

Hoạt động phân giải cellulose và vai trò của vi sinh vật phân giải cellulose có ảnh hưởng lớn đến độ phì nhiêu cho đất và có tầm quan trọng đặc biệt đối với vòng tuần hoàn carbon. Ngoài ra quá trình phân giải cellulose của vi sinh vật còn có ý nghĩa quan trọng trong quá trình xử lý chất thải có nguồn gốc hữu cơ giàu cellulose.

Trong điều kiện hiếu khí, các vi sinh vật tham gia vào việc phân giải cellulose gồm niêm vi khuẩn, vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm. Chúng tổng hợp enzyme cellulase thủy phân cellulose như sau:

(C6H10O5)n + H2O + xO2 → R-CHOH COOH + O2 → CO2 + H2O + xKc

Trong điều kiện kỵ khí, vi sinh vật sản xuất enzym cellulase để phân giải cellulose. Dưới tác dụng của cellulase và cellobiase, cellulose sẽ được biến thành glucose.

(C6H10O5)n + 1/2nH2O + xO2 → 1/2n C12H22O11

Cellulose Cellobiose

C12H22O11 + 1/2nH2O C6H12O6

Glucose

Glucose sẽ được tiếp tục lên men tạo thành nhiều sản phẩm khác như acid butyric, acid acetic, CO2, H2, CH4...

nC6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + CH3COOH + H2 + CO2 + xC

nC6H12O6 → CH3CH2CH2COOH + CH3COOH + CO2 + CH4 + Xc

Trong điều kiện không khí bị hạn chế, các vi khuẩn ưa ấm hoặc ưa nóng thuộc nhóm Clostridium và Bacillus sẽ tiến hành phân giải cellulose.


2.1. Dụng cụ






Trang 72

Cellobiase





6 Que cấy Cái 1

Kính hiển vi Cái 1

Lame và lamelle Tấm 2

7 Bình tia Cái 1



1 Tủ ấm Cái 1



- Dầu soi kính

- Xanh metylen

- Lugol

- Môi trường Vinogratxki:

+ KNO3: 2,5g

+ KH2PO4: 1,0g

+ MgSO4: 0,5g

+ NaCl: 0,5g

+ FeSO4: 0,01g

+ Mn2(SO4)3: 0,001g

+ Nước cất đủ 1000 ml

Phối trộn các thành phần, điều chỉnh pH7,0±0,2. Phân phối vào các dụng cụ chứa. Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút.


- Giấy lọc



- Đất vườn

3. Tiến hành thí nghiệm

Trang 73

3.1. Xác định quá trình phân giải hiếu khí cellulose bởi vi sinh vật

- Cho vào ống nghiệm 4 - 5 ml môi trường Vinogratxki.

- Nhúng vào dung dịch trong ống nghiệm một dải giấy lọc (20 x 1,5 cm)

- Dùng kẹp sắt hoặc sợi chỉ kẹp một đầu dải giấy vào miệng ống nghiệm. Ống nghiệm môi trường được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút

- Cho vào ống nghiệm một cục đất nhỏ (nguồn vi sinh vật) rồi đặt ống nghiệm vào tủ ấm, giữ ở 300C trong 7 - 15 ngày.

- Các vi sinh vật phân giải cellulose phát triển, tiết ra enzym cellulase làm cho giấy bị phân huỷ, hoá nhày có màu vàng, hồng, lục, chất nhày có màu sắc đó chính là khuẩn lạc của vi khuẩn.

- Xác định các đối tượng vi sinh vật tham gia quá trình phân giải hiếu khí cellulose.Để quan sát hình thái các vi sinh vật hiếu khí tham gia vào quá trình phân giải này ta làm tiêu bản từ các chất nhày trên bề mặt giấy lọc.

- Nhuộm đơn vết bôi bằng Fuchsin.

- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x 100).

3.2. Xác định quá trình phân giải kỵ khí cellulose bởi vi sinh vật

- Cho vào ống nghiệm 10ml môi trường có thành phần như sau:

+ NH4PO4: 2,0g

+ KH2PO4: 1,0g

+ CaCl2: 0,3g

+ Peptone: 1g

+ MgSO4: 0,5g

+ CaCO3: 5,0g

- Cho một dải giấy lọc (10 cm x 1,5 cm) ngập trong ống nghiệm có môi trường.

- Hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong 30 phút. Bỏ vào một cục đất nhỏ để cấy nguồn vi sinh vật có bào tử.

- Để tủ ấm ở 300C và 600C trong 1 - 2 tuần.

- Vi khuẩn phân giải Xenlulose kị khí phát triển ở 600C sẽ làm cho môi trường đục lên, phiến giấy lọc có màu vàng, nhày và nát vụn dần ra.

- Xác định thành phần loài vi sinh vật phân giải cellulose kị khí.

- Làm tiêu bản từ chỗ nhày của giấy và nhuộm đơn bằng Fuchsin.

- Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x 100).

3.3. Xác định hoạt tính enzym cellulase của vi sinh vật

a. Chủng vi sinh vật

- Thí nghiệm được tiến hành trên các chủng vi sinh vật:

- Nấm mốc: Penicillium, Aspergillus, Trichoderma

- Xạ khuẩn: Streptomyces sp.

- Nấm men: Saccharomyces sp.

b. Môi trường nuôi cấy:

Trang 74

Môi trường để kiểm tra khả năng sinh enzym có thành phần:

+ NaNO3 3g + FeSO4 0,01g

+ K2HPO4 1g + CMC 5g

+ KCl 0,5g + Agar 20g

+ MgSO4.7H2O 0,5g + Nước cất đủ 1000ml

- Cách pha chế: Hòa tinh bột tan vào nước ấm, khuấy đều, đun thành hồ rồi đổ vào hỗn hợp làm môi trường. Điều chỉnh pH = 5,5 nếu cấy nấm mốc, pH = 6,8 - 7,2 nếu cấy xạ khuẩn. Khử trùng môi trường ở 1210C/30 phút. Phân phối môi trường vào hộp petri, để nguội.

c. Cấy các chủng vi sinh vật để kiểm tra khả năng hình thành enzym cellulase

- Dùng que cấy hình thước thợ lấy giống vi sinh vật cấy vào tâm của đĩa môi trường thạch một điểm. Mỗi đĩa thạch cấy từ 1 chủng.

- Để các hộp petri đã cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 300C.

d. Xác định hoạt tính enzym cellulase

- Chủng vi sinh vật vừa phân lâp được nuôi cấy trong môi trường thích hợp để phát triển thành khuẩn lạc.

- Các enzym đặc trưng được chúng tiết ra môi trường xung quanh dưới dạng vòng trong suốt bao quanh khuẩn lạc gọi là vòng thủy phân.

- Căn cứ tỷ lệ vòng thủy phân và đường kính của khuẩn lạc để đánh giá khả năng hình thành enzym của chủng vi sinh vật (hoạt tính enzym của vi sinh vật).

- Dùng thước kẻ có chia mm, đo đường kính của khuẩn lạc vi sinh vật phát triển trên đĩa môi trường. Ghi chú là d (mm)

- Đổ dung dịch lugol lên mặt thạch môi trường

- Enzym cellulase tiết ra môi trường sẽ làm phân giải tinh bột ở phần xung quanh các khuẩn lạc tạo thành vòng thủy phân không màu. Phần còn lại sẽ có màu xanh.

- Dùng thước đo đường kính vòng thủy phân. Ghi chú là D (mm). (Chú ý: đo ở mặt sau hộp petri và đo bằng mm).

Hình. Phương pháp xác định hoạt tính enzym của vi sinh vật bằng vòng phân giải

- Tính tỷ lệ D/d. Tỷ số này có giá trị càng cao chứng tỏ hoạt tính enzym của chủng vi sinh vật càng mạnh .

Trang 75

Vùng phân giảiKhuẩn lạc

Vùng không phân giải

d

D

- Ta ghi nhận kết quả theo mẫu bảng sau:

Chủng Vi sinh vật

Quan sát lần 1 Quan sát lần 2 Nhận xét và kết luận

Thời gian nuôi D d D/d Thời gian nuôi D d D/d


- Phải đo đường kính khuẩn lạc trước khi cho dung dịch lugol vào đĩa Petri để đo đường kính vòng phân giải.

- Khi đo kích thước khuẩn lạc, tiến hành đo ở mặt dưới của đĩa Petri.

- Khi cấy sinh khối vi sinh vật vào đĩa petri, cấy vào tâm đĩa và hạn chế sự rơi vãi của vi sinh vật ra những vùng môi trường khác trên đĩa (nhất là đối với bào tử nấm mốc) để tránh hiện tượng mọc lan của khuẩn lạc vi sinh vật dẫn đến không xác định được vòng phân giải.

5. Báo cáo thực tập

- Trình bày hoạt tính của enzym cellulase và cơ chế phân giải cellulose bởi vi sinh vật?

- Trình bày phương pháp xác định khả năng phân giải cellulose bởi vi sinh vật?

- Nhận xét khả năng phân giải cellulose của các vi sinh vật trong môi trường đất?

- Vẽ hình tiêu bản nhuộm Gram của các vi sinh vật phân giải cellulose trong đất?

- Đo kích thước khuẩn lạc, kích thước vòng phân giải. So sánh hoạt tính enzym cellulase của các chủng vi sinh vật thử nghiệm?

Trang 76

BÀI 13ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM

TRỰC TIẾP1. Nguyên tắc

Phương pháp đếm trực tiếp là phương pháp định lượng dựa trên sự quan sát và đếm trực tiếp số lượng tế bào vi sinh vật bằng kính hiển vi và buồng đếm. Phương pháp này dùng để xác định số lượng các loại vi sinh vật đơn bào có kích thước lớn: nấm men, tảo đơn bào, bào tử mốc dễ quan sát trên kính hiển vi.. Quy trình đếm đơn giản, cho phép xác định nhanh chóng số lượng vi sinh vật. Tuy nhiên, do quan sát và đếm bằng mắt trên kính hiển vi, phương pháp này có một số trở ngại:

- Không phân biệt được tế bào vi sinh vật sống và chết trong mẫu.- Không phân biệt được các tế bào vi sinh vật và hạt vật thể- Hạn chế đối với huyền phù có mật độ thấp do lượng dung dịch đem đếm nhỏ.

Tùy mức độ hiện diện của vi sinh vật trong mẫu ban đầu, dung dịch đem đếm cần được pha loãng đến mức phù hợp (số tế bào trong một ô nhỏ không quá 10 tế bào). Nguyên tắc pha loãng:

- Mẫu phải được pha loãng. Tuỳ theo mức độ nhiễm khuẩn của mẫu ta có sự ước lượng pha loãng 1/5; 1/10 ; 1/20 hay 1/10; 1/100; 1/1000……..

- Dung dịch dùng pha loãng mẫu thường là NaCl 9% hay photphat đệm đã được vô trùng.

- Cách pha:

+ Mẫu 1/5 : 1ml mẫu + 4ml NaCl 9%

+ Mẫu 1/10: 1ml mẫu + 9ml NaCl 9%0

- Từ mẫu 1/10(10-1) lấy 1ml + 9ml NaCl 9% ta có độ pha loãng 10-2 , cứ như vậy ta có các độ pha loãng tiếp theo 10-3, 10-4……..


2.1. Dụng cụ







1 Bình tia Cái 1


3 Buồng đềm vi sinh vật Cái 1

4 Lamelle Cái 1

Trang 77



5 Que cấy Cái 1





2 Tủ sấy Cái 1

2.2. Môi trường và hoá chất- Nước muối sinh lý 0,9%- Nước cất vô trùng.- Cồn 96o

2.3. Nguyên liệu khác- Chủng nấm men: Saccharomyces cerevisiae- Bánh men thuốc bắc- Quả nho- Mẫu nước ao, hồ dùng để đếm số lượng tảo đơn bào


3.1. Đếm trên lam phết kính: Tiêu bản vi khuẩn đã được nhuộm màu (nhuộm đơn).

∑ = 30 - 50

Hình. Diện tích hình vuông phết kính Hình. Sơ đồ di chuyển vật kính trong phết kính

a. Phết kính- Dùng lam sạch và bút chì mỡ (bút lông kim), kẻ một hình vuông S = 400 mm2, ở mặt

trên lam. Mục đích không cho vi khuẩn lan ra khỏi diện tích đếm. - Hút V (0.02 – 0.2 ml) dung dịch đã pha loãng , nhỏ vào giữa hình vuông, ở mặt trên

lam. - Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy ở đầu que dàn đều giọt mẫu ra xung quanh,

vừa chạm vào cạnh hình vuông.- Cố định tiêu bản, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm blue methylen.- Nhỏ một giọt dầu soi, xem ở vật kính x100. b. Cách đếm- Đếm số tế bào vi sinh vật/ 1VT (VT: vi trường).- Đếm hết tất cả từ 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính. Theo sơ đồ hình vẽ.

Trang 78

D

20mm

c. Công thức tính

Số tế bào/ml mẫu = (X x 400)/(0.0004 x V x H)

X: Số tế bào vi khuẩn đếm được trong một vi trường400: diện tích hình vuông phết kính, bằng 400mm0.0004: diện tích vi trường vật kính X100, πR2= 0.0004mm2

V = thể tích giọt vi khuẩn phết kính H = hệ số pha loãng mẫu

3.2. Đếm trong buồng đếm

a.Cấu tạo buồng đếm.

Tên của loại buồng đếm.Rãnh buồng đếm, nơi cho dd vào

Khung đếm

Chiều cao của 1 ô nhỏ(1/10) Diện tích của 1 ô nhỏ(1/400)

Hình. Buồng đếm tế bào vi sinh vật

- Buồng đếm là một phiến kính trong, dày, hình chữ nhật.

- Giữa là phần lõm phẳng, có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ. Bên ngoài có ghi tên loại buồng đếm, và ghi các thông số kỹ thuật như hình trên.

b.Cấu tạo khung đếm.

Hình. Cấu tạo Khung đếm Thoma

Trang 79

Số vi trường có được trong S:4cm2

Lá kínhRãnh tràn

Lưới đếm vi sinh vật

Dịch mẫu

Hình. Buồng đếm nhìn mặt bên

Cấu tạo một khung đếm có:

- Trường hợp1: 1 khung có 16 ô lớn, 1 ô lớn có 25 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ.

- Trường hợp 2: 1 khung có 25 ô lớn, 1 ô lớn có 16 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ.

- Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400 mm2. Vậy Vô nhỏ = 0.1 mm x 1/400 mm2 = 1/4000mm3.

c. Cách tiến hành.

Hình. Cách nạp mẫu dung dịch vi sinh vật vào buồng đếm

- Đặt lamelle sạch phủ lên khung đếm.

- Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch nấm men đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu, bơm nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm và lamelle.

- Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lamelle, hơi thừa một ít. Nếu bị bọt mắc lại trong lamelle thì phải làm lại.

- Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm.

- Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó dùng vật kính x40 để đếm.

- Đếm số tế bào trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh, 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏ trong 1 ô lớn. Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm số tế bào nằm ở cạnh phía trên và cạnh bên trái của ô.

- Đếm tất cả 80 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (Trường hợp: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ).

- Hoặc đếm 125 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (Trường hợp: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ).

d.Công thức tính.

Trong trường hợp buồng đếm với ô lớn có 16 ô nhỏ, số lượng tế bào trong mẫu ban đầu

Trang 80

được tính như sau:

Số tế bào/1 ml mẫu = (a x 250 x 1.000)/H

Trong đó:

a = số tế bào trung bình có trong 1 ô lớn.

1.000 = số qui đổi từ 1mm3 thành 1ml (1ml = 1.000 mm3)

H = hệ số pha loãng (ví dụ: H = 10-2)

Hình. Phương pháp đếm trực tiếp số lượng tảo trong buồng đếm

Hình. Những tế bào được đếm (màu đen) và không được đếm (màu xanh) trong 1 ô lớn


- Chỉ đếm được tổng số tế bào, không thể biết tế bào nào còn sống, tế bào nào đã chết.

Trang 81

http://www.microbehunter.com/wp/view-image?filename=http://www.microbehunter.com/wp/wp-content/uploads/2010/06/counting_chamber5.jpg&alt=counting%20chamber%20(hemocytometer)%20-%20(C)%20Oliver%20Kim&caption=Do%20not%20count%20cells%20on%20the%20top%20and%20right%20lines.%20Here%20it

- Nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ mỗi ô nhỏ không quá 10 tế bào.

- Sử dụng xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô.

- Để đạt độ chính xác cao, thì số tế bào trung bình đếm được trong 1 ô nhỏ: 2.5 < a <10.

5. Báo các thực tập

- Trình bày nguyên tắc và cách tiến hành của phương pháp định lượng vi sinh vật bằng phương pháp đếm trực tiếp?

- Xác định số lượng tảo đơn bào trong 1ml mẫu thực phẩm phương pháp đếm trực tiếp?

- Phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách đếm trực tiếp thường áp dụng cho những đối tượng vi sinh vật nào? Giải thích?

Trang 82

BÀI 14ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ TRONG THỰC

PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC

1. Nguyên tắc

Tổng vi khuẩn hiếu khí là tổng số các loại vi khuẩn thuộc nhóm vi khuẩn hiếu khí tồn tại trong môi trường. Trong quá trình sinh trưởng và phát triển, nhóm vi khuẩn này cần oxy cho quá trình hô hấp hiếu khí để chuyển hóa các hợp chất hữu cơ thành năng lượng ATP cung cấp cho hoạt động của chúng. Các nhóm vi sinh vật hiếu khí tồn tại trong môi trường nước chúng sẽ phân giải tích cực các hợp chất hứu cơ tạo thành những sản phẩm cuối cùng là CO 2

và giải phóng ATP. Tổng số vi khuẩn hiếu khí là một trong những tiêu chí để đánh giá mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm của thực phẩm. Và hầu như trong tất cả các loại thực phẩm, nước uống, khi phân tích chất lượng vi sinh vật, chỉ tiêu tổng vi khuẩn hiếu khí là bắt buộc phải phân tích.Các bộ tiêu chuẩn về thực phẩm, nước uống luôn có mức giới hạn cho tiêu chuẩn này. Ví dụ: theo tiêu chuẩn TCVN 7046 : 2002 giành cho sản phẩm thịt tươi, chỉ tiêu tổng số vi khuẩn hiếu khí là: 106 khuẩn lạc/1g thịt. Nếu vượt quá giới hạn, thực phẩm được xem là không an toàn cho người sử dụng.

Tổng số các nhóm vi khuẩn hiếu khí trong mẫu thực phẩm có thể được xác định bằng phương pháp nuôi cấy trải trên bề mặt thạch hoặc bằng phương pháp tạo hộp đổ. Thông qua số lượng khuẩn lạc đếm được trên các đĩa petri cho phép xác định được lượng vi sinh vật sống còn khả năng sinh trưởng trong mẫu ban đầu. Phương pháp định lượng này dựa trên nguyên tắc: một vi sinh sống, trên môi trường dinh dưỡng, sau một khoảng thời gian xác định sẽ phát triển và hình thành nên một khuẩn lạc.

Tuy nhiên, để kết quả đếm chính xác nhất, số lượng khuẩn lạc trên đĩa petri phải trong giới hạn nhất định. Ví dụ, nếu lượng mẫu cấy vào đĩa là 1ml thì số lượng khuẩn lạc vi khuẩn trong đĩa phải trong giới hạn 25-250 khuẩn lạc, đối với nấm mốc là 30-50 khuẩn lạc... Nếu số lượng vượt quá giới hạn thì phải tiến hành pha loãng và chọn những độ pha loãng lớn hơn.


2.1. Dụng cụ





3 Bình tam giác 250ml Cái 1


5 Bình tia Cái 1



8 Que trải Cái 1


Trang 83



10 Que cấy Cái 1




3 Tủ sấy Cái 1

4 Máy dập mẫu Cái 1

5 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1

2.2. Môi trường và hoá chất- Môi trường Plate count agar (PCA)

+ Casein peptone: 5,0g+ Cao nấm men: 2,5g+ Dextrose: 1,0g+ Agar: 15,0g+ Nước cất đủ 1000ml

Cân đầy đủ các thành phần môi trường, phối trộn, điều chỉnh pH=7,0±0,2. Nấu sôi nhẹ cho tan agar. Phân phối môi trường vào bình tam giác. Hấp tiệt trùng ở 1210C/20 phút, để ấm (45-500C) phân phối vào các đĩa Petri.

- Nước muối sinh lý 0,9%- Nước cất vô trùng.- Cồn 96o

2.3. Nguyên liệu khác- Nước mía- Thịt tươi- Túi nilon dập mẫu

3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Lấy mẫu- Tùy theo loại vật phẩm cần xác định mà ta lấy mẫu để nghiên cứu với số lượng và

khối lượng khác nhau cho phù hợp.- Quá trình lấy mẫu có những yêu cầu sau:

+ Lấy các mẫu có tính chất đại diện, lượng mẫu vừa đủ.+ Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng.+ Mẫu lất xong, phải phân tích ngay, không được để quá 24h.+ Mẫu lấy phải có nhãn ghi ký hiệu đồng thời phải ghi vào sổ những đặc điểm

của mẫu và nơi thu mẫu.3.2. Pha loãng mẫu- Chuẩn bị một số bình tam giác chứa 90ml nước muối sinh lý 0,9% hoặc nước

peptone 1,0% vô trùng, một số ống nghiệm chứa 9ml nước muối hoặc nước peptone vô trùng và một số pipet 1ml vô trùng.

* Với mẫu ở dạng lỏng- Hút 1ml mẫu nghiên cứu cho vào ống nghiệm có 9ml nước muối sinh lý vô trùng.

Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên, thổi xuống 3 - 5 lần. Ta được độ pha loãng 1/10 hay 10-1.

Trang 84

- Tiếp tục hút 1ml ở ống nghiệm 1 cho vào ống nghiệm có 9ml nước muối sinh lý vô trùng thứ 2. Trộn đều dung dịch bằng cách hút lên, thổi xuống 3 - 5 lần. Ta được độ pha loãng 1/100 hay 10-2.

- Tiếp tục như vậy hút từ ống 2 sang ống 3, tứ ống 3 sang ống 4 ta sẽ có được các độ pha loãng tương ứng 10-3, 10-4.

Hình. Phương pháp pha loãng bậc 10 dung dịch huyền phù (pha loãng thập phân)

* Với mẫu ở dạng đặcChuẩn bị 2 bình tamgiác có dung tích 250ml:

- Bình 1 chứa 90ml nước muối sinh lý hoặc nước peptone 1,0% vô trùng.- Bình 2 đã vô trùng và không chứa gì cả.- Cho một ít cồn vào cối chày sứ và đốt lên để khử trùng. Để nguội.- Cân 10g mẫu, cho vào cối chày sứ, nghiền nát mẫu hoặc đồng nhất mẫu trong túi dập

mẫu với máy dập mẫu- Dùng toàn bộ nước ở bình 1 để chuyển mẫu sang bình 2. Lắc 5 phút. - Để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng như trong trường hợp mẫu ở trạng thái lỏng.- Tùy theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít.- Sau khi có độ pha loãng thích hợp thì tiến hành xác định số lượng vi sinh vật.

3.3. Xác định gián tiếp số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng các khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch (ISO 4833:1991)

a. Nguyên tắc- Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu lên môi trường đặc trưng trên

hộp petri.- Xác định số lượng tế bào bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc mọc lên sau thời gian

nuôi cấy vì mỗi khuẩn lạc là kết quả của sự phát triển của một tế bào.b. Cách cấy mẫu* Cấy theo phương pháp tạo hộp đổ- Pha loãng dịch huyền phù ở các nồng độ khác nhau: 10-3, 10-4 , 10-5 để cấy mẫu.- Ghi vào nắp hộp petri có môi trường thạch các thông tin: nồng độ pha loãng, ngày

cấy- Dùng pipet đã vô trùng lấy 1ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa petri (đã vô trùng).- Cho khoảng 15ml môi trường PCA ở nhiệt độ khoảng 450C vào hộp petri. Xoay

chậm cho hỗn hợp trộn đều. Để yên cho nguội. Lật ngược cho vào tủ ấm. Nuôi cấy ở 300C trong 72 giờ.

Trang 85

Ống nuôi cấy ban đầu(ống gốc)

10-1

101

10-2

102

10-3

103

10-4

104

Tỉ lệ pha loãngĐộ pha loãng

10-5

105 Độ pha loãng cuối

- Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ. Mỗi nồng độ cấy 3 hộp petri.- Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả.

Hình. Quy trình tạo hộp đổ* Phương pháp cấy bề mặt- Dịch huyền phù được chuẩn bị tương tự như phương pháp tạo hộp đổ.- Môi trường PCA sau khi hấp tiệt trùng, được làm nguội đến khoảng 50-600C sau đó

đổ vào đĩa Petri vô trùng.- Đĩa Petri chứa môi trường được làm khô bề mặt bằng cách sấy trong tủ sấy ở nhiệt

độ 350C hoặc chuẩn bị trước 2 ngày.- Dùng pipet vô trùng hút chính xác 0,1ml hoặc 0,3ml nhỏ lên bề mặt môi trường

trong đĩa petri.- Trải đều dung dịch vi sinh vật lên bề mặt môi trường bằng que trải tam giác thủy

tinh.- Các đĩa petri được để ở nhiệt độ phòng 15-20 phút cho khô bề mặt. Lật ngược cho

vào tủ ấm. Nuôi cấy ở 300C trong 72 giờ.- Mỗi mẫu cấy 3 nồng độ. Mỗi nồng độ cấy 3 hộp petri.- Sau đó lấy ra kiểm tra kết quả.

Trang 86

Đĩa petri vô trùng

PCA

45oC

10 -15 ml

Dung dịch mẫu đã

pha loãng

1 ml

Lắc đều đĩa petriĐể nguội

Lật ng

ược đĩa

Ủ 30oC/3 ngày

Đếm số khuẩn lạc và tính kết quả

Hình. Phương pháp cấy trải bề mặt

c. Cách đếm- Lấy bút chì kẻ 2 đường vuông góc ở đáy hộp petri và đánh dấu thứ tự từng vùng I, II,

III, IV.- Đếm số lượng khuẩn lạc từng vùng. Nhớ đánh dấu các khuẩn lạc đã đếm.- Số lượng tế bào trong một gram mẫu được tính theo công thức sau đây:

Với : N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml mẫu.

CFU: colony form units) C: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên các hộp petri đã chọn (có số khuẩn lạc nằm trong khoảng từ 25-250 khuẩn lạc/đĩa)

ni : Số hộp petri cấy tại độ pha loãng thứ idi: hệ số pha loãng tương ứng. v: thể tích dịch mẫu (ml) cấy vào trong mỗi đĩa

Ví dụ: trong một trường hợp phân tích 1g mẫu cụ thể nhận được kết quả sau:Nồng độ pha loãng 10-3 10-4

Kết quả Hộp petri 1 235 26Hộp petri 2 246 36Hộp petri 3 198 17

- Số khuẩn lạc có trong mẫu là:

- Vậy số lượng khuẩn lạc có trong 1ml mẫu hoặc trong 1 gam mẫu (CFU/g hay CFU/ml) là 2.3x105

* Trong trường hợp số lượng khuẩn lạc có trong cả hai hộp petri nhỏ hơn 15 ta tính như sau:

- Gọi m là lượng khuẩn lạc trung bình có trên hai hộp petri- Lượng khuẩn lạc có trong mẫu lỏng là: NE=m / ml- Nếu là mẫu đặc thì lượng khuẩn lạc có trong 1 gam mẫu sẽ là: NE=mxd-k, với d là hệ

số pha loãng.* Trong trường hợp số lượng khuẩn lạc trong cả hai hộp petri nhỏ hơn 1 tính như sau:- Lượng khuẩn lạc có trong mẫu lỏng là: NE nhỏ hơn 1 / ml- Nếu là mẫu đặc thì lượng khuẩn lạc có trong 1 gam mẫu sẽ là : NE nhỏ hơn 1xd-k,

với d là hệ số pha loãng- Chú ý: Độ pha loãng thích hợp nhất nếu ở nồng độ này cấy trên thạch đĩa cho số

khuẩn lạc trung bình từ 50 - 150 với vi khuẩn, xạ khuẩn; 30 - 50 với nấm.

Trang 87

Bút đếm khuẩn lạc Bàn đếm khuẩn lạc Máy đếm khuẩn lạc tự độngHình. Các loại dụng cụ đếm khuẩn lạc

4. Những điểm cần lưu ý- Khi tiến hành pha loãng mẫu, các dung dịch phải được hút đúng thể tích yêu cầu.- Đối với phương pháp tạo hộp đổ, môi trường nuôi cấy sau khi hấp tiệt trùng phải

được làm nguội đến 45-500C bằng bể ổn nhiệt trước khi đổ vào đĩa petri chứa dung dịch vi sinh vật.

- Các đĩa petri nuôi cấy vi sinh vật phải được lật úp trước khi nuôi ủ để tránh các khuẩn lạc ở bề mặt mọc loang.

- Trong quá trình đếm khuẩn lạc, không được mở hộp petri.- Que trải thủy tinh dùng để trải dung dịch vi sinh vật được khử trùng bằng cách nhúng

vào cồn 960 rồi đốt, không được hơ trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày phương pháp định lượng tổng vi khuẩn hiếu khí trong mẫu bằng phương pháp đếm khuẩn lạc?

- So sánh ưu và nhược điểm của phương pháp tạo hộp đổ và phương pháp cấy trải bề mặt?

- Tính số CFU/ml mẫu nước ban đầu?

Trang 88

BÀI 15ĐỊNH LƯỢNG COLIFORMS BẰNG PHƯƠNG PHÁP MPN

(MOST PROBABLE NUMBER)1. Nguyên tắc

Từ Coliforms được Blachstein sử dụng đầu tiên vào năm 1893 để nói về những vi khuẩn Bacilli có đặc điểm hình thái giống E.coli. Coliform là những trực khuẩn, Gram (-), không sinh bào tử, hô hấp tùy tiện, có khả năng lên men lactose sinh acid và sinh hơi ở 37oC trong 24-48 giờ. Nhóm Coliforms hiện diện rộng rãi trong tự nhiên, trong ruột người, động vật. Số lượng Coliforms trong mẫu được dùng để chỉ thị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác, chỉ thị cho mức độ an toàn vệ sinh của một môi trường hay một sản phẩm. Nhóm Coliforms gồm bốn giống là: Escherichia với một loài duy nhất là E. coli; Citrobacter; Klebsiella và Enterobacter.

Coliforms chịu nhiệt là những Coliforms có khả năng lên men lactose sinh hơi khi ủ ở 44oC/24h trong môi trường EC. Coliforms phân (Faecal Coliforms hay E. coli giả định) là Coliforms chịu nhiệt có khả năng sinh indole khi ủ ở 44.5oC/24h trong tryptone.

E. coli có mặt rất nhiều trong phân người và động vật. Trong phân tươi, đậm độ của chúng có thể đến 109/g. Chúng được tìm thấy trong nước cống rãnh, trong các công đoạn xử lý và trong tất cả các nguồn nước và đất vừa mới bị nhiễm phân từ người, động vật hoặc do sản xuất nông nghiệp. Gần đây người ta đã nghĩ đến E. coli có thể tồn tại hoặc thậm chí phát triển trong những nguồn nước ở vùng nhiệt đới không phải là đối tượng bị ô nhiễm phân. Từ phân, coliform có thể xâm nhiễm trực tiếp vào thực phẩm trong các công đoạn chế biến, cánh tác hoặc phân phối.

Hình. Cấu trúc nhóm Coliforms

Nhóm Coliforms trong thực phẩm có thể được xác bằng phương pháp MPN.

Phương pháp MPN (phương pháp có xác suất cao nhất, số tối khả) còn được gọi là phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ. Đây là phương pháp dùng để đánh giá số lượng vi sinh vật theo số lượng vi sinh vật có xác suất lớn nhất hiện diện trong một đơn vị thể tích mẫu hay nói cách khác phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VI SINH VậT trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu. Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ

Trang 89

pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 9 ống nghiệm. Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính.

Từ kết quả của các thí nghiệm định tính, dựa vào bảng Mac Crady để suy ra mật độ ước đoán số lượng vi sinh vật có trong mẫu, được trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/g mẫu. Độ chính xác của phương pháp MPN phụ thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng: số lượng ống nghiệm lặp lại càng cao thì độ chính xác của trị số MPN càng lớn.

Có hai hệ thống MPN

- Hệ thống 9 ống

- Hệ thống 15 ống

Phương pháp MPN có đặc điểm:

- Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như

+ Sự tạo hơi: Coliforms …

+ Sự đổi màu: S. aureus

- Cho phép định lượng được mật độ vi sinh vật thấp trong thể tích mẫu lớn


2.1. Dụng cụ





3 Bình tam giác 250ml Cái 1


5 Bình tia Cái 1



8 Que trải Cái 1


10 Ống Durham ống 9

11 Que cấy Cái 1




Trang 90



3 Tủ sấy Cái 1

4 Máy dập mẫu Cái 1

5 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1


- Môi trường BGBL

+ Peptone: 10g

+ Lactose:10g

+ Oxgall: 20g

+ Brilliant green: 0,0133g

+ Nước cất: đủ 1000ml

Điều chế: Cân 40g bột môi trường BGBL, bổ sung nước cất cho đủ 1000ml, khuấy đều. Phân phối vào các dụng cụ chứa. Đặt ống Durham vào môi trường. Đem hấp khử khuẩn ở 121oC (1atm)/15 – 20 phút. pH: 7,7± 0,1

- Nước muối sinh lý 0,9%- Nước cất vô trùng.- Cồn 96o

2.3. Nguyên liệu khác- Thịt tươi- Túi nilon dập mẫu


3.1. Lấy mẫu phân tích

- Mẫu thực phẩm từ các cơ sở chế biến được lấy theo tiêu chuẩn ISO : 5667 hoặc TCVN 5994:1995.

- Các dụng cụ chứa mẫu được bảo quản ở 40C trong thời gian ngắn (6-8 giờ) và ở -200C trong thời gian dài (không quá 36 giờ). Tránh ánh sáng trực tiếp.

- Trước khi phân tích, các mẫu nước bảo quản lạnh đông phải được rã đông hoàn toàn ở nhiệt độ phòng hoặc ở nhiệt độ 450C trong 15 phút.

3.2. Chuẩn bị mẫu phân tích

- Nếu là mẫu lóng, lắc nhẹ bình mẫu, dùng pipet vô trùng, hút chính xác 10ml dung dịch mẫu cho vào một bình tam giác có chứa sẵn 90ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% hoặc nước muối peptone 1%. Nếu là mẫu rắn, dùng đĩa cân, kẹp inox vo trùng cân chính xác 10 g mẫu cho vào một bình tam giác có chứa sẵn 90ml dung dịch nước muối sinh lý 0,9% hoặc nước muối peptone 1%.

- Lắc đều bình tam giác để hòa đều mẫu, ta được độ pha loãng 10 -1. Nếu là mẫu rắn, tiến hành dập mẫu bằng máy dập.

- Tiến hành pha loãng mẫu tiếp tục theo phương pháp pha loãng bậc 10 thành các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4...

- Dùng micropipet với đầu tuýp vô trùng, hút cho vào các ống nghiệm (loạt 9 ống hoặc 15 ống được phân thành 3 nhóm cho 3 nồng độ) có chứa môi trường thích hợp (ví dụ: BGBL

Trang 91

dùng cho coliforms) cho sự tăng trưởng của đối tượng vi sinh vật cần định lượng một thể tích chính xác (thường là 1ml) dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng liên tiếp.

- Các ống nghiệm môi trường được ủ ở nhiệt độ và thời gian thích thích hợp (37oC trong 24-36h).

- Xác định số ống dương tính (có biểu hiện sinh hơi, đổi màu, đục…) ở các loạt ống thí nghiệm ở 3 nồng độ pha loãng tương ứng.

3.3. Tính toán kết quả

- Từ trị số của số ống có biểu hiện dương tính tương ứng ở ba nồng độ pha loãng liên tiếp, tiến hành tra bảng MPN (Bảng tra Mac Crady) cho loạt 9 ống hoặc 15 ống, xác định trị số MPN/100ml của mẫu ban đầu.

- Dựa vào độ pha loãng của các nồng độ chọn phân tích và thể tích mẫu pha loãng cấy vào mỗi ống nghiệm môi trường BGBL, tính toán mật độ của Coliforms hiện diện trong 100ml mấu nước ban đầu. Đối chiếu với TCVN, xác định chất lượng của mẫu thực phẩm.


- Các ống nghiệm chứa môi trường BGBL có ống Durham phải hấp tiệt trùng cẩn thận đế tránh làm lẫn bọt khí vào ống Durham.

- Trong trường hợp tất cả các ống nghiệm môi trường thử nghiệm đều dương tính hoặc đều âm tính thì phải tăng hoặc giảm số lần pha loãng để trong loạt thí nghiệm phải có ống âm tính và ống dương tính.


- Trình bày đặc điểm của nhóm vi khuẩn Coliforms? Tác hại của chúng đối với con người và đối với thực phẩm?

- Trình bày nguyên tắc và phương pháp định lượng Coliforms trong thực phẩm theo phương pháp MPN?

Bảng – Các chỉ tiêu vi sinh vật của sữa tươi tiệt trùng - TCVN 7028 :

2002

Tên chỉ tiêu Mức cho phép

1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí, số khuẩn lạc trong 1 ml sản phẩm 10

2. Coliforms, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm 0

3. E.Coli, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm 0

4. Salmonella, số vi khuẩn trong 25 ml sản phẩm 0

5. Staphylococcus aureus, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm 0

6. Clostridium perfringens, số vi khuẩn trong 1 ml sản phẩm 0

Trang 92

Bản tra MPN dùng cho loạt 9 ống ở ba nồng độ liên tiếp:

Số ống dương tính

MPN/100 ml

Số ống dương tính

MPN/100 mlSố ml mẫu sử dụng

(ml)Số ml mẫu sử dụng

(ml)10 1 0,1 10 1 0,10 0 0 - 2 0 0 90 0 1 3 2 0 1 140 0 2 6 2 0 2 200 0 3 9 2 0 3 260 1 0 3 2 1 0 150 1 1 6 2 1 1 200 1 2 9 2 1 2 270 1 3 12 2 1 3 340 2 0 6 2 2 0 210 2 1 9 2 2 1 280 2 2 12 2 2 2 350 2 3 16 2 2 3 420 3 0 9 2 3 0 290 3 1 13 2 3 1 360 3 2 16 2 3 2 440 3 3 19 2 3 3 531 0 0 4 3 0 0 231 0 1 7 3 0 1 391 0 2 11 3 0 2 641 0 3 15 3 0 3 951 1 0 7 3 1 0 431 1 1 11 3 1 1 751 1 2 15 3 1 2 1201 1 3 19 3 1 3 1601 2 0 11 3 2 0 931 2 1 15 3 2 1 1501 2 2 20 3 2 2 2101 2 3 24 3 2 3 2901 3 0 16 3 3 0 2401 3 1 20 3 3 1 4601 3 2 24 3 3 2 11001 3 3 29 3 3 3 -

Trang 93

BÀI 16ĐỊNH LƯỢNG VI SINH BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG

PETRIFILM1. Nguyên tắcPetrifilm là màng quét lên một lớp chất dinh dưỡng và tác nhân tạo gel. Khi tiến hành

xét nghiệm, 1mL mẫu được cấy vào Petrifilm và ủ. Chất màu đặc biệt trên đĩa khiến các khuẩn lạc có màu đặc trưng dễ dàng phân biệt bằng mắt thường. Các đường kẻ ô giúp cho việc đếm số lượng khuẩn lạc dễ dàng hơn. Các phương pháp Petrifilm đã được thử nghiệm và được AOAC công nhận.

Đĩa Petrifilm E.Coli/Coliform Count (EC) có chứa Violet Red Bile (VRB), chất gel tan được trong nước lạnh, chất chỉ thị hoạt động của glucuronidase và một chất chỉ thị giúp cho việc đếm khuẩn lạc dễ dàng hơn. Hầu hết E.coli (khoảng 97%) sinh beta-glucuronidase, chất này tạo tủa màu xanh gắn kết với khuẩn lạc. Tấm film phía trên giữ bọt khí sinh ra từ quá trình lên men lactose của E.coli và coliforms. Khoảng 95% E.coli có sinh bọt khí, cho khuẩn lạc có màu từ xanh đến xanh – đỏ kèm theo bọt khí trên đĩa Petrifilm.

AOAC INTERATIONAL và U.S FDA Bacteriological Analytical Manual (BAM) xác định Coliforms là trực khuẩn gram âm, hình que, sinh hơi và acid suốt quá trình lên men chuyển hoá lactose. Khuẩn lạc coliform phát triển trên đĩa Petrifilm EC sinh acid, chất chỉ thị pH trong đĩa làm cho lớp keo có màu đỏ. Khí sinh ra được giữ lại xung quanh khuẩn lạc Coliform màu đỏ là dấu hiệu để xác định Coliform

Trong bài thực hành này chúng ta sẽ tiến hành định lượng Coliforms trong nước giải khát ngoài đường phố (giới hạn cho nước giải khát không cồn không đóng chai đối với Coliforms chai 10 CFU/1g, theo QĐ 867/1988 của Bộ y tế) bằng Petrifilm và phương pháp hộp trải truyền thống để so sánh. 2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1. Dụng cụ



1 Giá ống nghiệm Cái 12 Ống nghiệm Ф18 Cái 153 Bình tam giác 250ml Cái 14 Cốc 100ml Cái 15 Bình tia Cái 16 Pipette 1ml Cái 57 Pipette 10ml Cái 18 Micropipette 100-1000μl Cái 19 Đầu týp 1000μl Cái 1

STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú1 Nồi hấp cao áp Cái 12 Tủ cấy vô trùng Cái 13 Tủ sấy Cái 14 Máy dập mẫu Cái 15 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1

2.2. Môi trường và hoá chất- Tấm petrifilm dùng phân tích coliform và Escherichia coli- Nước muối sinh lý 0,9%- Nước cất vô trùng.- Cồn 96o

2.3. Nguyên liệu khác- Thịt tươi- Túi nilon dập mẫu

Trang 94

- Dịch vi khuẩn Escherichia coli kiểm chứng3. Tiến hành thí nghiệm

3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích- Dùng pipet vô trùng hút chính xác 10ml dung dịch mẫu nước cần phân tích cho vào

một túi dập mẫu hoặc một bình tam giác vô trùng. Đối với mẫu rắn cân chính xác 10 g mẫu bằng cân phân tích trong điều kiện vô trùng.

- Bổ sung thêm 90 ml dung dịch nước muối peptone 1% hoặc nước muối sinh lý vô trùng.

- Lắc đều bình tam giác hoặc đồng nhất mẫu bằng máy dập mẫu trong 60 giây, 6-7 nhịp /giây, ta được độ pha loãng 10-1.

Hình. Quy trình chuẩn bị mẫu phân tích- Tiến hành pha loãng mẫu: Dùng pipet vô trùng hút chính xác 1ml dung dịch mẫu ở độ

pha loãng 10-1, tiến hành pha loãng tiếp thành các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4... trên các ống nghiệm đã chuẩn bị sẵn chứa 9ml dung dịch nước muối peptone 1% vô trùng hoặc nước muối sih lý vô trùng.

3.2. Cấy mẫu- Tiến hành cấy mẫu quy trình đếm Coliforms bằng phương pháp đổ đĩa và ủ ở 37oC/2

ngày để làm mẫu đối chứng.- Cấy dịch kiểm chứng trên một đĩa Petrifilm theo quy trình như sau:

+ Đặt tấm petrifilm lên mặt bàn phẳng vô trùng+ Dùng tay hoặc dùng kẹp inox lật màng film nilon phủ bề mặt đĩa petrifilm.+ Dùng pipet vô trùng hoặc micropipet với đầu tuýp vô trùng hút chính xác 1ml dung

dịch mẫu ở các độ pha loãng đã lựa chọn nhỏ lên giữa màng môi trường trên đĩa petrifilm.+ Lật cuộn màng nilon trở lại cẩn thận để tránh tạo bọ khí, không được để tấm màng

film nilon rơi xuống+ Dùng tấm nhựa chặn có mặt phẳng ở bên dưới dàn mỏng giọt dung dịch đều khắp

màng môi trường trong vùng cấy. Dùng một lực nhẹ ấn lên tấm nhựa chặn trải đều mẫu lên vùng cấy trước khi lớp gel hình thành. Tránh xoay hay trượt tấm nhựa chặn mẫu.

+ Lấy tấm nhựa chặn ra để lớp keo đông lại.- Tấm petrifilm được nuôi ủ ở nhiệt độ 35-370C trong thời gian 18-24 giờ. Các tấm

petrifilm có thể chồng lên đến 20 đĩa.- Đếm số lượng khuẩn lạc đặc trưng của coliforms và tính kết quả theo phương pháp

đếm khuẩn lạc trực tiếp bằng mắt hay bằng máy đếm khuẩn lạc. Khuẩn lạc E.coli có màu xanh và sinh khí; khuẩn lạc Coliforms có màu đỏ và sinh khí.

Trang 95

4. Những điểm cần lưu ý- Không sử dụng đĩa này riêng rẻ để phát hiện E. coli O157. Như hầu hết những môi

trường kiểm tra E.coli/coliform khác, đĩa này sẽ không hiển thị đặc biệt với bất kì dòng

Trang 96

ColiformE. coli

Không phải coliform

Hình. Quy trình cấy mẫu vào đĩa petrifilm và cách nhận diện khuẩn lạc coliforms (màu hồng), E. coli (màu tím xanh) trên đĩa petrifilm

O157 nào hiện diện.- Thao tác cấy mẫu vào đĩa petrifilm phải cẩn thận tránh làm lẫn bọt khí vào lớp gel- Các tấm petrifilm có thể dùng để phân lập định danh vi sinh vật.- Sau khi đếm kết quả, các tấm petrifilm phải được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 1210C trong

30 phút trước khi loại bỏ.5. Báo cáo thực hành

- Trình bày nguyên tắc định lượng coliforms bằng phương pháp dùng petrifilm?- Trình bày phương pháp định lượng coliforms bằng phương pháp dùng petrifilm?- Giải thích sự hình thành màu và bọt khí của khuẩn lạc coliforms trên đĩa petrifilm?- Tính mật độ coliforms có trong mẫu ban đầu, đơn vị CFU/ml?

Trang 97

BÀI 17ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM

– LÀM TƯƠNG ĐẬU1. Nguyên tắc

Tương là loại nước chấm giàu đạm được chế biến với nguyên liệu gạo nếp hoặc ngô đồ lên và ủ mốc để làm men chuyển hoá protein từ hạt đậu nành. Tương được sử dụng hàng ngày rất lợi cho sức khỏe, đặc biệt phù hợp trong các món ăn chay.

Trong quá trình làm tương, protein khó tiêu trong hạt đậu tương được hỗn hợp enzym protease và peptidase tiết ra bởi các chủng mốc tương (thường nhất là Aspergillus oryzae) phân giải thành các peptid và acid amin dễ tiêu. Dịch acid amin có thể được chiết một phần để làm nước tương. Phần bã đậu qua quá trình ngâm ủ có thể được sử dụng để làm tương hột.


2.1. Dụng cụ




2 Que cấy Cái 1


4 Rổ nhựa Cái 1

5 Nồi inox Cái 1

6 Chảo inox Cái 1


8 Lọ thủy tinh có nắp đậy Cái 1




3 Tủ ấm Cái 1


- Dịch xà phòng loãng2.3. Chủng giống vi sinh vật- Nấm mốc: Aspergillus oryzea (Mốc vàng hoa cau, mốc tương)2.4. Nguyên liệu khác- Đậu tương- Cơm trắng- Bột mì- Muối ăn- Đường mía

Trang 98


3.1. Làm mốc giống- Cơm tẻ hoặc cơm nếp nấu mềm phân vào đĩa petri một lớp mỏng khoảng 0,5-1mm,

không nén chặt.- Hấp khử trùng đĩa petri ở 121oC trong thời gian 40-60 phút.- Để nguội cơm và cấy bào tử mốc tương Aspergillus oryzae vào.- Ủ đĩa petri ở nhiệt độ phòng.- Sau 36-48h, quan sát thấy mốc mọc kín hạt cơm (hạt cơm có màu vàng hoa cau) là

có thể sử dụng được.3.2. Sơ chế nguyên liệu- 100g hạt đậu nành sau khi lựa chọn, loại bỏ hạt lép và sâu mọt, đem rang vàng và bỏ

vào nồi nấu cùng với nước (khoảng 100g đậu với 300 ml nước), nấu nhừ trong 3 - 4 giờ. - Vớt hạt đậu nành ra rổ, trải mỏng, để nguội. Phần nước nấu đậu được bổ sung muối

đến nồng độ 15% trữ lại sử dụng trong giai đoạn sau.- 20g bột mì rang vàng và trộn đều vào đậu để tạo lớp áo bột, tạo điều kiện cho mốc

phát triển thuận lợi.3.3. Giai đoạn ủ mốc- Trộn 10g mốc giống vào 100g đậu đã được chuẩn bị ở trên.- Hỗn hợp đậu mốc được đặt trong rổ nhựa, để nơi thoáng mát, bề mặt được phủ giấy

báo để tránh ruồi nhặng.- Mỗi ngày, dùng muỗng đảo đều giúp mốc phát triển thuận lợi.- Sau 3-4 ngày, khi mốc phát triển kín hạt đậu, có thể dừng quá trình ủ mốc lại. Khi

mốc phát triển đều khắp và chằng chịt là lúc các enzyme do nấm mốc sản xuất đang tiến hành phân giải protein trong hạt đậu thành các axit amin tự do, tinh bột thành đường.

- Quá trình ủ mốc phải đảm bảo nhiệt độ và ẩm độ thích hợp cho mốc phát triển. Loại mốc Aspergilluss oryzae, có nhiệt độ phát triển là 30 -32oC, ẩm độ 80 -90%.

3.4. Gia đoạn hãm mốc và ngả tương- Toàn bộ đậu sau khi ủ mốc được cho vào một lọ thủy tinh.- Dung dịch nước nấu đậu bổ sung muối đến 15% đã chuẩn bị ở trên, được đổ vào

bình cho ngập đậu. Dùng giấy báo đậy kín để tránh ruồi nhặng.- Đem phơi nắng bình thủy tinh trong thời gian 15-20 ngày. Trong thời gian phơi phải

theo dõi thường xuyên để tránh mưa và đậy kín vào ban đêm. Sau từ 3-4 ngày, dùng đũa đảo đều lọ tương.

- Sau thời gian này, gạn nước muối 15% để riêng và thay bằng nước muối 8%. Tiếp tục đem phơi nắng lọ tương trong thời gian 7-10 ngày. Sau thời gian này, hạt đậu sẽ có màu vàng nâu đẹp, hương đậm đà.

- Sau 7 ngày, gạn nước muối 8%. Trộn nước muối này với nước muối 15%.- Bổ sung 60g đường mía vàng vào 100g bã đậu. Đem nấu sôi, sẽ được tương hột.- Phần hỗn hợp nước muối được bổ sung 20g đường, nấu sôi sẽ được nước tương.


- Khi ngả tương (phơi tương) phải đậy kỹ tránh để ruồi muỗi và nước mưa rơi vào hũ tương.

- Tương làm xong có thể sử dụng 6 – 7 tháng hoặc cả năm, tương càng ngấu ăn càng thơm ngon.

- Sau khi trút đậu vào nấu trong nồi, lọ thủy tinh và nắp phải đem rửa sạch và phơi khô trước khi cho đậu vào trở lại.

- Trong thời gian phơi nắng, mỗi ngày dùng đủa dài trộn tương lên xuống cho đều.


- Trình bày vài trò của nấm mốc Aspergillus oryzae trong quá trình làm tương?- Trình bày sự biến đổi của thành phần hạt đậu tương trong quá trình làm tương?

Trang 99

- Trình bày tác động của nước muối 15% ở gian đoạn hãm mốc?

Trang 100

BÀI 18ỨNG DỤNG VI SINH VẬT TRONG SẢN XUẤT THỰC PHẨM

– LÀM RƯỢU VANG1. Nguyên tắc

Sản xuất rượu vang dựa trên cơ sở về hóa sinh xảy ra trong quá trình lên men các loại nước quả dưới tác dụng của enzyme của nấm men. Dưới tác dụng hệ thống enzym của nấm men, đường được chuyển hóa thành rượu ethanol và CO2 cùng lúc sản sinh ra năng lượng. Quá trình này gọi là quá trình lên men ethanol. Phản ứng cần có sự hiện diện của phosphat vô cơ:

C6H12O6 + H3PO4 → CH3CH2OH + H2O + CO2 + FDPHầu hết các giống Saccharomyces (tác nhân chính trong lên men rượu vang) đều lên

men đường: glucose, galactose, saccharose, maltose, manose và không lên men lactose. Các loại đường trên hiện diện trong trái cây chín (nho, mậnm dâu, dứa, mơ...) với nồng độ khác nhau. Do đó, trái cây chín là nguyên liệu quan trọng trong quá trình lên men rượu để sản xuất những thức uống có giá trị: rượu vang, nước trái cây lên men...

Trong quá trình lên men, đường trong dịch quả được nấm men sử dụng để tăng sinh khối và tổng hợp một số sản phẩm (rượu, khí CO2 và glycerin, acid acetic, acid lactic, este etylacetat). Các alcol bậc cao, aldehyd acetic được tạo thành từ các acid amin. Các chất pectin bị thủy phân kéo theo sự tạo thành một lượng nhỏ metanol.

Lên men rượu vang thường chia thành các giai đoạn: lên men chính ở nhiệt độ từ 20 – 300C khoảng 10 ngày hoặc dài hơn. Ở cuối giai đoạn lên men chính dịch lên men trong dần vì protein và pectin lắng xuống. Lên men phụ ở nhiệt độ từ 15 – 180C. Khi lắng cặn hoàn toàn, dịch trong thì gạn, lọc xong sẽ được rượu vang có thể uống được, nhưng chưa ngon, cần phải tàng trữ ở nhiệt độ 4 – 100C để rượu vang hoàn thiện hương vị đặc trưng. Thời gian tàng trữ có thể là vài tháng, vài năm, thậm chí hàng chục hoặc hàng trăm năm.

Do thời lượng của bài thí nghiệm, quá trình lên men rượu vang chỉ thực hiện ở hai giai đoạn cơ bản là lên men chính và lên men phụ.2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1. Dụng cụ




2 Que cấy Cái 1


4 Rổ nhựa Cái 1


6 Lọ thủy tinh có nắp đậy Cái 1




3 Tủ ấm Cái 1

Trang 101


- Dịch xà phòng loãng2.3. Chủng giống vi sinh vật- Nấm men: Saccharomyces cerevisiae2.4. Nguyên liệu khác- Nho chín- Đường mía

3. Tiến hành thí nghiệmThí nghiệm được thực hiện với 3 nghiệm thức:- Nghiệm thức 1: lên men với nguồn vi sinh vật sẵn có trên nguyên liệu nho.- Nghiệm thức 2: lên men với sự bổ sung chủng nấm men thuần: Saccharomyces

cerevisiae.3.1. Chuẩn bị nguyên liệu- Cân 3 kg nho chín; 0,5 kg đường- Loại bỏ cuống, rửa sạch nho, dùng tay bẻ quả nho làm đôi hoặc làm bốn.- Cho tất cả nho vào lọ thủy tinh, bổ sung đường, dùng muỗng đảo đều.- Bổ sung thêm NaHSO3 với hàm lượng 200mg/lít có tác dụng chống oxy hóa dịch

nho, loại bỏ các vi sinh vật có hại.- Đậy kín nắp bình.- Dịch lên men có đặc điểm: pH 3,5-4,0, nồng độ đường 20%. Nếu chưa đạt được điều

kiện này, cần điểu chỉnh để quá trình lên men đạt hiệu quả tốt nhất.- Đối với nghiệm thức có bổ sung nấm men, dịch nấm men được bổ sung với hàm

lượng 2% giống (khoảng 100-120 triệu tế bào/lít).3.2. Lên men chính- Bình lên men được đặt ở nhiệt độ 300C trong thời gian 7-10 ngày. Trong giai đoạn

lên men chính, đường trong dịch quả sẽ được chuyển hóa thành rượu. Nồng độ rượu đạt khoảng 8-10%.

- Sau thời gian này, toàn bộ hỗn hợp rượu và bã nho trong bình lên men được ép để loại bỏ bã nho.

- Dịch rượu thu được, rót trở lại vào bình lên men, đậy kính bình để tiến hành lên men phụ.

3.3. Lên men phụ- Bình lên men được đặt trong tủ mát ở nhiệt độ 180C trong thời gian 25-20 ngày.- Trong thời gian này, nấm men và cặn nguyên liệu sẽ lắng dần xuống. Dịch rượu sẽ

dần trong hơn. Trong giai đoạn lên men phụ, quá trình lên men malolactic xảy ra sẽ chuyển hóa acid malic làm rượu có vị dịu hơn.

- Tiến hành gạn dịch rượu, và lọc để thu được rượu vang trong hơn.Rượu vang sau giai đoạn lên men phụ có mùi thơm đặc trưng, vị nồng nhẹ của rượu,

vị hơi chua ngọt của dịch trái cây còn sót lại. Rượu này có thể uống được. Để ngon hơn, dịch rượu cần được ủ ở nhiệt độ thấp 4-100C trong thời gian lâu hơn.4. Những điểm cần lưu ý

- Khi chọn nho dùng cho lên men, cần loại bỏ các quả bị dập nát hoặc bị lên men để tránh nhiễm tạp các vi sinh vật có hại.

- Trong quá trình lên men, bình lên men cần được đậy kín để tạo điều kiện kỵ khí cho quá trình lên men.

- Trong quá trình tách chiết dịch rượu, tránh dùng các vật liệu bằng sắt, nhôm để tránh làm tủa rượu.

- Không được làm dập nát hạt nho để tránh giải phóng chất độc cho người sử dụng.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày cơ chế của quá trình lên men rượu?

Trang 102

- Trình bày các quá trình sinh hóa xảy ra trong giai đoạn lên men chính và lên men phụ?

- Nêu những yêu cầu về chất lượng của rượu vang nho?

Trang 103

BÀI 19PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG ESCHERICHIA

COLI TRONG THỰC PHẨM1. Nguyên tắc

Escherichia coli lần đầu tiên được Escherich phân lập từ phân người vào năm 1855. Đây là vi khuẩn được chú ý nhiều và nghiên cứu kỹ lưỡng nhất. Chúng cư trú ở đường ruột của người và động vật máu nóng. Chúng có thể là vi khuẩn gây bệnh cơ hội. E. coli là vi sinh vật chỉ thị tiêu biểu nhất. Sự có mặt cũng như số lượng của chúng chỉ ra mức độ vệ sinh trong quá trình chế biến, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nước uống cũng như sự ô nhiễm phân trong môi trường. Từ năm 1982 đã phát hiện thấy 4 loài E. coli có khả năng gây bệnh có nguồn gốc thực phẩm (Enteropathogenic-EPEC; Enteroinvasive-EIEC; Enteroinvasive- EIEC; Enterotoxigenic - ETEC, trong đó có chủng O157:H7).

Phương pháp phân tích E. coli trong bài này được dựa trên quy trình MPN bằng sử dụng canh thang Lauryl sulphate tryptose (LST) vào test đoán chừng (presumptive test), sau đó dùng canh thang BGLB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) và ủ ấm ở 37 oC/24-48 h (để kiểm tra Coliforms). Tiếp theo chuyển sang môi trường canh EC (E. coli medium) ủ ở 44.5oC để kiểm tra Coliforms chịu nhiệt. Sau đó xác định Coliforms phân (E. coli giả định) bằng cách cấy sang môi trường EMB (Eosine Methylene Blue Agar), chọn khuẩn lạc điển hình và thử khả năng sinh Indol (I). Để xác định E. coli cần thử ba phản ứng sinh hóa tiếp theo là Methyl Red (MR), Voges-Proskeur (VP) và Citrate (iC). E. coli là Coliforms phân và cho kết quả thử nghiệm IMViC là + + - -.2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1. Dụng cụ



1 Giá ống nghiệm Cái 12 Ống nghiệm Ф18 Cái 153 Bình tam giác 250ml Cái 14 Cốc 100ml Cái 15 Bình tia Cái 16 Pipette 1ml Cái 57 Pipette 10ml Cái 18 Micropipette 100-1000μl Cái 19 Đầu týp 1000μl Cái 110 Ống Durham Cái 18

STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú1 Nồi hấp cao áp Cái 12 Tủ cấy vô trùng Cái 13 Tủ sấy Cái 14 Máy dập mẫu Cái 1

2.2. Môi trường và hoá chất- Môi trường BGBL- Môi trường EC broth- Môi trường EMB- Môi trường triptose broth- Môi trường MR-VP- Môi trường Simmon citrate- Nước muối sinh lý 0,9%- Cồn 96o

2.3. Nguyên liệu khác- Thịt tươi

Trang 104

- Túi nilon dập mẫu- Dịch vi khuẩn Escherichia coli kiểm chứng

3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Nuôi cấy Escherichia coli- E. coli là dạng coliform có nguồn gốc từ phân, phát triển được ở 44±0,50C, sinh

indol, sinh acid, không sinh aceton và không dùng citrat làm nguồn cacbon.- E. coli được phát hiện do khả năng lên men lactose sinh hơi ở 44±0,50C và có kết

quả nghiệm pháp IMVIC phù hợp.- Qui trình phân tích định lượng E .coli theo phương pháp MPN thực hiện như sau:

Trang 105

Laáy 10g (10ml) maãu ñoàng nhaát vaøo 90ml nöôùc muoái sinh lyù, ñöôïc 10-1

Pha loaõng maãu 10-2, 10-3, 10-4…

Chuyeån 1ml dung dòch 10-2, 10-3, 10-4 vaøo 10ml canh BGBL, moãi noàng ñoä 3 oáng laëp laïi, uû 37oC, 36h

Choïn oáng (+), caáy sang canh EC, uû 44.0 0.5oC trong 24-48 giôø

UÛ ôû 37.0 0.5oC trong 24 giôø

Choïn khuaån laïc deït, coù aùnh kim tím, ñöôøng kính khoaûng 1mm ñeå caáy sang TSA hay BHI

UÛ ôû 37.0 0.5oC qua ñeâm

Caáy chuyeån vaøo caùc moâi tröôøng thöû nghieäm sinh hoaù: Canh trypton (1), MRVP (2), Simmon Citrate (1) ñeå thöû nghieäm

phaùp IMViC

Keát luaän: Phaùt hieän (khoâng phaùt hieän) E.coli/g

E. coli coù bieåu hieän sinh hoaù: Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-). Moät trong soá caùc phaûn öùng treân sai laø khoâng phaûi

E.coli

Xác định ống (+) ở mỗi nồng độ, cấy sinh khối vi sinh vật từ các ống (+) sang đĩa môi trường EMB hoặc Endo để phân lập E.coli

a. Môi trường nuôi cấyMôi trường tăng sinh: môi trường BGBL 2% hoặc Lauryl sulphat tryptose* Môi trường BGBL 2% (Brilliant Green Bile Lactose 2%)- Peptone : 10g- Lactose : 10g- Mật bò : 20g- Dung dịch 0,1% Brilliant Green: 13,3 ml- Nước cất vừa đủ : 1000mlHòa tan peptone và lactose trong 500ml nước cất. Hòa 20g mật bò trong 200ml nước

cất, trộn hai dung dịch, thêm nước cất tới 975ml. Chỉnh về pH 7,4 ở 250C. Cho thêm 13,3ml dung dịch Brilliant Green 0,1% trong nước cất. Thêm nước cất cho đủ 100ml. Rót vào các ống nghiệm cỡ 16mm có ống Durham, hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút.

* Môi trường Lauryl sulphat tryptose- Tryptose : 10g- Lactose : 5g- Dikali hydrophosphat : 2,75g- NaCl : 5g- Natri lauryl sulphat :0,1g- Nước cất vừa đủ :1000mlĐun để hòa tan thành phần trên trong nước cất, rót vào ống nghiệm có dung tích phù

hợp, hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Chỉnh pH là 6,8* Môi trường Trypton Soya Agar (TSA) - Trypton :15g- Soya peptone :5g- NaCl :5g- Agar :15g- Nước cất đủ :1000 mlĐun nóng để hoà tan các thành phần, phân phối vào dụng cụ chứa và hấp khử trùng ở

1210C trong 15 phút. pH 7,3±0,2.b.Phương pháp tiến hành- Dùng pipet vô trùng, hút chính xác lấy 10ml mẫu nước thử nghiệm cho vào một bình

tam giác có chứa 90ml nước muối sinh lý 0,9% hoặc nước muối peptone 1% vô trùng. Lắc đều, được độ pha loãng 10-1.

- Tiến hành pha loãng bậc 10 mẫu 10-1 thành các độ pha loãng 10-2, 10-3, 10-4...- Lấy 1ml ở 3 độ pha loãng cuối cấy vào các ống nghiệm chứa 10ml môi trường tăng

sinh BGBL hoặc LSB. Để ở 37±0,50C trong 24-48 giờ.- Tiến hành 3 ống nghiệm mỗi nồng độ pha loãng- Chọ các ống dương tính (ống có biểu hiện sinh hơi, đổi màu, hóa đục), cấy chuyền

sang các ống môi trường canh EC. Ủ ở 44±0,50C. Ghi chú nồng độ tương ứng cho các ống canh EC ứng với các ống BGBL hoặc LSB dương tính.

3.2. Phân lập Escherichia colia. Môi trường phân lập* Môi trường EMB (Eosine Methylen Blue agar)- Peptone : 10g- Lactose : 10g- Dikalihydrophosphat : 2,75g - Eosine : 0,4g- Methylen xanh : 0,0065g- Agar :15g- Nước cất vừa đủ : 1000mlXử lý agar trước đến đồng nhất. Đun để hòa tan các thành phần trên trong nước cất.

Hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Điều chỉnh pH là: 7,2 ở 250C

Trang 106

* Môi trường Endo- Peptone :10g- Lactose : 10g- Cao thịt :10g- NaCl : 5g- Fushin baz : 0,04 g- Na2SO3 : 2,5 g- Agar : 15g- Nước cất vứa đủ : 1000mlĐun để hòa tan các thành phần trên trong nước cất. Hấp thanh trùng ở 1210C trong 15

phút. Điều chỉnh pH là: 7,4 ở 250Cb. Hóa chất, môi trường thử phản ứng sinh hóa * Môi trường MRVP (Metyl Red Voges Prokauer)- Dextrose hoặc glucose : 5g- Peptone : 5g- Dikalihydrophosphat : 5g- Nước cất vừa đủ : 1000mlCách pha: Đun để hòa tan các thành phần trên trong nước cất cho vào ống nghiệm có

dung tích phù hợp. Hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Điều chỉnh pH là: 7,4 ở 250C* Môi trường thạch Simons Citrat- Amonidihydrophosphat : 1g- Dikali hydro phosphat : 1g- NaCl : 5g- Natricitrat : 2g- Magie sunfat : 0,2g- Bromothymol xanh : 0,08g- Agar : 12,5g- Nước cất vừa đủ : 1000mlCách pha: đun để hòa tan các thành phần trên trong nước cất. Hấp thanh trùng ở

1210C trong 15 phút. Điều chỉnh pH là: 6,6 ở 250C* Nước peptone- Peptone : 10g - NaCl : 8,5g- Nước cất : đủ 1000mlCách pha: Cách pha: Đun để hòa tan các thành phần trên trong nước cất. Điều chỉnh

pH là: 7,0 ở 250C, chứa trong ống nghiệm hoặc bình có dung tích phù hợp. Hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút. Nếu chưa dùng thì bảo quản trong tối ở 0 50C không quá 1 tháng

* Thuốc thử Kovac- Được sử dụng để thử phản ứng indol- Hòa 5g p-dimetylaminobenzaldehyd vào 75 ml amyl alcohol, đun nhẹ ở 50÷550C

đến tan hết, để nguội và cho thêm 25ml H2SO4 đậm đặc.c. Phương pháp tiến hành* Phân lập- Xác định số ống môi trường canh EC dương tính (ống có biểu hiện hóa đục, sinh

hơi). Chọn các ống nghiệm có phản ứng dương tính để cấy sang môi trường phân lập (môi trường EMB hoặc Endo), để ở 370C trong 24h

- Nhân dạng khuẩn lạc E.coli:+ Trên môi trường EMB: khuẩn lạc màu tím, ánh kim, tròn, bờ đều, đường

kính khoảng 0,5mm+ Trên môi trường Endo: Khuẩn lạc màu đỏ, ánh kim, tròn, bờ đều, đường

kính khoảng 0,5mm

Trang 107

Hình. Khuẩn lạc đặc trưng của Escherichia coli trên môi trường EMB* Thử phản ứng sinh hóa- Tiến hành thử phản ứng sinh hóa các khuẩn lạc nghi ngờ là E.coli.- Phản ứng Indol: Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 5ml nước peptone để

ở 370C trong 24h. Cho thêm 0,5ml thuốc thử Kovac bằng cách cho chảy dọc theo thành ống nghiệm

+ Môi trường chuyển màu đỏ: indol (+)+ Môi trường không đổi màu: indol (-)

- Phản ứng MR (metyl red): cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào 2 ống nghiệm, mỗi ống chứa 5ml môi trường MRVP để ở 370C từ 48 - 96h. Cho vào một ống nghiệm vài giọt metyl red ở pH trung tính hoặc kiềm yếu

+ Môi trường chuyển màu đỏ: MR (+)+ Môi trường không đổi màu: MR (-)

- Phản ứng VP (Voges Proskauer) cho vào ống nghiệm chứa môi trường MR-VP còn lại khoảng 0,6ml dung dịch α- naphtol và 0,2ml dung dịch KOH lắc đều, để yên trong 2h.

+ Môi trường đổi sang màu đỏ eosin hoặc có vệt đỏ eosin phát triển trong vòng 15 phút : VP (+)+ Môi trường không chuyển màu đỏ: VP (-)

- Phản ứng citrat: Cấy ria khuẩn lạc nghi ngờ lên mặt nghiêng của môi trường simon citrat, để ở 370C trong 24h.

+ Môi trường đổi màu lục sang xanh dương và xuất hiện khuẩn lạc: citrat (+)+ Môi trường không đổi màu, không mọc khuẩn lạc: citrat (-)

d. Đọc kết quảPhát hiện có E.coli khi:- Môi trường EC: hóa đục, và sinh hơi.- Có khuẩn lạc điển hình trên môi trường EMB hoặc Endo.- Trực khuẩn Gram âm.- Các phản ứng sinh hóa: I (+); MR (+); V(-) ; Citrat (-)3.3. Xác định kết quả- Ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường canh EC và khuẩn lạc E.coli giả định

trên môi trường EMB hoặc Endo cho kết quả thử nghiệm IMViC như trên là ống nghiệm có E.coli. Thực hiện tương tự cho tất cả các ống nghiệm cho kết quả (+) trong môi trường EC và tạo được khuẩn lạc E.coli giả định trên môi trường EMB hoặc Endo. Ghi nhận số lượng các ống nghiệm có E.coli (+) ở mỗi độ pha loãng.

- Dùng bảng tra MPN để xác định mật độ vi sinh vật trong mẫu và biểu diễn dưới dạng chỉ số MPN/g hay MPN/ml mẫu ban đầu chưa pha loãng.

Trang 108

Hình. Kết quả thử nghiệm IMViC (+ + - -) xác định E. coli 4. Những điểm cần lưu ý

- Tiến hành nhuộm Gram vi sinh vật phân tích ở tất cả các bước thí nghiệm?- Các ống nghiệm môi trường tăng sinh chứa một lượng lớn vi sinh vật gây bệnh, tránh

không làm rơi đổ ra môi trường.- Các thử nghiệm sinh hóa được nhận định kết quả bằng các thuốc thử. Cần sử dụng

đúng thuốc thử cho từng thử nghiệm?- Thuốc thử Methyl red được pha trong cồn 960, cần chú ý tránh không được để gần

lửa đèn cồn.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày đặc điểm của vi khuẩn E. coli?- Trình bày quy trình phân tích định lượng E. coli trong thực phẩm theo phương pháp

MPN?- Giải thích cơ chế của các thử nghiệm sinh hóa để xác định E. coli?- Xác định mật độ MPN/ml của E. coli trong mẫu thực phẩm ban đầu?

Trang 109

BÀI 20PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SALMONELLA SPP. TRONG

THỰC PHẨM1. Nguyên tắc

Salmonella là vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, có hình que Gram âm, không sinh bào tử, sống hiếu khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện hiếu khí. Hầu hết có khả năng di động nhờ tiêm mao. Hầu hết có khả năng tạo H2S (trừ S. typhi) Có khả năng lên men sinh acid từ glucose, mannitol, không lên men lactose, sucrose, không tạo Indol. Có khả năng tạo enzyme lysine decarboxylase. Hiện diện trong nhiều loại thực phẩm. Đây là nhóm đối tượng vi sinh vật nguy hại, có thể gây ngộ độc với mật độ thấp (khoảng 1 triệu tế bào/g). Trong hầu hết các loại thực phẩm, chỉ tiêu Salmonella luôn bằng 0 (không được phép phát hiện trong thực phẩm).

Quá trình phân tích Salmonella thường bao gồm bốn bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định. Bước tăng sinh chọn lọc thường dùng các loại môi trường chuyên biệt tuỳ vào nguồn mẫu thu nhận được. Bước khẳng định nhằm xác nhận các khuẩn lạc đặc trưng cho Salmonella xuất hiện trên môi trường phân lập. Bước này dựa trên việc sử dụng các thử nghiệm sinh hoá và thử nghiệm huyết thanh đặc trưng cho Salmonella.2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1. Dụng cụ





2.2. Môi trường và hoá chất- Dung dịch BPW- Môi trường SCB- Môi trường XLD- Môi trường KIA- Nước muối sinh lý 0,9%- Nước cất vô trùng.- Thuốc nhuộm tím kết tinh- Dung dịch lugol- Thuốc nhuộm Fuschin- Cồn 96o

2.3. Nguyên liệu khác- Mẫu thịt gà tươi- Túi nilon dập mẫu- Dịch vi khuẩn Salmonella kiểm chứng

Trang 110

3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Tiền tăng sinh và tăng sinh chọn lọc- Thực hiện đồng nhất 25g mẫu thực phẩm vào trong 225ml dịch BPW. Ủ ở 37 0C

trong 16-24 giờ.- Sau thời gian ủ, tiến hành cấy chuyền 0,1ml dịch vi sinh vật được tiền tăng sinh sang

môi trường tăng sinh chọn lọc là SCB hoặc RV (nên dùng cả hai loại môi trường đồng thời). Ủ ở 370C trong 24 giờ.

- Các ống dương, nghi ngờ có sự hiện diện của Salmonella, khi môi trường có màu đỏ gạch, có cặn lắng, có thể có váng.

3.2. Phân lập Salmonellaa. Môi trường phân lậpPhân lập Salmonella trên một trong các môi trường sau:* Môi trường SS Agar (Salmonella - Shigella agar)- Thành phần:- Cao thịt : 5g- Pepton : 5g- Lactose : 10g- Mật bò : 8,5g- Natri Citrat : 8,5g- Natrithiosulphat : 8,5g- Sắt Citrat : 10g- Brilliant green 0,1% : 0,33ml- Đỏ trung tính1% : 2,5ml- Agar : 13,5g- Nước cất , đủ : 1000mlCách pha: Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thành phần trên trong nước cất, để nguội tới

450C, trong nồi cách thủy, rót vào mỗi hộp petri 15 - 20ml môi trường. Không hấp thanh trùng môi trường. Chỉnh pH = 7,0 ở 250C

* Môi trường thạch Mac Conkey- Thành phần: - Pepton : 20g- Lactose : 10g- NaCl : 5g- Mật bò :1,5g- Cristal violet 0,1% : 1ml- Đỏ trung tính 1% : 3ml- Agar : 13,5g- Nước cất, đủ :1000mlCách pha: Đun sôi để hòa tan các thành phần trên trong nước cất, chỉnh pH là 7,2 ở

250C. Hấp thanh trùng ở 1210C trong 15 phút* Môi trường Xylose lysine desoxycholate agar (XLD)- Cao nấm men :3g- NaCl :5g- D(+) xylose :3.5g- Lactose :7.5g- Sucrose :7.5g- L(+) lysine :5.0g- Sodium desoxycholate :2.5g- Sodium thiosulphate :6.8g- Ammonium iron (III) citrate :0.8g- Phenol red :0.08g- Agar :15g

Trang 111

- Nước cất 1 lít- pH 7.4 ± 0.2Đun sôi môi trường, không hấp, để nguội đến 500C rồi đổ đĩa, không giữ quá 1 ngày.b. Cách tiến hànhQuan sát mẫu cấy trong môi trường tăng sinh. Sau 24 giờ Salmonella làm đục đều môi

trường Selenite Broth, có thể hơi lắng cặn và tạo váng mỏng, màu môi trường chuyển từ trong suốt ban đầu sang màu đỏ gạch. Làm biến màu môi trường Muller - Kauffmann từ xanh lục sang vàng

Phân lập- Dùng que cấy vòng cấy ria canh trường từ môi trường tăng sinh lên đĩa petri chứa

môi trường phân lập KIA và HE. Cần cấy thưa để tạo khuẩn lạc riêng biệt. Để ở 370C trong 24 giờ. Trên các môi trường phân lập, Salmonella tạo các khuẩn lạc tròn, hơi lồi trong, bờ đều có đường kính khoảng 2 - 4mm, đôi khi có tâm đen.

- Nhuộm Gram các khuẩn lạc nghi ngờ. Thử phản ứng sinh hóa nếu Gram (-)

3.3. Thử phản ứng sinh hóa xác định Salmonellaa. Môi trường và hoá chất thử phản ứng sinh hóa* Môi trường KIA (Kligler's Iron Agar)- Cao thịt : 3g- Cao nấm men : 3g- Pepton : 15g- Proteose Pepton : 5g- NaCl : 5g- Lactose : 10g- Glucose : 1g- Sắt sunfat : 0,2g- Natrithiosunfat : 0,3g- Đỏ trung tính 0,5% : 6ml- Agar : 12g- Nước cất, đủ : 1000mlCách pha : Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thành phần trên trong nước cất, để nguội đến

450C trong nồi cách thủy, chỉnh pH là 7,4 ở 250C. Rót vào các ống nghiệm để làm thạch

Trang 112

Hình. Khuẩn lạc của Salmonella trên môi trường XLD

Hình. Khuẩn lạc của Salmonella trên môi trường HE

nghiêng một lượng sao cho khi môi trường đông lại thì thể tích phần đáy gấp đôi phần nghiêng

* Môi trường TSI (Triple Sugar Iron Agar)- Cao thịt : 4g- Pepton : 4g- Dextrose : 1g- Lactose : 10g- Saccharose : 10g- NaCl : 5g- Natrithiosunphat : 0,08g- Natrisunfit : 0,4g- Sắt sunfat : 0,2g- Đỏ trung tính1% : 2,5ml- Agar : 15g- Nước cất đủ : 1000mlCách pha: Đun sôi để hòa tan hoàn toàn thành phần trên trong nước cất, để nguội đến

450C trong nồi cách thủy, chỉnh pH là 7,3 ở 250C. Rót vào các ống nghiệm để làm thạch nghiêng một lượng sao cho khi môi trường đông lại thì thể tích phần đáy gấp đôi phần nghiêng

* Môi trường MIU (Motility Indol Urea Medium)- Trypton : 30g- Kali dihydrophosphat: 1g- NaCl : 5g- Đỏ phenol 0,25% : 2ml- Agar : 4g- Nước cất, đủ : 1000mlCách pha: Đun sôi để hòa tan thành phần trên trongnước cất, lọc qua giấy lọc và hấp

thanh trùng ở 1210C trong 15 phút, điều chỉnh pH là 6,8. Để nguội tới 450C trong nồi cách thủy. Cho thêm vào môi trường nóng chảy một lượng Ure 20% theo tỷ lệ 1 ure/ 9 môi trường. Rót vào ống nghiệm có dung tích phù hợp từng lượng 5ml và để thẳng đứng.

Dung dịch Ure được pha bằng nước cất và khử trùng bằng lọc khuẩn.* Môi trường Lysine Decacboxylase broth (LDC)- Yeast extract : 3g- Glucose : 1g- L-lysine : 5g- Bromocrezol purple : 0.016g- pH : 6.1± 0.2

Hoà tan các thành phần, phân phối vào các dụng cụ chứa và khử trùng ở 1210C trong 15 phút.

b. Tiến hành- Cấy đâm sâu rồi cấy ria vi khuẩn từ những khuẩn lạc nghi ngờ lên ống thạch nghiêng

chứa môi trường TSI hoặc KIA. Cấy đâm sâu vào môi trường MIU. Cấy sinh khối vào môi trường LDC, Manitol phenol red broth, MR-VP. Các ống nghiệm được ủ ở 370C trong 24 giờ.

- Trên môi trường TSI hoặc KIA các khuẩn lạc Salmonella có màu đen : dihydrosunfu (+), giữ nguyên màu đỏ của phần nghiêng: lactose (-), saccharose (-); phần đáy đổi màu từ đỏ sang vàng: dextrose hoặc glucose (+), tạo những bọt khí trongnền thạch, có sinh hơi

- Trên môi trường MIU Salmonella mọc lan khỏi đường cấy thẳng → có tính di động, không làm biến màu môi trường từ hồng nhạt sang đỏ đậm: Urease (-). Cho lên bề mặt môi trường MIU 0,5 ml thuốc thử Kovac, Salmonella không làm đỏ thuốc thử: indol (-)

- Trên môi trường LDC Salmonella phát triển sẽ làm đục và chuyển màu môi trường từ vàng sang tím (LDC (+), LDC (-) khi môi trường có màu vàng.

Trang 113

- Trên môi trường Manitol phenol red broth, Salmonella lên men manitol tạo acid, làm môi trường chuyển từ hồng nhạt sang vàng → Manitol (+)

- Trên môi trường MR-VP, Salmonella cho thử nghiệm VP (-)3.4. Đọc kết quả thử nghiệm sinh hóa xác định Salmonella

Mẫu có Salmonella khi:- Làm đục môi trường tăng sinh- Tạo khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập- Trực khuẩn Gram âm- Có tính di động- Lactose (-), Saccharose (-)- Dextrose hoặc Glucose (+)- Dihydrosunfua (+)- Urease (-)- Indol (-)- Manitol (+)- VP (-)

4. Những điểm cần lưu ý- Salmonella là nhóm vi sinh vật nguy hại, cần hết sức cẩn thận khi phân tích. Mang

găng tay, khẩu trang trong quá trình làm thí nghiệm.- Các môi trường tăng sinh chọn lọc, môi trường phân lập Salmonella có các thành

phần dễ biến tính ở nhiệt độ cao, do đó, không được hấp tiệt trùng khi pha chế.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày quy trình phân tích Salmonella trong thực phẩm?- Tại sao khi phân tích Salmonella trong thực phẩm, chỉ cần phân tích định tính?- Giải thích cơ chế của các phản ứng sinh hóa xác định Salmonella?- Nêu kết quả và kết luận về sự hiện diện của Salmonella trong mẫu thực phẩm ban

đầu?

Trang 114

Quy trình phân tích định tính Salmonella

Trang 115

Đồng nhất 25g mẫu với 225g BPW

Chuyển 0,1ml canh khuẩn sang ống nghiệm chứa 10ml Selenite Cystine Broth hoặc RV

Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 16 – 24 giờ

Ủ ở 37 ± 0,5oC trong 24 giờ

Cấy phân lập sang môi trường XLD và HE

Chọn khuẩn lạc đặc trưng: trong suốt, có hay không có tâm đen, cấy sang TSA hay BHI

Ủ ở 37 ± 0,5oC trong khoảng 24 giờ

Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm

Cấy chuyền vào môi trường thử nghiệm sinh hóa: KIA, Mannitol Phenol Red Broth, Urea Broth, Lysine Decarboxylase Broth

Canh Trypton, MRVP

Ủ ở 37 ± 0,5oC trong khoảng 24 giờ

Biểu hiện của SalmonellaTrên KIA/TSI: đỏ/vàng, H2S (+),Gas (+)

Urea (-); indol (-); mannitol (+); LDC (+), VP(-)Ngưng kết với kháng huyết thanh O đa giá

Phát hiện (không phát hiện) Salmonella/25 g

BÀI 21PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS

CEREUS TRONG THỰC PHẨM1. Nguyên tắc

Bacillus cereus được phát hiện lần đầu tiên bởi Hauge năm 1949 khi phân tích mẫu xốt vani gây tiêu chảy tại bệnh viện ở Oslo, Na uy.Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố phổ biến trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm. Ngoài các độc tố gây ngộ độc thực phẩm là diarrhoed và emetic, Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như: nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễm trùng mắt.

Quá trình phân tích định lượng Bacillus cereus trong thực phẩm có thể được thực hiện theo phương pháp MPN hoặc phương pháp đếm khuẩn lạc. Khuẩn lạc của Bacillus cereus trên môi trường phân lập MYP được xác định bằng các phản ứng sinh hóa đặc trưng.2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1. Dụng cụ





2.2. Môi trường và hoá chất- Dung dịch TSP- Môi trường MYP- Môi trường nitrate broth- Môi trường phenol red dextrose broth- Nước muối sinh lý 0,9%- Nước cất vô trùng.- Thuốc nhuộm tím kết tinh- Dung dịch lugol- Thuốc nhuộm Fuschin- Cồn 96o

- Lysozyme- Môi trường thạch tyrosin- Môi trường MR-VP- Môi trường TSA* Dung dịch đệm phosphat : được sử dụng để pha loãng- Dung dịch mẹ+ KH2PO4 :34g+ Nước cất :500ml

Trang 116

Chỉnh pH = 7,2. Cho nước cất vào đủ 1000ml. Hấp 121oC, 15 phút.- Pha loãng để sử dụng+ Dung dịch mẹ :1,25ml+ Nước cất :98,75mlPhân phối 90ml vào các erlen và 9ml vào các ống nghiệm. Hấp khử trùng 121oC, 15

phút.* Môi trường Manitol - Egg - Yolk polymyxin (MYP)- Cao thịt :1g- Peptone :10g- Mannitol :10g- NaCl :10g- Phenol red :2,5ml- Thạch :15g- Nước cất đủ :900mlpH = 7,2±0,2. Hấp 121oC, 15 phút. Để nguội đến 500C.- Dung dịch Polymixin B 0,1%Hòa 500.000 đơn vị polymixin B sulfat trong 50ml nước cất vô trùng. Bảo quản 4oC.- Egg yolk emulsion 50%: sản phẩm thương mại.Môi trường hoàn chỉnh: bổ sung 2,5ml dung dịch polymixin B và 1,25ml egg yolk

emulsion vào 225ml môi trường thạch cơ bản đã khử trùng và làm nguội 50oC. Trộn đều và đổ 10 - 15ml vào các đĩa petri.

* Môi trường Phenol Red - Dextrose BrothĐược sử dụng để thử nghiệm khả năng lên men glucose của vi sinh vật.- Proteose peptone No.3 :10g- Cao thịt :1g- Dextrose :5g- NaCl :5g- Phenol red :0,018g- Nước cất đủ :1000mlHấp khử trùng 121oC, 10 phút. pH cuối = 7,4±0,2.* Môi trường Nitrat Broth : Được sử dụng trong khẳng định sinh hóa- Cao thịt :3g- Peptone :5g- KNO3 :1g- Nước cất đủ :1000mlHấp khử trùng ở 121oC, 15 phút, pH cuối = 7,0±0,2.* Môi trường MR - VP: Được sử dụng trong khẳng định sinh hóa- Peptone :5g- Glucose :5g- Phosphate buffer :5g- Nước cất :1000mlPhân phối môi trường vào các ống nghiệm và hấp khử trùng 121oC, 15 phút, pH cuối=

7,5±0,2. * Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA) : Được sử dụng để bảo quản, phục hồi vi sinh vật trong quá trình thí nghiệm- Trypticase peptone :15g- Phytone peptone :5g- NaCl :5g- Nước cất đủ :1000ml

Trang 117

Đun nóng, phân phối môi trường vào các ống nghiệm, hấp khử trùng 15 phút, 121oC. Đặt ống nghiệm nghiêng. pH cuối = 7,3±0,2.

* Môi trường thạch Tyrosine: Dùng để thử nghiệm khả năng phân hủy Tyrosine của Bacillus cereus- Nutrient agar- Cao thịt :3g- Peptone :5g- Agar :15g- Nước cất đủ :1000mlHấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 6,8±0,2.- Dung dịch Tyrosine 5%Tyrosine :5gNước cất :100mlHấp khử trùng 121oC, 15 phút.Môi trường hoàn chỉnh: trộn 90ml môi trường Nutrient agar đun chảy làm nguội 45oC

với 10ml dung dịch Tyrosine 5%, phân phối 10ml vào các đĩa petri.* Môi trường Nutrient Broth với lysozymeNutrient Broth- Cao thịt :3g- Peptone :5g- Nước cất đủ :1000mlHấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 6,8±0,2.Lysozyme 0,1%- Lysozyme hydrochloride :0,1g- Nước cất :100mlLọc bằng màng lọc vô trùng.Môi trường hoàn chỉnh: hòa 1ml lysozyme 0,1% với 99ml môi trường Nutrient Broth,

phân phối vào các ống nghiệm.* Thuốc thử Voges - Proskauer- a-Naphtol :5g- Etanol 96% :100mlBảo quản ở 0 - 5oC trong lọ tối.* Dung dịch Kali hydroxit 40% (KOH)- Kali hydroxit (KOH) :40g- Nước cất đủ :100ml* Thuốc thử nitritThuốc thử A- Acid sulfanilic :8g- CH3COOH 5N :1000mlThuốc thử B- a-Napthol : 2,5g- CH3COOH 5N :1000mlThuốc thử hoàn chỉnh- Dung dịch A 0,25ml- Dung dịch B 0,25ml2.3. Nguyên liệu khác- Mẫu thịt heo tươi- Túi nilon dập mẫu- Dịch vi khuẩn Bacillus cereus kiểm chứng

3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích tại phòng thí nghiệm

Trang 118

- Mẫu đưa về phòng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vô trùng. Dùng kéo và kẹp vô trùng lấy đại diện 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng trong điều kiện vô trùng.

- Mẫu được đồng nhất với 90ml dung dịch đệm phosphat bằng máy dập mẫu để có dung dịch pha loãng 10-1.

- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch đệm phosphat để được dung dịch pha loãng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha loãng ở các nồng độ cao hơn.

3.2. Cấy mẫu lên môi trường MYP- Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp, hút 0,1ml dịch pha loãng vào mỗi đĩa MYP

(mỗi nồng độ 2 đĩa). Dùng que gạt trải cẩn thận chất nuôi càng nhanh càng tốt. Ủ 30oC, trong thời gian 24 - 48 giờ.

- Chọn và đếm các đĩa có từ 15 - 150 khuẩn lạc đặc trưng của Bacillus aureus (dẹt, đường kính 2 - 3mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vòng đục). Chuyển 5 khuẩn lạc nghi ngờ này lên môi trường phục hồi TSA , ủ ở 30oC qua đêm trước khi tiến hành các thử nghiệm sinh hoá.

3.3. Khẳng định Bacillus cereus bằng các phản ứng sinh hóa- Thử nghiệm khả năng lên men glucose: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang môi

trường thạch glucose, ủ 35oC trong 24 giờ. Bacillus cereus cho phản ứng dương tính làm đổi màu môi trường từ đỏ sang vàng.

- Thử nghiệm khả năng chuyển hóa nitrat thành nitrit: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang môi trường nitrat, ủ ở 35oC trong 24 giờ. Bacillus cereus có phản ứng dương tính nên sau khi nhỏ thuốc thử vào canh khuẩn chuyển sang màu đỏ cam trong 10 phút.

- Thử nghiệm Voges - proskauer: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang môi trường canh MR - VP, ủ ở 35oC trong 48 giờ. Bacillus cereus cho phản ứng dương tính: môi trường chuyển sang màu hồng khi cho thuốc thử a-Naphthol vào (trước khi nhỏ a-Naphthol vào phải làm kiềm hóa môi trường nuôi cấy bằng KOH 40%).

- Thử nghiệm Tyrosin: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang ống thạch nghiêng Tyrosin, ủ 35oC trong 48 giờ. Khuẩn lạc Bacillus phân hủy tyrosin tạo khoảng trong xung quanh khuẩn lạc.

- Thử nghiệm Lysozyme: cấy vi khuẩn từ môi trường TSA sang ống nghiệm chứa môi trường Nutrient Broth với 0,001% lysozyme, ủ 35oC trong 24 giờ. Bacillus phát triển làm môi trường đục đều.

3.4. Tính toán kết quả:

Số Bacillus cereus trên 1g mẫu =

Trong đó :

Trang 119

Hình. Khuẩn lạc B.cereus trên môi trường Mossel

Hình. Khuẩn lạc B.cereus trên môi trường MYP

N: tổng số khuẩn lạc đếm đượcn: số lượng đĩa đếmf: độ pha loãng tương ứngV: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩaR: tỉ lệ xác nhận = tỉ lệ giữa số khuẩn lạc nghi ngờ cho thử nghiệm dương tính so với

số khuẩn lạc nghi ngờ.4. Những điểm cần lưu ý

- Bacillus cereus là nhóm vi sinh vật nguy hại, cần hết sức cẩn thận khi phân tích. Mang găng tay, khẩu trang trong quá trình làm thí nghiệm.

- Các môi trường phân lập Bacillus cereus có các thành phần dễ biến tính ở nhiệt độ cao, do đó, không được hấp tiệt trùng khi pha chế.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày quy trình phân tích Bacillus cereus trong thực phẩm?- Tại sao khi phân tích Bacillus cereus trong thực phẩm, chỉ cần phân tích định tính?- Giải thích cơ chế của các phản ứng sinh hóa xác định Bacillus cereus?- Nêu kết quả và kết luận về sự hiện diện của Bacillus cereus trong mẫu thực phẩm

ban đầu?

Trang 120

Choïn 5 khuaån laïc đặc trưng caáy sang TSA hay BHI, uû 30oC, 24h

Laáy 25g maãu ñoàng nhaát vaøo 225ml pepton ñeäm, ñöôïc 10-1

Pha loaõng maãu 10-2, 10-3, 10-4…

Chuyeån 0,1ml dung dòch 10-2, 10-3, 10-4 cấy trải vaøo đĩa petri môi trường MYP, uû 30oC, 30h

Caáy thöû sinh hoaù: phenol red glucose broth, gram, nitrate broth, VP, Tyrosine

agar, Lysozyme broth

Keát luaän Bacillus cereus

Đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng coù maøu hoàng eosin, lecithinase döông tính trên đĩa petri

BÀI 22PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐỊNH LƯỢNG

STAPHYLOCOCCUS AUREUS TRONG THỰC PHẨM1. Nguyên tắc

Staphylococcus aureus (tụ cầu vàng) được Robert Koch phát hiện vào năm 1878 thông qua phân lập từ mủ của các ung nhọt. Staphylococcus aureus thuộc họ Micrococcaceae (cầu khuẩn). Tụ cầu khuẩn hiện nay được phát hiện có 20 loại , được chia làm 2 nhóm: nhóm coagulase (+) và coagulase (-). Staphylococcus aureus thuộc loại coagulase (+). Hiện diện ở nhiều nơi trong môi trường và trên cơ thể người. Gây nhiều bệnh nguy hiểm trên da, trong cơ thể bằng cách tiết các độc tố như hyaluronidase, hemolysine, leukocidine, exfoliatine, 5 độc tố ruột enterotocxine A, B, C, D, E và độc tố gây hội chứng sốc nhiễm độc.

Nguyên tắc phát hiện sự hiện diện và định lượng số lượng của Staphylococcus aureus trong thực phẩm dựa vào sự xuất hiện của khuẩn lạc điển hình (chỉ định bởi sự khử của Kali tellurite và lòng đỏ trứng) trên môi trường phân lập Baird-Parker và phản ứng dương tính coagulase trong dịch huyết tương thỏ.2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1. Dụng cụ





2.2. Môi trường và hoá chất- Môi trường BPA bổ sung kali tellurite và lòng đỏ trứng- Huyết tương thỏ đông khô- Nước muối sinh lý 0,9%- Thuốc nhuộm tím kết tinh- Dung dịch lugol- Thuốc nhuộm Fuschin- Cồn 96o

* Dung dịch Saline Peptone Water (SPW)Được sử dụng để pha loãng vi sinh vật, thành phần như sau:- Pepton :1g- NaCl :8,5g- Nước cất đủ :1000mlPhân phối 9ml vào các ống nghiệm và 90ml vào các erlen. Hấp khử trùng 121oC, 15

phút. pH cuối = 7,0.* Môi trường Baird-Parker- Tryptone 10g

Trang 121

- Cao thịt 5g- Cao nấm men 1g- Sodium pyruvate 10g- Glycine 12g- Lithium chloride.6H2O 5g - Agar 20g- Nước cất đủ 1000mlHấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 7,0± 0,2.Môi trường hoàn chỉnh: thêm 5ml Bacto EY tellurite enrichment được làm ấm 45oC

vào 95ml môi trường cơ bản được đun chảy và làm nguội ở 45oC, trộn đều và đổ 10 - 15ml vào các đĩa pettri vô trùng.

* Môi trường Trypticase Soy Agar (TSA):Được sử dụng để bảo quản, phục hồi vi sinh vật trong quá trình thí nghiệm- Trypticase peptone 15g- Phytone peptone 5g- NaCl 5g- Nước cất đủ 1000mlĐun nóng, phân phối môi trường vào các ống nghiệm, hấp khử trùng 15 phút, 121oC.

Đặt ống nghiệm nghiêng. pH cuối = 7,3±0,2.2.3. Nguyên liệu khác- Mẫu thịt heo tươi- Túi nilon dập mẫu- Dịch vi khuẩn Staphylococcus aureus kiểm chứng

3. Tiến hành thí nghiệm3.1. Chuẩn bị mẫu phân tích- Mẫu đưa về phòng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vô trùng. Dùng kéo và kẹp vô

trùng lấy đại diện 10g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Mẫu được đồng nhất với 90ml dung dịch SPW bằng máy dập mẫu để có dung dịch pha loãng 10-1.

- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch SPW để được dung dịch pha loãng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha loãng ở các nồng độ cao hơn.

3.2. Cấy và ủ mẫu- Chọn nồng độ pha loãng thích hợp, cấy 0,1ml dịch pha loãng vào đĩa môi trường

Baird Parker, dùng que cấy tam giác trải đều mẫu cho đến khi khô. Thực hiện tương tự với 2 đĩa môi trường Baird Parker khác. Ủ 37oC trong 24 - 48 giờ.

Hình. Khuẩn lạc đặc trưng của Staphylococcus aureus trên môi trường BPA3.3. Đọc kết quả- Đếm riêng số khuẩn lạc đặc trưng Nt (tròn, đen, bóng, có quầng sáng, quầng trong

xung quanh khuẩn lạc) và không đặc trưng Na của Staphylococcus aureus.

Trang 122

- Cấy 5 khuẩn lạc đặc trưng và 5 khuẩn lạc không đặc trưng sang ống thạch nghiêng TSA. Ủ 30oC trong 24 giờ.

3.4. Phép thử khẳng định* Thử nghiệm catalase- Mục đích: chẩn đoán phân biệt khóm vi khuẩn Staphylococci với khóm vi khuẩn

Streptococci và Pneumococci. Staphylococci có emzyme catalase sẽ phóng thích O2 từ H2O2

tạo hiện tượng sủi bọt. - Thử nghiệm được thực hiện bằng cách hoà một ít sinh khối vi sinh vật lấy trực tiếp

từ khuẩn lạc trên môi trường BPA vào giọt H2O2 trên lame kính. Kết quả: + Hiện tượng sủi bọt xảy ra ngay lập tức sau khi H2O2 tiếp xúc với vi khuẩn có

catalase (+) → cocci này là Staphylococci.+ Không có hiện tượng sủi bọt: catalase (-) → nhóm cocci này là Streptococci

* Thử nghiệm coagulase- Cấy sinh khối vi khuẩn từ môi trường TSA sang các ống nghiệm chứa huyết tương

thỏ, ủ 37oC. - Theo dõi kết quả phản ứng đông huyết tương sau 2, 4, 6, 8 và 24 giờ. Staphylococcus

aureus cho phản ứng huyết tương dương tính (có khối đông huyết tương hình thành).3.5. Tính toán kết quảMật độ Staphylococcus aureus trong 1g mẫu (CFU/g):

Trong đó: - f: hệ số pha loãng, V: thể tích mẫu cấy- n: số đĩa thoả điều kiện- Nt: tổng số khuẩn lạc đặc trưng- Na: tổng số khuẩn lạc không đặc trưng- Rt: tỉ số giữa khuẩn lạc đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số khuẩn lạc

đặc trưng- Ra: tỉ số giữa khuẩn lạc không đặc trưng cho thử nghiệm khẳng định (+) so với số

khuẩn lạc không đặc trưng4. Những điểm cần lưu ý

- Staphylococcus aureus là nhóm vi sinh vật nguy hại, cần hết sức cẩn thận khi phân tích. Mang găng tay, khẩu trang trong quá trình làm thí nghiệm.

- Thử nghiệm coagulase có thể thực hiện trên dịch huyết tương thỏ đông khô hoặc dịch huyết tương thỏ tươi.

- Dung dịch H2O2 dùng làm thử nghiệm coagulase phải được bảo quản ở nhiệt độ thấp để tránh làm mất hoạt tính khi sử dụng.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày đặc tính và độc tính của vi khuẩn Staphylococcus aureus?- Trình bày quy trình phân tích định lượng Staphylococcus aureus?- Ý nghĩa của việc xác định chỉ số Ht và Ha?- Xác định kết quả phân tích định lượng Staphylococcus aureus trong mẫu thịt ban

đầu?

Hình. Kết quả thử nghiệm coagulase trên dịch huyết tương thỏ (âm tính: I, dương tính: II, III, IV, V)

Trang 123

Quy trình phân tích Staphylococcus aureus trong thực phẩm:

Trang 124

Cấy 0,1 – 0,3 ml dung dịch mẫu (10-1) lên bề mặt môi trường Baird Parker agar, trang đều bằng que tam giác

Cấy 0,1 – 0,3 ml dung dịch mẫu (10-1) lên bề mặt môi trường Baird Parker agar, trang đều bằng que tam giác

Ủ ngược đĩa ở 37 ± 0,5oC trong 48 giờ

Đếm số khuẩn lạc đặc trưng (Nt) và số khuẩn lạc không đặc trưng (Na)

Đếm số khuẩn lạc đặc trưng (Nt) và số khuẩn lạc không đặc trưng (Na)

Chuyển 5 kl đặc trưng và 5 kl không đặc trưng sang mt TSA

Ủ ở 37 ± 0,5oC qua đêm

Cấy chuyền vào ống chứa 0,3ml huyết tươngCấy chuyền vào ống chứa 0,3ml huyết tương

Ủ ở 37 ± 0,5oC và theo dõi sau 2, 4, 6, 8 giờ. Nếu không có kết quả dương tính sẽ ủ đến 24 giờ. Xác định tỉ lệ dương tính Rt (KL đặc trưng) và Ra(KL không đặc trưng)

Kết quả: số S. areus (CFU/g)

)(1

aatt RNRNnVf

S

BÀI 23PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VIBRIO CHOLERAE TRONG

THỰC PHẨM (Tiêu chuẩn: TCN 200:2004)1. Nguyên tắc

Vibrio cholerae thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae là phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, có khả năng di động nhanh, phản ứng oxidase dương tính, phát triển được ở nhiệt độ 420C, lên men đường sacarose, khử lysin; phát triển được ở môi trường không có muối nhưng không phát triển được ở môi trường có nồng độ muối lớn hơn hoặc bằng 6 %; nhạy với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat.

Vibrio cholerae là nhóm vi khuẩn nguy hiểm (tác nhân gây bệnh tả), thường xâm nhiễm vào các loại thủy hải sản. Có khả năng phát dịch nhanh. Trong tất cả các loại thực phẩm, chỉ tiêu đối với đối tượng này bằng 0 (không được phát hiện trong 25g thực phẩm).

Phát hiện Vibrio cholerae bằng cách tăng sinh trong môi trường lỏng chọn lọc và cấy chuyển phân lập trên môi trường rắn chọn lọc. Những khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định bằng thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanh.2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1. Dụng cụ





2.2. Môi trường và hoá chất* Nước pepton kiềm: Ancalin Peptone Water (APW) - Pepton : 10,00 g- Natri clorua : 10,00 g- Nước cất : đủ 1000ml - pH 8,5±0,2 (ở nhiệt độ 250C)Hoà tan các thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu rồi chia vào các bình chứa thích hợp.

Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút. Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay hơi nước và pH bị thay đổi.

* Môi trường phân lập: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muối-Sacarose (TCBS thạch) - Pepton : 10,00 g- Cao nấm men : 5,00 g- Natri xitrat : 10,00 g- Na2S2O3 : 10,00 g - Mật bò : 5,00 g- Sacarose : 20,00 g- Natri clorua (NaCl) : 10,00 g

Trang 125

- Sắt (III) citrat (FeC6H5O7) : 1,00 g- Natri cholate : 3,00 g- Xanh bromthymol : 0,04 g- Xanh thymol : 0,04 g- Thạch : 15,00 g.- Nước cất vô trùng đủ 1000ml- pH 8,6± 0,2 (ở nhiệt độ 250C).Ðun sôi để hoà tan hoàn toàn các thành phần rồi làm nguội ngay tới nhiệt độ khoảng

500C. Rót 15 - 20 ml vào các đĩa petri vô trùng. Trước khi sử dụng phải làm khô đĩa môi trường bằng cách để qua đêm ở nhiệt độ trong phòng hoặc đặt đĩa trong tủ ấm ở nhiệt độ khoảng 370C - 450C. Không hấp khử trùng môi trường

Môi trường, thuốc thử sinh hoá* Thạch sắt ba đường: Triple Sugar Iron agar -TSI

- Pepton : 15,00 g- Proteose pepton : 5,00 g- Cao thịt bò : 3,00 g- Cao nấm men : 3,00 g - NaCl : 5,00 g- Lactose : 10,00 g - Sacarose : 10,00 g - Glucose : 1,00 g - FeSO4 : 0,20 g- Na2S2O3 : 0,30 g - Ðỏ phenol : 0,024 g - Thạch : 12,00 g - Nước cất đủ : 1000 ml- pH = 7,4±0,2 (ở nhiệt độ 250C)Hoà tan các thành phần, chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C

trong 15 phút. Trước khi môi trường đông, đặt các ống nằm nghiêng sao cho phần thạch đứng cao khoảng 2 - 3 cm và phần thạch nghiêng khoảng 4 - 5 cm.

* Thạch sắt hai đường: Klingler Iron Agar -KIA- Polypepton pepton : 20,00 g- NaCl : 5,00 g- Lactose : 20,00 g - Dextrose : 1,00 g - Sắt ammoni xitrat : 0,50 g- Na2S2O3 : 0,50 g - Phenon đỏ : 0,025 g - Thạch : 15,00 g- Nước cất đủ : 1000 ml- pH = 7,4±0.2 (ở nhiệt độ 250C)Hoà tan các thành phần, chia vào mỗi ống nghiệm khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C

trong 15 phút. Trước khi môi trường đông, đặt các ống nằm nghiêng sao cho phần thạch đứng cao khoảng 2 - 3 cm và phần thạch nghiêng khoảng 4 - 5 cm

* Hugh - Leifson Glucose - Pepton : 2,00 g- Cao nấm men : 0,50 g- NaCl : 30,00 g - Dextrose : 10,00 g- Tím bromcresol : 0,015 g - Thạch : 3,00 g - Nước cất đủ : 1000 ml

Trang 126

- pH = 7,4±0,2 (ở nhiệt độ 250C)Ðun nóng để hoà tan hoàn toàn các thành phần trên rồi chia vào mỗi ống nghiệm

khoảng 5 ml. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. * O/F Glucose- Trypton : 2,00 g- Natri clorua (NaCl) : 5,00 g- K2HPO4 : 0,30 g- Xanh bromthymol : 0,03 g - Thạch : 2,00 g- Glucose : 10,00 g- Nước cất đủ: 1000ml- pH = 6,8±0,2 (ở nhiệt độ 250C)Ðun sôi để hoà tan các thành phần rồi rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút . * Canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 % NaCl (ký

hiệu lần lượt là: T1N0; T1N1; T1N3; T1N6; T1N8 và T1N10) Hoà tan 10 g trypton trong 1 lít nước cất. Sau đó, thêm lần lượt : 10, 30, 60, 80 và 100

g NaCl để được các canh thang trypton có giải nồng độ NaCl như trên. Sau đó, khuấy đều, rồi chỉnh pH sao cho môi trường sau khi hấp có pH = 7,2 0,2 (ở nhiệt độ 250C). Tiến hành rót 5 ml môi trường vào mỗi ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Các ống môi trường phải được nút chặt trong quá trình bảo quản để tránh bốc hơi nước làm thay đổi nồng độ muối.

* Môi trường thử decarboxylase (Môi trường cơ bản)- Pepton : 5,00 g- Cao nấm men : 3,00 g- Glucose : 1,00 g - Tím bromcresol : 0,02 g- Nước cất đủ : 1000 ml- pH = 6,5±0,2 (ở nhiệt độ 250C)Tuỳ theo loại môi trường cần pha, thêm 5 g một trong các loại axitamin: L-lysin hoặc

L-arginin hoặc L-ornithin vào môi trường cơ bản trên. Sau đó, rót 5 ml môi trường vào các ống nghiệm, nới lỏng nắp. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút. Các ống phải được nút chặt trong khi bảo quản và sau khi cấy.

* Canh thang urê - urê : 20,00 g- Na2HPO4 : 9,50 g- K2HPO4 : 9,10 g- Cao nấm men : 0,10 g- Ðỏ phenol : 0,01 g- Nước cất đủ : 1000ml- pH = 6,8±0,1 (ở nhiệt độ 250C)Hoà tan các thành phần. Không được hấp khử trùng, lọc vô trùng bằng màng lọc có

đường kính lỗ là 0,45 ml. Sau đó, rót khoảng 1,5 - 3,0 ml vào các ống nghiệm hoặc đĩa petri đã được sấy vô trùng.

* Canh thang bromcresol ( Môi trường cơ bản)- Pepton : 10,00 g- NaCl : 5,00 g- Cao thịt bò : 3,00 g- Tím bromcresol : 0,04 g- Nước cất đủ : 1,00 lít - pH = 7,0±0,2 (ở nhiệt độ 250C)

Trang 127

Hoà tan các thành phần trên, chỉnh pH sao cho môi trường sau khi pha đạt yêu cầu như trên rồi rót 2,5 ml vào các ống nghiệm. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 10 phút.

Pha các loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sacarose, lactose, D-cellobiose, arabinose, D-manniton và D-mannose) trong nước cất rồi lọc vô trùng. Thêm 0,278±0,002 ml dung dịch này vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trường cơ bản. Môi trường cuối cùng có nồng độ carbohydrat là 5%.

* Thạch trypton muối 2% : TSA 2% NaCl - Trypton : 10,00 g- NaCl : 20,00 g- Thạch : 20,00 g- Nước cất đủ : 1000 ml- pH = 7,2±0,2 (ở nhiệt độ 250C)Ðun sôi để hoà tan các thành phần trên. Hấp ở nhiệt độ 1210C trong 15 phút. Sau đó, để

nguội đến nhiệt độ khoảng 45 - 500C rồi rót ra đĩa hoặc ống nghiệm.* Thuốc thử OxidasseHoà tan 1,0 g N-tetrametyl-p-phenylenediamine.2HCl vào 100 ml nước cất vô trùng.

Ðựng dung dịch trong lọ sẫm màu hoặc bọc lọ trong giấy bạc. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 - 80C, sử dụng trong vòng 7 ngày.

* Dầu khoáng vô trùngRót khoảng 20 - 50 ml dầu khoáng vào bình có nắp xoáy. Hấp dầu ở nhiệt độ 121 0C

trong 30 phút. * Thuốc thử ONPG - Dung dịch đệm:Natri dihydro phosphat ngậm 1 phân tử nước (NaH2PO4.H2O) : 6,90 gNước cất : 45,00 mlDung dịch hydroxit natri (NaOH) 30 % (w/v) : 3,00 mlHoà tan NaH2PO4.H2O trong nước cất. Thêm dung dịch NaOH 30% và chỉnh pH = 7,0

(ở nhiệt độ 250C), thêm nước cất vừa đủ 50 ml. Bảo quản dung dịch ở nhiệt độ 2 - 80C. - Dung dịch ONPG:ONPG (o-nitrophenyl-D-galactoside ) : 80,00 mg Nước cất ở 370C : 15,00 mlDung dịch đệm : 5,00 mlHoà tan ONPG trong nước cất ở nhiệt độ 370C. Thêm dung dịch đệm vào rồi lắc đều.

Bảo quản ở nhiệt độ 2 - 80C. Trước khi sử dụng phải làm ấm dung dịch đến nhiệt độ 370C.* Các đĩa 10 mg và 150 mg O/129 VibriostatCắt giấy lọc thành các mảnh tròn đường kính khoảng 5 - 6 mm rồi đặt vào các đĩa petri,

hấp khử trùng. Chuẩn bị đĩa 150 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 - diisopropyl -

pteridin photphat (O/129) trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 15,0 mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch này vào mỗi đĩa.

Chuẩn bị đĩa 10 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 - diisopropyl - pteridine phosphat (O/129) trong nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1,0mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch này vào mỗi đĩa.

Sấy khô các đĩa, bảo quản trong tủ lạnh, tránh ánh sáng. 2.3. Nguyên liệu khác- Mẫu thủy sản tươi (nghêu, sò, mực...)- Túi nilon dập mẫu- Dịch vi khuẩn Vibrio cholerar kiểm chứng- Cồn 96o

3. Tiến hành thí nghiệm3.1 Chuẩn bị mẫuChuẩn bị mẫu thực phẩm

Trang 128

Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào một túi PE đã vô trùng. Cắt các mẫu lớn thành các mảnh nhỏ rồi thêm 225 ml nước pepton kiềm APW vào túi, nghiền bằng máy nghiền đồng nhất trong 2 phút. Mẫu kiểm tra thường ví dụ: mẫu nghêu

Lấy phần thịt của 10 - 12 con nghêu (kể cả nước) rồi cắt nhỏ, trộn đều. Sau đó, nghiền bằng máy nghiền đồng thể 50 g mẫu hàu trong 450 ml nước pepton kiềm APW trong 2 phút. Chia dung dịch mẫu này vào 2 bình vô trùng, mỗi bình chứa 250 ml rồi pha loãng thành hai dãy bằng cách trộn đều 10 ml dung dịch mẫu trong 90 ml nước pepton kiềm APW. Ủ mẫu ở hai chế độ nhiệt là 37,00C±1,00C và 42,00C±0,20C.

3.2 Tăng sinh a. Ðối với mẫu thông thườngỦ các bình chứa mẫu đã chuẩn bị (kể cả mẫu chứng dương và mẫu chứng âm) ở nhiệt

độ 37,00C±1,00C trong 6 - 8 giờ. Sau đó, phân lập, phần còn lại ủ tiếp 16 - 24 giờ rồi phân lập lại.

b. Ðối với mẫu nghêuỦ 1 dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 ở nhiệt độ 37,00C±1,00C trong 6 - 8 giờ và 16 - 24 giờ.Ủ 1 dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 ở nhiệt độ 42,00C±0,20C trong 6 - 8 giờ.3.3. Phân lập và đọc kết quả trên đĩaSau khi nuôi ủ ở các chế độ nhiệt và các khoảng thời gian trê, không lắc, dùng khuyên

cấy lấy dịch mẫu trên bề mặt cấy ria vào môi trường TCBS thạch. Ủ các đĩa TCBS thạch ở nhiệt độ 37,00C±1,00C trong 18 - 24 giờ.

Trên môi trường TCBS thạch, khuẩn lạc V. cholerae tròn, hơi dẹt, bóng, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacarose), ở giữa đậm và có viền mờ xung quanh.

Hình. Khuẩn lạc đặc trưng của Vbrio cholerae trên môi trường TCBS3.4 Thử nghiệm sinh hoá và kháng huyết thanha. Thử nghiệm sinh hoá sơ bộ Chọn ít nhất 3 khuẩn lạc nghi ngờ trên TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường

không chọn lọc TSA 2% NaCl. Ủ ở nhiệt độ 37,00C±1,0oC trong 18 - 24 giờ. Khuẩn lạc mọc trên môi trường này được sử dụng để thực hiện các thử nghiệm sinh hoá.

* Thử nghiệm trên môi trường TSI, KIA Cấy chuyển các khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống thạch nghiêng TSI hoặc

KIA. Nới lỏng các nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,00C±1,00C trong 18 - 24 giờ.

Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng và thạch đứng của môi trường chuyển màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S. Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ và thạch đứng màu vàng, không sinh hơi và không sinh H2S.

* Thử nghiệm với các canh thang trypton muối

Trang 129

Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào các ống canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 8 và 10 %. Nuôi ủ ở nhiệt độ 37,0±1,0 0C trong 18 - 24 giờ, rồi ủ lại các ống âm tính sau 18 - 24 giờ nữa. V. cholerae phát triển được trong ống canh thang có nồng độ NaCl là 0%, 3% và làm đục môi trường.

* Thử nghiệm lên men - oxy hoá Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào 2 ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson

glucose hoặc O/F glucose. Phủ khoảng 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng vào một trong 2 ống. ủ các ống nghiệm ở nhiệt độ 37,0±1,00C trong 1 - 2 ngày. V. cholerae lên men glucose làm môi trường Hugh - Leifson từ màu tím chuyển thành vàng và môi trường O/F từ màu xanh thành vàng.

* Thử nghiệm oxidase Ðặt giấy lọc lên một nắp đĩa petri, nhỏ khoảng 2 - 3 giọt thuốc thử oxidase. Dùng que

cấy bạch kim (platin) hoặc que cấy nhựa dùng một lần; hoặc que gỗ vô trùng lấy các khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí đã nhỏ thuốc thử oxidase. V. cholerae làm vết ria có màu tím thẫm hoặc xanh thẫm sau 10 giây .

Chú thích: không dùng que cấy bằng crôm hoặc bằng sắt trong thử nghiệm này. * Nhuộm gram V. cholerae là vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy.b. Thử nghiệm sinh hoá khẳng định* Thử nghiệm phát triển ở nhiệt độ 420C Cấy vi khuẩn từ TSA vào một ống canh thang trypton 1% NaCl. Ủ ở nhiệt độ

42,00C±0,20C trong 18 - 24 giờ. V. cholerae phát triển được ở nhiệt độ 420C làm môi trường bị đục.

* Thử nghiệm cacbonhydratCấy vi khuẩn từ TSA vào các ống canh thang bromcresol có chứa một trong các lọai

cacbohydrat: sacarose, lactose, D-cellobiose, arabinose, D-manniton, D-mannose. Ủ các ống canh thang ở nhiệt độ 37,00C±1,00C. Phản ứng dương tính khi môi trường có màu vàng, âm tính khi môi trường giữ nguyên màu đỏ.

V. cholerae cho phản ứng sacarose, manniton, mannose dương tính và lactose, cellobiose, arabinose âm tính.

* Thử nghiệm decacboxylase/dehydrolase Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào các ống canh thang ornithin, lysin, arginin và ống đối chứng không có axit amin. Mỗi ống được phủ 1 - 2 ml dầu khoáng vô trùng. Ủ các ống ở nhiệt độ 37,00C±1,0 0C trong 18 - 24 giờ. Phản ứng dương tính khi môi trường giữ nguyên màu tím hoặc hơi đậm hơn. Phản ứng âm tính khi toàn bộ ống canh thang có màu vàng ổn định trong 4 ngày (tương tự màu của ống đối chứng).

V. cholerae cho phản ứng lysin và ornithin dương tính, phản ứng arginin âm tính.* Thử nghiệm urêCấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê, ủ ở nhiệt độ 37,00C±1,00C trong 18 - 24 giờ.

V. cholerae cho phản ứng âm tính nếu môi trường giữ nguyên màu tím hồng. * Thử nghiệm ONPGLấy vi khuẩn đã phát triển trên môi trường TSI hoặc từ môi trường không chọn lọc

khác có chứa 1,0% lactose vào ống nghiệm có chứa 0,25 ml nước muối sinh lý, hoà tan. Thêm 1 giọt toluen vào ống rồi lắc đều, để yên trong 5 phút. Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG. ủ ống nghiệm ở nhiệt độ 37,00C±1,00C. Kiểm tra ống định kỳ trong 24 giờ. V. cholerae cho phản ứng ONPG dương tính khi dung dịch có màu vàng.

Có thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG. Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý. Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống rồi ủ ấm và đọc kết quả như trên.

* Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 VibriostatDàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl. Ðặt các đĩa O/129 có chứa 10 mg hoặc

150mg Vibriostat vào các vị trí khác nhau. Sau đó, lật ngược đĩa rồi ủ ở nhiệt độ 37,0±1,00C

Trang 130

trong 18 - 24 giờ. V. cholerae không phát triển được do bị ức chế bởi Vibriostat tạo một vòng vô khuẩn xung quanh các đĩa O/129.

* Thử nghiệm kháng huyết thanhNhỏ 1 giọt kháng huyết thanh lên lam kính sạch và một giọt nước muối sinh lý lên

một vị trí khác của lam. Dùng que cấy vô trùng khác nhau chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch trên rồi phân tán đều vi khuẩn. Kết luận dương tính khi có hiện tượng ngưng kết ở giọt có kháng huyết thanh và không có hiện tượng ngưng kết ở giọt nước muối. Sử dụng chủng chứng dương và chủng chứng âm trong quá trình thực hiện.

Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết thanh V. cholerae theo Bảng 1 và Bảng 2.

Bảng . Phân biệt V. cholerae O1 và V. cholerae non - O1

Kháng nguyên Kháng huyết thanh đa giá O1

Dung dịch muối sinh lý

Kết luận

Chủng có kết quả sinh hoá tương tự V. cholerae

+ - V.cholerae O1


- - V.cholerae non- O1


+ + Chủng không đặc hiệu với kháng nguyên O

nhóm 1

Bảng. Phân biệt các kiểu huyết thanh chủng V.cholerae O1

Kháng nguyên Kháng huyết thanh Inaba

Kháng huyết thanh Ogawa

Dung dịch muối sinh lý

Kết luận

V. cholerae O1 + - - Chủng Inaba

V. cholerae O1 - + - Chủng Ogawa

V. cholerae O1 + + - Chủng Hikojima

V. cholerae O1 - - - Chủng không đặc hiệu

3.5. Ðọc kết quảPhát hiện hoặc không phát hiện được V. cholerae trong 25 g mẫu.

4. Những điểm cần lưu ý- Môi trường tăng phân lập Vibrio là TCBS có một số thành phần biến tính ở nhiệt độ

cao, không được hấp tiệt trùng.- Chủng Vibrio cholerae (gây bệnh tả) là loại vi sinh vật nguy hiểm, cẩn thận trong

quá trình thực hành. Mang khẩu trang và găng tay để tránh bị xâm nhiễm. Các dung dịch vi sinh vật, dụng cụ và môi trường nuôi cấy cần được hấp tiệt trùng cẩn thận sau khi thí nghiệm.

- Dịch pepton kiềm (APW) tăng sinh chọn lọc Vibrio, sau 24 giờ sẽ có mùi khó chịu, khi hấp tiệt trùng để loại bỏ, cần bọc kỹ bằng túi nilon.

- Để kết quả phân tích chính xác, nên sử dụng môi trường tổng hợp dạng đông khô cho tất cả các bước thử nghiệm.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày đặc tính sinh lý và gây bệnh của Vibrio cholerae?- Trình bày quy trình phân tích Vibrio cholerae trong thủy sản?- Giải thích cơ chế của các thử nghiệm sinh hóa và kháng huyết thanh sử dụng trong

quá trình phân tích xác định Vibrio cholerae?

Trang 131

BÀI 24PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS

TRONG THỰC PHẨM1. Nguyên tắc

Vi khuẩn Clostridium perfringens thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương. Đa số sống kị khí, ưa nhiệt và có khả năng sinh bào tử chịu nhiệt. Clostridium perfringens thủy giải mạnh protein và chuyển hóa acid amin tạo mùi khó chịu. Clostridium perfringens sinh độc tố trong thực phẩm và gây bệnh hoại tử vết thương.

Clostridium perfringens được phân tích bằng cách sử dụng môi trường có chứa sắt và sulphite. Khuẩn lạc mọc trên môi trường có màu đen do phản ứng giữa S2- và Fe2+.2. 2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1. Dụng cụ




STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú1 Nồi hấp cao áp Cái 12 Tủ cấy vô trùng Cái 13 Tủ sấy Cái 14 Máy dập mẫu Cái 15 Bình ủ kỵ khí Cái 16 Bếp đun cách thủy Cái 17 Bút đếm khuẩn lạc Cái 1

2.2. Môi trường và hoá chất* Môi trường Sulphite polymyxin sulphadiazin (SPS agar)Được sử dụng để định lượng Clostridium perfringens- Peptone :15g- Yeast extract :10g- Ferric citrate :0,5g- Sodium sulphite :0,5g- Polymycin B sulphate :0,01g- Sodium sulfadiazine :0,12g- Agar :13,9g- Nước cất đủ :1000mlPhân phối vào ống nghiệm. Hấp 15 phút ở 121oC. pH cuối = 7,0±0,2.* Dung dịch Buffered Peptone Water (BPW)Được sử dụng để pha loãng vi sinh vật- Peptone :10g- NaCl :5g- Na2HPO4.9H2O :9g- KH2PO4 :1,5g- Nước cất đủ :1000ml

Trang 132

Phân phối 9ml vào các ống nghiệm và 90ml vào các erlen. Hấp khử trùng 121oC, 15 phút. pH cuối = 7,0±0,2.

* Môi trường Wilson Blair cải tiến (Sulfite Iron Wilson Blair agar)Được sử dụng để định lượng Clostridium perfringens- Glucose :20 g- Peptone :10g- NaCl :5g- Cao thịt :5g- Agar :20g- Nước cất đủ :1000mlĐun sôi, phân phối vào ống nghiệm hoặc hộp petri. Hấp ở 121oC. pH cuối = 7,0±0,2.

Để tủ lạnh. Không được dùng trước 24 giờ và sau 5 ngày.* Dung dịch phèn sắt 5% (pha trước khi dùng)* Dung dịch Na2SO3 5% (pha trước khi dùng)

2.3. Nguyên liệu khác- Mẫu thủy sản tươi (nghêu, sò, mực...)- Túi nilon dập mẫu- Dịch vi khuẩn Clostridium perfringens kiểm chứng- Cồn 96o

- Túi kỵ khí Gaspak3. Tiến hành thí nghiệm

* Phương pháp SPS3.1. Cách ủ mẫu- Mẫu đưa về phòng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vô trùng. Dùng kéo và kẹp vô

trùng lấy đại diện 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Mẫu được đồng nhất với 225ml dung dịch BPW bằng máy dập mẫu để có dung dịch pha loãng 10-1.

- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch BPW để được dung dịch pha loãng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha loãng ở các nồng độ cao hơn.

3.2. Cấy và ủ mẫu- Lấy 1ml mẫu đã pha loãng, đồng nhất cho vào đĩa petri- Cho 15 - 20 ml thạch SPS vào mỗi đĩa, đảo đĩa, trộn đều. Để đông lại- Lật úp đĩa, để trong bình kỵ khí. Ủ 35 - 370C trong 24h.3.3. Đọc kết quả- Đếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng của Clostridium perfringens (tròn, đen, có đường

kính 3mm).3.5. Tính toán kết quảSố khuẩn lạc trong 1g mẫu bằng trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ có trong 2 ống

nghiệm nuôi cấy (cùng nồng độ) nhân với hệ số pha loãng tương ứng và chia cho 10.* Phương pháp Wison Blair cải tiến3.6. Chuẩn bị mẫu phân tích tại phòng thí nghiệm- Mẫu đưa về phòng thí nghiệm, mở ra cho vào khay vô trùng. Dùng kéo và kẹp vô

trùng lấy đại diện 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng. Mẫu được đồng nhất với 225ml dung dịch BPW bằng máy dập mẫu để có dung dịch pha loãng 10-1.

- Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch pha loãng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch BPW để được dung dịch pha loãng 10-2. Tùy theo mức độ nhiễm bẩn của mẫu mà tiến hành pha loãng ở các nồng độ cao hơn.

3.7. Cấy và ủ mẫu- Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp. Cho 10ml dung dịch pha loãng (mỗi nồng độ 2

ống) vào ống nghiệm có chứa môi trường Wilson Blair cải tiến làm nguội ở 45oC. Cho thêm 2ml dung dịch Na2SO3 và 5 giọt phèn sắt 5%. Tiếp tục làm như sau:

- Lắc đều

Trang 133

- Đun cách thủy 75oC, 15 phút- Làm đông nhanh - Ủ 37oC trong bình kỵ khí trong thời gian 18 - 24 giờ3.8. Đọc kết quảĐếm tất cả các khuẩn lạc đặc trưng của Clostridium perfringens (tròn, đen, có đường

kính 3mm).3.9. Tính toán kết quảSố khuẩn lạc trong 1g mẫu bằng trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ có trong 2 ống

nghiệm nuôi cấy (cùng nồng độ) nhân với hệ số pha loãng tương ứng và chia cho 10.4. Những điểm cần lưu ý

- Phèn sắt và Na thiosulfat cần pha riêng rẽ và bổ sung sau khi hấp tiệt trùng.- Chủng Clostridium perfringens là loại vi sinh vật nguy hiểm, cẩn thận trong quá

trình thực hành. Mang khẩu trang và găng tay để tránh bị xâm nhiễm. Các dung dịch vi sinh vật, dụng cụ và môi trường nuôi cấy cần được hấp tiệt trùng cẩn thận sau khi thí nghiệm.

- Để kết quả phân tích chính xác, nên sử dụng môi trường tổng hợp dạng đông khô cho tất cả các bước thử nghiệm.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày đặc tính sinh lý và gây bệnh của Clostridium perfringens?- Trình bày quy trình phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm?- Giải thích cơ chế của các thử nghiệm sinh hóa sử dụng trong quá trình phân tích xác

định Clostridium perfringens?

Quy trình phân tích Clostridium perfringens trong thực phẩm:

Trang 134

Đồng nhất mẫu, xử lý mẫu 80oC

Cấy trên đĩa với môi trường SPS ở 45oC, lắc đều

Bổ sung thêm môi trường SPS

Ủ 37oC trong bình kỵ khí, trong 24 – 48 giờ

Đếm khuẩn lạc màu đen đường kính khoảng 3mm

BÀI 25PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM BẰNG

PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)1. Nguyên tắc

Các phương pháp truyền thống phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm bao gồm các bước nuôi cấy trên môi trường chọn lọc và hàng loạt các thử nghiệm hoá sinh để khẳng định sự hiện diện của một loài gây bệnh nhất định, và thường kéo dài vài ngày đến vài tuần. Trong những năm vừa qua, các phương pháp nhanh hơn, chuyên biệt hơn nhằm phát hiện các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm dựa trên nguyên tắc sinh học phân tử và miễn dịch học như phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA…đã được thiết lập. PCR (Polymerase Chain Reaction) là kỹ thuật được ứng dụng phổ biến khắc phục được các nhược điểm của phương pháp truyền thống nhờ khả năng phát hiện nhanh và đặc hiệu mầm bệnh. Các nghiên cứu hiện nay trên thế giới đang tập trung vào khẳng định khả năng sử dụng PCR như phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vệ sinh thực phẩm.

PCR là một kỹ thuật nhằm tạo ra một lượng lớn bản sao DNA mục tiêu trong ống nghiệm dựa vào các chu kỳ nhiệt. Kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985. Sự phân tích sản phẩm PCR bằng điện di sẽ cho phép phát hiện vi sinh vật mục tiêu dự trên sự so sánh với các trình tự DNA đặc trưng của vi sinh vật chuẩn. Xét nghiệm bằng kỹ thuật PCR thường có kết quả độ chính xác rất cao, tính đặc hiệu lớn. Tuy nhiên kết quả cũng còn tùy thuộc trình độ của kỹ thuật viên, phương tiện máy móc làm việc và việc quản lý chất lượng. 2. 2. Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1. Dụng cụ




10Ống Eppendorf 0,2. 0,5 ml; 1,5 ml chuyên dùng cho PCR

Cái 5

STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú1 Nồi hấp cao áp Cái 12 Tủ cấy vô trùng Cái 13 Tủ sấy Cái 14 Máy dập mẫu Cái 15 Bình ủ kỵ khí Cái 16 Bếp đun cách thủy Cái 17 Bút đếm khuẩn lạc Cái 18 Máy PCR Cái 1

9Máy ly tâm dùng cho ống eppendorf 1,5 ml

Cái 1

10 Máy vortex Cái 111 Thiết bị điện di ngang và bộ

nguồn điện di có điện thế hoạt Cái 1

Trang 135



động từ 80 đế 150 volt

12Hộp đèn soi UV có kính lọc 302mm

Cái 1

13 Bộ chụp ảnh trên đèn UV Cái 12.2. Môi trường, hóa chấta. Hóa chất* Mồi: Gồm hai mồi invA1 và invA2 được thiết lập cách nhau 520 bp trong gen invA

có vai trò trong quá trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật và người. Trình tự của hai mồi như sau :

invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3'invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3'Nồng độ mồi sử dụng trong phân tích được pha loãng thành 6 pM trong đệm TE. Ðệm

TE có thành phần như sau : 10 mM Tris-HCl (pH = 8), 1 mM EDTA.* Hỗn hợp dùng trong khuếch đại PCR 1,1x- Taq polymerase: 0,025 U/ml (1,25 U/50 ml)- Tris - HCl (pH = 8,8 ở nhiệt độ 25oC): 75 mM- Sunphat amon (NH4)2ư SO4: 20 nM- Tween 20: 0,01% (v/v)- dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 200 mM (mỗi loại)- Magiê clorua (MgCl2) 1,5 mM- Tất cả các thành phần trên được pha chế trong nước cất 2 lần và bảo quản ở nhiệt độ

4oC trong 1 tháng. Có thể bảo quản ở nhiệt độ - 20oC trong 1 năm. Không nên rã đông và tái đông dung dịch đã pha chế nhiều lần.

* Thang ADNNên sử dụng thang đo phù hợp có thể ước lượng được đoạn khuếch đại 520 bp. Có thể

sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp đã biết trước làm thang đo trong phương pháp này.

* AgaroseSử dụng trong kỹ thuật này là loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ hơn 1000

bp.* Ðệm điện di TAE 1x- Tris: 4,84 g- Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0: 2 ml- Axit axetic băng: 1,14 ml- Nước cất cho đủ: 1000 mlNên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), khi sử dụng mới pha loãng với

nước thành dung dịch 1x.* Ðệm tải mẫu 6x- Glyxerol: 30 %- Xanh bromphenon: 0,25 %- Tris: 200 mM- Na2EDTA: 20 mMCác thành phần trên được pha trong nước cất, bảo quản ở nhiệt độ 4oC.* Thuốc nhuộm AND: dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/mlb. Môi trường nuôi cấy vi sinh vậtDung dịch đệm pepton- Pepton (C5H10O5): 10,0g- Natri clorua (NaCl): 5,0g- Ðinatri hyđro phôt phat (Na2HPO4): 3,6 g- Kali đihyđro phôt phat (KH2PO4): 1,5g

Trang 136

- Nước cất: 1000 mlHoà tan các thành phần trong nước cất, đun tan, phân phối vào trong các bình chứa

phù hợp. Hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC trong 15 phú. pH sau khi khử trùng là 7,0 0,2 ở 25oC.

2.3. Nguyên liệu khácMẫu thức ăn đường phố, thịt gà tươi sống, hải sản, trứng và sản phẩm của trứng, rau

xà lách, thức ăn gia súc nhiễm vi sinh vật tự nhiên.3. Tiến hành thí nghiệm

3.1. Lấy mẫuCân chính xác 25 g mẫu (hoặc một khối lượng chính xác tuỳ theo yêu cầu) rồi cho vào

bình tam giác hoặc bao PE vô trùng.3.2. Tăng sinhNhằm làm tăng số lượng Salmonella trong mẫu, các tế bào bị suy yếu hay tổn thương

cũng được phục hồi và phát triển. Giai đoạn này được tiến hành trong môi trường không chọn lọc và trên nguyên tắc cứ một phần khối lượng mẫu sẽ bổ sung 9 phần khối lượng môi trường tăng sinh. Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm.

Ủ mẫu có môi trường tăng sinh ở nhiệt độ 37,0oC 1,0oC trong khoảng 18 giờ 2 giờ. 3.3. Xử lý mẫu giải phóng ADNGiai đoạn này nhằm thu nhận sinh khối sau khi tăng sinh, rửa sạch môi trường sau khi

nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng ADN. Cách xử lý như sau:- Lắc đều canh khuẩn tăng sinh. Hút 0,5 ml vào trong ống eppendorf có thể tích 1,5

ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút rồi loại bỏ phần môi trường lỏng bên trên. Rửa sinh khối bên dưới với nước cất vô trùng rồi tiếp tục ly tâm với chế độ như trên để loại bỏ phần nước.

- Huyền phù sinh khối trong ống với 0,5 ml nước cất vô trùng. Ðun sôi cách thuỷ trong 10 phút. Ly tâm huyền dịch sau khi đun với tốc độ 10 000 vòng/phút trong 5 phút để lắng các mảnh vỡ tế bào xuống đáy. Phần dịch trong bên trên được coi là khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại.

3.4. Khuếch đạiGiai đoạn này nhằm làm tăng số lượng bản sao đoạn ADN đích trên máy luân nhiệt

(thermocycler) bằng hai mồi đặc trưng. Quá trình khuếch đại được tiến hành trong khoảng 30 chu kỳ.

- Chuẩn bị ống khuếch đạiHút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào trong ống nghiệm PCR có thể tích

0,2 hoặc 0,5 ml, thêm vào 1 ml mỗi mồi invA1 và invA2 có nồng độ 6 pM và 3 ml mẫu khuôn ADN. Tổng thể tích trong một ống khuếch đại là 50 ml.

Ðối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng dịch ADN của Salmonella chuẩn đã biết.

Ðối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu bằng nước cất vô trùng.- Chương trình khuếch đạiCác ống khuếch đại được đặt vào trong máy luân nhiệt. Chương trình khuếch đại như

sau: duy trì nhiệt độ 95oC trong 5 phút để làm biến tính hoàn toàn các sợi ADN trong mẫu. Tiếp theo là 35 chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 bước như sau: 95oC/60 giây; 54oC/45 giây và 72oC/60 giây. Sau khi kết thúc 35 chu kỳ, mẫu được giữ ở nhiệt độ 72oC trong 10 phút, sau đó giữ ổn định ở nhiệt độ 20oC cho đến khi điện di.

3.5. Ðiện di sản phẩm khuếch đại- Chuẩn bị gel điện di agarose 1%Gel agarose 1 % pha trong đệm TAE 1x được đun chảy hoàn toàn và đổ vào khay điện

di đã có sẵn các lược để tạo giếng. Gel điện di phải có độ dày khoảng 3 - 4 mm. Gel sau khi chuẩn bị được ngâm chìm hoàn toàn trong đệm TAE.

- Chuẩn bị dịch điện diMẫu sau khi khuếch đại được nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x rồi trộn thật đều.

Trang 137

- Ðiện diMột giếng trong gel điện di được sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng

dương. Nạp 10 ml dịch điện di đã chuẩn bị vào trong gel agarose. Tiến hành điện di trong 60 phút ở hiệu điện thế 100 vôn.

3.6. Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại- Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫuPha dung dịch nhuộm ADN như sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít

nước, pha vào trong khay chứa có miệng rộng hơn bản gel điện di.- Nhuộm gelNgâm bản gel đã điện di vào dung dịch nhuộm trong 10 phút. Rửa gel bằng nước

trong khoảng 3 - 5 phút để loại bỏ phần etyl bromua dư.- Quan sát, chụp hìnhCho bản gel đã nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn rồi quan sát các

vạch sáng đỏ của ADN xuất hiện trên bản gel. Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết quả.3.7. Ðọc và giải thích kết quảKết quả phân tích chỉ được xem xét kết luận khi mẫu đối chứng dương tính có sản

phẩm khuếch đại ADN với kích tước 520 bp và mẫu đối chứng âm không có sản phẩm này.Mẫu được kết luạn là dương tính Salmonella khi có sản phẩm khuếch đại 520 bp trên

bản gel. Mẫu được kết luận là âm tính khi không có sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác hơn 520 bp.4. Những điểm cần lưu ý

- Mang khẩu trang và găng tay cao su sạch để tránh làm tạp nhiễm sản phẩm PCR- Không điều chỉnh ngoài khoảng thể tích cho phép được hút khi sử dụng các

micropipette.- Tuân thủ đúng các bước thao tác khi chuẩn bị phản ứng PCR và khi vận hành máy

luân nhiệt PCR.- Phải dùng kính bảo vệ mắt khi quan sát sản phẩm điện di trên gel agarose dưới đèn

UV.5. Báo cáo thực tập

- Trình bày nguyên tắc phương pháp PCR trong xác định vi sinh vật của thực phẩm?- Trình bày vai trò của mồi xuôi, ngược trong phản ứng PCR?- Giải thích tại sao phản ứng PCR chỉ nên tiến hành khoảng 35 chu kỳ?- Trình bày nguyên tắc và phương pháp đọc bản điện di sản phẩm PCR?- Trình bày kết quả xác định Salmonella spp. trong mẫu thực phẩm ban đầu bằng

phương pháp PCR?

Trang 138

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lê Duy Linh, Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng. 2010. Thực tập vi sinh cơ sở. NXB Đại học Quốc Gia Tp. Hồ Chí Minh.2. Trần Văn Minh, Dương Nhật Linh. 2008. Thực tập vi sinh cơ sở. Tài liệu lưu hành nội bộ. Trường Đại học Mở Tp. Hồ Chí Minh.3. Lê Xuân Phương. 2004. Thí nghiệm vi sinh vật học. NXB Đại học Đà Nẵng.4. Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hoàng, Phạm Thị Phượng Trang, Phạm Thi Hồng Tươi. 2001. Thực tập vi sinh vật học. NXB Đại học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh.

5. Trần Linh Thước.2002. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm. NXB Giáo dục.

6. Benson. 2001. Microbiological Applications Lab Manual, eighth edition. The McGraw-Hill companies.

7. Harley Prescott. 2002. Laboratory Exercises in Microbiology, fifth edition. The McGraw-Hill companies.

8. N.F. Lightfoot, E.A. Maier. 2003. Microbiological Analysis of Food and Water: Guidelines for Quality Assurance. Elsevier Science.

Trang 139

Documents

BaigiangTHVisinhvathoc-Compresshinh