CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-

FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT- UNIVERSIDAD DELVALLE DE GUATEMALA

INFORME FINAL

DINÁMICA DE LA TRANSMISIÓN DE Flavivirus, Alphavirus Y Orthobunyavirus

EN DIFERENTES HÁBITATS DE PUERTO BARRIOS, IZABAL, GUATEMALA, 2009-2010

PROYECTO FODECYT No. 016-2011

LICDA. CELIA CORDÓN ROSALES Investigadora principal

GUATEMALA, SEPTIEMBRE DE 2016

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AGRADECIMIENTOS

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -CONCYT-.

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OTROS AGRADECIMIENTOS

Como contraparte de este proyecto se contó con el apoyo financiero del CDC a través del Acuerdo Cooperativo de Investigación (R-CoAg Guatemala Infectious Disease No. 1U01GH000028-02) entre el Centro de Estudios en Salud de la Universidad del Valle (CES-UVG y los Centros de Control de Enfermedades (CDC), División de Enfermedades Infecciosas Transmitidas por Vectores (DVBID), Fort Collins, Colorado.

El presente informe fue elaborado por: Licda. Celia Cordón, Licda. Lucía Ortíz, Licda. María Luisa Müller, Licda. Silvia Sosa y Licda. Ana Silvia González. Adicionalmente las siguientes personas contribuyeron en el diseño y ejecución del estudio: Dra. María Eugenia Morales-Betoulle, Dr. Nick Komar, Dr. Marm Kilpatrick, Licda. Ana Lucía Ramírez, Bernarda Molina, Licda. Marinés DuTeil, Licda Nancy Zamora, Silvia Ramírez, Dr. Danilo Alvarez, Alfonso Salám, Mónica Santiago, Lic. Oscar de León, Carmen Yoc,

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TABLA DE CONTENIDOS

RESUMEN ................................................................................................................ 1

SUMMARY ................................................................................................................ 2

PARTE I .................................................................................................................... 3

I.1 INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 3

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ......................................................... 5

I.2.1 Antecedentes ......................................................................................... 5

I.2.2 justificación del trabajo de investigación ................................................ 6

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS ......................................................................... 8

I.3.1 Objetivos .............................................................................................. 8

I.3.1.1 Objetivo general ................................................................................. 8

I.3.1.2 Objetivos específicos .......................................................................... 8

I.3.2 Hipótesis ............................................................................................... 8

I.4 METODOLOGIA .......................................................................................... 9

I.4.1 Las variables ........................................................................................ 9

I.4.1.1 Variables dependientes ..................................................................... 9

I.4.1.2 Variables independientes .................................................................. 9

I.4.2 Indicadores ........................................................................................... 9

I.4.3 Estrategia Metodológica ..................................................................... 9

I.4.3.1 Población y Muestra ........................................................................... 9

I.4.4 El Método ............................................................................................ 10

I.4.4.1 Diseño del estudio ........................................................................... 10

I.4.4.2 Métodos de colecta de zancudos .................................................... 12

I.4.4.3 Identificación y clasificación de zancudos ....................................... 12

I.4.4.4 Detección de material genético viral en zancudos ........................... 12

I.4.4.5 Identificación de la ingesta sanguínea en zancudos ....................... 15

I.4.4.6 Secuenciación de productos de PCR ............................................... 18

PARTE II ................................................................................................................. 20

II.3 MARCO TEÓRICO .................................................................................... 20

II.3.1 Arbovirus ............................................................................................ 20

II.3.1.1 Flavivirus .............................................................................................. 20

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II.3.1.2 Alphavirus ............................................................................................. 25

II.3.1.3 Orthobunyavirus .................................................................................. 30

II.3.2 Estudio de los patrones alimenticios de zancudos ........................ 33

II.3.2.1 Comportamiento de alimentación de zancudos .................................... 33

PARTE III ................................................................................................................ 37

III. RESULTADOS ........................................................................................... 37

PARTE IV. ............................................................................................................... 55

IV.1 CONCLUSIONES ................................................................................... 55

IV.2 RECOMENDACIONES ........................................................................... 57

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 59

IV.4 ANEXOS ....................................................................................................... 70

PARTE V ................................................................................................................. 80

V.1 INFORME FINANCIERO ......................................................................... 80

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RESUMEN Los arbovirus son etiologías comprobadas de enfermedades febriles y neurológicas. En Guatemala circulan varios arbovirus de los géneros Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus. Estudios previos estudios realizados por el CES-UVG y CDC de Atlanta han demostrado la presencia y transmisión del virus del Oeste del Nilo a través de evidencia serológica en caballos y hospederos aviares, y aislamiento del virus en zancudos. Adicionalmente, se obtuvieron aislados virales de Alphavirus y evidencia molecular preliminar de la circulación de Orthobunyavirus en zancudos.

Como continuación de estas investigaciones, en este estudio se buscó la presencia de ARN de arbovirus de los géneros Flavivirus, Orthobunyavirus y Alphavirus en zancudos colectados durante 2009-2010 en diferentes hábitats y épocas climáticas en Puerto Barrios, Izabal. Adicionalmente se investigaron los patrones de alimentación en las especies de zancudos positivas a alguno de los virus estudiados, con el objetivo de conocer más acerca de la dinámica de transmisión de enfermedades arbovirales en diferentes hábitats y épocas climáticas y sus implicaciones en los esfuerzos de prevención y control. Se encontró que arbovirus de los tres géneros estudiados circulan en al menos siete de las especies de zancudos capturados. Éstos se alimentan de una amplia gama de hospederos vertebrados como aves (gallinas y otras) y mamíferos, incluyendo roedores, ganado, caballos y perros. Entre las especies de zancudos estudiadas no se detectaron especies con ingesta sanguínea de humanos. Sin embargo, se detectaron altas tasas de infección por arbovirus en el habitat intradomicilio. Asi mismo, se detectó mayor circulación de Flavivirus y Alphavirus durante la época lluviosa, en contraste con Orthobunyavirus, que fue detectado principalmente durante la época seca. Con base a las preferencias alimenticias de los zancudos estudiados, los resultados sugieren que los arbovirus circulantes puedan estar siendo contenidos en el ciclo enzoótico. Este estudio da luz sobre la identidad de especies potenciales de vectores de arbovirus en la región y provee información importante para la implementación de programas de monitoreo de arbovirus en distintos hábitats y estaciones del año.

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SUMMARY

Arboviruses are etiologies of febrile and neurological illness. In Guatemala circulate several arboviruses including the genus Flavivirus, Alphavirus and Orthobunyavirus. Previous studies conducted by CDC in Atlanta and CES-UVG demonstrated the presence and transmission of West Nile virus through serological evidence in horses and avian hosts and isolation of the virus from mosquitoes. Additionally, Alphavirus isolates and preliminar molecular evidence of Orthobunyavirus circulation in mosquitoes were obtained.

As a complement of these previous studies, in this study we established the

presence of arboviral RNA of the genus Flavivirus, Alphavirus and Orthobunyavirus in mosquitoes collected during 2009-2010 in different habitats and climatic seasons in Puerto Barrios, Izabal. In addition, we established the blood feeding patterns of virus positive mosquitoes in order to learn more about the dynamics of transmission of arboviral diseases in different habitats and climatic seasons and their implications for prevention efforts and control.

We found that the three studied arboviruses circulate in at least seven captured mosquito species. They feed on a wide range of vertebrate hosts such as birds (chickens and other) and mammals, including rodents, cattle, horses and dogs. No human blood feed was detected among the studied mosquito species. However, high rates of arboviral infection were detected within the household’s habitat. Likewise, increased circulation of Flavivirus and Alphavirus was detected during the rainy season, in contrast to Orthobunyavirus, which was detected mainly during the dry season. Based on the feeding preferences of studied mosquitoes, the results suggest that circulating arboviruses may be contained in the enzootic cycle. This study shows the identity of potential arbovirus vector species in the region and provides important information for the implementation of arbovirus monitoring programs in different habitats and seasons.

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PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN Los arbovirus (virus transmitidos por artrópodos) se mantienen en la naturaleza a través de un ciclo que involucra a un hospedero vertebrado en los que se replican (usualmente un ave o pequeño mamífero) y un artrópodo vector, como zancudos, garrapatas o moscas. Los zancudos hembra ingieren virus de la sangre de un animal infectado y transfieren a través de su saliva el virus al nuevo huésped. Los humanos usualmente son hospederos finales y no transmiten el virus a otros humanos. Sin embargo, estas infecciones pueden llevar a enfermedad clínica al contrario de lo que se observa en los reservorios naturales (Weaver y Barrett 2004). Existen más de 500 arbovirus conocidos, de éstos más de 150 afectan a los humanos pero únicamente alrededor de 26 son importantes como patógenos a éstos (CDC 2005; Frean y Blumberg 2005). La mayoría de infecciones por arbovirus son asintomáticas o con síntomas parecidos a la influenza. Sin embargo, algunos virus transmitidos por zancudos son patógenos humanos importantes que pueden causas enfermedad en el sistema nervioso, coma o muerte, siendo capaces de causar epidemias (Weaver y Barrett 2004). La incidencia real de estos arbovirus no se conoce, ya que en la mayoría de países tropicales no han sido estudiados, por lo que los casos rara vez son detectados y reportados. También se asocian principalmente a condiciones tropicales de pobreza (LaBeaud 2008). Dentro de los virus importantes a la salud humana, se encuentran varios pertenecientes a los géneros Flavivirus (familia Flaviviridae), Alphavirus (familia Togaviridae) y Orthobunyavirus (familia Bunyaviridae), que han sido causantes de brotes recientes en humanos y/o animales (Charrell et al. 2007; Komar and Clark 2006; LaBeaud 2008; Weaver y Barrett 2004). El brote del alfavirus Chikungunya (CHIKV) en India durante 2006-2007 afectó más de 2 millones de personas, principalmente de la población pobre en edad productiva (Kumar et al. 2007). En 2008 un brote epizoótico del flavivirus fiebre amarilla (YFV) en monos causó un brote en humanos con una tasa de letalidad del 27% (WHO 2008), registrándose ese año otro brote en Paraguay (WHO 2008). El alfavirus encefalitis equina venezolana (VEEV) fue causante de una epidemia/epizootia que empezó en 1969 en El Salvador y Guatemala y llegó a Texas en 1971 afectando miles de humanos y equinos. Luego de 19 años de inactividad, varios brotes de VEEV ocurrieron en Venezuela, Colombia y el sur de México durante 1992-1996 (Weaver et al. 2004; Weaver y Barret 2004). En Kenia, Tanzania y Somalia, durante los años 1997 y 1998 un brote de fiebre hemorrágica fue atribuido al ortobunyavirus Ngari (NRIV) con una tasa de ataque del 27% (Gerrard, Barret y Nichol 2004). En Norteamérica, se reportan de 80 a 100 casos al año de enfermedad neuroinvasiva por el bunyavirus Encefalitis de LaCrosse (CDC 2010). Estos datos demuestran la importancia de estudiar y detectar la circulación de estos virus reemergentes. En Guatemala, en los últimos 60 años, los virus aislados o de los que se ha encontrado evidencia serológica en humanos, vertebrados o zancudos incluyen los Flavivirus: dengue (DENV), virus de la fiebre amarilla (YFV), encefalitis de San Luis (SLEV), Jutiapa (JUTV) y WNV, los Alphavirus: VEEV, encefalitis equina del este (EEEV) y del oeste (WEEV), y los Orthobunyavirus: Marituba (MTBV, o cepa Nepuyo), Patois (PATV) y bunyavirus del grupo C. Existen reportes de enfermedad humana y animal en el país a

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causa de algunos de estos virus pero no hay certeza sobre su incidencia debido a la falta de sistemas de vigilancia y detección oportuna (Morales-Betoulle et al. 2009, datos no publicados; OPS 2008; Ubico y McLean 1995; Cupp et al. 1986, Karabastros 1985; Scherer et al. 1983, Scherer et al. 1976, Jorge y Bevier 1958; De Rodaniche y Galindo 1957a, 1957b). Los zancudos en los que se detectaron estos virus pertenecen a especies de los géneros Culex, Aedes, Coquillettidia, Haemagogus y Sabethes (Cupp et al. 1986, Scherer et al. 1976, De Rodaniche y Galindo 1957a, 1957b). Otros estudios reportan también a especies de los géneros Psorophora, Deinocerites, Mansonia y Uranotaenia, entre otros (CDC 2009). Sin embargo, se conoce poco acerca de la ecología de estos virus y de la biología de sus vectores. La introducción del virus del oeste del Nilo (WNV) en América del Norte en 1999 y su subsecuente dispersión a Latinoamérica (Komar y Clark 2006) evidenció la importancia de detectar y estudiar estos agentes infecciosos. En 2010 el equipo de CES-UVG, con el apoyo de la División de Enfermedades Transmitidas por Vectores (DVBID) de CDC Fort Collins, completó 6 años de estudios de la ecología de WNV y otros arbovirus en varios departamentos de Guatemala. Estos estudios encontraron evidencia de la transmisión de varios virus, incluyendo WNV, VEEV y ortobunyavirus del grupo C en equinos, bovinos, perros, humanos y zancudos (Morales-Betoulle et al. 2009, datos no publicados). Sin embargo, aunque se estableció la presencia de estos virus en la región, se desconoce su distribución por hábitat y época, razón por la cual es necesario estudiar a fondo su ecología y la biología de sus potenciales vectores, para iniciar sistemas de vigilancia y control El objetivo de este proyecto fue detectar, por métodos moleculares, ARN de los virus de los géneros Flavivirus, Orthobunyavirus y Alphavirus en zancudos que fueron colectados previamente por nuestro equipo en 2009-2010. Así como también identificar la fuente de la ingesta sanguínea de las especies de zancudos positivos para determinar sus patrones de alimentación. Esta información nos ayudará a comprender mejor la dinámica de transmisión de estos virus, como base para recomendaciones para su prevención y control y también para guiar estudios adicionales enfocados en la ecología de estos virus.

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I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

I.2.1 Antecedentes

Los arbovirus (virus transmitidos por artrópodos) se caracterizan en su mayoría por causar enfermedad en hospederos vertebrados (Kuno y Chang 2005). Entre éstos se encuentran los virus transmitidos por zancudos, como el virus dengue (DENV), virus del oeste del Nilo (WNV) y virus de encefalitis equina venezolana (VEEV), entre otros. En las últimas décadas se ha observado un incremento en la incidencia de éstos patógenos a nivel mundial (Weaver y Reisen 2010; Gubler 2010). Dicho aumento ha sido relacionado al constante cambio de los hábitats donde habitan los hospederos, la actividad humana, desastres naturales, el cambio climático, entre otros (Gould y Higgs 2009; Smith et al. 2004; Nasci y Moore 1998). Por esta razón los estudios ecológicos son de vital importancia para comprender mejor el comportamiento de los hospederos reservorios y la dinámica de transmisión de los virus (Dauphin et al. 2004; Ansari y Shope, 1996; Moore et al. 1993). En Guatemala, desde el año 2004, se reportó evidencia de transmisión de WNV y VEEV al encontrarse caballos sanos seropositivos a este virus en varios departamentos del país (Morales-Betoulle et al. 2006). En investigaciones posteriores, realizadas entre 2004 y 2007, se encontraron caballos, ganado, perros y aves residentes silvestres y domésticas seropositivas a WNV, así como equinos y bovinos seropositivos a VEEV (Morales-Betoulle et al. 2007; Morales-Betoulle et al. 2009, datos no publicados). En 2007 se inició un estudio de 3 años en un foco de transmisión (sitio con evidencia de transmisión activa) de WNV en Puerto Barrios, Izabal para conocer la ecología de este y otros Flavivirus. Como parte de estas investigaciones, se colectaron zancudos para identificar las especies potenciales vectores de virus. Se detectó la presencia de WNV en zancudos de la especie Cx. quinquefasciatus, Cx. mollis/Cx. inflictus y Cx. sp. (sin identificar) colectados durante ese año. En estudios adicionales del material colectado, se detectaron Alphavirus (sin identificar) y se tiene evidencia molecular preliminar de circulación de Orthobunyavirus del grupo C y de los serotipos California/Bunyawera (Cal/Bwa) en zancudos Cx. (Melanoconion) taeniopus (de León 2010; Morales-Betoulle et al. 2009, datos no publicados) (sinónimo de Cx. opistophus [Sirivanakarn y Belkin, 1980]). Algunos de estos virus podrían estar asociados a enfermedades febriles humanas, sin embargo han sido poco estudiados. En un estudio realizado en Puerto Barrios durante 2009 y 2010, solamente alrededor del 20% de los casos febriles humanos fueron confirmados como dengue por pruebas serológicas o moleculares en muestras agudas, quedando aproximadamente la mitad de los casos con el agente etiológico sin identificar (Lindblade et al. 2010, estudio en marcha). Aunque está pendiente el análisis de las muestras para Alphavirus y Orthobunyavirus, esto podría sugerir a otros arbovirus como los agentes etiológicos para estas enfermedades febriles. Actualmente, el estudio de las preferencias de alimentación sanguínea de artrópodos hematófagos es una práctica comúnmente utilizada para estudiar el papel de las distintas especies de vectores en el ciclo de transmisión de agentes patógenos a hospederos vertebrados (Mota et al. 2007; Kent y Norris 2005; Ngo y Kramer 2003; Lee et al. 2002; Boakye et al. 1999). En el caso de los zancudos, estos presentan un comportamiento de alimentación complejo que involucra diversos factores, tanto del comportamiento y biología del zancudo, así como de sus hospederos (Carver et al. 2009; Kuno y Chang 2005). Los zancudos con una preferencia de alimentación oportunista, es decir a partir de distintas especies de hospederos, son de gran importancia en los ciclos de transmisión de los arbovirus. Estos estudios pueden proveer

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información importante acerca del comportamiento de los vectores y el rango de hospederos potencialmente en riesgo de transmisión viral (Molaei et al. 2007; Marquardt et al. 2000; Mukabana et al. 2000; Niebylski y Meek 1992). En el marco del estudio de vigilancia ecológica de WNV en Puerto Barrios, Izabal, Guatemala, se han realizado estudios preliminares del comportamiento alimenticio de hembras de zancudos, principalmente de las especies Cx. nigripalpus, Cx. quinquefasciatus y Cx. taeniopus colectados durante 2007-2009 en el Foco de Transmisión (Kading et al. 2013, Kent et al. 2010; Ramírez 2010; González 2008). En estos estudios se ha observado que dichas especies pueden alimentarse de diversos hospederos incluyendo humanos, otros mamíferos y aves domésticas. Actualmente, no se ha estudiado a fondo los patrones de alimentación de otras especies potenciales vectores con altas densidades en la región. Tampoco se ha estudiado la ecología de los arbovirus por hábitat y época climática, aunque observaciones preliminares y estudios en otras regiones sugieren que los virus y sus vectores no se distribuyen de forma homogénea.

I.2.2 Justificación del trabajo de investigación En Guatemala los casos de fiebres suelen ser diagnosticados como dengue clínico. Sin embargo, en 2010, de los 371 casos de dengue reportados, únicamente 13 (3.5%) fueron confirmados por pruebas de laboratorio (CNE 2011). De acuerdo a los resultados preliminares de un estudio de casos febriles humanos en Puerto Barrios durante 2009 y 2010 (K. Lindblade et al. 2010, no publicado), alrededor del 80% de los casos no fueron confirmados como dengue por medio de pruebas serológicas o moleculares. Estos resultados sugieren que otros arbovirus podrían estar asociados a estas enfermedades febriles en la región, y que, con base a la pirámide de carga de enfermedad, sí existen enfermedades febriles relativamente leves deben existir casos severos no identificados. Por otro lado, en diversas ocasiones, en conjunto con las autoridades del Ministerio de Agricultura, Ganadería y Alimentación (MAGA) se han investigado casos de enfermedad con signos de encefalitis en equinos sin llegar a un resultado definitivo con las herramientas de diagnóstico disponibles en el país (datos no publicados). Esto evidencia la importancia de implementar otras pruebas de diagnóstico para la detección de otros agentes infecciosos potencialmente implicados y de potencial epidémico. En estudios previos en Puerto Barrios, Izabal, se tiene evidencia de la circulación de diferentes arbovirus, tanto en zancudos, como en otros hospederos vertebrados. Entre éstos WNV, VEEV y Orthobunyavirus (de León 2010; Morales-Betoulle et al. 2009, datos no publicados; Morales-Betoulle et al. 2007; Morales-Betoulle et al. 2006). La infección por estos virus usualmente muestra síntomas clínicos similares a los del dengue. Los resultados preliminares obtenidos con Cx. taeniopus para Alphavirus y Orthobunyavirus sugieren que el estudio de virus de estos géneros debe ampliarse e incluir otras especies de zancudos, lo cual, junto con información adicional para Flavivirus sería de importancia para la comprensión de sus ciclos de trasmisión en la región. Se ha observado que el comportamiento de los arbovirus varía entre las distintas regiones del mundo, y únicamente los estudios ecológicos locales podrán proveer datos reales que permitan evaluar el comportamiento de estos patógenos en el país. En las investigaciones anteriores del grupo de CES-UVG en conjunto con DBVID CDC, los estudios arbovirales se enfocaron principalmente en WNV en ámbitos peridomésticos de

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Puerto Barrios. No obstante, las observaciones preliminares y estudios en otras regiones sugieren que los virus y sus vectores no se distribuyen de forma homogénea. En esta propuesta de investigación se planteó estudiar arbovirus de tres géneros diferentes y las distintas especies de zancudos potenciales vectores de éstos en varios hábitats y las dos estaciones climáticas de Puerto Barrios. El trabajo de campo fue realizado con fondos de contrapartida de CDC, por lo que en este estudio únicamente se cubrió la identificación de zancudos y las pruebas moleculares. Como parte de esto se implementaron pruebas moleculares para la detección de material genético del género Alphavirus. Esto complementó la capacidad diagnóstica de arbovirus en el Centro de Estudios en Salud de la Universidad del Valle de Guatemala. Dicha capacidad comprendía pruebas de diagnóstico molecular por PCR convencional (PCR) y PCR en tiempo real (rRT-PCR) de WNV, el género Flavivirus, y el género Orthobunyavirus, así como para la identificación de la ingesta sanguínea en zancudos. La implementación de las pruebas moleculares para Alphavirus es importante debido a que en éste género se encuentran virus con potencial importancia a la salud pública como VEEV, EEEV y WEEV, entre otros. De éstos virus, EEV y WEEV no han sido estudiados aunque se ha encontrado evidencia serológica (Ubico y McLean 1995). Por otro lado, VEEV, aunque en la epidemia de 1969 en Guatemala demostró ser un virus de interés regional (Weaver et al. 2004; Scherer et al. 1972), no es vigilado actualmente en el país y tiene el potencial de ser un virus reemergente, como lo demuestran los recientes brotes en el sur de México y Sudamérica (Vilcarromero et al. 2010; Weaver et al. 2004; Estrada-Franco et al. 2004). Con la capacidad diagnóstica establecida en el país, se contará con herramientas que posteriormente podrán ser utilizadas para dar un diagnostico diferencial de enfermedades febriles no determinadas. Para implicar a una especie como vector de un determinado arbovirus se debe de tomar en cuenta su densidades poblacional, demostrar la presencia del virus en él, debe de ser capaz de transmitir el virus y se debe de alimentar del hospedero amplificador en la naturaleza (preferencias de alimentación). Con el fin de identificar las especies de zancudos potencialmente involucradas en la transmisión de los virus estudiados, el estudio de las mismas se realizó en diferentes hábitats y épocas seca y lluviosa. Esto último se debe a que se ha observado que la distribución temporal y espacial de las especies de zancudos no es homogénea. Con este estudio se pretende complementar la información obtenida en los estudios previos que han buscado establecer el papel de las diferentes especies de zancudos en el ciclo de transmisión de los arbovirus estudiados. Así mismo ayudará a fortalecer la capacidad de identificar por medio de pruebas moleculares los diferentes arbovirus que circulan en el área en los diferentes hábitats y estaciones del año. Los datos de los análisis de ingesta sanguínea combinados con las tasas de infección de zancudos podrán utilizarse para determinar cuáles son las especies potenciales de vectores, hospederos vertebrados, y las épocas de transmisión.

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I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 Objetivo general

Determinar y evaluar la dinámica de transmisión de Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus en diferentes hábitats de Puerto Barrios, Izabal, Guatemala, para recomendar acciones para su vigilancia y control.

I.3.1.2 Objetivos específicos

1. Determinar y evaluar la dinámica de transmisión de Flavivirus, Alphavirus y

Orthobunyavirus en diferentes hábitats de Puerto Barrios, Izabal, Guatemala, para recomendar acciones para su vigilancia y control.

2. Evaluar la presencia de arbovirus en diferentes hábitats y estaciones climáticas de

Puerto Barrios, Izabal a través de pruebas moleculares para Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus.

3. Identificar y evaluar los vectores potenciales de arbovirus en los diferentes hábitats y

estaciones del año en Puerto Barrios, Izabal.

4. Identificar y evaluar la fuente de ingesta sanguínea de las especies de zancudos positivos para Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus.

5. Divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el campo de su

competencia la información obtenida de la investigación.

I.3.2 Hipótesis

1. La presencia de Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus en zancudos de distintas

especies varía en los diferentes hábitats y estaciones. 2. La identidad de las especies de zancudos es diferente entre hábitats y estaciones del

año. 3. Las especies de zancudos positivos para Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus, se

alimentan de diversas especies de hospederos vertebrados.

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I.4 METODOLOGIA

I.4.1 Las variables I.4.1.1 Variables dependientes

Resultado de las pruebas moleculares de laboratorio para detectar la presencia de Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus. Esta variable es de tipo categórico y puede asumir las categorías de positivo o negativo. Resultado de las pruebas moleculares de laboratorio para identificar la fuente de ingesta sanguínea. Esta variable es de tipo categórico y puede asumir las categorías de positivo o negativo.

I.4.1.2 Variables independientes

Densidad de zancudos capturados en el sitios de estudio.

I.4.2 Indicadores

Para las muestras positivas a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus el indicador es la presencia de una banda visualizada en un gel de agarosa de alrededor de 250pb, 467pb y 251pb respectivamente y adicinalmente en el caso de las muestras positivas a Alphavirus tienen un Tm cercano al del control positivo.

Para identificar la fuente de ingesta sanguínea el indicador es la presencia de

una banda visualizada en un gel de agarosa de alrededor de 334pb, 680pb, 132pb, 453pb, 561pb, 94pb, 118pb y 176pb para humano, perro, cabra, cerdo, vaca, gallina, ratón y caballo respectivamente.

I.4.3 Estrategia Metodológica

I.4.3.1 Población y Muestra

El sitio de estudio se encuentra en el municipio de Puerto Barrios (15º50’N; 88º28’W), departamento de Izabal, en la costa Caribe de Guatemala. La población de Izabal supera los 400 mil habitantes, donde la mitad de pobladores (52%) viven en la pobreza y cerca de un quinto (18%) en la pobreza extrema. De sus habitantes, 60% pertenecen al área urbana y 40% al área rural (INE 2002; INE 2006). El área corresponde a una zona de vida de bosque húmedo subtropical, con un régimen caliente y húmedo. La temperatura y

precipitación medias anuales son de 27C y 3,500mm respectivamente. Aunque no hay una época seca bien definida, febrero a abril son los meses más secos (IGN 1972; INSIVUMEH 2009).

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I.4.4 El Método

I.4.4.1 Diseño del estudio Para este estudio se realizaron colectas de zancudos en seis diferentes hábitats rurales y urbanos representativos de Puerto Barrios. Estas fueron (1) intradomicilares, (2) peridomiciliares, en (3) bosques secundarios, (4) pastizales con sombra, (5) pastizales al sol y (6) dormideros urbanos de Quiscalus mexicanus (zanate o clarinero). El dormidero de Q. mexicanus se estudió debido a que en estudios previos de nuestro grupo, ésta fue una de las especies muestreadas más seropositivas a WNV, lo que sugiere que pueda ser un reservorio natural de WNV en Puerto Barrios (Morales-Betoulle et al. 2013). Para cada hábitat estudiado se establecieron 2 sitios de muestreo diferentes para un total de 12 unidades muestreales. Cada sitio fue muestreado durante dos fechas continuas. En el caso de las colectas intra- y peridomiciliar una de las réplicas se estableció en una casa del área rural y la otra en el área urbana. Se realizó un muestreo para cada época climática (seca y lluviosa): un viaje de campo durante el 12-15 julio 2009 y otro durante el 12-15 de enero 2010, en donde se muestrearon igual número de sitios. Algunas localidades debieron cambiarse en enero por falta de acceso o, en el caso de dormideros de Q. mexicanus, movilización de las poblaciones (Cuadro 1; Figura 1). Los meses de julio y enero, de acuerdo a su temperatura y precipitación, corresponden a la época lluviosa y seca respectivamente (INSIVUMEH 2009). Todos los sitios de muestreo se encuentran dentro de un área aproximada de 80 km2 que comprende la ciudad de Puerto Barrios, Santo Tomás de Castilla y la aldea rural Machacas del Mar. En esta misma área en la que nuestro grupo ha estudiado la ecología de WNV y otros arbovirus desde 2006. Los sitios fueron seleccionados a conveniencia de acuerdo a sus características cualitativas. Cuadro 1. Localización y altitud de sitios de muestreo de zancudos en Puerto Barrios, Izabal, 2009-2010 Unidad A. Julio 2009 B. Enero 2010

Hábitat muestreal Coordenadas Altitud (mSNM) Coordenadas Altitud (mSNM)

Casa Rural

1 N15°45’37.8’’ W88°32’14.5’’

33 Idem A

Urbana 2 N15°43’50.0’’ W88°35’34.6’’

11 Idem A

Bosque secundario 1 N15°44’15.7’’ W88°35’4.00’’

3 Idem A

2 N15°44’16.2.’’ W88°34’58.6’’

4 Idem A

Pastizal con sombra 1 N15°43’15.5’’ W88°34’27.4’’

22 N15°43’48.6” W88°34’15.8”

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2 N15°43’24.3’’ W88°33’38.1’’

22 Idem A Idem A

Pastizal al sol 1 N15°45’45.8’’ W88°32’8.3’’

19 N15°45’47.2” W88°32’13.0”

11

2 N15°45’49.3’’ W88°32’01.2’’

23 N15°45’52.8” W88°32’16.0”

12

Dormidero 1 N15°43’32.7” W88°35’48.6”

7 Idem A Idem A

2 N15°41’49.3’’ W88°35’10.5’’

17 N15°41’33.7” W88°37’02.2”

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Fuente: Acuerdo Cooperativo de Investigación CDC/CES-UVG 2009-2010. Precisión altitud: 4.2-8.5m

11

Figura 1. Sitios de muestreo de zancudos en diferentes hábitats de Puerto Barrios, Izabal, 2009-

2010

Fuente: Modificado de Google 2010. BS= Bosque secundario, CR= Casa rural, CU= Casa urbana, D=

Dormidero, P= Pastizal al sol, PS= Pastizal con sombra, 1 o 2= Repetición de mismo hábitat, A= Julio 2009, B= Enero 2010

1km

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I.4.4.2 Métodos de colecta de zancudos En cada uno de los sitios de muestreo se utilizaron cuatro métodos de colecta previamente utilizados en estos estudios (Morales-Betoulle et al 2013, Kent et al 2010): (1) una trampa CDC con cebo de CO2 (hielo seco) dirigida hacia hembras en busca de hospederos (McNelly 1989; Sudia y Chamberlain 1962), (2) una trampa grávida con cebo de agua y estiércol dirigida hacia hembras grávidas (i.e. con huevos) en búsqueda de sitios de oviposición (Reiter 1983), (3) una trampa de reposo dirigida hacia hembras alimentadas (Komar et al. 1995), y (4) un aspirador de mochila, modelo 1412, dirigido hacia zancudos en refugios o vegetación (John W. Hock, Gainesville, FL). Las trampas fueron colocadas antes del anochecer y recolectadas al amanecer, el aspirador se utilizó por 10 min en los alrededores de los sitios de muestreo cuando se recogieron las trampas. Los diferentes métodos de colecta son complementarios, pues registran grupos diferentes de zancudos debido a diferencias en hábitos de alimentación y comportamiento entre las especies (Kent et al. 2010;). También puede ser que haya variación interespecífica en el grado de atracción o susceptibilidad a quedar atrapado. En las colectas nocturnas no estarán bien representadas las especies con actividad diurna. Además, como las colectas se realizaron a nivel del suelo, las especies del dosel no estarán adecuadamente representadas (McNelly 1989).

I.4.4.3 Identificación y clasificación de zancudos El procesamiento de zancudos se realizó como ha sido reportado anteriormente (Morales-Betoulle et al. 2008, Kent et al 2010). Los zancudos recolectados se introdujeron en hieleras con hielo seco para matarlos. Luego se colocaron en viales plásticos debidamente rotulados con el lugar, fecha y tipo de trampa. Se colocaron únicamente 50 insectos por vial para evitar que perdieran partes corporales que son importantes para su posterior identificación y pruebas moleculares. Las muestras fueron transportadas en hielo seco al laboratorio de CES-UVG en donde se encuentran almacenados a -70ºC hasta que fueron procesadas para conservar la integridad del ADN de la ingesta sanguínea y el ARN viral. Los zancudos hembra adultos se clasificaron morfológicamente hasta especie. Esto se realizó con la ayuda de un estereoscopio y utilizando planchas frías para no romper la cadena de frío y dañar el ARN viral. La identificación se realizó con la ayuda de la clave dicotómica para zancudos en Guatemala de Clark-Gil y Darsie (1983) y con la clave de Darsie y Ward (2005) para los zancudos de América del Norte. Los individuos se clasificaron en grupos o “lotes” de hasta 50 individuos por especie, fecha, sitio de muestreo y de acuerdo a si se encuentran alimentados o no.

I.4.4.4 Detección de material genético viral en zancudos

De los zancudos identificados, se priorizó el análisis molecular de los pertenecientes a las especies abundantes y previamente reportadas como vectores de los virus estudiados en otras regiones. El análisis molecular se esquematiza en la Figura 2. La identificación viral se realizó hasta nivel de género (Flavivirus, Alphavirus, Orthobunyavirus), con la excepción de los flavivirus, en donde también se identificó específicamente el virus del oeste del Nilo (WNV).

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Los lotes de zancudos o zancudos individuales (dependiendo si se encontraban alimentados o no) se maceraron en medio BA-1 (Morales-Betoulle et al, 2008) que permite el cultivo en células para realizar aislados virales. Posteriormente se realizó la extracción de los ácidos nucleicos utilizando el kit de extracción “QIAamp viral RNA Mini Kit” (Qiagen, Valencia, California), de acuerdo a las especificaciones del fabricante. Las muestras fueron almacenadas a -70ºC hasta la realización de los distintos ensayos. Para asegurar que la extracción de ARN haya sido exitosa se amplificó el gen18S del ARN ribosomal de zancudo (Diptera: Culicidae) de un grupo seleccionado de muestras (Hoffman et al. 2004). Este análisis se utiliza como un control de extracción de ARN. Para ello se utilizó el kit QuantiTect SYBR Green RT-PCR (Qiagen) en un volumen final de 20µL utilizando los cebadores 18S417 y 18S920c de acuerdo al protocolo de Hoffmann et al. 2004. El programa de amplificación utilizado es el siguiente: un ciclo de 1 h a 45°C y 3 min a 94°C seguido por 45 ciclos de 30 s a 94°C, 1 min a 60°C y 3 min a 68°C y por ultimo un ciclo de 7 min a 72°C. Los productos de PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 2%, únicamene los que presentaron una banda en 504pb fueron cosiderados postivos. Figura 2. Esquematización del procedimiento para el análisis de la presencia de ARN viral y el

análisis de la ingesta sanguínea en zancudos

Fuente: CES-UVG 2011

I.4.4.4.1 Flavivirus y virus del Oeste del Nilo

La detección de Flavivirus se realizó por medio del ensayo de Transcripción inversa y Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) utilizando el kit comercial “Syber-green Quantitect” (Qiagen) validado previamente en nuestro laboratorio (Morales-Betoulle et al. 2008, Gonzalez-Reiche et al. 2010). La prueba utiliza cebadores (primers) consenso diseñados para detectar un segmento de la región del gen no estructural (NS) 5 del genoma de Flavivirus, FU1 (5’-TACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAA-3’) y cFD2 (5’-

GTGTCCCAGCCGGCGGTGTCATCAGC-3’) que amplifican un producto de 250pb (Kuno et al. 1998).

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Brevemente, el ensayo se realiza en un sólo paso y consiste en una fase de reacción de transcripción inversa en la que se sintetiza ADNc a partir de la plantilla de ARN, seguido por la reacción de PCR para la amplificación de esta región del genoma viral que es visualizada por luz UV luego de electroforesis en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. El RT-PCR se lleva a cabo utilizando 2µL de ARN en una mezcla de reacción total de 20µL. El programa de amplificación consiste en una primera etapa de transcripción inversa 30min a 50ºC, seguido por una desnaturalización inicial a 95ºC por 15 min. La tercera etapa comprende 45 ciclos que incluyen una desnaturalización a 94ºC por 15 s, una etapa de hibridización (annealing) por 30 s a 55ºC y una extensión de 30 s a 72ºC. El último paso es una extensión final de 5 min a 72ºC. Como control positivo se utilizó ARN de WNV a una dilución 1:500, y como control negativo agua libre de ARNasas. El producto del RT-PCR fue visualizado en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Todas las muestras fueron consideradas positivas si presentaban una banda de 250pb. La detección de virus del oeste del Nilo (WNV) se realizó con RT-PCR en tiempo real utilizando sondas específicas. Se utilizó el kit comercial “Quanti Tect RT mix” (Qiagen). La prueba utiliza cebadores oligonucleótidos y una sonda fluorescente específicos para WNV, diseñados para detectar un segmento de la región no codificante 3’ del genoma de la cepa NY99 (Lanciotti et al. 2000).

El ensayo consiste en un paso de reacción de transcripción inversa en la que se sintetiza ADNc a partir de la plantilla de ARN, seguido por la reacción de PCR que se basa en la actividad enzimática 5’ exonucleasa de la polimerasa y el uso de una sonda fluorescente de ADN (TaqMan) para la detección de la amplificación del genoma viral en tiempo real a través de una señal de fluorescencia. El RT-PCR se lleva a cabo utilizando 5µL de ARN en una mezcla de reacción total de 15µL y utilizando los cebadores WN3’NC-forward (5’-CAGACCACGCTACGGCG-3’) WN3’NC-reverse (5’-CTAGGGCCGCGTGGG-3’) WN3’NC* ([FAM]- (5’-TCTGCGGAGTGCAGTTCTGCGAT-[BHQ-1-3’]) (Lanciotti et al. 2000). El programa de amplificación consiste en una primera etapa de transcripción inversa 30 min a 50ºC, seguido por una desnaturalización inicial a 95ºC por 15 min. La tercera etapa comprende 45 ciclos que incluye una desnaturalización a 95ºC por 15 s y una etapa de hibridación de hebras y extensión por 1 min a 60ºC. Como control positivo se utilizó ARN de WNV a una dilución 1:500, y como controles negativos agua libre de ARNasas y un control sin plantilla de ARN (NTC).

I.4.4.4.2 Orthobunyavirus Para la detección de Orthobunyavirus, se implementó una prueba de RT-PCR descrita por Kuno et al. 1996 que utiliza cebadores específicos para detectar miembros de los serotipos Bunyamwera y California, así como del grupo Bwamba (Kuno et al. 1996). Para la implementación de esta prueba, se variaron diversas condiciones de reacción hasta amplificar el fragmento deseado de 251pb. El RT-PCR se lleva a cabo utilizando el kit comercial “Syber-green Quantitect” (Qiagen) los cebadores BCS82C (5’-ATGACTGAGTTGGAGTTTCATGATGTCGC-3’) y BCS332V (5’-TGTTCCTGTTGCCAGGAAAAT-3’) con 2µL de ARN en una mezcla de reacción total de 20µL. El programa de amplificación estandarizado consiste en una primera etapa de transcripción inversa 30 min a 50ºC, seguido por una desnaturalización inicial a 95ºC por 15 min. La tercera etapa comprende 45 ciclos que incluyen una desnaturalización a 94ºC por 15 s, una etapa de hibridización (annealing) por 30 s a 55ºC y una extensión de 30 s a 72ºC. El último paso es una extensión final de 5min a 72ºC. Como control positivo se utilizó lisado del virus INKV en

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dilución 1:100, y como control negativo agua libre de ARNasas. El producto del RT-PCR fue visualizado en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Todas las muestras fueron consideradas positivas si presentaban una banda de 251pb.

I.4.4.4.3 Alphavirus

Para la detección de Alphavirus se implementó un RT-PCR en tiempo real utilizando cebadores degenerados confidenciales provistos por el Dr. R. Lanciotti del Centro para Control y Prevención de Enfermedades, Estados Unidos (R. Lanciotti 2010, comunicación personal). Estos cebadores amplifican regiones conservadas del genoma viral por medio de un RT-PCR en tiempo real usando SYBR Green como fluoróforo. Para la implementación de esta prueba, se variaron diversas condiciones de reacción hasta amplificar el fragmento deseado de 467pb. El RT-PCR en tiempo real se lleva a cabo utilizando el kit comercial “Syber-green Quantitect” (Qiagen) con 2µL de ARN en una mezcla de reacción total de 25µL. El programa de amplificación estandarizado consiste en una primera etapa de transcripción inversa 30 min a 50ºC, seguido por una desnaturalización inicial a 95ºC por 15 min. La tercera etapa comprende 45 ciclos que incluyen una desnaturalización a 94ºC por 15 s, una etapa de hibridización (annealing) por 30 s a 60ºC y una extensión de 30 s a 72ºC. La última etapa consiste en el análisis de “Curva de disociación” o “Melt Curve” de acuerdo a las especificicaciones del termociclador Applied Biosystem 7500. Como control positivo se utilizó ARN transcrito en dilución 1:1000, cual fue obtenido a partir de un plásmido que contenía el fragmento del virus O'Nyong-nyong (Gulu strain) y como control negativo agua libre de ARNasas. Una de las principales desventajas al usar SYBR Green como fluoróforo es la obtención de señales no específicas debido al efecto de “Primer-dimer”. Por ello, el análisis de positividad se realizó de acuerdo a las curvas de disociación determinando la temperatura de disociación (o Tm por sus siglas en inglés) y visualizando los porductos de la reacción en un gel de agarosa al 2%. Todas las muestras fueron consideradas positivas si presentaban un Tm cercano al del control positivo demás de una banda de 467pb. Aquellas muestras que sólo cumplieran uno de estos dos criterios, se consideraron sospechosas.

I.4.4.5 Identificación de la ingesta sanguínea en zancudos Cada zancudo alimentado fue procesado en forma individual como se indica en la Figura 3. Para esto se utilizaron metodologías previamente validadas en nuestro laboratorio (Kent et al. 2010, Kading et al. 2013). En una cabina de bioseguridad 2 se removió el abdomen de cada individuo conteniendo la ingesta sanguínea y se extrajo el ADN utilizando el kit comercial “QIAamp DNA Mini Kit”. A todas las muestras extraídas se les realizó un PCR para amplificar el fragmento de la subunidad 4 del NADH deshidrogenasa, codificada por el genoma mitocondrial del zancudo. Debido al alto número de copias del genoma mitocondrial por célula, este es un PCR muy robusto, en este caso se utiliza para verificar la calidad de las extracciones de ADN. Para ello se realizó una rección con 1uL de templado en un volumen final de 20µL de la mezcla de reacción que contenía los cebadores ND4for (5’-GTDYATTTATGATTRCCTAA-3’) y ND4rev (5’-CTTCGDCTTCCWADWCGTTC-3’) (Gorrochotegui-Escalante et. al 2000, 2002) El programa de amplificación utilizado es el siguiente: 10 ciclos de 3 min a 95°C, 30s a 92°C, 60 s a 48°C y 40 s a 72°C seguido de 42 ciclos de 30 s a 92°C, 35 s a 52°C y 40 s a 72°C seguido de un ciclo de 5 min a 72°C. El producto del PCR fue visualizado en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Todas las muestras fueron consideradas positivas si presentaban una banda de 400pb. Aquellas muestras positivas para este PCR fueron

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analizadas para identificar la fuente de ingesta sanguínea, de lo contrario se repitó la extracción de ADN. Las muestras positivas para este PCR fueron analizadas para detección de hospederos vertebrados y posteriormenete para identificar la fuente sanguíea proveniente de aves o mamíferos como se detalla en las secciones siguientes. Para detectar la presencia de arbovirus en los zancudos analizados, los tórax, cabezas y patas de los zancudos disectados se reunieron en lotes según especie, fecha, sitio de colecta y tipo de trampa. Estos lotes fueron analizados con las pruebas descritas anteriormente para detectar el genoma viral de Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus.

Figura 3. Procedimiento realizado para la determinación del hospedero fuente de la ingesta

sanguínea en los zancudos colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal.

* PCR interno: PCR para amplificar el gen mitocondrial ND4 del zancudo, con el fin de verificar si se extrajo ADN y si éste era amplificable; ** PCR vertebrado: PCR para amplificar el gen del citocromo b de vertebrado a modo de verificar que los zancudos analizados contenían ingesta sanguínea proveniente de un hospedero vertebrado; ****No identificados: hospederos vertebrados no identificados posiblemente anfibios, y/o reptiles *****diferente a los analizados Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

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I.4.4.5.1 Vertebrados

Para la detección de hospederos vertebrados se utilizó el protocolo publicado por Meece et al. 2005, en cual se amplifica una región interna del gen citocromo b de vertebrados. Ya que el numero de copias por celula del genoma mitocondrial es alto, este es un PCR robusto y se utiliza como un tamizaje inicial para descartar las muestras en donde la extracción de vertebrado no haya sido eficiente. Para ello se realizó una mezcla conteniendo 2µLde ADN extraído de abdómenes de zancudos alimentados en una mezcla de reacción con los cebadores BM1 (5’-CCC CTC AGA ATG ATA TTT GTC CTCA-3’) y BM2: (5’-CCA TCC AAC ATC TCA GCA TGA TGA AA-3’) El programa de amplificación que utilizado es el siguiente: un ciclo de 5 min a 95°C seguido de 35 ciclos de 30 s a 95°C, 50 s a 50°C y 40 s a 72°C seguido de un ciclo de 4 min a 72°C. El producto del PCR fue visualizado en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Todas las muestras fueron consideradas positivas si presentaban una banda de 358pb.

I.4.4.5.2 Aves y mamíferos

Para la identificación de hospederos aviares y mamíferos se utilizaron dos pares de cebadores descritos por Ngo y Kramer 2003. Un par de estos cebadores Mammal_forward (5’-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3’) y Mammal_reverse (5’-TGTAGTTRTCWGGGTCHCCTA-3’) amplifican un único producto de 600pb en las muestras de hospederos mamíferos. Mientras que el otro par de cebadores: Avian_forward (5’-GACTGTGACAAAATCCCNTTCCA-3’) y Avian_reverse (5’-GGTCTTCATCTYHGGYTTACAAGAC-3’) amplifican dos productos en las muestras de hospderos aviares, uno de ~290pb y otro de 600pb (Ngo y Kramer 2003). Adicionalmente, se usó un tercer par de cebadores descritos por Cicero y Johnson 2001. Estos cebadores Avian_forward (5’-GACTGTGACAAAATCCCNTTCCA-3’) y Avian_reverse (5’-GGTCTTCATCTYHGGYTTACAAGAC-3’) amplifican un producto de 508 pb tanto para los templados de origen aviar como mamífero (Cicero and Johnson 2001). Los templados de origen aviar se pueden diferenciar de los de origen mamífero al comparar los productos para ambos sets de cebadores.Cada reacción se corrió por separado en un volumen final de 25uL con los cebadores descritos anteriormente y 2uL de templado. El programa de amplificación utilizado es el siguiente: un ciclo de 5 min a 95°C seguido de 35 ciclos de 30 s a 94°C, 30 s a 55°C y 90 s a 72°C seguido de un ciclo de 4 min a 72°C. El producto del PCR fue visualizado en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Las muestras fueron consideradas positivas para mamífero si presentaban una banda de 600pb al utilizar los primers descritos por Ngo y Kramer 2003 y una banda de 580pb al utilizar los primers de Cicero y Johnson 2001. Por el contrario, las muestras fueron consideradas positivas para mamífero si presentaban dos bandas de 600pb y ~290pb al utilizar los primers descritos por Ngo y Kramer 2003 y una banda de 580pb al utilizar los primers de Cicero y Johnson 2001.

I.4.4.5.3 Identificacion de hospederos específicos

Para identificar el hospdero específico, a todas aquellas muestras positivas para mamífero se les corrió un PCR para detectar humano (Homo sapiens), perro (Canis familiaris), cabra (Capra hircus), cerdo (Sus scrofa), vaca (Bos taurus), ratón (Mus musculus) y caballo (especies del género Equus).

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Para la indentificación de hospederos se empezó realizando un PCR multiplex descrito por Kent et al. 2005 en el cual se realiza una reacción con volumen final de 25uL con los cebadores Pig573F (5’-CCTCGCAGCCGTACATCTC-3’), Human741F (5’-GGCTTACTTCTCTTCATTCTCTCCT-3’), Goat894F (5’-CCTAATCTTAGTACTTGTACCCTTCCTC-3’), Dog368F (5’-GGAATTGTACTATTATTCGCAACCAT-3’), Cow121F (5’-CATCGGCACAAATTTAGTCG-3’), UNREV1025 (5’-GGTTGTCCTCCAATTCATGTTA-3’), UNFOR403 (5’-

TGAGGACAAATATCATTCTGAGG-3’), Cow371R (5’-GAGCTAGAATTAGTAAGAGGGCC-3’) utilizando 2uL de templado. El programa de amplificación utilizado es el siguiente: un ciclo de 5 min a 95°C seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 57°C y 1 min a 72°C seguido de un ciclo de 7 min a 72°C. El producto del PCR fue visualizado en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Las muestras fueron consideradas positivas para para humano, perro, cabra, cerdo y/o vaca si presentaban una banda de alrededor de 334pb, 680pb, 132pb, 453pb, 561pb y 176pb respectivamente.

Para este proyecto se implementó el PCR para la detección tanto de ratón (Mus musculus) como de caballo (especies del género Equus) variando las condiciones de reacción hasta amplificar los fragmentos del tamaño deseado. Para identificar ingesta sanguínea tanto de ratón como caballo se utlizaron dos pares de cebadores específicos descritos por Pizarro y Stevens 2008: raton_f (5’-AGATGGCTCAGTGGGTAAAGG-3’), raton_r (5’-

GTGGAGGTCAGAGGACAAACTT-3’), caballo_f (5’-CCAAAGCCCCCCAGTACATAG-3’) y caballo_r (5’-

GTGGCCAAGTGGTTAAGTTCG-3’) para ratón y caballo respectivamente (Pizarro y Stevens 2008). Cada reacción se corrió por separado en un volumen final de 20uL con buffer de reacción 1X, dNTPs 6.25uM, cebadores (descritos anteriormente) 1.25uMc/u, 1U de Go-taq Promega (Madison, WI) y 2uL de templado. El programa de amplificación utilizado es el siguiente: un ciclo de 5min a 95°C seguido de 35 ciclos de 30 s a 95°C, 30 s a 60°C y 30 s a 72°C seguido de un ciclo de 5min a 72°C. El producto del PCR fue visualizado en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Las muestras fueron consideradas positivas para ratón y/o caballo si presentaban una banda de 118pb y 176pb respectivamente.

Por otro lado, para identificar el hospdero específico, a todas aquellas muestras positivas para ave se les corrió un PCR para detectar ingesta sanguínea de gallina (Gallus gallus domesticus) de acuerdo con el protocolo descrito por Kent et al. 2005 en el cual se realiza una reacción con volumen final de 25uL con los cebadores Chick1123R (5’-

GAAGAGGATAAGTAGGATGGTGAAG-3’), UNFOR1029 (5’-TAACCTGAATCGGAAGCCAACC-3’) y 2uL de templado. El programa de amplificación utilizado es el siguiente: un ciclo de 5 min a 95°C seguido de 30 ciclos de 1 min a 95°C, 1 min a 58°C y 1 min a 72°C seguido de un ciclo de 7min a 72°C. El producto del PCR fue visualizado en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Las muestras fueron consideradas positivas para gallina si presentaban una banda de alrededor de 94pb.

I.4.4.6 Secuenciación de productos de PCR

Debido que los productos de PCR para detectar flavivirus eran ligeramente menores

al producto esperado, algunos productos fueron secuenciados para confirmar su identidad. Para ello, los productos de PCR fueron purificados con el kit QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, California), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los productos purificados fueron enviados a Macrogen, USA para secuenciación directa. Las secuencias consenso fueron obtenidas utilizando el programa SeqMan del paquete Lasergene DNAstar Madison, WI; http://www.dnastar.com/t-products-seqman-ngen.aspx) y

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se alinearon utilizando el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para determinar la identidad de los productos secuenciados.

I.4.4.7 Recopilación de datos y análisis de resultados

Los datos recopilados durante la investigación fueron ingresados con bases de datos utilizando los programas ACCESS y Excel. Se verificó la consistencia de los datos ingresados y se realizaron copias de las bases. Los datos fueron analizados con el programa R versión 3.0.2 (R Core Team 2014) y Excel.

Este estudio es de tipo descriptivo. Se describió el número de especies por hábitat y época climática, con énfasis en las especies de zancudo positivas en este estudio a alguno de los virus estudiados. También se calculó la tasa de infección para cada uno de los virus encontrados en las especies de zancudos segregada por hábitat y época climática. Debido a que se tenían lotes de diferentes tamaños, se estimó la tasa de infección utilizando el método de máxima verosimilitud con corrección de sesgo (MLE) utilizando el programa PooledInfRate versión 4.0 (Biggerstaff 2014).

Se analizaron las proporciones de ingestas derivadas de diferentes hospederos por hábitat y época climática, con énfasis en las especies de zancudo positivas en este estudio a alguno de los virus estudiados. El total de zancudos fue calculado contando el número de ingestas identificadas tomando en cuenta que un mismo individuo podría tener una o más ingestas. Para comparar la proporción de ingestas sanguíneas derivadas de cada hospedero identificado, así como para analizar las diferencias entre especie se realizó una prueba exacta de Fisher utilizando el programa en línea disponible en: http://www.physics.csbsju.edu/stats/exact_NROW_NCOLUMN_form.html. Debido que este programa no permite el ingreso de valores de tres dígitos, se ingresó el valor 99 cuando el número de ingestas observadas era mayor a 99. Para todos los análisis, se trabajó con un

nivel de confianza de = 0.05 dentro del modelo utilizado.

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PARTE II

II.3 MARCO TEÓRICO II.3.1 Arbovirus

Los virus transmitidos por artrópodos hematófagos son llamados arbovirus como

abreviación de “arthropod-borne virus”, o virus transmitidos por artrópodos, principalmente zancudos. Estos virus se perpetúan en la naturaleza principalmente a través de la transmisión biológica entre hospederos vertebrados susceptibles y artrópodos hematófagos. Estos virus tienen la capacidad de replicarse tanto en los tejidos de animales vertebrados como de artrópodos. En los artrópodos, después de un período de incubación extrínseca, son transmitidos a otros vertebrados mediante picaduras (Kuno y Chang 2005; OMS 1967; OMS 1985). Muchos arbovirus son zoonóticos y poseen ciclos de mantenimiento que involucran aves, roedores y primates no humanos como hospederos reservorios (Weaver y Barrett 2004).

Debido a su particular forma de tranmisión, un paso importante para la implementación de medidas de control de arbovirus, es determinar las especies de zancudos importantes como vectores. Para esto se utilizan cuatro criterios principales (Woodring, Higgs y Beaty 1996). (1) Que el vector se alimente del hospedero vertebrado en condiciones naturales de campo y que las estaciones y localidades de la actividad del vector coincidan con incidencia de infecciones en vertebrados. (2) La identificación de vectores infectados a través de estudios de campo. (3) Determinar que la especie de vector puede ser infectada al alimentarse de un hospedero virémico. (4) Confirmar experimentalmente la competencia del vector infectado de transmitir el patógeno a un hospedero vertebrado no infectado. Con base a estos criterios, un primer paso lo constituye el estudio de los patrones de ingesta sanguínea para identificar potenciales vectores en una localidad dada. La evaluación de dicho criterio es el enfoque de la presente investigación.

De los más de 590 arbovirus conocidos, se sabe que al menos 150 afectan a los

humanos. Muchos de los arbovirus febriles y que causan encefalitis, son zoonóticos, con capacidad de causar epidemias por lo tanto importantes para la salud pública. La mayor parte de estos virus están clasificados dentro de las familias Flaviviridae, Togaviridae y Bunyaviridae. La mayoría de las infecciones humanas son asintomáticas, o leves con síntomas parecidos a la gripe. Los principales síntomas son fiebre, dolor de cabeza, mialgias, algunas veces sarpullido y/o postración. Algunos pueden ocasionar encefalitis dejando secuelas neurológicas, sin embargo los casos son pocos (CDC 2005; Frean y Blumberg 2005). A continuación se describen tres de los géneros de las familias de virus anteriomente mencionadas, las cuales fueron estudiadas como parte de este estudio.

II.3.1.1 Flavivirus Los Flavivirus conforman uno de los cuatro géneros de virus de ARN de hebra positiva que junto con los Pestvirus, Hepacivirus y Pegivirus consituyen la familia Flaviviridae (ICTV, 2006). Según la clasificación internacional más reciente el género Flavivirus incluye 53 especies de virus de las cuales 27 son transmitidas por zancudos (ICTV 2014, Gubler, Kuno y Markoff 2007). Además de esto clasificación, es conocido que existen otros flavivirus de insectos, que forman un grupo separado genéticamente y que

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están presentes en varias regiones geográficas (Hobson-Peters J et al. 2013, Cook et al. 2012). De manera general, los flavivirus están asociados a altos niveles de morbilidad y mortalidad en hospederos vertebrados alrededor del mundo. Veintidós (65%) de los virus transmitidos por zancudos pueden causar enfermedad en humanos (Cuadro 2.) (Gubler, Kuno y Markoff 2007). Cuadro 2. Algunos flavivirus de importancia médica

Virus Zancudos vectores Enfermedad

Dengue Aedes Sistémica suave, fiebre, fiebre hemorrágica, síndrome de choque de dengue

Fiebre amarilla Aedes Hepatitis, fiebre hemorrágica Virus del oeste del Nilo Culex Fiebre, encefalitis, hepatitis Encefalitis de San Luis Culex Encefalitis

Fuente: modificado de Flint et al. (2004)

Usualmente los flavivirus han sido clasificados por medio de ensayos

serológicos (neutralización). De acuerdo a la reactividad cruzada resultante de estos ensayos, se ha agrupados a los flavivirus en ocho complejos antigénicos (Calisher et al. 1989). Dos de estos grupos lo conforman los flavivirus transmitidos por zancudos, cada uno de estos grupos se distingue por la sintomatología clínica que provoca en humanos y por su ecología. Los flavivirus que causan encefalitis se encuentran en el serogrupo de encefalitis japonesa e incluyen al virus de encefalitis japonesa (Japanese encephalitis virus, JEV), WNV), virus de encefalitis del valle de Murray (VEVM) y SLEV (Kuno et al. 1998; Calisher et al. 1989). Todos estos virus son zoonóticos, sus hospederos vertebrados naturales son aves y sus principales vectores son zancudos del género Culex. El otro grupo incluye virus vicerotrópicos que pueden causar fiebres hemorrágicas como YFV y DENV. Estos virus tienen un ciclo silvestre que involucra primates inferiores como hospederos vertebrados y zancudos del género Aedes como vectores principales (Gubler et al. 2007; Hoshino et al. 2006). Esta clasificación resalta el hecho que las propiedades antigénicas que distinguen a estos grupos y los síntomas que estos virus provocan, están relacionadas con su composición y estructura tanto física como molecular.

Las partículas virales de los Flavivirus tienen apariencia esférica con diámetro entre

40 a 60 nm. La envoltura derivada de la bicapa de lípidos de la célula hospedera, contiene dos glicoproteínas integrales de membrana codificadas por el genoma viral: la proteína de envoltura E (53 kDa) y la proteína de membrana prM (18-20 kDa) (Petersen y Roehrig 2001). La cápside, formada por la proteína C, encierra el genoma de ARN, de 11 kilobases (kb) de largo (Chambers et al. 1990; Lindenbach, Thiel y Rice 2007). El ARN posee un único marco abierto de lectura (ORF por sus siglas en inglés) de aproximadamente 10 kb que codifica una poli-proteína de 3386 a 3433 aminoácidos (Figura 4). En los extremos 5’ y 3’ de la ORF se encuentran regiones no codificantes (UTR) (McMinn 1997).

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Figura 4. Estructura y expresión del genoma de flavivirus.

Fuente: González Reiche 2008, modificado de Lindenbach et al. (2007). A) Estructura genómica y elementos de ARN. B) procesamiento de poliproteínas y productos del rompimiento. Topología propuesta para los productos poliprotéicos de rompimiento de flavivirus con respecto de la membrana del retículo endoplasmático.

En Guatemala se conoce de la circulación de varios flavivirus, entre estos el

DENV, es considerado endémico y causante de numerosas epidemias en los últimos años (OPS 2008). Entre otros flavivirus se ha reportado YFV, en zancudos en el valle del Motagua (Jorge y Bevier 1958), JUTV en roedores (Karabastros 1985) y desde 2003, investigadores del Centro de Estudios en Salud de la Universidad del Valle (CES-UVG) en conjunto con la División de Enfermedades Infecciosas Transmitidas por Vectores (DVBID) de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades (CDC) de Estados Unidos han estudiado y demostrado la presencia de WNV (Morales-Betoulle et al. 2013).

II.3.1.1.1 Virus del Oeste del Nilo El virus del oeste del Nilo, fue descubierto en 1937 en Uganda (Gubler et al. 2007). Entre los años 50 y 70 se reportaron casos aislados y varios brotes en África, Medio Oriente, Europa y Asia. A partir de su introducción en el continente americano, en Nueva York en 1999 (CDC 1999; Lanciotti et al. 1999; Nash et al. 2001) este flavivirus transmitido por zancudos es ahora el arbovirus con la más amplia distribución geográfica (Kramer et al. 2008), y por lo tanto considerado un patógeno emergente o resurgente de importancia mundial (Gubler 2002).

II.3.1.1.1.1 Ciclo de transmisión

La transmisión biológica tanto del WNV como de cualquier flavivirus transmitido por zancudos incluye tres componentes esenciales: virus, vector y hospedero vertebrado (Kuno y Chang 2005). El hospedero vertebrado principal del WNV son las aves, el virus se mantiene en la naturaleza en un ciclo de transmisión entre zancudo-ave-zancudo que involucra principalmente los zancudos del género Culex (Campbell et al. 2002). El virus debe replicarse tanto en el zancudo como en el ave produciendo viremia relativamente

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elevada para completar el ciclo de transmisión primario (Figura 4) (Komar 2003). Los zancudos se infectan a través de la ingesta sanguínea del ave infectada. Consecuentemente, el virus infecta las células del estómago, dispersándose hacia la hemolinfa y luego a una variedad de tejidos, incluyendo las glándulas salivales (Figura 5). El zancudo transmite el virus que reside en las glándulas salivales durante ingestas sanguíneas subsecuentes. Algunas especies de aves, y otros hospederos vertebrados como humanos y otros mamíferos son hospederos incidentales y generalmente no están involucrados en el ciclo de transmisión, sin embargo son susceptibles de ser infectados. Sin embargo para que esto ocurra, los factores ambientales y biológicos tales como barreras ecogeográficas, vertebrados disponibles, etc.; así como los ciclos biológicos deben estar sincronizados en espacio y tiempo para asegurar el contacto entre el vector y los hospederos (Gubler et al. 2007).

Figura 5. Ciclo de transmisión del WNV

Fuente: Gonzalez Reiche 2008, modificado de Komar (2003). Las especies de vectores pueden variar pero los zancudos culícidos son los responsables de los ciclos de amplificación. Las aves silvestres son los hospederos virémicos más importantes para la mayoría de los virus. También se muestran posibles rutas de transmisión alternativas.

Las especies del género Culex han sido identificadas como vectores principales del WNV, sin embargo el virus ha sido aislado de un rango excepcionalmente amplio de especies de zancudos (Granwehr et al. 2004), incluyendo hasta 62 especies en Estados Unidos (CDC 2007b) de los géneros Aedes, Anopheles, Coquilletidia, Culiseta, Deinocerites, Mansonia, Orthopodomyia, Psorophora y Uranotaenia. Entre estas especies los miembros del género Culex parecen ser los más eficientes en esparcir el virus entre aves y de aves a humanos y otros mamíferos (Dauphin et al. 2004). El complejo Culex pipiens está ampliamente distribuido geográficamente. En Norte América este grupo está representado por tres miembros principales: el zancudo doméstico del norte, Cx. pipiens en áreas por encima de una latitud de 39º N, el zancudo doméstico del sur, Cx. quinquefasciatus que se encuentra en latitudes menores a 36º N, y entre latitudes de 36º a 39º N, se encuentran Cx. pipiens y Cx. quinquefasciatus así como

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híbridos de estas dos especies (Goddard 2003). Los miembros este complejo, se reproducen en zanjas, alcantarillas, depósitos de agua, y agua contaminada (también se reproduce en contenedores artificiales alrededor de las casas como latas, jarras y llantas); (Goddard 2003). Otra especie de interés es Cx. nigripalpus, que se encuentra principalmente en el sur de los Estados Unidos, Antillas, México, América Central, Trinidad, Ecuador, Colombia, Venezuela, las Guyanas, Brasil y Paraguay (Goddard 2003). Con base a estudios de competencia vectorial se ha demostrado que Cx. nigripalpus es un vector competente del WNV (Sardelis et al. 2001; Rutledge et al. 2003; Moraes et al. 2007). En América Central aun no se sabe con exactitud cuales son las especies de zancudos transmisores de WNV, sin embargo, Cx. nigripalpus es una especie abundante en la región que podría funcionar como vector amplificador y como vector puente para el WNV (Moraes et al. 2007).

II.3.1.1.1.2 Epidemiología A partir de su introducción al hemisferio occidental, el WNV se esparció a la mayor

parte del territorio de los Estados Unidos y Canadá, convirtiéndose endémico en varias regiones (CDC 2007a). En América Latina se ha reportado evidencia de circulación de WNV a lo largo del continente con excepción de ocho países (Elizondo-Quiroga y Elizondo Quiroga, 2013). Aún así, se ha observado poca evidencia de morbilidad y mortalidad en humanos y equinos y a la fecha no ha habido brotes documentados en humanos. A lo largo de estos años, los investigadores han propuesto varias hipótesis para explicar este fenómeno, entre éstas, la protección cruzada por anticuerpos heterosubtípicos debidos a la pre-existencia de otros flavivirus en estas regiones; que las cepas ciruclantes de WNV en Latinoamérica sean de virulencia atenuada o de origen diferente a las cepas circulantes en Norte America; que el diagnóstico definivo de WNV y su diferenciación de otros flavivirus es complejo en regiones donde circulan varios flavivirus debido a reacciones serológicas cruzadas. Finalmente, que las preferencias alimenticias de los zancudos vectores en estas regiones sean diferentes (Elizondo-Quiroga y Elizondo Quiroga, 2013, Kading et al. 2013, Kramer et al. 2008).

En Guatemala, se cuenta con evidencia de circulación de WNV desde 2004

(Morales-Betoulle et al. 2006, Morales-Betoulle et al. 2013), y se han realizado estudios para detectar WNV en humano en varios hospitales del país (Lindblade et al. 2010, estudio en marcha; Dueger et al. datos no publicados), sin embargo, a la fecha no se ha reportado algún caso humano con enfermedad neurológica atribuible a WNV. Probablemente la suma de factores anteriormente mencionados provea una explicación a las aparentemente menores tasas de morbilidad en humanos observadas en los ecosistemas tropicales y el resto de Latinoamérica (Elizondo-Quiroga y Elizondo-Quiroga, 2013).

II.3.1.1.1.3 Sintomatología

La mayoría de infecciones por el WNV son asintomáticas (~80%), y aproximadamente 20 a 30% de los individuos infectados desarrollan manifestaciones clínicas relacionadas con cuadros febriles caracterizados por fiebres altas, dolor de cabeza, fatiga, malestar, dolor muscular y debilidad; también se han reportado síntomas gastrointestinales, y eczema en tronco y extremidades (Hayes et al. 2005b). Un menor número de individuos (1%), puede desarrollar enfermedad neuroinvasiva. En dichos casos las características clínicas en general incluyen cefalea severa, síntomas oculares, debilidad

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muscular, daño cognitivo, temblores, meningitis y parálisis flácida. La tasa de mortalidad ligada a la infección neuroinvasiva es de aproximadamente el 10% y las secuelas neurológicas a largo plazo son comunes (Samuel y Diamond 2006). Además de las manifestaciones neurológicas otros síntomas que pueden ocurrir durante la infección por WNV incluye viremia e inflamación de multiples órganos internos. Adicionalmente, se sabe que el riesgo de encefalitis aumenta con la edad y es mayor en pacientes con trasplante de órganos. La severidad de la enfermedad varía desde una ligera desorientación hasta un coma y la muerte (Hayes et al. 2005b).

II.3.1.2 Alphavirus

El género Alphavirus (familia Togaviridae) contiene virus de ARN de simple hebra en sentido positivo los cuales pueden infectar humanos y animales silvestres y domésticos. Actualmente se conocen 29 especies dentro del género, entre las que se pueden mencionar el WEEV, EEEV y VEEV, el virus O’nyong-nyong (ONNV), el virus Chikungunya (CHIKV), y virus del río Ross (RRV) (Firth 2008). Dependiendo del virus, este puede afectar el sistema nervioso o las articulaciones. Estos virus usualmente tienen ciclos complejos, involucrando ciclos enzoóticos en los cuales participan hospederos reservorios tales como aves y mamíferos roedores, marsupiales o primates (Cuadro 3). En algunos casos, los humanos y otras especies pueden actuar como hospederos amplificadores secundarios (Weaver y Barrett 2004; Casals 1954).

Cuadro 3. Algunos alfavirus de importancia médica

Virus Enfermedad Hospedero

reservorio Zancudos vectores

enzoóticos

Zancudos vectores epidémicos

Encefalitis equina del este

Cuadro febril, encefalitis

Aves Culex y Culiseta Aedes, Ochlerotatus y Coquilletidia

Encefalitis equina venezolana

Cuadro febril, encefalitis

Roedores Culex Ochlerotatus y Psorophora

Encefalitis equina del oeste

Cuadro febril, encefalitis

Aves Culex ---

Chikungunya Artralgia, sarpullido Primates Aedes Aedes

O’nyong-nyong Artralgia, sarpullido Desconocido Desconocido Anopheles

Fuente: modificado de Weaver y Barrett (2004)

Existen varias hipótesis que tratan de explicar el surgimiento de los alfavirus. Se cree que los alfavirus se originaron en el Nuevo o Viejo Mundo y se transmitieron de un hemisferio a otro hace alrededor de 2,500 años (Weaver et al. 1993). Levinson et al. (1990) propusieron que los alfavirus se originaron en el Nuevo Mundo y llegaron al Viejo Mundo en dos ocasiones. Cualquiera de estas dos hipótesis involucra la participación de aves migratorias para la dispersión, las cuales se infectan en el lugar de partida y llegan a su destino con viremias altas que pueden permitir la transmisión (Strauss y Strauss 1994).

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II.3.1.2.1 Características moleculares

Los alfavirus poseen ARN de simple hebra en sentido positivo, envueltos, con simetría icosahédrica y un tamaño de virión de 60 a 70 nm de diámetro (Griffin 2001). Poseen cinco proteínas estructurales (C, E3, E2, 6K y E1) y cuatro proteínas no estructurales que participan en la replicación del ARN viral y la producción de ARN subgenómico (Strauss y Strauss 1994). El virión esta formado por la nucleocápside icosahédrica con T=4 formada por doscientas cuarenta copias de monómeros de la proteína de la cápside (C). Posee una envoltura lipídica derivada de la célula del hospedero, la cual contiene las glicoproteínas E1 y E2 codificadas por el virus, las cuales participan en la unión del virus a la célula huésped (E2 interactúa con los receptores de unión de superficie celular y la E1 interviene en la fusión con membranas endosomales) (Ryman 2008). La proteína E3 puede encontrarse presente en algunos alfavirus, tales como el virus del bosque Semliki (Semliki forest virus, SFV). Por último, la proteína 6K está involucrada en el procesamiento de las proteínas de la envoltura, la permeabilización de membrana y el ensamblaje viral (Firth 2008).

El genoma encapsulado del alfavirus tiene una longitud aproximada de once a doce kb, posee una cobertura de guaninas metiladas y se encuentra poliadenilado. Este se divide en dos marcos abiertos de lectura (ORF), separados por una región no codificante, que codifican para proteínas no estructurales (NS) y proteínas estructurales respectivamente. Estos se encuentran divididos por el promotor para el ARNm subgenómico (Ryman 2008). El genoma se encuentra organizado de tal manera que las proteínas no estructurales se encuentran codificadas en el extremo 5’ y las proteínas estructurales en el extremo 3’. Las proteínas no estructurales son traducidas a partir del ARN genómico y las proteínas estructurales a partir de ARN subgenómico. Las cinco proteínas estructurales se encuentran codificadas como una poliproteína (C-E3-E2-6K-E1) de alrededor de ciento cuarenta kDa (Figura 6).

Figura 6. Organización del genoma de los alfavirus

Fuente: modificado de Powers et al. (2001)

Al ingresar un alfavirus en una célula vertebrada, se da un aumento en la permeabilidad de la célula. Estos se replican rápidamente, liberando nuevos virus entre cuatro y seis horas luego de la infección. La infección causa un efecto citopático que se caracteriza por disminución de tamaño de la célula a la vez que esta se hace más redonda y aparecen vesículas de superficie (proceso también conocido como zeiosis) llevando finalmente a la muerte de la célula en veinticuatro horas (Levine et al. 1993). Muchos arbovirus inducen apoptosis, sin embargo el mecanismo por el cual esto sucede no es bien conocido.

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Una característica importante de los alfavirus es que poseen lo que se conoce como exclusión de superinfección, esto quiere decir que las células (vertebradas o invertebradas) con un alfavirus específico no pueden ser posteriormente infectadas con el mismo u otro altamente relacionado. Este proceso comienza luego de la traducción de los genes que codifican las proteínas no estructurales del virus y da como resultado que si existiera un genoma superinfectante, este podría ser traducido pero no replicado (Stollar y Shenk 1973).

II.3.1.2.2 Virus de encefalitis equina De los alfavirus del Nuevo Mundo, el VEEV es el patógeno más importante para humanos y equinos y ha causado brotes periódicos de enfermedad febril y neurológica en América Latina durante el último siglo. Varios brotes han presentado miles de casos en equinos y humanos en amplias áreas geográficas, durando varios años. Brotes recientes en México y América del Sur han demostrado que VEEV es una enfermedad re-emergente. Este virus también tiene potencial como arma biológica lo cual ha renovado el interés en él (Weaver et al. 2004).

El VEEV fue identificado en 1939 como el agente etiológico causante de una serie de casos de encefalitis en caballos en Venezuela, que originalmente se pensó que podían ser causados por los virus que circulaban en Estados Unidos, como el EEEV y el WEEV. Se logró aislar el virus del cerebro de caballos que habían muerto en áreas rurales y a partir de esto se observó que el virus era altamente patogénico en conejillos de indias causándoles la muerte entre 48 y 72 horas post inoculación. Así mismo, al inocular caballos con el virus, se observó el mismo cuadro clínico que en los caballos que fueron infectados naturalmente (Kubes 1939).

II.3.1.2.2.1 Ciclo de transmisión

Los alfavirus dentro del complejo antigénico del VEEV se clasifican como epidémicos/epizoóticos o enzoóticos. Las cepas epidémicas/epizoóticas contienen cepas virulentas en equinos aisladas durante epidemias y cepas epizoóticas equinas (los subtipos IAB e IC). Las cepas enzoóticas (subtipos ID-IF, II-VI) son aquellas avirulentas en equinos que se mantienen circulando constantemente entre roedores en hábitats selváticos y raramente causan enfermedad en humanos (Young y Johnson 1969).

Durante su ciclo de vida (Figura 7), el virus infecta tanto a artrópodos como a hospederos vertebrados. Posee un ciclo enzoótico en el cual se da la transmisión desde un vector artrópodo hasta un hospedero reservorio competente. También puede darse en este ciclo la transmisión de un vector artrópodo a un hospedero incompetente (hospedero final). El ciclo enzoótico del virus ocurre en hábitats selváticos, involucrándose en éste aves, roedores y primates no humanos como hospederos reservorios. Se ha observado que los roedores son los principales hospederos amplificadores y se cuenta con evidencia de que ciertas especies tales como Liomys salvini, Oligoryzomys fulvescens, Oryzomys couesi y Sigmodon hispidus juegan un papel importante en el ciclo de mantenimiento del virus (Deardorff et al. 2009). La infección humana y las epidemias surgen cuando las personas entran en contacto con este tipo de hábitats. Una característica del VEEV es que alcanza una mayor amplificación e infección en humanos haciendo uso de animales domésticos como hospederos, conociéndose esto como un ciclo epizoótico rural. En éste se involucran equinos y cerdos, lo que incrementa el paso del virus a humanos, causando epidemias en comunidades rurales. Para que el VEEV se adapte a hospederos amplificadores

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domésticos (equinos), requiere mutaciones en el gen E2, lo cual incrementa el nivel de viremia en el hospedero y ha ocurrido al menos tres veces en el siglo pasado. Este cambio viene acompañado por un cambio del serotipo original a IAB o IC. Además ocurre una adaptación a los zancudos vectores del ciclo epizoótico (Weaver et al. 2004). Figura 7. Ciclo del virus de encefalitis equina venezolana

Fuente: modificado de Weaver et al. (2004)

La prevalencia de la infección en zancudos es dependiente de las estaciones. Se ha

observado incidencia del virus en el verano y luego de lluvias fuertes, debido a que ocurre un aumento de la población de zancudos. El zancudo queda infectado de por vida y sigue teniendo la capacidad de transmitir el virus. En los roedores, la prevalencia también es dependiente de las estaciones y la incidencia se observa principalmente en el verano. En equinos la infección es evidente y se expresa clínicamente dependiendo de la dosis. Los signos y síntomas son severos generalmente, teniendo un periodo de incubación de 5 días y una tasa de mortalidad del 40% (ICTVdB 2006). Estudios realizados en Brasil acerca de las interacciones ecológicas entre la vida silvestre, el hombre y el virus en un bosque tropical demostraron que existe una correlación positiva entre la transmisión del virus entre roedores y la abundancia de animales no inmunes. Hay una disminución en la transmisión si la población de zancudos es alta y la población de roedores es baja y de la misma forma, si la población de zancudos es baja y la población de roedores es alta. Es por esto que este virus ha sido utilizado como un ejemplo de un agente el cual infecta la vida silvestre y es dependiente de los factores ecológicos del bosque tropical (Shope y Woodall 1973). Se ha observado que a mayor abundancia, diversidad y estabilidad de las poblaciones de vectores, en combinación con la

Ciclo enzoótico

Ciclo epizoótico Mutación, selección

Eventos hipotéticos

Ratas algodoneras, ratas espinudas, etc.

Pérdida de vigor

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densidad de los reservorios hospederos roedores, existen mayores niveles de VEEV circulando en distintos focos (Barrera et al. 2002).

Cuando ocurren epidemias y brotes en poblaciones de equinos, las cepas de los virus responsables se ven asociadas a distintos vectores. Estos son en especial aquellos pertenecientes al genero Ochlerotatus y Psorophora. Estos muestran cambios en la densidad de población con respecto a las estaciones (Weaver et al. 2004). Por otro lado, se han identificado varias especies de zancudos como vectores de las cepas enzoóticas del virus. Más del 70% de los aislados de cepas enzoóticas provienen del género Culex subgénero Melanoconion, lo que sugiere que estos zancudos son los principales vectores de la mayoría de las cepas enzoóticas de VEEV (Ferro 2003). Entre estos se encuentra Cx. taeniopus, el cual es el principal vector del subtipo IE en Guatemala (Cupp et al. 1979). Todos estos son miembros de la sección Spissipes del subgénero Melanoconion (Sirivanakarn 1982).

La probabilidad de transmisión viral por la vía respiratoria, vía feco-oral, contacto directo y contacto sexual es poco probable. La transmisión congénita, transplacental y perinatal es rara (ICTVdB 2006). Sin embargo, actualmente se le ha prestado particular interés al potencial uso del VEEV como un arma biológica ya que la dosis infectiva para humanos es baja, ha demostrado ser estable e infeccioso al utilizarse como aerosol y es posible producir grandes cantidades de él (Sidwell y Smee 2003).

II.3.1.2.2.2 Epidemiología La distribución geográfica del virus es restringida. Este se encuentra en Norte América, Sur América y Centro América, en regiones subtropicales y tropicales. El virus fue aislado en 1938, desde entonces han ocurrido una gran cantidad de epidemias y brotes tanto en humanos como en equinos en el centro, sur y norte América. Entre éstas se puede mencionar el descubrimiento de anticuerpos contra el virus en una persona de Florida, el periodo epidémico en equinos y humanos de 1969 a 1972 en México y Centro América, los brotes en equinos en Chiapas en 1993 y Oaxaca en 1996 (con tasas de mortalidad de 50% y 7% respectivamente) causadas por la variante IE, el brote en Colombia en 1995 donde se vieron afectadas alrededor de cien mil personas (variante IC) y más recientemente el brote en Perú, donde se encontró evidencia serológica del virus en el 23% de la población (Morrison et al. 2008; Weaver et al. 1996).

El virus ha sido aislado numerosas veces de zancudos, animales y humanos. En 1963 se aisló de zancudos y animales centinelas en México, en Panamá se aisló de un humano en 1961 quien murió (Johnson et al. 1968; Mangiafico, Rossi y Ludwig 2002) y en Brasil ha sido aislado de roedores (Shope y Woodall 1973). En Guatemala, se encontró evidencia serológica en 1965 proveniente de humanos, mamíferos silvestres y equinos de que el virus se encontraba circulando en el país. El virus fue aislado en 1967 y 1968 de un hámster centinela en la aldea de La Avellana, departamento de Santa Rosa (Scherer, Dickerman y Ordoñez 1971). Se determinó que el virus presente en Centro América y México pertenecía a la variante enzoótica IE. En 1969 fue posible aislar el virus de sangre e hisopados nasales de humanos y equinos enfermos y se determinó que alrededor del 75% de los equinos murieron durante la epidemia (Scherer et al. 1972). Se logró aislar el virus de zancudos, obteniendo veinte distintas cepas a partir de zancudos Culex, una de Mansonia y una de Aedes, al mismo tiempo que se obtuvo evidencia serológica en marsupiales, roedores, humanos y perros (Scherer et al. 1976; Dickerman 1973).

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En el caso de la infección en humanos, se han observado factores que predisponen a la persona a contraer el virus. Una de ellas es la proximidad a un bosque tropical, ya sea por su residencia o por su ocupación. Se ha observado que trabajadores de campo se han infectado con virus de roedores (Shope y Woodall 1973). Los niños son más susceptibles que los adultos a la infección y esta se expresa clínicamente dependiendo de la dosis (ICTVdB 2006).

II.3.1.2.2.3 Sintomatología

En humanos adultos, la infección por VEEV causa síntomas parecidos a los de un resfriado, sin embargo, estos pueden progresar en algunos casos hasta causar encefalitis. Además, pueden presentarse síntomas neurológicos como desorientación, ataxia, depresión y convulsiones en un 14% de los casos, principalmente en niños. Adicionalmente, el virus puede dejar secuelas neurológicas (Zaacks y Paessler 2010). En los casos fatales (menos del 1%) se ha observado edema, congestión, hemorragias, vasculitis, meningitis y encefalitis en el sistema nervioso central, neumonía, hemorragia alveolar, congestión y edema en los pulmones, necrosis folicular y disminución de linfocitos en el tejido linfoide y degeneración hepatocelular difusa en el hígado (Johnson y Martin 1974)

II.3.1.3 Orthobunyavirus La familia Bunyaviridae contiene virus de ARN de simple hebra en sentido negativo, compuesto por más de 300 especies (González-Scarano 2005). Estos virus pueden infectar tanto vertebrados (géneros Orthobunyavirus, Hantavirus, Nairovirus y Phlebovirus) como plantas (Tospovirus). Los artrópodos son los principales vectores de los bunyavirus, con excepción de los Hantavirus que son transmitidos por roedores (Schmaljohn y Hooper 2001). La diferenciación entre las especies es difícil, debido a la falta de caracterización bioquímica de muchos de los aislados virales. Las especies se diferencian principalmente por criterios serológicos (reacción cruzada de neutralización y ensayos de hemaglutinación) (ICTV, 2006).

II.3.1.3.1 Características moleculares Los bunyavirus tienen un genoma monocatenario tripartita de ARN simple hebra en sentido negativo. Los tres fragmentos son llamandos L, M y S (grande, mediano y pequeño respectivamente por sus siglás en inglés). El segmento L codifica la polimerasa dependiente de ARN (RdRp) encargada de llevar a cabo la transcripción-traducción (polaridad) de sentido negativo. El segmento M codifica dos glicoproteínas (Gn y Gc) con polaridad negativa, insertadas como proyecciones en la envoltura lipídica de los viriones. Estas glicoproteínas están involucradas en la entrada y salida del virus en las células hospederas. En algunos géneros (Orthobunyavirus, Phlebovirus y Tospovirus) en el mismo marco abierto de lectura (ORF, por sus siglas en inglés), el segmento M también codifica una proteína no estructural (NSM), cuya función es desconocida. El segmento S codifica la proteína de la nucleocápside (N) con polaridad negativa. Algunos géneros (Phlebovirus y Tospovirus) utilizan un ORF translapado para codificar una proteína no estructural (NSS). Ésta última proteína es expresada conjuntamente con la proteína N utilizando una estrategia ambisentido (Schmaljohn y Hooper 2001).

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Los viriones son esféricos y envueltos con una membrana liídica procedente de las membranas celulares del hospedero (Borucki et al. 2002). Las ribonucleocapsides están presentes en el interior del virion, semejando un “collar de perlas” (Figura 8). Figura 8. Esquema de corte transversal de un virión típico de la familia Bunyaviridae.

80 – 120 nm Fuente: de León (2010), modificado de Schmaljohn y Nichol (2007)

II.3.1.3.1 Ciclo de transmisión

Los ortobunyavirus pueden presentarse en dos ciclos: zoonótico y enzoonótico. El primero ocurre en reservorios artrópodos, los cuales mantienen en la naturaleza la transmisión del virus entre los zancudos. El virus puede ser tranmitido verticalmente por hembras infectadas por lo que puede sobrevivir durante el invierno. Los machos pueden transmitir el virus por vía venérea (Soldan y González-Scarano 2005).

En el ciclo enzoótico ocurre la amplificación en vertebrados. Éste involucra la

intervención de mamíferos pequeños (especialmente roedores y ocasionalmente humanos como reservorio final) que pueden ser infectados cuando las hembras infectadas se alimentan de ellos. En el mamífero se puede desarrollar una viremia que a su vez puede infectar a otros artrópodos hematófogos (Figura 9) Se han documentado pandemias originadas por ciclos de amplificación urbana (Moraes 2007). Los vectores de los géneros de bunyavirus tramsmitidos por artrópodos generalmente son alguna especie de zancudo. En el caso del género Orthobunyavirus, los vectores principales son zancudos de las especies Culex y Aedes (Moraes 2007, Reese 2008).

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Figura 9. Patogénesis de Orthobunyavirus en humanos.

Fuente: Modificado de Wattam (2006).

II.3.1.3.2 Epidemiología

Desde mediados del siglo XX se han observado brotes de enfermedad causada por

estos virus en América. Por ejemplo, variantes muy virulentas del virus Oropouche (Oropouche virus, OROV) (Ortobunyavirus) han causado brotes epidémicos de hasta 100,000 infecciones humanas en Brasil (Vasconcelos et al. 1998, Moraes 2007). La mayoría de estudios sobre bunyavirus, realizados en América tropical o subtropical, se originan principalmente en Brasil (Nunes 2005, de Brito 2007, Morales 2007, Quinan 2008). En otros países se ha estudiado casos de infección humana por bunyavirus emergentes (Scherer et al. 1983, Tauro et al. 2009). Entre 1968 y 1980 un equipo realizó estudios sobre el alfavirus VEEV en Guatemala. Aunque el objetivo era analizar la ecología de VEEV, durante esos estudios se obtuvo 34 aislados de diversos ortobunyavirus. Entre los virus aislados se encontraron 28 del grupo C y 6 del grupo PAT. En total, se identificaron siete aislados como virus Nepuyo (Marituba Virus, MTBV) y tres como virus Patois (Patois virus, PATV). De estos virus, 31 fueron aislados de hámsters centinela en La Avellana, Santa Rosa, y Puerto Barrios, Izabal. Dos aislados de NEPV se obtuvieron de personas con enfermedad febril, también en Guatemala. El único aislado viral de zancudos macerados provino de un grupo de Cx. taeniopus y fue identificado como NEPV (Scherer et al. 1986; Cupp et al. 1986; Scherer et al. 1985; Scherer et al. 1983).

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II.3.1.3.3 Sintomatología Los síndromes asociados a estos virus son variados. Los bunyavirus presentes en

América se asocian principalmente a dos síndromes: encefalítico (sobre todo serogrupos California y Bunyamwera) y febril (sobre todo Grupo C) (Kuno et al. 1996 y Nunes et al. 2005). Como se mencionó anteriormente, en Guatemala se han aislado bunyavirus del Gupo C, que causan comúnmente un síndrome febril, muy similar al presentado por una persona enferma con dengue (Scherer et al 1983, Scherer et al 1986).

II.3.2 Estudio de los patrones alimenticios de zancudos

El estudio de los patrones de alimentación de los vectores de arbovirus que

afectan al humano y otros animales, es esencial para conocer las relaciones entre hospederos y vectores. A su vez es importante para conocer el papel cada una de las especies involucradas en el ciclo de transmisión de la enfermedad (Tempelis 1975) y para el desarrollo de estrategias de control (Parida et al. 2006). El análisis de la ingesta sanguínea provee información necesaria para determinar el tipo de hospederos y el potencial de una especie de funcionar como vector (Niebylski y Meek 1992; Elizondo-Quiroga et al. 2006). Aunque un amplio rango de animales puede servir como fuente de alimentación para una especie de zancudos, muchas especies individuales de zancudos tienen preferencia por ciertas especies de vertebrados (Klowden 1996). En este contexto, el termino “preferencia de hospedero” se refiere a la selección de un hospedero vertebrado específico como una fuente de alimento, sobre otras especies igualmente disponibles (Washino y Tempelis 1983).

II.3.2.1 Comportamiento de alimentación de zancudos

En el caso de los zancudos, únicamente las hembras son hematófagas (requieren ingesta sanguínea) para satisfacer necesidades metabólicas específicas (Richards, Anderson y Smartt 2009). Las proteínas de la sangre y el hierro proveen energía y nutrientes importantes para el desarrollo de los huevos (Zhou et al. 2007). El patrón de alimentación de un zancudo puede ser de dos tipos: fijo u oportunista, entre los patrones fijos, las preferencias de alimentación pueden ser clasificadas como: (i) principalmente de mamíferos, (ii) principalmente de aves, o (iii) principalmente de vertebrados de sangre fría, mientras que los oportunistas se alimentan de una amplia gama de hospederos dependiendo de su disponibilidad (Edman y Taylor 1968, Marquardt, Demaree y Grieve 2000). Por otro lado, las especies de zancudos también pueden clasificarse como endofílicas, cuando permanecen dentro de las viviendas de los humanos durante la mayor parte de su ciclo gonotrópico, o exofílicas, cuando la mayoría del tiempo permanecen en el exterior (Klowden 1996). Adicionalmente, los zancudos pueden cambiar sus preferencias alimentarias a lo largo del año de forma estacional. Se ha sugerido que este tipo de comportamiento puede ser de gran importancia para la transmisión de ciertos virus a poblaciones humanas cuando durante la ocurrencia de epidemias de origen zoonótico (Kilpatrick et al. 2006).

Los zancudos utilizan distintas estrategias para encontrar a sus hospederos orientándolos en el espacio a través de la detección del aroma del hospedero, visión y percepción de temperatura. En relación al aroma, la principal señal es el dióxido de carbono emitido por los hospederos como producto de la respiración. Adicionalmente se ha

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observado que algunos zancudos se sienten atraídos por otros olores como los componentes volátiles de las plumas de las aves (Allan, Bernier y Kline 2006) y el 1-octen-3-ol en el aliento de bovinos (Kline et al. 1991), entre otros. Por último, la orientación también involucra el reconocimiento de calor y la audición. Estudios han demostrado que ciertas especies de zancudos se sienten atraídas ca los cantos de distintos anfibios (Bartlett-Healy, Crans y Gaugler 2008). Un último factor que determina el éxito de un zancudo para alimentarse es la abundancia de hospederos, especialmente para aquellos con patrones de alimentación oportunista (Hess, Hayes y Tempelis 1968). Se ha demostrado que existe una relación inversa entre la densidad de zancudos y la proporción que se logra alimentar exitosamente de un solo hospedero (Edman, Webber y Kale 1972). Esto se debe probablemente a que al aumentar la densidad de zancudos los hospederos adoptan estrategias defensivas, lo que aumenta la frecuencia de alimentación interrumpida y tiene como consecuencia ingestas parciales.

Otro factor involucrado en el éxito de la alimentación de los zancudos son las características del hábitat en el que se encuentran. Estudios realizados en California con Cx. tarsalis mostraron que estos preferían alimentarse en sitios con vegetación alta, sin estar necesariamente asociados con los sitios que mostraban una mayor cantidad de hospederos potenciales (Lothrop y Reisen 2001). Se ha observado además que algunas especies prefieren volar en la parte alta de los árboles mientras otros vuelan a menor altura (Savage et al. 2008).

II.3.2.2 Técnicas para el estudio del los patrones de alimentación de los zancudos

A lo largo de los años se han desarrollado varias técnicas para caracterizar la fuente de alimentación de insectos hematófagos. Estas técnicas han utilizado como principio la serología y más recientemente, métodos moleculares para detección de ADN. Los primeros ensayos desarrollados para la identificación de la ingesta sanguínea se basaban en pruebas serológicas para detectar la precipitina (Bull 1923) o inhibición de la hemaglutinación. Posteriormente se utilizaron técnicas de inmunofluorescencia (McKinney, Spillane y Holden 1972) y más adelante se desarrollaron técnicas de ELISA que utilizan anticuerpos dirigidos a hospederos específicos (Tempelis 1975). Entre estas, la prueba de la precipitina es más específica y sensible que la prueba de ELISA además de ser de bajo costo y fácil de realizar (Gomes et al. 2001). Sin embargo, las pruebas basadas en la interacción antígeno-anticuerpo presentan algunas desventajas, como la posibilidad de reacciones cruzadas entre especies pudiendo resultar en la identificación errónea, y la necesidad de producir anticuerpos específicos contra cada una de las posibles especies que puedan servir como fuente alimenticia para los zancudos, por último estos análisis se basan en proteínas, las cuales pueden desnaturalizarse cuando no se manejan en las condiciones adecuadas (Parson et al. 2000). Con el fin de superar estas desventajas se desarrollaron métodos moleculares basados en el uso de ADN para la identifiación del hospedero. Actualmente, los métodos moleculares son los más utilizados, debido a las diversas ventajas que presentan. Entre estas un nivel mayor de sensibilidad y especificidad. Aunque los zancudos ingieren alrededor de 30µL de sangre (Ngo y Kramer 2003), esta contiene un gran número de células. La mayoría de las células de los vertebrados contiene tanto un núcleo como mitocondrias. Una excepción son los eritrocitos de mamíferos que no contienen núcleo o mitocondrias por lo tanto tampoco se puede obtener ADN de ellos. En este caso, los

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leucocitos son la fuente de material genético en la sangre que puede identificarse (Mukabana, Takken y Knols 2002). El método más utilizado es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para amplificar secuencias específicas de ADN a partir de las cuales se puede llevar a cabo la identificación. Las técnicas de detección por PCR utilizan diferentes marcadores moleculares dirigidos a regiones conservadas para la identificación y diferenciación de especies. Algunas se basan en la amplificación de regiones de genes de ARN ribosomal, mientras que otras utilizan genes nucleares para la identificación de la ingesta sanguínea en artrópodos. Sin embargo los genes nucleares están presentes en dos copias por célula y por lo general, la cantidad de células en la ingesta sanguínea de un zancudo puede ser insuficiente, por lo que muchas veces es necesario clonar los productos obtenidos, dificultando el proceso de su identificación (Kent 2009).

Recientemente, se prefiere utilizar técnicas de detección basadas en marcadores moleculares del genoma mitocondrial tanto en estudios de identificación de especies como en estudios filogenéticos (Kocher 1989). Entre los marcadores de este tipo, se encuentran CO1 (citocromo c oxidasa I) y cytb (citocromo b) (Figura 10). El gen del citocromo b mitocondrial es uno de los genes de vertebrados amplamente caracterizado (Jonhs 1998). Este marcador ha sido utilizado en distintos protocolos para identificación de especies por secuenciación o amplificación con cebadores que permiten diferenciar grupos específicos (Ngo y Kramer 2003), así miso se ha utilizado para análisis heteroduplex (Lee 2002), “reverse line blotting” (Abbasi, Cunio y Warburg 2008) y RFLP (Meece 2005, El-Sayed 2009) entre otras. Una de las ventajas de utilizar el método de secuenciación es que se puede obtener la identidad específica del hospedero y que en general es requerido como método confirmatorio después de la amplificación por PCR. Otra ventaja de este método, es que se cuenta con bastante información de secuencias en GenBank1. Las desventajas que presenta son que se requiere equipo de secuenciación y reactivos que por lo general son costosos y la posibilidad de que no haya información de secuencia de algunas especies, lo que puede resultar en una identificación errónea (Kent 2009).

Figura 10. Organización del genoma mitocondrial en vertebrados.

Fuente: modificado de Pereira (2000). Los marcadores mas utilizados son los genes Cyt b y CO I, correspondientes al citocromo b y el citocromo oxidasa I, que codifican para proteínas de la cadena respiratoria.

1GenBank es una base de datos de secuencias de ADN de acceso público mantenida por el Instituto Nacional

de Salud (NIH) de los Estados Unidos. Puede accederse en http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/

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Cualquiera que sea la estrategia de identificación de ingesta sanguínea, la implementación de estudios y metodologías que utilizan marcadores genéticos moleculares deben permitir: (1) una identificación precisa de los índices antropofílicos de las especies de artrópodos hematófagos para evaluar el riesgo de transmisión a humanos de las enfermedades transmitidas por vectores; (2) proveer una herramienta de evaluación de la eficiencia y eficacia de los programas de control enfocados a reducir el contacto entre el humano y el vector (al realizar por ejemplo estudios pre y post-intervención) y (3) contribuir a mejorar la capacidad de detectar hospederos reservorios de los distintos patógenos (Mukabana et al. 2002).

La identificación de ingestas sanguíneas acoplada a la detección de patógenos, como arbovirus en los potenciales vectores son estrategias utilizadas para establecer la relación entre la presencia de un virus en el potencial zancudo vector y el origen de la ingesta sanguínea a partir de un potencial hospedero. Sin embargo, los hallazgos deben ser confirmados debido a varios factores que pueden interferir con este tipo de análisis, como por ejemplo, la dificultad de distinguir si el vector se encontraba infectado antes de la ingesta o si el patógeno se encuentra en la sangre ingerida. Para poder realizar esta distinción es necesario conocer la forma en que el virus se disemina en el potencial vector.

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PARTE III

III. RESULTADOS

Objetivo 1: Determinar y evaluar la dinámica de transmisión de Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus en diferentes hábitats de Puerto Barrios, Izabal, Guatemala, para recomendar acciones para su vigilancia y control. La dinámica de transmisión de los arbovirus estudiados fue evaluada al estudiar los vectores y vertebrados potenciales hospederos, así como los hábitats y épocas de transmisión. Esta información se compila de manera detallada en los Objetivos 2 a 4 a continuación. En términos generales, se detectaron arbovirus en todos los hábitats y épocas estudiados. Las especies positivas de zancudos se alimentan principalmente de mamíferos y algunas de ellas, en menor porcentaje, de aves. No se detectaron ingestas provenientes de humano.

La presencia de Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus varía entre los diferentes hábitats y estaciones (Hipótesis 1). Los virus del género Flavivirus se encontraron en cuatro de los seis hábitats estudiados, pero principalmente en bosque secundario y en el hábitat intradomicilio. Los virus del género Alphavirus se encontraron solamente en pastizales, y los virus del género Orthobunyavirus se encontraron en todos los hábitats, excepto en peridomicilio, presentando la mayor tasa de infección en el pastizal con sombra (Figura 11). Adicionalmente, solamente se detectó circulación de Flavivirus y Alphavirus durante la época lluviosa, mientras que Orthobunyavirus fue detectado en ambas épocas, pero las mayores tasas de infección se presentaron durante la época seca (Figura 13).

Las especies positivas a Flavivirus fueron Ae. angustivittatus, Cx. interrogator, Cx. mollis/Cx. inflictus y Cx. nigripalpus. Las positivas a Alphavirus fueron Cx. interrogator y Ps. confinnis. Las positivas a Orthobunyavirus fueron Ae. angustivittatus, Cx. quinquefasciatus, Cx. taeniopus y Ps. confinnis.

La identidad de las especies de zancudos positivos es diferente entre hábitats y estaciones del año (Hipótesis 2). Sin embargo, no todas las especies presentaron las mayores tasas de infección en el hábitat o época en la que fueron más abundantes (Figura 11 y Figura 13). Las especies de zancudos positivos se alimentan de diversas especies de hospederos vertebrados (Hipótesis 3). Todas las especies se alimentaron principalmente de mamíferos (63%-100%; muchos de ellos vacas y caballos) y en menor porcentaje de aves (Cuadro 4). Adicionalmente, se detectaron cambios por hábitat o época en los patrones de alimentación de algunas de las especies de zancudos (Figura 15 y Figura 16). Objetivo 2: Evaluar la presencia de arbovirus en diferentes hábitats y estaciones climáticas de Puerto Barrios, Izabal a través de pruebas moleculares para Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus. Se procesaron un total de 852 lotes de zancudos de los géneros Aedes, Culex y Psorophora para la detectar la presencia de arbovirus. De éstos, ocho lotes fueron positivos

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a Flavivirus, tres a Alphavirus y 14 a Orthobunyavirus. De los lotes positivos a Flavivirus ninguno fue positivo a WNV. Siete especies presentaron al menos un lote positivo (rango: 1-4) a los arbovirus estudiados. Las especies positivas a cada virus y las tasas de infección generales de cada una por hábitat y época se muestran en Figura 11-14. Se capturaron zancudos positivos a alguno de los arbovirus estudiados en todos los hábitats muestreados, pero principalmente en el bosque secundario, pastizal con sombra e intradomicilio. Los lotes con individuos positivos a Flavivirus fueron colectados en cuatro de los seis hábitats estudiados (todos con excepción del pastizal con sombra y dormidero). La mayor tasa de infección a Flavivirus la presentó Ae. angustivittatus (n=50), en el intradomicilio (88.7 zancudos positivos a Flavivirus por cada 1,000 zancudos; la mayor tasa de infección de las observadas para todos los virus y hábitats) y en el bosque secundario (7.2/1,000). Adicionalmente, en el intradomicilio, las especies Cx. mollis/Cx. inflictus (n=118) (31.4/1,000) y Cx. nigripalpus (n=182) (28.8/1,000) presentaron altas tasas de infección. La especie Cx. nigripalpus fue positiva en todos los hábitats en los que se detectó Flavivirus, pero en el resto de hábitats presentó tasas menores a las del intradomicilio (0.4-1.8/1,000). Cx. interrogator presentó una alta tasa de infección en el bosque secundario (30.3/1,000). Los lotes con individuos positivos a Alphavirus fueron colectados únicamente en pastizales (con sombra y sin sombra), en las especies Cx. interrogator (n=27) (tasa infección: 24.2 1,000 zancudos) y Ps. Confinnis (n=40) (8.0/1,000). Los lotes con individuos positivos a Orthobunyavirus fueron colectados en todos los hábitats, excepto el peridomicilio. Cx. taeniopus (n=44) presentó la mayor tasa de infección para Orthobunyavirus, en el pastizal con sombra (20.0/1,000), seguida por Ps. confinnis, en el pastizal al sol (13.0/1,000). La especie Cx. quinquefasciatus (n=74) fue positiva a Orthobunyavirus tanto en el intradomicilio (tasa infección: 9.2/1,000) como en el dormidero (2.3/1,000). Ae. angustivittatus fue positiva en el bosque secundario (7.2/1,000). Todos los lotes con individuos positivos a Flavivirus y Alphavirus fueron colectados durante la época lluviosa, mientras que la mayoría de los positivos a Orthobunyavirus fueron colectados durante la época seca. Cx. interrogator presentó las mayores tasas de infección para Flavivirus y Alphavirus en la época lluviosa (10.3/1,000 en ambos casos). En la época seca, la especie Ps. confinnis presentó la mayor tasa de infección (100.3 positivos a Orthobunyavirus/1,000 zancudos; la mayor tasa de infección de las observadas para todos los virus y épocas). Los valores de todas las tasas de infección calculadas se incluyen en el Anexo 6. Objetivo 3: Identificar y evaluar los vectores potenciales de arbovirus en los diferentes hábitats y estaciones del año en Puerto Barrios, Izabal.

En este estudio se identificaron un total de 27,045 zancudos hembra adultos. Se colectaron individuos pertenecientes a 9 géneros diferentes, y al menos 33 especies. De estos, 24,843 (91.9%) individuos se colectaron en trampas CDC con CO2, 1,267 (4.7%) con aspirador, 602 (2.2%) en trampas grávidas y 333 (1.2%) en trampas de reposo. Un total de 24,024 (88.8%) fueron zancudos vacíos (sin ingesta sanguínea o huevos), 1,898 (7.0%) grávidos (con huevos) y 1,123 (4.2%) alimentados. En total se identificaron 1,410 lotes de

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zancudos, que fueron identificados de acuerdo a fecha, especie, tipo de trampa y sitio de colecta.

Con todos los métodos de colecta se capturaron principalmente zancudos vacíos

(91.5% de las colectas en trampas CDC con CO2, 53.0% con aspirador, 63.8% en trampas grávidas y 75.2% en trampas de reposo). En total, 20-30% de los zancudos colectados con aspirador, en trampas grávidas y en las trampas de reposo (20.3%, 30.1% y 21.2% respectivamente) estaban grávidos. Los zancudos alimentados representaron el 26.7% de las colectas con el aspirador. En el resto de trampas se colectaron bajos porcentajes de zancudos alimentados (3.0% en trampas CDC con CO2, 6.1% en trampas grávidas y 3.6% en trampas de reposo).

Las abundancias por hábitat y época climática de las especies de zancudos positivos a

alguno de los arbovirus estudiados se muestran en la Figura 12 y Figura 14. Un total de 12,147 (44.9%) individuos fueron colectado en bosque secundario, 3,922 (14.5%) en pastizal con sombra, 7,766 (28.7%) en pastizal sin sombra, 934 (3.5%) en dormidero, 1,968 (7.3%) en el peridomicilio y 308 (1.1%) en el intradomicilio. Con respecto a las épocas de colecta, un total de 22,157 (81.9%) individuos fueron colectados en época lluviosa y 4,888 (18.1%) en época seca.

De los 25 lotes encontrados positivos a alguno de los arbovirus estudiado, 14 (56.0%)

se colectaron en trampas CDC con CO2, 10 (40.0%) con aspirador y 1 (4.0%) en una trampa de reposo. En total, 12 (48.0%) de estos lotes eran de zancudos alimentados, 8 (32.0%) de zancudos vacíos y 5 (20.0%) de zancudos vacíos y/o grávidos.

De las siete especies en las que se encontraron lotes positivos a Flavivirus, Alphavirus

y/o Orthobunyavirus, la más abundante fue Cx. nigripalpus (6,057 individuos en 182 pooles), seguida de Cx. mollis/Cx. inflictus2 (2,379 en 118), Cx. quinquefasciatus (594 en 74), Cx. taeniopus (534 en 44), Ps. confinnis (413 en 40), Ae. angustivittatus (405 en 50) y Cx. interrogator (117 en 27). Otras especies que fueron abundantes durante el estudio, pero que no fueron positivas son Cx. chidesteri, Cx. theobaldi, Cx. coronator s.l., Ma. titillans, Ps. albipes y Ps. cingulata. La totalidad de los zancudos capturados en este estudio se incluye en el Anexo 5.

Todas las especies positivas, con excepción de Ps. confinnis y Cx. taeniopus, se

registraron en todos los hábitats estudiados (Figura 12). Cx. mollis/Cx. inflictus, Cx. nigripalpus y Cx. taeniopus presentaron las mayores abundancias en bosque secundario, Cx. quinquefasciatus en dormidero y Ps. confinnis en pastizal sin sombra. Adicionalmente, todas las especies positivas fueron más abundantes durante la época lluviosa, con excepción de Cx. quinquefasciatus, que fue más abundante durante la época seca (Figura 14).

2Los adultos de las especies Cx. mollis y Cx. inflictus no pudieron diferenciarse adecuadamente, por lo que los

individuos colectados pueden representar una o ambas especies.

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Objetivo 4: Identificar y evaluar la fuente de ingesta sanguínea de las especies de zancudos positivos para Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus.

De los zancudos alimentados colectados, 360 (89%) individuos pertenecían a alguna de las especies positivas para Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus. De éstos, en 356 (99%) se amplificó por PCR el gen ND4 exitosamente (control interno para presencia de ADN y control de calidad de la extracción), mientras que en 4 (1%) no se logró amplificar a pesar que la extracción se realizó dos veces.

En los 356 individuos positivos para la amplificación del gen ND4, se procedió a

amplificar porciones del gen citocromo b de vertebrado para identificar el origen de la ingesta sanguínea. Se logró detectar citocromo b en 353 (99%) mientras que en 3 (1%) no se detectó. De los 353 individuos, se encontraron 52 (13%) con ingesta sanguínea provenientes de más de un hospedero para un total de 398 ingestas. Estas muestras a su vez fueron analizadas para identificar el grupo o especie a la que pertenecía la ingesta sanguínea (Anexo 7).

La mayoría de las ingestas sanguíneas en las especies de zancudos positivas a

alguno de los arbovirus estudiados provienen de hospederos mamíferos (n, 85%), seguidos de hospederos vertebrados no identificados (n, 8%) y por último hospederos aviares (n, 6%) (Anexo 8). Dentro de los hospederos mamíferos, 157 (43%) ingestas sanguíneas fueron provenientes de vaca, 65 (18%) de caballo, 61 (17%) de otro mamífero no identificado, 48 (13%) de ratón y 15 (4%) de perro. Dentro de los hospederos aviares, 6 (2%) de las ingestas se identificaron como provenientes de gallina y 17 (5%) de otra ave no identificada (Anexo 9).

Los patrones de alimentación por especie, y sus tasas de infección generales (sin

tomar en cuenta hábitat o época) se muestran en el Cuadro 4. Las especies Ae. Angustivittatus y Cx. interrogator se alimentan principalmente de vaca y caballo (91% y 100% respectivamente). Cx. mollis/Cx. inflictus, Cx. nigripalpus, Ps. confinnis y Cx. taeniopus también se alimentan principalmente de vaca y caballo (73%, 81%, 84% y 65%, respectivamente), pero también de otros mamíferos (11%, 16%, 6% y 35%) -como ratón-. Además, Cx. mollis/Cx. inflictus, Cx. nigripalpus y Ps. confinnis también se alimentan de aves (16%, 3%, 11%). Por último, Cx. quinquefasciatus no presentó ingesta de vaca, pero sí de caballo (13%), otros mamíferos (77%) –como ratón y perro-, y aves (10%).

Al comparar el porcentaje de ingestas proveniente de hospederos mamíferos, aviares y

vertebrados no identificados, se encontró que el patrón de alimentación de Cx. mollis/Cx. inflictus (p=0.034), Cx. nigripalpus (p=3.6x10-4) y Cx. quinquefasciatus (p=9.6x10- 6) varía significativamente entre hábitats (Figura 15 y Anexo 10). Por otro lado el patrón de alimentación de Cx. mollis/Cx. inflictus (p=0.004) y Cx. nigripalpus (p=6.4x10-4) varía significativamente entre la época seca y lluviosa (Figura 16 y Anexo 11).

Objetivo 5: Divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el campo de su competencia la información obtenida de la investigación.

Como parte de los productos previstos para este proyecto, se someterá un artículo para publicación en una revista indexada. Este aún se encuentra en elaboración. Así mismo, se presentarán los resultados en el seminario científico que se realiza en el Centro de Estudios en Salud de la Universidad del Valle de Guatemala; con el objetivo de

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das a conocer los resultados y al que se invitaran a las personas interesadas del Ministerio de Salud Publica y Asistencia Social (MSPAS) y al Ministerio de Agricultura y Ganadería (MAGA). Adicionalmente, este estudio formó parte de la formación académica de un profesional en el área de Bioquímica y Microbiología, cuyo trabajo de graduación para optar al grado de licenciado está disponible en la blilioteca de la UVG.

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Figura 11. Tasas de infección* en las especies de zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en diferentes hábitats.

*Tasa de infección por el método de máxima verosimilitud, con corrección para el sesgo, e intervalos de confianza corregidos calculados con PooledInfRate 4.0 de acuerdo a Biggerstaff (2014). Fuente: Fodecyt 16-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

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Figura 12. Total de individuos de las especies de zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en diferentes hábitats.

Fuente: Fodecyt 16-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

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Figura 13. Tasas de infección* en las especies de zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en época seca y lluviosa.

*Tasa de infección por el método de máxima verosimilitud, con corrección para el sesgo, e intervalos de confianza corregidos calculados con PooledInfRate 4.0 de acuerdo a Biggerstaff (2014). Fuente: Fodecyt 16-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

Figura 14. Total de individuos de las especies de zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en época seca y lluviosa.

Fuente: Fodecyt 16-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

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Cuadro 4. Porcentaje de hospederos mamíferos y aviares identificados en las especies de zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal.

Especie de zancudo

Hospedero identificado* Tasa de infección/ 1000 zancudos**

(Intervalo de confianza al 95%)

Especie n (%) Flavivirus Alphavirus Orthobunyavirus

Ae. angustivittatus (n=11)

Otra ave**

4.79 (0.92-15.21)

2.4 (0.14-11.45)

Gallina

Otro mamífero** 1 (9%)

Vaca 4 (36%)

Ratón

Perro

Caballo 6 (55%)

Cx. interrogator (n=2)

Otra ave**

8.18 (0.50-38.44) 8.22 (0.50-38.71)

Gallina

Otro mamífero**

Vaca 1 (50%)

Ratón

Perro

Caballo 1 (50%)

Cx. mollis/Cx. inflictus (n=19)

Otra ave** 3 (16%)

0.43 (0.02-2.07)

Gallina

Otro mamífero** 2 (11%)

Vaca 9 (47%)

Ratón

Perro

Caballo 5 (26%)

Cx. nigripalpus (n=175)

Otra ave** 3 (2%)

0.68 (0.22-1.62)

Gallina 2 (1%)

Otro mamífero** 11 (6%)

Vaca 123 (70%)

Ratón 15 (9%)

Perro 2 (1%)

Caballo 19 (11%)

Ps. confinnis (n=36)

Otra ave** 4 (11%)

5.41 (0.96-18.58) 9.45 (3.40-21.64)

Gallina

Otro mamífero** 1 (3%)

Vaca 15 (42%)

Ratón 1 (3%)

Perro

Caballo 15 (42%)

Cx. quinquefasciatus (n=112)

Otra ave** 7 (6%)

3.35 (0.61-10.85)

Gallina 4 (4%)

Otro mamífero** 44 (39%)

Vaca

Ratón 29 (26%)

Perro 13 (12%)

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Especie de zancudo

Hospedero identificado* Tasa de infección/ 1000 zancudos**

(Intervalo de confianza al 95%)

Especie n (%) Flavivirus Alphavirus Orthobunyavirus

Caballo 15 (13%)

Cx. taeniopus (n=14)

Otra ave**

1.81 (0.11-8.66)

Gallina

Otro mamífero** 2 (14%)

Vaca 5 (36%)

Ratón 3 (21%)

Perro

Caballo 4 (29%)

*Se analizó la presencia de hosperos específicos tanto mamíferos como aviares inlcuyendo: vaca, ratón, perro, caballo, cabra, cerdo, humano y gallina. En ninguna muestra analizada se detectó ingesta sanguínea proveniente de cabra, cerdo o humano. **No identificado. ***Tasas de infección generales para la especie, sin tomar en cuenta el hábitat o época. Se tomó en cuenta el número de lotes positivos y negativos, así como el número de individuos en cada lote. Calculadas por el método de máxima verosimilitud, con corrección para el sesgo, e intervalos de confianza corregidos calculados con PooledInfRate 4.0 de acuerdo a Biggerstaff (2014). Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

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Figura 15. Porcentaje de hospederos vertebrados identificados en las especies de zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en diferentes hábitats

*El patrón de alimentación varía significativamente por hábitat para Cx. mollis/Cx. inflictus (p=0.034), Cx. nigripalpus (p=3.6x10

-4) y Cx.quinquefasciatus (p=1.79.6x10

-

6).

Ae. angustivittatus n=12, Cx. interrogator n=1, Cx. mollis/Cx. inflictus n=21, Cx. nigripalpus n=160, Cx. quinquefasciatus n=117, Cx. taeniopus n=9, Ps. confinnis n=35 Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

* * *

48

Figura 16. Porcentaje de hospederos vertebrados identificados en las especies de zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en época seca y lluviosa.

*El patrón de alimentación varía significativamente por época para Cx. mollis/Cx. inflictus (p=0.004) y Cx. nigripalpus (p=0.00064). Ae. angustivittatus n=12, Cx. interrogator n=1, Cx. mollis/Cx. inflictus n=21, Cx. nigripalpus n=160, Cx. quinquefasciatus n=117, Cx. taeniopus n=9, Ps. confinnis n=35 Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

* *

49

III.1 Discusión de Resultados Objetivo 1: Determinar y evaluar la dinámica de transmisión de Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus en diferentes hábitats de Puerto Barrios, Izabal, Guatemala, para recomendar acciones para su vigilancia y control. En este estudio se detectó por métodos moleculares circulación simultánea de tres géneros importantes de arbovirus en distintos hábitats ecológicos de Puerto Barrios entre 2009 y 2010. Estos resultados indican que la distribución de los arbovirus estudiados no es homogénea en los diferentes hábitats y épocas climáticas de Puerto Barrios durante estos dos años, a su vez, los resultados proveen evidencia adicional que confirma observaciones anteriores. Estudios longitudinales adicionales podrán brindar mayor detalle del comportamiento de estos virus y de su asociación con variables ambientales y otras de importancia. Es importante resaltar que con los ensayos de RT-PCR específico para género utilizados en este estudio no es posible conocer la identidad a nivel de especie de los arbovirus detectados. Esta evidencia molecular debe ser confirmada a través de la secuenciación directa de los productos de PCR. Esto, a su vez puede tener algunas limitantes debido a que la carga viral en un zancudo positivo puede no ser suficiente para proveer material genético de buena calidad para su identificación por secuenciación. La implementación de métodos para ailsamiento viral a través de cultivos celulares es la mejor herramienta para la caracterización de las muestras positivas. Sin embargo, varias de las especies de los arbovirus aquí estudiados requieren laboratorios especializados para cultivo viral con niveles de bioseguridad superiores a actualmente disponibles en Guatemala. En este estudio se encontró que la mayor parte de los zancudos se alimentaron de mamíferos (no humanos); mientras que algunas especies se alimentaron tanto de mamíferos como de aves. La variación en los patrones alimenticios de los zancudos entre distintos hospederos podría constituir un riesgo para la transmisión de arbovirus al humano a partir de otros hospederos reservorios. Entre los distintos hábitats estudiados, se esperaba encontrar ingestas de humano principalmente en el hábitat intradomicilio; No obstante, no se detectaron ingestas de humano, es posible que éste sea un evento raro o dependiente de la disponibilidad y abundancia de otros hospederos preferidos. A su vez, se debe tomar en cuenta que algunas prácticas culturales, como la co-habitación de humanos y animales domésticos de crianza o compañía (ej. aves, perros, cerdos) aumenta la disponibilidad de otros hospederos no humanos en el hábitat intradomicilio. Por otro lado, el rango de vuelo de los zancudos es muy amplio, lo que les permite encontrar diferentes hospederos dentro y fuera de las casas con estructuras no totalmente cerradas. Estas preferecias alimenticias podrían tener implicaciones en la transmisión de diversos arbovirus a humanos, que podría tener un efecto profilático al disminuír la exposición a vectores de los mismos infectados. Con base a los resultados obtenidos, es evidente que el ganado es un hospedero importante para algunas de las especies de zancudos aquí estudiadas, sin embargo, su papel en los ciclos de transmisión de los virus debe investigarse una vez se cuente con mayor información de la identidad de los virus circulantes y de otras especies presentes en las ingestas sanguíneas. En este respecto, se recomienda secuenciar las ingestas

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sanguíneas para identificar otras especies de hospederos vertebrados no detectadas con los primers utilizados. Esto es imporante ya que algunas especies de reptiles y aves silvestres han sido identificadas como reservorios de Flavivirus y Alphavirus en otras localidades, así como otras especies de roedores silvestres en el caso de Orthobunyavirus. Adicionalmente, debido al pequeño número de individuos de algunas especies de zancudos disponibles para el estudio, no es posible concluir sobre el papel de las distintas especies de vectores y hospederos detectados, en los ciclos de transmisión de estos arbovirus. La transmisión de los distintos arbovirus es un fenómeno multifactorial en el que tanto factores ambientales, como estacionales y espaciales facilitan la interacción entre vectores, hospederos reservorios y otros hospederos incidentales susceptibles. Esta dinámica de transmisión puede ser estudiada y eventualemente modelada, a través de investigaciones sistemáticas longitudinales de campo, combinadas con estudios experimentales de laboratorio que confirmen la competencia de las distintas especies de ser infectadas y capaces de mantener transmisión sostenible en la naturaleza. Los resultados de este estudio consituyen un primer paso orientado a capturar información preliminar para identificar en poblaciones locales potenciales reservorios y potenciales vectores importantes en la transmisión de arbovirus. Esta información preliminar podrá guiar futuros estudios y acciones de salud pública; principalmente en la prevención de casos humanos. Objetivo 2: Evaluar la presencia de arbovirus en diferentes hábitats y estaciones climáticas de Puerto Barrios, Izabal a través de pruebas moleculares para Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus.

Los resultados del estudio evidencian la circulación de los arbovirus estudiados en los

seis diferentes hábitats de Puerto Barrios en los que se trabajó. A pesar de tener lotes positivos a Flavivirus, ninguno de estos fue posivito a WNV. Los Flavivirus fueron encontrados principalmente en la especie Cx. nigripalpus el cual ha sido reportado como un vector importante de éstos como el WNV y el virus de Encefalitis de San Luis; así mismo como vector del virus de Encefalitis Equina del Este (Alphavirus) (Zyzak, Loyless, Cope, Wooster, & Day, 2002) (Vitek, Richards, Mores, Day, & Lord, 2008). También se conoce la circulación de Flavivirus no patógenos de zancudos que pueden contribuír a la tasa de infección obtenida en este estudio (ver más adelante).

Los resultados indican que las mayores tasas de infección por arbovirus ocurren en el bosque secundario, pastizales tanto de sol como de sombra y, principalmente en el intradomicilio; por lo que se recomienda que la vigilancia de dichos arbovirus, y el monitoreo de posibles vectores debe ser prioritizado en estos hábitats. Es importante notar que Alphavirus fue detectado únicamente en pastizales y en especies de zancudos que no fueron las más abundantes; sin embargo esto se puede deber a la bionomía del zancudo los cuales se reportan viven en charcos de agua en el piso. Ps. confinnis, especie en la que se encontró Alphavirus, es repotada por la literatura como un posible vector del virus de la Encepalitis Equina Venezolana; un Alphavirus (Ortiz, et al 2005). Adicionalmente, en el caso de los Flavivirus y Alphavirus, la época lluviosa es prioritaria para su vigilancia, mientras que para Orthobunyavirus también lo es la época seca. A este respecto, el desarrollo de programas independientes para el monitoreo de los distintos virus podría ser más adecuado.

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Objetivo 3: Identificar y evaluar los vectores potenciales de arbovirus en los diferentes hábitats y estaciones del año en Puerto Barrios, Izabal.

En muchos de los casos, principalmente en el intradomicilio, la abundancia de zancudos capturados fue baja. Aún, así, se detectaron altas tasas de infección. Esto refuerza que el intradomicilio es un sitio prioritario para la vigilancia de arbovirus.

En el estudio, 48.0% de los lotes positivos fueron de zancudos alimentados. No obstante, solo 4.2% del total de zancudos capturados eran alimentados. Ya que estos zancudos tienen mayor probabilidad de presentar infección por arbovirus (puesto que ya se han alimentado), y que además son útiles para estudiar los patrones de alimentación, los estudios adicionales deben darle mayor énfasis a métodos que colecten principalmente estos zancudos. En este caso, el aspirador fue el método que presentó un mayor rendimiento para la colecta de zancudos alimentados.

Flavivirus

Ae. angustivittatus ha sido reportado como una de las especies de Aedes más comúnes en elevaciones bajas de Centroamérica (Arnell 1976 en WRBU 2014). De ser un vector competente, esta especie podría jugar un papel importante en el ciclo de virus del género Flavivirus, principalmente como vector puente entre los ciclos selváticos y domésticos. Aún no se han reportado en la literatura estudios experimentales de competencia vectorial de esta especie para arbovirus, sin embargo, sí se ha aislado el flavivirus Ilheus, de esta especie en Panamá (De Rodaniche & Galindo 1963). A pesar de que se obtuvo una alta tasa de infección por flavivirus en esta especie, en este estudio se procesaron únicamente 50 pooles de Ae. angustivittatus, por lo que estos resultados deben ser utilizados cuidadosamente. Estudios que incluyan un mayor número de individuos, podrán establecer si Ae. angustivittatus constituye una especie de importancia.

La especie de zancudo Cx. nigripalpus resulta de interés en la vigilancia por su alta

abundancia en todos los hábitats y épocas e infección por Flavivirus en la mayor parte de éstos, con una alta tasa de infección en el intradomicilio. Esta especie es considerada un vector de EEEV, SLEV y WNV (Turell et al. 2005 en WRBU 2014). Por último, en estudios previos realizados en UVG, se aisló WNV de pools de Culex mollis/Cx. inflictus (Morales-Betoulle et al. 2013).

La secuenciación de un lote de Ae. angustivittatus, Cx. nigripalpus y Cx. interrogator

(con fondos de contrapartida), sugiere que el Flavivirus detectado es DENV (ver Anexo 1-4). Aunque se ha reportado DENV en otras especies de Aedes, no tenemos conocimiento de reportes previos en Ae. angustivittatus, y no se conoce que los zancudos Culex sean susceptibles a este virus, por lo que estos resultados deben tomarse con precaución y ser validados.

Como se mencionó anteriormente, es posible que en algunos de los lotes de Culex

spp. positivos a Flavivirus, el agente sean Culex flavivirus, o flavivirus específicos de zancudos. Por ejemplo, CxFV Izabal 2006 fue aislado por primera vez en la región de estudio en la especie de Cx. quinquefasciatus (Morales-Betoulle et al. 2008), el cual fue detectado por PCR con los mismos cebadores utilizados en este estudio. Otros virus similares han sido detectado en especies de la Península de Yucatán, incluyendo Cx. interrogator (tasa de infección 2.6 [IC 95%: 0.48–8.42]), Cx. nigripalpus y Cx. taeniopus

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(sinónimo de Cx. opistophus) (Sirivanakarn & Belkin 1980) en la Península de Yucatán (Saiyasombat et al. 2010).

Alphavirus

Se ha demostrado que Ps. confinnis es susceptible tanto a VEEV de la cepas enzoóticas como epizoóticas (Turell, Barth y Coleman 1999; Ortiz, Anishchenko y Weaver 2005). Este hecho, conjuntamente con su abundancia y patrones de alimentación lo sugieren como un importante vector puente de VEEV (Ortiz, Anishchenko y Weaver 2005). Esta especie fue confirmada como el vector primario durante un brote de VEEV en Texas en 1971, con una tasa de infección de hasta 1 en 100. En este brote se registraron 1500 muertes de equinos y morbilidad en 110 humanos (Sudia et al. 1975a). No tenemos conocimiento de reportes previos de Alphavirus en Cx. interrogator.

Orthobunyavirus

En Guatemala, se tienen reportes previos de Orthobunyavirus aislados de

Cx. taeniopus. En la costa del Pacífico se aisló NEPV (Cupp et al. 1986), y posteriormente se obtuvo evidencia molecular preliminar de circulación de Orthobunyavirus del grupo C y de los serotipos California/Bunyamwera en zancudos de esta especie (de León 2010; Morales-Betoulle et al. 2009, datos no publicados). Por otro lado, se ha aislado WEEV de Cx. quinquefasciatus en California (Carpenter & LaCasse 1955) y Virus Santa Rosa, un posible arbovirus del grupo Bunyamwera, de Ae. angustivittatus en Durango, México (Sudia et al. 1975b; Arbovirus Catalog 2014). No tenemos conocimiento de reportes previos de infección de Ps. confinnis con Orthobunyavirus. Objetivo 4: Identificar y evaluar la fuente de ingesta sanguínea de las especies de zancudos positivos para Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus.

En este objetivo se pretendió establecer el rango de hospederos vertebrados (aves y

mamíferos especialmente humanos) de las especies de zancudos positivas a Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus, para identificar potenciales vectores de estos virus al humano.

Del total de zancudos analizados (356) fue posible identificar la fuente de ingesta

sanguínea de vertebrado en 353 zancudos (98%) en el resto posiblemente la sangre del abdomen se degradó durante su almacenamiento previo a la extracción o la cantidad de ADN extraído no fue suficiente para el análisis, por lo que se exluyeron del análisis (ver Anexo 7).

Como se observa en Anexo 8, con excepción de Cx. interrogator y Cx. taeniopus los

zancudos muestran un patrón de alimentación mixto, es decir se alimentan de un rango diverso de hospederos tanto mamíferos, aviares y vertebrados no identificados, que podrían incluir reptiles o anfibios. En el caso de los zancudos positivos para Flavivirus y algunos Alphavirus, esto es de suma importancia ya que el ciclo de vida de WNV incluye hospederos aviares como los principales reservorios amplificadores del virus y mamíferos como hospederos incidentales. Por otro lado, en el caso de Ortobunyavirus y Alphavirus el

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ciclo de vida implica uno o varios hospederos mamíferos (y aviares en el caso de Alphavirus) para su transmisión. Los roedores han sido identificados como reservorios importantes dado que pueden participal en el ciclo enzoonótico de diversos Alphavirus (incluyendo VEEV) y Ortobunyavirus. Al encontrarse en diferentes hábitats como pastizales y peridomicilio (Anexo 10) pueden servir como reservorio para la transmisión en equinos que a su vez pueden servir como hospederos amplificadores. En general, se encontró un alto porcentaje de ingestas provenientes de vaca (susceptibles a algunos Ortobunyavirus) y caballo, siendo éstos últimos de interés especial puesto que están involucrados en el ciclo epizoótico de varios arbovirus incluyendo VEEV y WNV.

De acuerdo a el análisis estadístico realizado (ver Anexo 10 y Anexo 11) se puede

observar en en varias especies (Cx. nigripalpus, Cx. quinquefasciatus y Cx. mollis/Cx. inflictus) el patrón de alimentación varía significativamente por hábitat y en el caso de Cx. nigripalpus y Cx. mollis/Cx. inflictus también es significativa por época de colecta.

En cuanto a los patrones de alimentación, Cx. nigripalpus se ha descrito como

extremadamente oportunista, alimentándose de un rango variado de hospederos con tendencia por los hospederos aviares (Edman y Taylor 1968). Dentro de los hospederos domésticos se ha documentado que esta especie tiene cierta preferencia por la gallina, aunque también se han identificado otros hospederos aviares como T. gray y Q. mexicanus, que han sido descritos como una fuente significativa de infecciones de WNV debido a que se han detectado niveles significativos de seroprevalencia contra este virus (Kading et al. 2013). Los hospederos mamíferos más comunes descritos en esta especie son bovinos, equinos (Kading et al. 2013), perro y roedores (Laporta et al. 2008). El mayor número de ingestas identificadas fue en el hábitat de pastizal al sol, en donde se detectó el mayor número de ingestas provenientes de vaca y/o caballo. Esto posiblemente se debe a la alta disponibilidad de estos hospederos ya que la selección es influenciada por la abundancia relativa de éstos en cada hábitat (Day 1993). Respecto al hábitat de colecta, se observó que el patrón de alimentación varía significativamente tanto por hábitat como por época, respaldando los comportamientos oportunistas reportados en la literatura.

Por otro lado, se identificó ingesta sanguínea proveniente de reptiles o anfibios

(especialmente en el hábitat “bosque secundario”) ver Figura 15. La literatura reporta que iguanas y lagartijas has sido hospederos identificados en la ingesta de los zancudos; por lo que es posible que estos sean los hospederos de éstas ingestas (Kading et al. 2013). En este estudio se puede observar que esta especie presentó el rango más diverso de hospederos (mamífero, ave y otros vertebrados no identificados que podrían incluir reptiles o anfibios) de todos los zancudos analizados, lo que concuerda con la literatura respecto a lo oportunista de la especie.

Al igual que Cx. nigripalpus, Cx. quinquefasciatus también es una especie

oportunista. Dentro de las preferencias alimentarias se han descrito diversos hospederos tanto aviares como mamíferos dependiendo de la disponibilidad de éstos en cada hábitat. Dentro de los resultados de este estudio, la mayoría de las ingestas identificadas provenían de otro mamífero diferente a los analizados, seguido de ratón, caballo, perro, otra ave diferente a gallina y gallina. Dentro de los mamíferos se ha descrito que esta especie tiene cierta preferencia por perros, humanos (Molaei et al. 2007; Garcia-Rejon et al. 2013; Gomes et al. 2003) y roedores (Alencar et al. 2012), que concuerda con los resultados obtenidos pues se detectó un alto porcentaje de ingestas provenientes de perro y ratón que apoya la literatura citada. Respecto a los hospederos aviares, las gallinas han sido

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descritas como hospderos importantes (Alencar et al. 2012; Kading et al. 2013), así como otras aves no domésticas como palomas y paserinas (gorriones, pinzones y cuervos), siendo éstas últimas hospederos competentes de WNV (Lura et al. 2012). En este estudio se identificaron ingestas sanguíneas provenientes de gallina y otra ave no identificada que pudiera ser alguna de las descritas anteriormente. Al igual que en el caso de Cx. nigripalpus, las ingestas aviares detectadas para Cx. quinquefasciatus, son más bajas a lo resportado en la literatura, debido posiblemente a la disponibilidad de hospederos. Respecto al hábitat, se encontró una alimentación mixta (hospederos aviares, mamíferos y otros vertebrados no identificados que podrían incluir reptiles o anfibios) en peridomicilio, intradomicilio y dormidero Quiscalus, mientras que en pastizal al sol se encontraron únicamente ingestas sanguíneas provenientes de hospederos vertebrados no identificados. Es posibleque estas ingestas provengan de anfibios, pues se ha documentado que ocasionalmente Cx. quinquefasciatus se alimenta de estos hospederos (Savage et al. 2007).

Aunque para Cx. taeniopus no hay suficiente información disponible sobre los patrones de alimentación, varios estudios sugieren la preferencia de esta especie por los hospederos mamíferos bovinos y caninos (Ramírez 2010 y Cupp et al. 1986). Como se puede observar en las Figuras 15-16 esta especie tiene preferencia por los mamíferos, pues en los diferentes hábitats de colecta sólo se identificaron ingestas sanguíneas de mamíferos. Las especies mayormente identificadas son vaca, caballo, ratón y otro mamífero diferente a los analizados.

Para Cx. interrogator únicamente se han reportado ingestas sanguíneas

provenientes de hospderos aviares (Kading et al. 2013), sin embargo en este estudio únicamente se detectó ingesta sanguínea de mamíferos: vaca y caballo. Debido a que el número de zancudos analizados es extremadamente bajo no es posible inferir sobre las preferencias alimenticias de esta especie.

Por otro lado, Ae. angustivittatus se ha descrito con tendencia a picar animales, en

especial equinos (Parra-Henao y Suárez 2012), sin embargo, no se encontró más información sobre los patrones de alimentación. En este estudio se detectaron ingestas sanguíneas proveniente de mamíferos y de vertebrados no identificados. Las ingestas de mamífero identificadas fueron provenientes de caballo, vaca y otro mamífero diferente a los analizados.

En el caso de Cx. mollis/Cx. inflictus no se encontró literatura disponible para comparar

los patrones de alimentación. En este estudio se encontraron ingestas provenientes tanto de hospederos mamíferos como aviares, incluyendo vaca, caballo, otra ave diferente a gallina y otro mamífero diferente a los analizados.

En general se observó un menor número de ingestas aviares al reportado, debido

posiblemente a la disponibilidad de hospederos. Aunque no se identificaron ingestas provenientes de humanos, existe un riesgo de transmisión a éste debido a la circulación de los virus en especies que están en cercanía y que pudieran servir como reservorio del virus. En peridomicilio como intradomicilio se identificaron diversos hospederos, incluyendo vertebrados no identificados que, de ser reservorios, pudieran estar en contacto con zancudos que posteriormente puedan transmitir enfermedades al humano.

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PARTE IV.

IV.1 CONCLUSIONES Objetivo 1: Determinar y evaluar la dinámica de transmisión de Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus en diferentes hábitats de Puerto Barrios, Izabal, Guatemala, para recomendar acciones para su vigilancia y control.

Se detectó la presencia de Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus en zancudos colectados en diferentes hábitats de Puerto Barrios.

La diversidad de hospederos aviares y mamíferos de los cuales los zancudos se alimentan podría constituir un riesgo para la transmisión de arbovirus zoonóticos para los humanos en los hábitats estudiados.

En las especies de zancudos estudiadas no se detectaron ingestas de sangre humana, lo que sugiere una preferencia hacia hospederos no-humanos. Dichas preferencias podrían tener implicaciones en la transmisión de diversos arbovirus a humanos durante los picos de mayor circulación viral en otros reservorios animales.

La identificación de arbovirus en las especies de zancudos estudiadas, combinada con las preferencias alimenticias de los mismos provee información fundamental necesaria para guiar futuros estudios para la identificación de especies vectores que puedan sostener transmisión de distintos arbovirus al momento de presentarse un brote.

Objetivo 2: Evaluar la presencia de arbovirus en diferentes hábitats y estaciones climáticas de Puerto Barrios, Izabal a través de pruebas moleculares para Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus.

La presencia de Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus varía entre los diferentes hábitats y estaciones del año.

Los virus del género Flavivirus se encontraron principalmente en bosque secundario y en intradomicilio, mientras que los Alphavirus se encontraron solamente en pastizales y los Orthobunyavirus principalmente en pastizal.

La presencia de Alphavirus y Orthobunyavirus en zancudos colectados en los hábitats de pastizal en diferentes épocas del año sugiere circulación enzoótica en ciclo selvático de dichos virus entre vectores y hosopederos mamíferos involucrados.

Se detectó circulación de de Flavivirus y Alphavirus durante la época lluviosa, mientras que Orthobunyavirus fue detectado en ambas épocas, sugiriendo distintos patrones de estacionalidad entre diferentes arbovirus.

Las mayores tasas de infección para los arbovirus estudiados se presentaron durante la época seca.

Objetivo 3: Identificar y evaluar los vectores potenciales de arbovirus en los diferentes hábitats y estaciones del año en Puerto Barrios, Izabal.

La mayor abundancia de zancudos fue detectada en el bosque secundario.

La mayor abundancia de zancudos fue detectada durante la época lluviosa.

Se detectó Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus en siete de las especies de zancudos capturadas.

De las especies positivas a las arbovirus estudiados la especie mas abundante fue Cx. nigripalpus.

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Todas las especies positivas fueron más abundantes durante la época lluviosa, con excepción de Cx. quinquefasciatus, que fue más abundante durante la época seca

Aunque las mayores abundancia de zancudos positivos a Flavivirus se registró en el bosque secundario y las menores en el intradomicilio; el intradomicilio presentó las mayores tasas de infección por estos virus.

La identificación de DENV en la especie de zancudo Ae. angustivittatus sugiere un papel potencial no antes reportado como vector de este Flavivirus.

Objetivo 4: Identificar y evaluar la fuente de ingesta sanguínea de las especies de zancudos positivos para Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus.

Se observó que los zancudos se alimentan principalmente de mamíferos: o Cx. nigripalpus se alimenta principalmente de vaca, caballo y ratón. o Cx. quinquefasciatus se alimenta principalmente de otro(s) mamífero(s)

diferente a los analizados, ratón y caballo. o Cx. taeniopus se alimenta principalmente de vaca, caballo y ratón. o Cx. interrogator se alimenta principalmente de vaca y caballo. o Ae.angustivittatus se alimenta principalmente de vaca, caballo y otro

mamífero diferente a los analizados. o Cx. mollis/Cx. inflictus se alimenta principalmente de vaca, caballo y otra ave

diferente a la analizada.

No se encontraron ingestas sanguíneas provenientes de humanos, lo que sugiere que la transmisión de los arbovirus circulantes podría estar contenida dentro de ciclos enzootícos.

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IV.2 RECOMENDACIONES Objetivo 1: Determinar y evaluar la dinámica de transmisión de Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus en diferentes hábitats de Puerto Barrios, Izabal, Guatemala, para recomendar acciones para su vigilancia y control.

Se recomienda la continuación de este tipo de estudios con el objetivo de general y acumular información para entender mejor la dinámica de transmisión de distintos arbovirus circulantes tanto en la región de estudio como en otras regiones del país.

Los hallazgos de este estudio y previas investigaciones sugieren que es importante evaluar la circulación de arbovirus en zancudos vectores a lo largo del tiempo en distintas estaciones del año bajo diseños de estudio que incorporen vigilancia en vectores y hospederos vertebrados, así como variables ambientales, con el objetivo de monitorear y modelar el comportamiento de los virus zoonóticos circulantes.

La información generada a través de esta investigación resalta la necesidad de implementar programas de monitoreo de los distintos arbovirus para la detección temprana y mejorar la respuesta a brotes de naturaleza zoonótica en el país.

Objetivo 2: Evaluar la presencia de arbovirus en diferentes hábitats y estaciones climáticas de Puerto Barrios, Izabal a través de pruebas moleculares para Flavivirus, Alphavirus y Orthobunyavirus.

Realizar este estudio con mayor frecuencia (mas veces al año) y con mayor intensidad de muestreo.

Establecer diagnóstico diferencial por técnicas moleculares y secuenciación para especies específicas de los géneros de virus estudiados en este proyecto.

Incorporar a este tipo de estudio la toma de muestra de hospederos animales que habitan en proximidad a los hábitats de zancudos, e implementar diagnóstico serológico para la detección de anticuerpos contra distintos arbovirus, con el objetivo de identificar reservorios potenciales.

Objetivo 3: Identificar y evaluar los vectores potenciales de arbovirus en los diferentes hábitats y estaciones del año en Puerto Barrios, Izabal.

Realizar estudios de competencia vectorial en las especies de zancudos que fueron positivas para algunos de estos arbovirus con el objetivo de establecer su potencial como vectores.

Incorporar la secuenciación al diagnóstico molecular de arbovirus para identificar los virus circulantes.

Reforzar la implementación de medidas educativas en las comunidades involucradas para reducir la densidad de zancudos y la exposición a éstos durante las épocas de lluvia.

Objetivo 4: Identificar y evaluar la fuente de ingesta sanguínea de las especies de zancudos positivos para Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus.

Incorporar al diseño de futuros estudios la colección de datos de disponibilidad de hospederos, en donde se capturen los zancudos, con el objetivo de calcular índices de alimentación.

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Se recomienda incorporar a las pruebas de identificación de ingesta sanguínea la secuenciación del producto de PCR de vertebrado para establecer con mayor precisión la fuente de alimentación de las distintas especies de zancudos

Debido que en algunos casos se disponía de un número limitado de zancudos se recomienda aumentar el esfuerzo de muestreo para obtener un mayor número de individuos.

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IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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70

IV.4 ANEXOS Anexo 1. Cromatograma obtenido a partir del producto de PCR para detección de flavivirus de la muestra GU-2009-07188 proveniente de un lote de Ae. angustivitattus

A B

La secuencia A) fue obtenida utilizando el primer forward (FU1) mientras que la secuencia B) fue obtenida utilizando el primer reverse (CFU2). Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011)

Anexo 2. Cromatograma obtenido a partir del producto de PCR para detección de flavivirus de la

muestra GU-2009-07717 proveniente de un lote de Cx. nigripalpus

A B

La secuencia A) fue obtenida utilizando el primer forward (FU1) mientras que la secuencia B) fue obtenida utilizando el primer reverse (CFU2). Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

71

Anexo 3. Cromatograma obtenido a partir del producto de PCR para detección de flavivirus de la

muestra GU-2009-07880 proveniente de un lote de Cx. interrogator

A B La secuencia A) fue obtenida utilizando el primer forward (FU1) mientras que la secuencia B) fue obtenida utilizando el primer reverse (CFU2). Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

Anexo 4. Resultados de la alineación de los productos del PCR para detección de flavivirus

obtenidos con el programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)

Las alineaciones de las tres muestras analizadas mostraron el mismo resultado que el mostrado. Base de datos utilizada: Nucleotide Collection (nr/nt), optimised for highly similar sequence (megablast). Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

72

Anexo 5. Tasas de infección* en los zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en diferentes hábitats y en época seca y lluviosa.

Virus Especie de

zancudo Hábitat Epoca Tasa Inf. IC 95% Lotes

Lotes (+) Indiv.

Flavivirus Ae. angustivittatus Todos Todas 4.79 (0.92;15.21) 48 2 401

Cx. interrogator Todos Todas 8.18 (0.5;38.44) 27 1 117

Cx. mollis/Cx. inflictus Todos Todas 0.43 (0.02;2.07) 117 1 2329

Cx. nigripalpus Todos Todas 0.68 (0.22;1.62) 176 4 5942

Alphavirus Cx. interrogator Todos Todas 8.22 (0.5;38.71) 27 1 117

Ps. confinnis Todos Todas 5.41 (0.96;18.58) 39 2 405

Orthobunyavirus Ae. angustivittatus Todos Todas 2.4 (0.14;11.45) 48 1 401

Cx. quinquefasciatus Todos Todas 3.35 (0.61;10.85) 73 2 593

Cx. taeniopus Todos Todas 1.81 (0.11;8.66) 44 1 534

Ps. confinnis Todos Todas 9.45 (3.4;21.64) 39 4 405

Flavivirus Ae. angustivittatus Intradomicilio Todas 88.69 (6.09;351.08) 5 1 10

Ae. angustivittatus Bosque secund. Todas 7.19 (0.5;34.17) 14 1 120

Cx. interrogator Bosque secund Todas 30.28 (2.26;140.99) 5 1 27

Cx. mollis/Cx. inflictus Intradomicilio Todas 31.41 (1.77;193.21) 6 1 37

Cx. nigripalpus Intradomicilio Todas 28.79 (1.58;161.3) 7 1 40

Cx. nigripalpus Peridomicilio Todas 1.76 (0.11;8.42) 17 1 549

Cx. nigripalpus Pastizal sol Todas 0.56 (0.03;2.73) 41 1 1782

Cx. nigripalpus Bosque secund. Todas 0.39 (0.02;1.88) 68 1 2585

Alphavirus Cx. interrogator Pastizal sombra Todas 24.23 (1.74;110.05) 9 1 35

Ps. confinnis Pastizal sol Todas 7.96 (1.4;28.04) 27 2 287

Orthobunyavirus Ae. angustivittatus Bosque secund. Todas 7.22 (0.5;34.37) 14 1 120

Cx. quinquefasciatus Intradomicilio Todas 9.23 (0.55;45.07) 14 1 108

Cx. quinquefasciatus Dormidero Todas 2.3 (0.14;10.98) 42 1 423

Cx. taeniopus Pastizal sombra Todas 20 (2;104.25) 7 1 32

Ps. confinnis Pastizal sol Todas 12.96 (4.95;29.37) 27 4 287

Flavivirus Ae. angustivittatus Todos Lluviosa 4.9 (0.94;15.56) 42 2 391

Cx. interrogator Todos Lluviosa 10.27 (0.64;48) 17 1 91

Cx. mollis/Cx. inflictus Todos Lluviosa 0.69 (0.04;3.32) 74 1 1448

Cx. nigripalpus Todos Lluviosa 0.75 (0.24;1.8) 150 4 5359

Alphavirus Cx. interrogator Todos Lluviosa 10.32 (0.65;48.41) 17 1 91

Ps. confinnis Todos Lluviosa 5.68 (1.01;19.54) 32 2 387

Orthobunyavirus Ae. angustivittatus Todos Lluviosa 2.46 (0.15;11.71) 42 1 391

Cx. quinquefasciatus Todos Seca 5.45 (1.01;17.54) 39 2 363

Cx. taeniopus Todos Seca 3.88 (0.25;18.57) 18 1 235

Ps. confinnis Todos Lluviosa 4.93 (0.95;15.63) 32 2 387

Ps. confinnis Todos Seca 100.34 (22.94;279.76) 7 2 18

*Tasa de infección calculada por el método de máxima verosimilitud, con corrección para el sesgo, e intervalos de confianza corregidos calculados con PooledInfRate 4.0 (Biggerstaff 2014). No se muestran los estimados de la tasa de infección <= 0. Tasa Inf.=tasa de infección/1,000 individuos; IC 95%=intervalo de confianza al 95%; Lotes (+) =número de lotes positivos; Indiv.=número de individuos. Fuente: Fodecyt 16-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

73

Anexo 6. Total de zancudos hembra adultos colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en diferentes hábitats y en época seca y lluviosa.

No. Especies / Hábitats

Época lluviosa

Época seca Total Bosque

Secundario Pastizal Sombra

Pastizal Sol

Dormidero Peridomicilio Intradomicilio Total

Lluviosa Bosque

Secundario Pastizal Sombra

Pastizal Sol

Dormidero Peridomicilio Intradomicilio Total Seca

1 Aedeomyia squamipennis 0 1 0 0 0 0 1

0 0 0 0 0 0 0

1

2 Aedes aegypti 0 0 0 1 0 0 1

0 0 0 12 0 2 14

15

3 Ae. albopictus 0 0 0 2 0 1 3

0 5 0 0 0 0 5

8

4 Ae. angustivittatus 118 16 113 5 133 10 395

6 2 1 1 0 0 10

405

5 Ae. hastatus 0 0 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0

0

6 Ae. scapularis 7 4 12 0 8 0 31

0 1 0 0 0 0 1

32

7 Ae. serratus 4 0 0 0 0 0 4

0 0 0 0 0 0 0

4

8 Ae. sp. 139 27 743 5 30 0 944

6 0 0 0 0 0 6

950

9 Ae. taeniorhynchus 0 44 1 6 3 0 54

0 0 0 0 0 0 0

54

10 Anopheles albimanus 0 1 1 0 0 0 2

0 0 1 0 0 0 1

3

11 An. apicimacula 0 0 0 0 0 0 0

2 0 0 0 0 0 2

2

12 An. neomaculipalpus 0 0 0 0 0 0 0

0 0 2 0 0 0 2

2

13 An. punctimacula 0 0 0 0 0 0 0

4 1 0 0 0 0 5

5

14 An. sp 0 1 7 0 0 0 8

1 1 0 0 0 0 2

10

15 An. vestitipennis 0 0 2 0 0 0 2

1 0 1 0 0 0 2

4

16 Coquilletidia sp.* 5 2 2 1 0 0 10

1 0 4 0 0 0 5

15

17 Culex (Culex.) sp. * 2987 2139 3671 267 626 65 9755

1589 45 15 28 5 0 1682

11437

18 Cx. (Melanoconion) sp.* 152 2 143 2 2 0 301

109 0 9 2 1 0 121

422

19 Cx. chidesteri 203 78 54 1 40 8 384

460 17 4 5 0 0 486

870

20 Cx. coronator s.l. 9 4 8 86 4 1 112

5 5 1 24 0 2 37

149

21 Cx. declarator/mollis** 0 1 0 0 1 0 2

0 0 0 0 0 0 0

2

22 Cx. erraticus 2 0 9 0 0 0 11

0 0 0 0 0 0 0

11

23 Cx. inflictus 67 59 38 0 40 2 206

70 3 2 0 0 0 75

281

24 Cx. interrogator 15 29 4 15 27 1 91

12 6 0 7 1 0 26

117

25 Cx. mollis/Cx. inflictus** 737 283 212 5 224 37 1498

838 27 6 6 4 0 881

2379

26 Cx. nigripalpus 2078 959 1785 16 549 40 5427

619 8 0 3 0 0 630

6057

27 Cx. quinquefasciatus 1 0 3 210 8 8 230

2 1 0 214 47 100 364

594

28 Cx. sp. 0 0 0 0 0 0 0

0 0 1 0 0 0 1

1

29 Cx. taeniopus 141 29 110 0 11 8 299

218 3 11 0 1 2 235

534

30 Cx. theobaldi 85 2 3 2 7 0 99

96 0 0 1 0 0 97

196

74

No. Especies / Hábitats

Época lluviosa

Época seca Total Bosque

Secundario Pastizal Sombra

Pastizal Sol

Dormidero Peridomicilio Intradomicilio Total

Lluviosa Bosque

Secundario Pastizal Sombra

Pastizal Sol

Dormidero Peridomicilio Intradomicilio Total Seca

31 Ma. dyari 1 9 53 0 6 1 70

0 0 0 0 0 0 0

70

32 Ma. titillans 0 13 127 0 5 1 146

1 1 0 1 0 0 3

149

33 Psorophora albipes 405 43 148 0 160 9 765

19 1 5 0 0 0 25

790

34 Ps. cingulata 0 0 1 0 0 0 1

133 0 1 0 0 0 134

135

35 Ps. confinnis 106 10 279 0 0 0 395

0 2 16 0 0 0 18

413

36 Ps. sp.* 651 30 141 2 18 4 846

7 0 2 0 0 0 9

855

37 Ps. varipes 32 4 7 0 7 6 56

0 0 0 0 0 0 0

56

38 Trichoprosopon digitatum 1 0 0 0 0 0 1

1 0 0 0 0 0 1

2

39 Uranotaenia lowii 0 1 2 3 0 0 6

0 0 5 1 0 0 6

12

40 Ur. orthodoxa 0 1 0 0 0 0 1

1 1 0 0 0 0 2

3

Total 7946 3792 7679 629 1909 202 22157

4201 130 87 305 59 106 4888

27045

*Especímenes no identificados hasta especie debido a falta de caracteres importantes para la identificación. Podrían comprender varias especies. **Dos especies que no pudieron diferenciarse, puede ser solo una o ambas. Fuente: Fodecyt 16-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

75

Anexo 7. Resultados obtenidos en el laboratorio para la determinación del hospedero fuente de la ingesta sanguínea en los zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal.

* PCR interno: PCR para amplificar el gen mitocondrial ND4 del zancudo, con el fin de verificar si se extrajo ADN y si éste era amplificable; ** PCR vertebrado: PCR para amplificar el gen del citocromo b de vertebrado a modo de verificar que los zancudos analizados contenían ingesta sanguínea proveniente de un hospedero vertebrado; ***De las 303 ingestas provenientes de mamíferos se identificaron 346 ingestas provenientes de hospederos específicos mixtos (ingestas sanguíneas provenientes de más de un hospedero). Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

76

Anexo 8. Hospederos vertebrados identificados en los zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal.

Especie de zancudo Ave Mamífero Otro vertebrado* Total

Ae. angustivittatus 0 (0%) 9 (75%) 3 (25%) 12 (100%)

Cx. interrogator 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Cx. mollis/Cx. inflictus 3 (14%) 16 (76%) 2 (10%) 21 (100%)

Cx. nigripalpus 5 (3%) 149 (93%) 6 (4%) 160 (100%)

Cx. quinquefasciatus 11 (9%) 97 (83%) 9 (8%) 117 (100%)

Cx. taeniopus 0 (0%) 9 (100%) 0 (0%) 9 (100%)

Ps. confinnis 4 (11%) 22 (63%) 9 (26%) 35 (100%)

Total 23 (6%) 303 (85%) 29 (8%) 355 (100%)

*No identificado, El total de zancudos fue calculado contando el número de ingestas identificadas tomando en cuenta que un mismo individuo podría tener una o más ingestas. Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011)

Anexo 9. Hospederos mamíferos y aviares identificados en los zancudos positivos a Flavivirus,

Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal.

*No identificado El total de zancudos fue calculado contando el número de ingestas identificadas tomando en cuenta que un mismo individuo podría tener una o más ingestas. Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011)

Anexo 10. Hospederos vertebrados identificados en los zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en diferentes hábitats.

Especie de zancudo Hábitat Ave Mamífero Otro vertebrado* Total

p**

Ae. angustivittatus Bosque secundario 0 (0%) 1 (33%) 2 (67%) 3 (100%)

0.555 Pastizal al sol 0 (0%) 6 (86%) 1 (14%) 7 (100%)

Pastizal con sombra 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Peridomicilio 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Cx. interrogator Pastizal con sombra 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) 1.000

Cx. mollis/Cx. inflictus Bosque secundario 1 (17%) 3 (50%) 2 (33%) 6 (100%)

0.034 Pastizal al sol 0 (0%) 10 (100%) 0 (0%) 10 (100%)

Pastizal con sombra 2 (50%) 2 (50%) 0 (0%) 4 (100%)

Peridomicilio 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Especie de zancudo Gallina Otra ave* Caballo Perro Ratón Vaca Otro

mamífero* Total

Ae. angustivittatus 0 (0%) 0 (0%) 6 (55%) 0 (0%) 0 (0%) 4 (36%) 1 (9%) 11 (100%)

Cx. interrogator 0 (0%) 0 (0%) 1 (50%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (50%) 0 (0%) 2 (100%)

Cx. mollis/Cx. inflictus 0 (0%) 3 (16%) 5 (26%) 0 (0%) 0 (0%) 9 (47%) 2 (11%) 19 (100%)

Cx. nigripalpus 2 (1%) 3 (2%) 19 (11%) 2 (1%) 15 (9%) 123 (70%) 11 (6%) 175 (100%)

Cx. quinquefasciatus 4 (4%) 7 (6%) 15 (13%) 13 (12%) 29 (26%) 0 (0%) 44 (39%) 112 (100%)

Cx. taeniopus 0 (0%) 0 (0%) 4 (29%) 0 (0%) 3 (21%) 5 (36%) 2 (14%) 14 (100%)

Ps. confinnis 0 (0%) 4 (11%) 15 (42%) 0 (0%) 1 (3%) 15 (42%) 1 (3%) 36 (100%)

Total 6 (2%) 17 (5%) 65 (18%) 15 (4%) 48 (13%) 157 (43%) 61 (17%) 369 (100%)

77

Especie de zancudo Hábitat Ave Mamífero Otro vertebrado* Total

p**

Cx. nigripalpus Bosque secundario 1 (17%) 2 (33%) 3 (50%) 6 (100%)

3.6x10-4

Pastizal al sol 2 (1%) 138 (97%) 3 (2%) 143 (100%)

Pastizal con sombra 1 (14%) 6 (86%) 0 (0%) 7 (100%)

Peridomicilio 1 (25%) 3 (75%) 0 (0%) 4 (100%)

Cx. quinquefasciatus Dormidero Quiscalus 7 (8%) 76 (92%) 0 (0%) 83 (100%)

9.6x10-6

Intradomicilio 3 (14%) 15 (68%) 4 (18%) 22 (100%)

Pastizal al sol 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%) 1 (100%)

Peridomicilio 1 (9%) 6 (55%) 4 (36%) 11 (100%)

Cx. taeniopus Bosque secundario 0 (0%) 1 (100%) 0 (0% ) 1 (100%)

1.000 Intradomicilio 0 (0%) 2 (100%) 0 (0%) 2 (100%)

Pastizal al sol 0 (0%) 5 (100%) 0 (0%) 5 (100%)

Pastizal con sombra 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Ps. confinnis Bosque secundario 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) 1.000

Pastizal al sol 4 (12%) 21 (62%) 9 (26%) 34 (100%)

Total 23 (6%) 303 (85%) 29 (8% ) 355 (100%)

*No identificado **Calculado con el test exacto de Fisher El total de zancudos fue calculado contando el número de ingestas identificadas tomando en cuenta que un mismo individuo podría tener una o más ingestas. Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011).

Anexo 11. Hospederos vertebrados identificados en los zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en época seca y lluviosa.

Especie de zancudo Época de colecta Ave Mamífero

Otro vertebrado* Total p**

Ae. angustivittatus Seca 0 (0%) 9 (75%) 3 (25%) 12 (100%) 1.000

Cx. interrogator LLuviosa 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) 1.000 Cx. mollis/Cx. inflictus

LLuviosa 3 (75%) 1 (25%) 0 (0%) 4 (100%)

0.004 Seca 0 (0%) 15 (88%) 2 (12%) 17 (100%)

Cx. nigripalpus

LLuviosa 2 (67%) 0 (0%) 1 (33%) 3 (100%)

0.00064

Seca 3 (2%) 149

(95%) 5 (3%) 157

(100%)

Cx. quinquefasciatus

LLuviosa 7 (9%) 60 (80%) 8 (11%) 75 (100%)

0.263 Seca 4 (10%) 37 (88%) 1 (2%) 42 (100%)

Cx. taeniopus

LLuviosa 0 (0%) 3 (100%) 0 (0%) 3 (100%)

1.000 Seca 0 (0%) 6 (100%) 0 (0%) 6 (100%)

Ps. confinnis

LLuviosa 0 (0%) 3 (100%) 0 (0%) 3 (100%)

0.682 Seca 4 (13%) 19 (59%) 9 (28%) 32 (100%)

Total

23 (6%) 303

(85%) 29 (8%) 355

(100%) *No identificado **Calculado con el test exacto de Fisher El total de zancudos fue calculado contando el número de ingestas identificadas tomando en cuenta que un mismo individuo podría tener una o más ingestas. Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011)

78

Anexo 12. Hospederos vertebrados identificados en otras especies de zancudos colectados en

2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en época seca y lluviosa.

Especie de zancudo Época de colecta Ave Mamífero Otro vertebrado* Total

Ae. taeniorhynchus Seca 0 (0%) 2 (67%) 1 (33%) 3 (100%) Ps. albipes Seca 0 (0%) 12 (100%) 0 (0%) 12 (100%) Ma. titillans Seca 1 (7%) 14 (93%) 0 (0%) 15 (100%) Cx. chidesteri Seca 0 (0%) 3 (100%) 0 (0%) 3 (100%) Ps. varipes Seca 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) An. albimanus Seca 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) Ps. cingulata Seca 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) Cx. complejo coronator Seca 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) An. neomaculipalpus Seca 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) Ae. aegypti Seca 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Total

1 (3%) 37 (95%) 1 (3%) 39 (100%)

*No identificado El total de zancudos fue calculado contando el número de ingestas identificadas tomando en cuenta que un mismo individuo podría tener una o más ingestas. Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011)

Anexo 13. Hospederos vertebrados identificados en otras especies de zancudos colectados en

2009-2010, Puerto Barrios, Izabal en diferentes hábitats.

Especie de zancudo Hábitat Ave Mamífero Otro vertebrado* Total

Ae. taeniorhynchus Pastizal con sombra 0 (0%) 2 (67%) 1 (33%) 3 (100%) Ps. albipes

Bosque secundario 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) Pastizal al sol 0 (0%) 11 (100%) 0 (0%) 11 (100%)

Ma. titillans

Pastizal con sombra 1 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%) Pastizal al sol 0 (0%) 13 (100%) 0 (0%) 13 (100%) Peridomicilio 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Cx. chidesteri

Bosque secundario 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) Dormidero Quiscalus 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) Peridomicilio 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Ps. varipes Pastizal al sol 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) An. albimanus Pastizal al sol 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) Ps. cingulata

Pastizal al sol 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Cx. complejo coronator Pastizal con sombra 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) An. neomaculipalpus Pastizal al sol 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%) Ae. aegypti Dormidero Quiscalus 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Total

1 (3%) 37 (95%) 1 (3%) 39 (100%)

*No identificado El total de zancudos fue calculado contando el número de ingestas identificadas tomando en cuenta que un mismo individuo podría tener una o más ingestas. Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011)

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Anexo 14. Hospederos mamíferos y aviares identificados en los zancudos positivos a Flavivirus, Alphavirus y/o Orthobunyavirus colectados en 2009-2010, Puerto Barrios, Izabal.

*No identificado El total de zancudos fue calculado contando el número de ingestas identificadas tomando en cuenta que un mismo individuo podría tener una o más ingestas. Fuente: Fodecyt 016-2011 y Proyecto Monitoreo Virus del Oeste del Nilo, Acuerdo Cooperativo CDC/CES-UVG (2010-2011)

Especie de zancudo Gallina Otra ave* Caballo Perro Ratón Vaca Otro

mamífero* Total

Ae. taeniorhynchus 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 2 (100%) 0 (0%) 2 (100%)

Ps. albipes 0 (0%) 0 (0%) 3 (25%) 0 (0%) 0 (0%) 7 (58%) 2 (17%) 12 (100%)

Ma. titillans 0 (0%) 1 (6%) 4 (24%) 0 (0%) 0 (0%) 11 (65%) 1 (6%) 17 (100%)

Cx. chidesteri 0 (0%) 0 (0%) 2 (67%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (33%) 3 (100%)

Ps. varipes 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%)

An. albimanus 0 (0%) 0 (0%) 1 (50%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (50%) 0 (0%) 2 (100%)

Ps. cingulata 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Cx. complejo coronator 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

An. neomaculipalpus 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 1 (100%)

Ae. aegypti 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) 1 (100%)

Total 0 (0%) 1 (2%) 12 (29%) 0 (0%) 0 (0%) 24 (59%) 4 (10%) 41 (100%)

80

PARTE V

V.1 INFORME FINANCIERO