Basispracticum Biologische Chemie BIC-10306

Practicumhandleiding Biochemie

Februari 2011

Leerstoelgroepen Biochemie en Moleculaire Biologie

Op de voorkant staat de kristalstructuur van het transacetylase enzym van het pyruvaat dehydrogenase complex uit de bacterie Azotobacter vinelandii. Het transacetylase enzymcomplex vormt de basis voor het pyruvaat dehydrogenase multienzymcomplex. Het multienzymcomplex bestaat uit het pyruvaat dehydrogenase, het dihydrolipoyl transacetylase en het dihydrolipoyl dehydrogenase. De structurele integratie van drie verschillende enzymen maakt een gecoördineerde katalyse van een complexe reactie mogelijk.

Inhoud

INHOUD In dit deel van het practicum Biologische Chemie maken we kennis met een aantal veelgebruikte technieken in de biochemie. In het inleidende college wordt de theoretische achtergrond van de experimenten toegelicht en worden de experimenten globaal besproken en in een kader geplaatst. In de practicumhandleiding is elk experiment voorzien van een inleiding, vervolgens wordt het experimentele deel beschreven. Extra informatie over de experimenten is in het theorie-deel te vinden. Inleiding 2 Blok 1 Proteomics

- Overzicht 5 - Immunoprecipitatie en proteomics (IP) 6 - Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 10 - β-Glucuronidase als reporterenzym voor genexpressie (GUS) 13 - Verslag over de experimenten van blok 1 17

Blok 2 Werkingsmechanismen redoxenzymen

- Overzicht 18 - (In vivo) activiteit en remming van polyphenol oxidase (PPO) 19 - Het werkingsmechanisme van lactaat dehydrogenase 22 - Experimenten met lactaat dehydrogenase (LDH-1) 22 - Het uitwerken van het LDH experiment (LDH-2) 26 - Computer Graphics van LDH (LDH-3) 29 - Verslag over de experimenten van blok 2 32

Blok 3 Klinische en forensische biochemie

- Overzicht 33 - Urinezuurbepaling (UZ) 33 - Klinische enzymactiviteitsmetingen (KE) 35 - Isoenzymen en isoelectrisch focusseren (IEF) 37 - Verslag over de experimenten van blok 3 41

Theorie-deel

- Absorptie en fluorescentie 42 - Spectrofotometrie 43 - Fluorimetrie 46 - Handleiding Jenway fluorimeter 49 - Vrije energie en redoxpotentiaal 50 - Lactaat dehydrogenase 51 - Swiss PDB viewer 54 - Urinezuurbepaling 56 - Het principe van de zuurstofelectrode 56 - Electroforese 58 - Isoenzymen 59 - β-glucuronidase als reporterenzym voor genexpressie 60

- 1 -

Inleiding

INLEIDING Inhoud van het practicum Tijdens het biochemische deel van het practicum Biologische Chemie zal ervaring worden opgedaan met veelgebruikte biochemische technieken, analysemethoden en apparatuur. Bij de keuze van de experimenten is zoveel mogelijk geprobeerd een breed scala aan onderwerpen aan te bieden in een vorm zoals je ze ook in andere niet-biochemische disciplines kunt tegenkomen. Technieken die je tijdens het practicum gaat oefenen zijn de volgende: - het opzetten en in silico uitvoeren van een kwantitatieve immunologische bepaling - het volgen van een protocol van een immunoprecipitatie en de identificatie van

eiwitten met massaspectroscopie - de spectroscopische bepaling van de kinetische eigenschappen van een enzym - polarografische zuurstofmetingen - enzym-ligand bindingstudies mbv fluorescentiespectroscopie - computer graphics van de 3D-structuur van een enzym - het aantonen van isoenzymen mbv. gelelectroforese en activiteitskleuring Opzet van het practicum Het practicum bestaat uit twee delen: een theoretisch en een praktisch deel. De theorie achter de uit te voeren experimenten zal in de colleges behandeld worden. Deze theorie staat ook in de handleiding en verder in het boek Biochemistry, Berg et al. Het praktisch deel omvat het uitvoeren van de experimenten, het (foutloos) uitrekenen van de verkregen resultaten en het schrijven van een verslag. In het verslag moeten de in de handleiding gestelde vragen worden beantwoord. De verslagen worden, mits tijdig ingeleverd, nagekeken en teruggegeven zodat men goed voorbereid aan de toets kan deelnemen. Deze wordt in de examenweek afgenomen. In deze toets zal de kennis over de in het verslag beantwoorde vragen en berekeningen worden getest. Verslag Het verslag dient om de assistent de mogelijkheid te geven te beoordelen hoe je de experimenten hebt uitgevoerd en of je in staat bent de bijbehorende resultaten foutloos uit te rekenen. Via het beantwoorden van vragen wordt ook getest of je de theorie achter de experimenten begrijpt. Gezien deze randvoorwaarden worden aan het verslag de volgende eisen gesteld: - Het verslag dient per blok electronisch te worden aangeleverd bij de betrokken

assistent en de practicumleider. Vergeet niet namen en groepsnummer op de omslag te vermelden.

- De resultaten van de experimenten moeten kort worden beschreven. Dit betekent dat de gemeten waarden overzichtelijk moeten worden gepresenteerd en dat moet worden aangegeven hoe de berekeningen zijn uitgevoerd. Indien de metingen geregistreerd zijn op een recorder dan dienen de recorderresultaten in het verslag grafisch te worden weergegeven. Dit biedt de assistent de mogelijkheid te controleren of de data juist zijn geïnterpreteerd.

- De bij de experimenten gestelde vragen en opdrachten moeten beantwoord en uitgevoerd worden. Aan de kwaliteit van de antwoorden worden hoge eisen gesteld. De antwoorden op de vragen zijn terug te vinden in de handouts, het theoretisch deel van de handleiding en in het boek Biochemistry.

- Het verslag wordt per mail bij de assistent ingeleverd en zal met opmerkingen worden teruggestuurd.

- 2 -

Inleiding

- Om te voorkomen dat het schrijven en nakijken van de verslagen een slepende zaak wordt, moet het verslag over een set experimenten (blok) twee weken nadat het blok is afgerond worden ingeleverd. Wanneer het verslag niet op tijd wordt ingeleverd kan voor het betreffende blok het cijfer één gegeven worden.

Toets Naast het beoordelen van de kwaliteit van de verslagen wordt getoetst of je de theorie die ten grondslag ligt aan het praktisch gedeelte beheerst en of je in staat bent uitgevoerde experimenten uit te rekenen. Voor de toets geldt een bodemcijfer van 5.5. Een bodemcijfer wordt toegepast omdat het beheersen van de theorie en het kunnen uitrekenen van experimenten essentiële onderdelen van het practicum zijn. De toets bestaat uit 10 theorievragen en 4 rekenvraagstukken. De telling is zodanig dat je een voldoende hebt als je alle sommen goed hebt en 8 theorievragen fout, of 50% van de sommen goed en 2 theorievragen fout. Op de internetpagina van dit vak staan minimaal 4 toetsen. De internetpagina is: biochemistry.wur.nl/pcb/index.html Bepalen van het eindcijfer Voor het bepalen van het eindcijfer gelden de volgende regels: Het vak is opgesplitst in een Biochemiedeel en een Moleculaire Biologiedeel. Elk deel is weer opgesplitst in subdelen waaronder een toets. Het berekenen van een eindcijfer wordt via een gewogen middeling uitgevoerd, met dien verstande dat voor de beide toetsen een voldoende is gehaald (≥ 5.5). De eindwaardering voor zowel het Biochemiedeel als Moleculaire Biologie deel komt tot stand door de cijfers voor het practicumverslag, de praktische vaardigheid en inzet, en de toets te middelen. Wanneer voor een van de toetsen een cijfer van 4.5 tot 5.4 wordt gehaald, terwijl voor de andere onderdelen wel een voldoende is gehaald, wordt een 5 als eindresultaat doorgegeven. Wanneer voor één van de toetsen een cijfer lager dan 4.5 wordt gehaald, terwijl voor de andere onderdelen wel een voldoende is gehaald, wordt het toetscijfer als eindresultaat voor het vak doorgegeven. Indien voor beide toetsen een cijfer lager dan 4.5 wordt behaald, terwijl voor de andere onderdelen wel een voldoende is gehaald, wordt het gewogen gemiddelde van beide toetscijfers doorgegeven. De resultaten behaald voor de verschillende onderdelen zijn, nadat de cijfers moeten zijn ingeleverd, terug te vinden op de Blackboard site van deze cursus en op het prikbord bij Biochemie (Transitorium). Orde, netheid en aanwezigheid Om een groep mensen in een beperkte ruimte goed te kunnen laten werken, zal er enige discipline moeten heersen. Dit is vooral belangrijk wanneer er nauwkeurig moet worden gewerkt, zoals op dit practicum. Er wordt van je verwacht dat alle flessen, buizen met oplossingen en incubaties worden voorzien van een opschrift. Cuvetten en Eppendorf reactievaatjes horen thuis in hun respectievelijke houders. Schone pipettipjes worden altijd in een bak bewaard en nooit los op tafel neergelegd. Opgeloste giftige chemicaliën worden niet via de gootsteen weggegooid maar in afvalvaten opgeslagen. Gebruikt glaswerk wordt met water omgespoeld en in de afwasbakken neergezet. Gemorst water of gemorste oplossingen worden onmiddellijk met papier opgenomen. Kledingstukken, tassen en overtollig papier worden niet op de werktafels of op de grond neergelegd. Wanneer je klaar bent met het experimentele werk wordt de werkplek opgeruimd. In verband met de giftigheid van sommige chemicaliën kan eten en drinken tijdens het werk aan de laboratoriumtafels niet worden toegestaan. Het practicum begint iedere dag ’s ochtends om 8.30 uur en ’s middags om 13.30 uur. Wanneer je verhinderd bent, wordt van je verwacht dat je je afmeldt bij het secretariaat

- 3 -

Inleiding

- 4 -

van de leerstoelgroep Biochemie, tel: 0317-482868. In overleg met de practicumleiding wordt bepaald wanneer je de experimenten inhaalt. Indeling van de experimenten Het practicum is onderverdeeld in drie blokken. Het practicum start met een algemeen inleidend college en na het college wordt op de practicumzaal door de assistent een inleiding over de komende experimenten gegeven. In de middag wordt er met het experimentele werk begonnen. Er zijn gedurende het practicum twee middagen geroosterd die gebruikt kunnen worden om experimenten in te halen, om experimenten uit te werken en om verslagen te schrijven.

Blok 1: Proteomics Immunoprecipitatie en proteomics IP Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ELISA β-Glucuronidase GUS Blok 2: Werkingsmechanismen redoxenzymen Polyphenol oxidase PPO Lactaat dehydrogenase LDH Blok 3: Klinische en forensische biochemie Urinezuurbepaling UZ Klinische enzymactiviteitsmetingen KE Isoelectrisch focusseren IEF

Blok 1

GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 1 Blok 1 bevat oefeningen in technieken waarmee eiwitten, eiwitcomplexen en enzymen kunnen worden aangetoond en gekarakteriseerd. De technieken zijn een immunoprecipitatie (IP) gevolgd door een identificatie van de geprecipiteerde polypeptiden (proteomics), een ‘Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay’ (ELISA) voor het bepalen van een hormoonconcentratie en een enzymassay (GUS) voor het bepalen van de specifieke activiteit van een enzym in een celextract (β-glucuronidase als reporterenzym voor genexpressie). Bij twee van de drie experimenten in dit blok is de apparatuur vervangen door een computerprogramma. Dit wil zeggen dat het computerprogramma moet worden voorzien van invoergegevens (het vullen van een cuvet, ‘epje’ of ELISA plaat), vervolgens genereert het programma data die moeten worden verwerkt op dezelfde manier alsof er een normaal apparaat gebruikt is. De computerprogramma’s behoeden je niet voor fouten. Er geldt dus ‘rubbish in, rubbish out’. Inleiding: immunologie levert technieken om eiwitten te onderzoeken Immunologische methoden zijn belangrijke gereedschappen om eiwitten te zuiveren, kwantitatief te bepalen en te lokaliseren in de cel. Alle immunologische technieken maken gebruik van de specificiteit van antilichamen voor hun doelmoleculen. Een antilichaam (ook wel immunoglobuline, IgG, genoemd) is een eiwit dat in een dier wordt gemaakt in een reactie op de aanwezigheid van een lichaamsvreemde stof, het antigeen. Dit kunnen eiwitten, koolhydraten en nucleinezuren zijn. Een antilichaam herkent (= bindt sterk aan) een groep of een cluster van aminozuurzijketens van het antigeen. De bindingsplaats wordt epitoop genoemd. Door de mogelijkheid van automatiseren wordt de ELISA techniek grootschalig toegepast. Voorbeelden in de klinische biochemie zijn het bepalen van de bloedgroepfactor of een kwantitatieve insuline of oestrogeen bepaling. Andere voorbeelden zijn het aantonen van de veroorzakers van infectieziekten zoals het rode hondvirus, salmonella bacteriën, schimmels zoals Aspergillus en parasieten zoals trypanosomen. Een bekende ELISA toepassing is het aantonen van het AIDS veroorzakende retrovirus, Human Immunodeficiency Virus, (HIV) in bloedcellen. Het HIV virus heeft manteleiwitten die uniek zijn voor dit virus en die niet in andere humane retrovirussen worden aangetroffen. Antilichamen die zijn opgewekt tegen de manteleiwitten worden gebruikt om een besmetting met het virus aan te tonen. Achtergrondinformatie is terug te vinden in Biochemistry, Berg et al. 6de editie hoofdstuk 3.3 ‘Immunology provides important techniques with which to investigate proteins’, p. 84-90.

- 5 -

Proteomics

Immunoprecipitatie en proteomics Doel van het experiment Het doel van dit experiment is om via een simulatieprogramma inzicht te krijgen in de procedures waarmee men een immunoprecipitatie uitvoert en op welke manier het geprecipiteerde complex wordt gekarakteriseerd. De identificatie van de eiwitten in het complex gaat met behulp van electroforese, eiwit digestie, massaspectrometrie en een databasezoekactie. Samenvatting van het experiment 1. Het karakteriseren van een serum IgG preparaat en het koppelen van IgG moleculen

aan agarose beads. 2. Precipiteren van een antigeencomplex met IgG-agarose beads. Niet-specifiek

gebonden eiwitten worden via wasstappen verwijderd. 3. Loskoppelen van het antigeencomplex van de IgG-agarose beads met behulp van een

zeep (natrium dodecyl sufaat, SDS). 4. Het gezuiverde complex scheiden in polypeptideketens via SDS-polyacrylamide

gelelectroforese (SDS-PAGE). 5. Individuele banden uit de gel snijden, disulfidebindingen reduceren, de thiol groepen

carboxymethyleren en de polypetideketen in stukjes knippen (digesteren) met trypsine. 6. De massa van de trypsinefragmenten bepalen met massaspectrometrie (MALDI-TOF). 7. Het vergelijken van de massa’s van de peptides met een peptidedatabase. Eiwitten in

de database zijn in silico geknipt en de massa van de peptidefragmenten is berekend. Het te identificeren trypsinedigest wordt vergeleken met alle trypsinedigesties uit de database. Na een statistische analyse worden mogelijke overeenkomsten in een resultatentabel samengevat.

8. Na het identificeren van alle eiwitbandjes uit de polyacrylamide gel is het mogelijk na te gaan welke polypeptideketens in het eiwitcomplex aanwezig zijn en mogelijk een structureel complex vormen in de cel.

Bovenstaande stappen moeten via de drie hoofdmenu items in het programma ‘Immunoprecipitatie en Proteomics ‘ worden uitgevoerd. De hoofdmenu items zijn: a. Het karakteriseren van het IgG preparaat (‘Characterization IgG’). b. Het uitvoeren van een immunoprecipitatie en het bereiden van een trypsine digest

(‘Isolation of Protein Complex’). c. Het karakteriseren van het trypsine-digest met behulp van massaspectrometrie en een

databasezoekactie (‘Characterization of Peptides’). Na het karakeriseren van het IgG preparaat wordt besloten of de concentratie werkzame IgG moleculen hoog genoeg is om een succesvolle immunoprecipitatie uit te kunnen voeren. Wanneer deze lager is dan 1% dan zal er een nieuw preparaat moeten worden getest. Door een te lage werkzame concentratie IgG moleculen moet er voor de immunoprecipitatie meer agarose worden toegevoegd. Dit verhoogt de niet-specifieke adsorptie aan de agarose zelf en ook de kans dat er eiwitten worden gebonden aan de niet-specifieke IgG moleculen. Deze niet-specifieke co-precipitatie vertroebelt de uitkomst van het experiment en kan zelfs een geheel onjuist antwoord geven. Wanneer de concentratie werkzame IgG moleculen groter is dan 1% kan verder gegaan worden in het programma. Aan het eind van het experiment moet je in staat zijn aan te kunnen geven welk complex er geprecipiteerd is. Daarna wordt aangegeven uit welke componenten dit complex bestaat.

- 6 -

Blok 1

De uit te voeren ‘ín silico’ activiteiten In het programma ‘Immunoprecipitation and proteomics’ moeten, na het openen van het startmenu waarbij een serum wordt toegewezen, drie hoofdactiviteiten worden uitgevoerd: a) Het karakteriseren van het antilichaampreparaat (IgG preparaat) Om een immunoprecipitatie uit te kunnen voeren is er een antilichaampreparaat nodig met een voldoende hoge antigeenbindingsaffiniteit en concentratie van de reagerende IgG moleculen. Dit betekent dat het percentage IgG moleculen met een hoge bindingsaffiniteit voor het antigeen hoog moet zijn. Bij voorkeur meer dan 20%. Dit is de eerste vereiste voor een succesvolle immunoprecpitatie. In deze simulatie worden antilichamen gebruikt tegen GFP (Green Fluorescent Protein). Dit eiwit bevat een zeer fluorescente cofactor en is hierdoor eenvoudig met fluorescentie te detecteren. Het protocol voor de bereiding van een goed gedefinieerd antilichaampreparaat is als volgt. Men immuniseert een konijn met GFP. Men tapt bloed af en uit het serum wordt de IgG fractie gezuiverd. Deze wordt getest op de concentratie en affiniteit van de bindende IgG’s. De concentratie en ‘bruikbare’ affiniteit kan eenvoudig worden getetst door te bepalen wat het percentage reagerende IgG moleculen is nadat het protocol met precipitatie en wasstappen doorlopen is. Als de bindingsaffineit voldoende is zal men niet te veel antigeen verliezen tijdens de wasstappen (= het verwijderen van niet-specifiek gebonden eiwitten). Protocol voor een immuunreactie tussen GFP en IgG. In een Eppendorf reactievaatje wordt buffer gemengd met 5 μL van een verdunde gezuiverde GFP oplossing (bijvoorbeeld 5 μg/mL) en 20 μL van een verdunde IgG oplossing (50 μg/mL). In opeenvolgende incubaties wordt de concentratie GFP steeds meer opgevoerd. Na een reactie van 1 uur worden aan de incubatie agarose bolletjes toegevoegd. Deze bolletjes zijn voorzien van Protein A. Dit eiwit bindt aan het Fc-gedeelte van IgG moleculen. Er kan maximaal 1 μg IgG per incubatie gebonden worden. Na een reactietijd van 1 uur worden de agarose bolletjes met de gebonden IgG-GFP moleculen via centrifugatie gesedimenteerd en wordt de concentratie van (het niet-gebonden) GFP in het supernatant met behulp van fluorescentie correlation spectroscopie (FCS) gemeten. Een concentratie van 1 pg/mL GFP kan nog gemeten worden. Tot een concentratie van 10 μg/mL is het fluorescentiesignaal rechtevenredig met de concentratie. Voor deze metingen is slechts 200 μL oplossing vereist. Met behulp van bovenstaande technieken is het mogelijk de bindingscapaciteit van het IgG preparaat voor GFP moleculen te bepalen. De bindingscapaciteit moet worden uitgedrukt in een mol-ratio: hoeveel mol GFP kan per mol IgG gebonden worden. Vervolgens kan worden berekend hoeveel procent van de IgG moleculen reageert met GFP. Gegevens nodig voor het schrijven van het verslag Gebruik de uitwerking van fluorescentie gegevens in Excel voor het verslag. Geef de curve waarmee je het IgG preparaat hebt gekarakteriseerd. Geef het percentage van de met GFP reagerende IgG moleculen en aan waarom het percentage hoog moet zijn om een preparaat te kunnen gebruiken voor een immunoprecipitatie van een eiwitcomplex. Bij de berekeningen (in het programma) wordt gebruik gemaakt van de molecuulgewichten van GFP en IgG. Voorbeelden van de berekeningen staan in het kader op de volgende bladzijde. Bestudeer deze. Het is mogelijk dat je deze berekeningen op de toets moet kunnen reproduceren.

- 7 -

Proteomics

Gegevens en rekenvoorbeelden Het molecuulgewicht van IgG = 150 kDa en dat van GFP 26.9 kDa. IgG 5 mg/mL 5 (g/L) / 150 000 (g/mol) = 33.33 x 10-6 mol/L = 33.33 μM. Omdat IgG twee bindingsplaatsen per molecuul heeft bevat deze concentratie 66.66 μM bindingsplaatsen voor een antigeen. Voor GFP geldt eenzelfde berekening. 5 mg/mL = 5 (g/L) / 269 00 (g/mol) = 185.9 μM 1 μg IgG kan maximaal 13.3 pmol antigeen binden. 1 mol bindingsplaatsen = 75 000 g. 1g = 1/75 000 mol. 1 μg = 10-6/75000 = 13.3 pmol (=10-12 mol). Voor GFP is de berekening gelijk. 1 μg GFP = 10-6/26900 = 37.2 pmol. Als er 1 mol GFP bindt per mol IgG bindingsplaats dan is de verhouding IgG / GFP op basis van eiwit 2.79 μg IgG en 1 μg GFP (75000/26900 = 2.79).

b) Protocol voor een immunoprecipitatie In een serie genetische experimenten is getracht C-terminaal van alle eiwitten in bakkersgist (Saccharomyces cerevisiae) een GFP sequentie in te bouwen. In dit in silico experiment wordt een van de verkregen klonen onderzocht. De cel bevat een ingebouwd GFP gen en het fusie-eiwit wordt geproduceerd. Het in het eerste deel van het experiment beschreven IgG preparaat is nu via het Fc-gedeelte covalent gekoppeld aan agarose-bol-letjes. Uitvoering 5 mL celextract wordt geïncubeerd met 25 μg IgG (17 μL gepakte agarose beads). Na een incubatie van 1 uur bij 4 °C onder voortdurend zwenken worden de agarose beads afgedraaid (1 min 3000 rpm). Er wordt 3 keer gewassen met buffer. Vervolgens wordt het eiwitcomplex losgekoppeld van de agarose-IgG bolletjes door het toevoegen van SDS. Na centrifugeren wordt aan het supernatant β-mercaptoethanol toegevoegd. Het mengsel van eiwitten wordt op een SDS-polyacrylamide gel op grootte gescheiden in verschillende banden. De individuele banden worden uitgesneden en behandeld met DTT, de cysteinezijketens worden met jodoacetaat gecarboxymethyleerd en de overmaat jodoacetaat wordt met cysteine verwijderd. Overnacht wordt het mengsel met trypsine behandeld. Het totale volume is 50 μL. Er wordt 25 μL gebruikt voor een MALDI-TOF experiment. c) Het karakteriseren van de peptides Het bepalen van de massa’s van de peptiden in het trypsinedigest Voor de massaspectrometrie is het nodig dat de moleculen in de gasfase worden gebracht. Een methode is de Matrix-Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) techniek. Een peptidepreparaat wordt samen met een zogenoemde matrix-oplossing gemengd en dit mengsel wordt op een plaatje gebracht. Daar wordt het oplosmiddel verdampt zodat er kristallen van het matrixmateriaal en peptiden achterblijven. De kristallen worden vervolgens pulserend bestraald met een laser. De moleculen van de matrix-oplossing absorberen laserlicht en worden geïoniseerd. Een deel van deze geïoniseerde matrixmoleculen ioniseert de peptiden en deze komen in de gasfase. Vervolgens wordt

- 8 -

Blok 1

gemeten hoe lang het duurt voordat de geïoniseerde peptiden in een massaspectrometer de detector raken (Time Of Flight). De tijdsduur is afhankelijk van de massa van het peptide. Dit levert een tabel met massa’s op.

Figuur 1.1 MALDI-TOF massaspectrometrie 1) Het eiwitmonster, omgeven door een matrix, wordt geïoniseerd door een pulse van de laser. 2) Een electrisch veld versnelt de gevormde ionen door een vliegbuis naar een detector. 3) De lichtste ionen komen het eerst aan. 4) De ioniserende pulserende laser start ook een klok die de vliegtijd van de ionen meet.

Het identificeren van trypsinefragmenten De tabel met massa’s van de trypsinefragmenten wordt vergeleken met een database van polypeptideketens van eiwitten die allemaal in silico geknipt zijn met hetzelfde proteolytisch enzym en die allemaal hun eigen set van massa’s opleveren. Deze activiteit wordt via de MASCOT-site uitgevoerd. Via een statistische analyse kan gekeken worden met welke polypeptideketen of ketens de aangeboden massa’s zoveel mogelijk overeenkomen. Gegevens die in het verslag moeten worden verwerkt In het verslag moet worden vermeld welke peptiden m.b.v. MALDI-TOF en MASCOT zijn geïdentificeerd, tot welk cellulair complex deze peptiden behoren, en wat de fysiologische functie van het complex is.

- 9 -

Proteomics

ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA bepaling) Doel van het experiment Met behulp van het ImmunoLAB programma wordt inzicht verkregen hoe men met antilichamen een kwantitatieve bepaling kan uitvoeren. Het is natuurlijk ook mogelijk dit soort bepalingen praktisch uit te voeren, maar dan moet men een protocol nauwkeurig volgen anders wordt er veelal na een paar middagen werken geen of een onbevredigend resultaat verkregen. Omdat de wachttijden en handelingen via een simulatie snel zijn te verrichten, is het mogelijk zelf condities te kiezen en deze te testen. Op deze manier wordt meer inzicht in de methode verkregen dan met het volgen van een ‘kookboek’. Principe van het experiment Bij de ELISA bepaling is het immobilisatiemiddel een polystyreen plaat en wordt een enzymatische reactie gebruikt als detectiemiddel. In de hier uit te voeren simulatie wordt het antilichaam vastgezet aan een vast oppervlak en wordt een competitie opgezet tussen gelabeld en ongelabeld antigeen om een beperkte hoeveelheid bindingsplaatsen. De kwaliteit en verdunning van het antilichaampreparaat bepaalt hier het aantal bindingsplaatsen en dus het dynamische bereik van het experiment. Gebonden gelabeld antigeen wordt zichtbaar gemaakt met behulp van een enzymreactie. Preparaten Voor een kwantitatieve immunoassay heb je gezuiverd antigeen nodig. In deze simulatie zal het gaan om het humane insuline, een peptide hormoon. Humaan insuline wordt tegenwoordig via de recombinant DNA technologie in een eukaryoot systeem geproduceerd en via een aantal stappen gezuiverd. Het gezuiverde insuline, in dit experiment het antigeen, is in drie porties verdeeld: • Een deel is bij een konijn ingespoten, waardoor een immuunreactie is opgewekt.

Hierdoor worden er met humaan insuline reagerende antilichamen aangemaakt. Door wat bloed af te tappen wordt een antiserum verkregen. Dit serum bevat antilichamen die het antigeen binden. Je moet je hierbij realiseren dat de kwaliteit van het antiserum van konijn tot konijn verschilt. Dit betekent dat de concentratie van de reagerende IgG moleculen en hun affiniteit voor verschillende epitopen (IgG bindingsplaatsen) op het antigeen verschilt. Deze twee factoren bepalen de kwaliteit van het antilichaampreparaat en zijn dus onbekend bij het begin van de komende simulaties.

• Een tweede deel wordt bewaard als een oplossing van 1 mg/mL. Deze oplossing wordt

gebruikt, samen met het antiserum (antilichaamoplossing), om een ijklijn te maken. • Het derde deel is gelabeld. In de ELISA methode is het antigeen voorzien van een

biotine-groep. Verder is een biotine bindend eiwit beschikbaar, avidine, waaraan het enzym Horse Radish Peroxidase (HRP) is gekoppeld.

• Het labellen van het antigeen is nodig omdat er geen andere manier is om een

antilichaam-antigeen complex aan te kunnen tonen. Een hoeveelheid enzym zoals HPR, is via een activiteitsmeting te bepalen. Hierbij wordt een substraat omgezet in een gekleurd product.

- 10 -

Blok 1

De ImmunoLab procedure De in het programma gevolgde procedure is de volgende: • Er wordt 100 μL van een verdunde antilichaamoplossing in de putjes van een 96 wells-

plaat gebracht. De omstandigheden (hogere pH) zijn zo gekozen dat eiwit aan het polystyreenoppervlak irreversibel bindt.

• Het niet-gebonden eiwit (dus ook antilichamen) wordt bij neutrale pH weggewassen en de resterende eiwitbindingsplaatsen worden bezet met een ander eiwit (blokkeren).

• Er wordt met biotine-gelabeld antigeen (AgB) en ongelabeld antigeen (Ag) aan de putjes toegevoegd. Het antigeen kan binden aan de geïmmobiliseerde antilichamen.

• Het niet-gebonden materiaal wordt via wasstappen verwijderd. • Er wordt avidine (een eiwit met een biotinebindingsplaats) met daaraan gekoppeld

HRP toegevoegd. Het avidine bindt sterk aan biotine, dat weer via het antigeen en de IgG moleculen aan het polystryreenoppervlak vastzit.

• Het niet-gebonden materiaal wordt weer weggewassen. • Als laatste wordt er 100 μL substraatoplossing voor het HRP enzym toegevoegd. De

hoeveelheid gebonden enzym bepaalt de hoeveelheid kleur die in een bepaalde tijd gevormd wordt. In de simulatie kan de kleur niet onbeperkt toenemen. De lichtabsorptie van een putje wordt niet groter dan 2.5 omdat de apparatuur geen waarden boven de 2.5 weergeeft. Wanneer deze waarde bereikt wordt, wordt de evenredigheid tussen kleur en hoeveelheid enzym verbroken. Het is daarom verstandig de absorptie niet boven de 2 te laten stijgen.

• De plaat wordt in een spectrofotometer doorgemeten. De gemeten waardes variëren tussen 0 en 2.5. Dit wordt met een kleurcode weergegeven. Is er in een putje weinig of geen enzym aanwezig dan is de kleur wit. Meer enzym geeft een toename in groenkleuring. Voorts is het mogelijk de absorptiewaarden op te vragen.

Algemene informatie en rekenvoorbeelden Het molecuulgewicht van IgG = 150 kDa en dat van insuline 5 kDa. IgG heeft 2 bindingsplaatsen dus is dan de molaire ratio op eiwitbasis 75 kDa / 5 kDa = 15 μg / 1 μg. 1 μg IgG kan maximaal 0.067 μg insuline binden. Dit zijn 13.3 pmol insuline bindingsplaatsen op IgG. 1 μg insuline (Ag) is 1 x 106 pg / 5000 (pg/pmol) = 200 pmol. Er wordt standaard 100 μL oplossing aan een putje toegevoegd. De maximale bindingscapaciteit voor eiwit is per putje 400 ng / 100 μL. De concentratie van een IgG oplossing moet minder zijn dan 400 (ng) / 100 (μL) = 4 (ng / μL) = 4 μg / mL. De maximale hoeveelheid insuline (gelabeld en ongelabeld) dat binden kan in een putje is 5.33 pmol (0.4 μg x 13.3 pmol/μg). De concentratie van een insuline oplossing moet altijd minder zijn dan 5.33 pmol/100μL = 53.3 (pmol/mL) x 5000 (pg/pmol) = 266.5 x 103 pg/mL =266.5 ng/ml = 0.266 μg/mL.

- 11 -

Proteomics

Uitvoering Het bepalen van het percentage werkzame IgG moleculen in het gezuiverde IgG preparaat Er moet worden begonnen met het bepalen van het percentage werkzame antilichamen (Ab) in het IgGpreparaat. Hiervoor moet je weten welke de minimale hoeveelheid Ab is waarmee je alle (gelabelde) Ag kunt binden. De hoeveelheid gelabeld Ag kan ook gekozen worden. Soms kan het noodzakelijk zijn de standaard hoeveelheid (10 μL 5 μg/mL) te verminderen of juist te vergroten. Wanneer je weet bij welke antilichaamverdunning alle gelabelde moleculen nog binden, kan deze verdunning gebruikt worden om een testcurve te maken die informatie geeft hoe je met een beperkt aantal meetpunten een ijklijn kunt maken die nodig is voor de concentratiebepaling van insuline in het monster. Het bereik van de assay is te vergroten door een factor 10 meer Ab te gaan gebruiken. Let wel op dat de maximale bindingscapaciteit van de ELISA plaat niet wordt overschreden.

Vuistregels Begin met het gebruiken van de standaard instellingen voor de IgG verdunningen. Verdun de oplossing tussen de rijen 2 maal. Neem een factor 10 tot 15 minder eiwit van het gezuiverd Ag dan van de IgG oplossing. De bindingsratio op eiwitbasis is IgG-bindingsplaatsen / insuline = 15 / 1. De hoeveelheid niet-gelabeld antigeen in de eerste kolom (de minst verdunde oplossing) moet ongeveer 100 maal meer zijn dan de hoeveelheid gelabeld-antigeen. Kies voor het bepalen van een concentratie altijd een curve waarbij een paar antigeenverdunningen een gelijke extinctie wordt gemeten. Een concentratiebepaling in een monster moet altijd worden uitgevoerd op een plaat waarbij ook een ijklijn aanwezig is. Kies voor de ijklijn de kolommen 1 t/m 6 en voor het monster 7 t/m 12. Er is een Excel-sheet beschikbaar waarin drie tab-bladen geschikt gemaakt zijn om de data uit het programma direct om te zetten in grafieken. • Tab-blad ‘titer’ voor het bepalen van het percentage werkzame IgG moleculen. • Tab-blad ‘Test curve’ voor het maken van een testcurve. • Tab-blad ‘Calibration and sample curve’. Deze is bruikbaar voor het bepalen van de concentratie insuline in het monster.

Testcurve en kwantitatieve analyse van het monster Hierna wordt een testcurve gemaakt. Met de gemaakte curve kan worden geschat met welke zes antigeenverdunningen een goede ijklijn kan worden gemaakt . Deze worden gebruikt op de plaat waarmee de concentratie antigeen in het monster wordt bepaald. Op deze plaat zijn zes kolommen beschikbaar voor de ijklijn en zes kolommen voor monsterverdunningen. Uit de gegevens van deze plaat moet de concentratie antigeen in het monster worden bepaald.

- 12 -

Blok 1

Verslag Gebruik het progress report voor het schrijven van het verslag over dit experiment. In het verslag moeten de volgende gegevens worden gepresenteerd: - het preparaat dat getest is; - het percentage werkzame antilichamen; - de testcurve en de curves van de ijlijn en monsterverdunningen moeten worden

getoond; - de berekening van de concentratie concentratie insuline in het monster moet worden

gegeven. β-GLUCURONIDASE ALS REPORTERENZYM VOOR GENEXPRESSIE Doel van het experiment Het doel van het experiment is de kinetische parameters te bepalen van het E. coli enzym β-glucuronidase in een plantenextract. Deze parameters zijn nodig om de specifieke activiteit van het enzym in een transgene plant op een wetenschappelijk verantwoordelijke manier vast te stellen. Het enzym β-glucuronidase wordt veel gebruikt als marker voor genexpressie in transgene planten. Naast de theorie over het meten van de kinetische parameters van een enzym, zie hoofdstuk 8 Biochemistry, moet u rekening houden met experimentele mogelijkheden en onmogelijkheden bij het opzetten en uitvoeren van het experiment. De enzymactiviteit zal met behulp van fluorescentie worden gemeten met een Jenway fluorimeter. Vervolgens wordt de ‘virtuele’ fluorimeter gelijk gemaakt aan de Jenway fluorimeter en worden de vervolgexperimenten in silico met de ‘virtuele’ versie van de fluorimeter uitgevoerd.

Figuur 1.2 De reactievergelijking van de hydrolyse van MUG met bijbehorende

structuurformules. Eigenschappen van β-glucuronidase en de activiteitsmeting Het enzym β-glucuronidase katalyseert de hydrolyse van glucuronides. In dit experiment zal 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG), de ether van 4-methylumbelliferon (7-hydroxy 4-methylcoumarine) en D-glucuronzuur, als substraat worden gebruikt. MUG is niet fluroescent en het hydrolyseproduct, 4-methylumbelliferon (MUB), is alleen fluorescent als de 7-hydroxy groep geïoniseerd is. De pKa van de 7-hydroxygroep van MUB ligt rond pH 8, vandaar dat de fluorescentie van MUB bij pH 8.5 wordt gemeten.

- 13 -

Proteomics

Factoren die de uitkomst van een fluorescentiemeting kunnen beïnvloeden 1. Omdat een fluorescentie meting geen absolute meting is, moet er altijd geijkt worden

met een standaard. Dit in tegenstelling tot extinctiemetingen. De verschillen tussen een fluorescentie- en absorptiemeting worden uitgelegd op het college en een samenvatting is terug te vinden in de theorie behorende bij blok 2.

2. Een activiteitsmeting moet ook door anderen elders uitgevoerd kunnen worden. Dit betekent dat de reactieomstandigheden bekend moeten zijn en zodanig dat deze niet afhankelijk zijn van de gebruikte enzymhoeveelheden. Om hier zeker van te zijn moet de activiteitsmeting bij verschillende hoeveelheden enzym worden uitgevoerd, waarbij gecontroleerd wordt of de gemeten activiteit rechtevenredig is met de hoeveelheid toegevoegd enzym.

Protocollen en wetenswaardigheden Extractie van het enzym Een leeg Eppendorf reactievaatje is gewogen. Een paar plantenblaadjes zijn in het Eppendorf vaatje gedaan. Het geheel is opnieuw gewogen (ongeveer 20 mg). Per 20 mg materiaal is 100 μL extractiebuffer toegevoegd en de blaadjes zijn voorzichtig fijn gewreven in de extractiebuffer met een stamper. Dit is voorzichtig uitgevoerd omdat anders de extractievloeistof direct uit het vaatje vliegt. De celresten zijn afgedraaid in een Eppendorfcentrifuge (2 minuten centrifugeren) en het supernatant is overgebracht naar een schoon vaatje. Dit supernatant bevat de oplosbare celbestanddelen en dus ook het enzym β-glucuronidase. Het gebruik van de (virtuele) fluorimeter De kinetische parameters van het β-glucuronidase preparaat zullen met een virtuele Jenway fluorimeter worden bepaald. De virtuele fluorimeter heeft net als de Jenway fluorimeter de eigenschap dat je niet onmiddellijk na het sluiten van het deksel kunt meten en dat het even duurt voordat het signaal stabiel is. Voor een betrouwbare interpretatie van de enzymactiviteit moet de toename van de fluorescentie enkele minuten gevolgd kunnen worden op de recorder en moet de recordertrace een voldoende lineair stuk bevatten om er zeker van te zijn dat de activiteitsmeting correct is. In het programma kan een raaklijn aan de curve worden getrokken. Noteer steeds de gebruikte hoeveelheid enzym, de substraatconcentratie, het volume van het cuvet en de gemeten helling. Het opzetten van een activiteitsmeting Hieronder volgen een aantal punten waar rekening mee gehouden moet worden voor het opzetten en uitvoeren van enzymactiviteitsmetingen. Je hebt de beschikking over: - Een aantal cuvetten met een weglengte van 1 cm waarin men maximaal 1.2 mL

vloeistof kan pipetteren. - Reactiebuffer. In deze buffer kan de activiteit van het enzym gemeten worden en wordt

de ijking met MUB uitgevoerd. - Geconcentreerde substraatoplossingen. De concentratie is 5 mM en in het virtuele

experiment is de concentratie 1 en 10 mM 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide (MUG).

- Bladextract. Dit is bereid zoals hierboven beschreven. - Fitprogramma. Er is op de website van het programma een ‘fitter’ aanwezig. Via de

invoer van een dataset van substraatconcentraties met de bijgehorende

- 14 -

Blok 1

- 15 -

ek.

enzymactiviteiten worden de data gefit aan de Michaelis-Menten vergelijking. Deze fit levert een KM en VMAX waarde op.

Extra gegevens - De KM waarde van β-glucuronidase (GUS) voor MUG is ongeveer 50 μM. Met behulp van kennis van de Michaelis-Menten kinetiek (Figuur 1.3) moet je in staat zijn substraatconcentraties te kiezen waarmee een dataset wordt verkregen waarmee een VMAX

en KM kan worden bepaald. Realiseer je dat hoge substraatconcentraties aanleiding kunnen geven tot substraatremming. Besef ook je dat je nauwkeuriger 50 μL van een 10x verdunde oplossing kan toevoegen dan 5 μL van een onverdunde oplossing. - 10 - 20 μL bladextract is een goede hoeveelheid om de substraat afhankelijkheid van de enzymactiviteit te testen.

Figuur 1.3 Reactiesnelheid van een enzym dat voldoet aan Michaelis-Menten kinetiEen grafiek van de reactiesnelheid (V0) als functie van de substraatcocentratie [S] laat zien dat de maximale snelheid (Vmax) pas wordt bereikt bij oneindige substraatconcentratie. De Michaelis constante (KM) is de substraatconcentratie waarbij de snelheid gelijk is aan Vmax/2.

Experimenteel gedeelte Er moeten een drietal experimenten uitgevoerd worden: 1. De fluorimeter moet worden gekalibreerd en vervolgens moet een activiteitsmeting

onder een standaardconditie worden uitgevoerd. 2. De activiteitsmeting wordt gebruikt om de virtuele fluorimeter gelijk te maken aan de

reëele fluorimeter. Vervolgens wordt er bij een vaste hoeveelheid enzym een aantal experimenten uitgevoerd met de virtuele fluorimeter om de VMAX en KM te kunnen bepalen.

3. Als laatste wordt onder VMAX condities de activiteit bij drie verschillende enzymconcentraties gemeten.

Probeer eerst helder te krijgen wat je moet gaan meten en overleg eventueel met de assistent over het werkprotocol en begin daarna met het vullen van de cuvetten. 1) Het kalibreren van de fluorimeter De gevoeligheid van de Jenway fluorimeter moet geijkt worden. Dit kan door de fluorescentie van 4 oplossingen te meten. Een blanco (alleen reactiebuffer) en drie concentraties (500, 1000 en 1500 nM) MUB moeten gemeten worden. De concentratie van de ijkstof MUB is 50 μM. Schrijf de getallen die op de display onder RFU verschijnen op. Deze heb je nodig voor het verslag. Vervolgens wordt de activiteit van een plantenextract (GUS oplossing) gemeten. 20 μL GUS wordt gemeten met 0.25 mM MUG in een volume van 1 mL. De concentratie van de MUG oplossing is 5 mM. Het resultaat van deze meting (uitgedrukt in nM/min/20 μL enzympreparaat) wordt gebruikt om de virtuele fluorimeter

Proteomics

gelijk te maken aan de Jenway fluorimeter. Bij de Jenway fluorimeter is een handleiding aanwezig hoe metingen kunnen worden uitgevoerd. 2) Het bepalen van de KM en VMAX waarden a. De volgende metingen worden met de virtuele fluorimeter uitgevoerd. Start het

programma en vul de gevraagde gegevens in. b. Test eerst bij een vaste hoeveelheid bladextract de relatie substraat en enzymactiviteit. c. Bepaal door een fit van de dataset (substraatconcentratie-enzymactiviteit) aan een

hyperbool de KM en VMAX waarden voor het enzympreparaat. d. Wanneer de gegevens niet goed genoeg zijn voor een betrouwbare analyse, herhaal

dan enige metingen. 3) Het bepalen van de GUS activiteit van het extract onder VMAX condities a. Nadat duidelijk is welke de VMAX condities zijn, worden verschillende

enzymhoeveelheden onder deze condities getest om te onderzoeken of er een lineair verband is tussen de hoeveelheid toegevoegd enzym en de activiteit die gemeten wordt.

b. Ga al tijdens het experiment na of de GUS activiteit rechtevenredig is met de hoeveelheid toegevoegd bladextract. Zo niet voer dan extra metingen uit.

Samenstelling van de verschillende oplossingen Extractiebuffer: 50 mM kaliumfosfaat (pH 7.0), 1 mM EDTA, 0.1 % Triton X-100 (0.2 g /

200 mL), 10 mM DTT (dithiotreitol) (380 mg / 200 mL) Reactiebuffer: 0.1 M Tris HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.1 % Triton X-100, 1 mM DTT MUG: 1 en 10 mM 4-methylumbelliferyl- β-D-glucuronide MUB: 50 μM 4-methylumbelliferon

Meten onder VMAX condities De Michaelis-Menten vergelijking is: V0 = S * VMAX / (S + KM) Als men onder VMAX condities wil meten dan kiest men een substraatconcentratie die 10 maal de KM is. Bij deze substraatconcentratie wordt 91% van de theoretisch haalbare enzymactiviteit gemeten. V0 = 10*KM*VMAX/(10*KM+KM) = 10/11 * VMAX = 0.91 * VMAX Om 95% van de VMAX te meten moet de substraatconcentratie worden opgevoerd tot 18.9 maal de KM. V0 = 18.9 KM* VMAX/19.9 KM Het rekenvoorbeeld geeft aan dat het praktisch nooit mogelijk is de VMAX te kunnen meten. Om een paar procent meer dan de 91 % van de maximaal haalbare activiteit te meten moet de substraatconcentratie veel hoger worden met het gevaar van sub-straatremming en ander artefacten zoals hoge zoutconcentraties. Vandaar dat men meestal kiest voor 10 * de KM als substraatconcentratieconditie om onder VMAX condities te meten.

16

Blok 1

17

VERSLAG OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 1 1) Verslag over het immunoprecipitatie experiment Beantwoord de volgende vragen puntsgewijs. - Beschrijf de methode waarmee je het IgG preparaat hebt gekarakteriseerd. - Geef de berekening van het percentage reagerende IgG moleculen met een hoge

affiniteit. - Is de kwaliteit voldoende om het preparaat te gebruiken voor een immunoprecipitatie

van een eiwitcomplex? - Beschrijf de stappen die nodig zijn om een immunoprecitatie uit te voeren uitgaande

van een goed IgG preparaat. - Schets in grote lijnen hoe je een immunoprecipitaat kunt karakteriseren. - Geef aan welk peptide uit de SDS gel m.b.v. MALDI-TOF en MASCOT is geïdentificeerd

en tot welk cellulair complex dit behoort en welke de fysiologische functie van het complex is.

2) Verslag over het ELISA experiment - Beschrijf de gevolgde ELISA methode stapsgewijs. - In het verslag moet worden aangegeven wat het percentage werkzame antilichamen in

het IgG preparaat is geweest. Laat ook de grafiek zien waarmee dit percentage is berekend.

- Presenteer de ijklijn en de verdunningscurve waarmee de concentratie insuline in het moster is bepaald.

- Geef aan hoe je de concentratie insuline in het monster hebt berekend. 3) Verslag over het β-glucuronidase experiment Het verslag moet de elementen bevatten die op de website ‘writing a report’ worden aangegeven: http://biochemistry.wur.nl/pbc/gus-jenway/index.html. Bij de resultaten moeten de volgende zaken worden vermeld. - Presenteer de getallen van de ijklijn van de Jenway meting en geef ook de uitkomst van

de standaardactiviteitsmeting. - Presenteer de getallen waarmee de KM en VMAX zijn berekend. - Laat zien dat onder de experimenteel bepaalde VMAX condities de activiteit

rechtevenredig is met de gebruikte hoeveelheden bladextract. - Bereken uit de fluorescentieveranderingen veroorzaakt door de verschillende

hoeveelheden bladextract de β-glucuronidase activiteit per mg blad. Druk deze activiteit uit in pmol MUB gevormd per minuut per mg geëxtraheerd bladextract.

Werkingsmechanismen redoxenzymen

GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 2 In de experimenten van blok 2 staan methoden centraal waarmee cellulaire processen en enzymen in vivo en in vitro bestudeerd kunnen worden.

In het eerste experiment zullen verschillende methoden voor het meten van de activiteit van polyphenol oxidase (PPO) worden vergeleken. Dit koperbevattende enzym is betrokken bij de bruinkleuring van groente en fruit. Door het oxideren van phenolen tot quinonen ontstaan zeer reactieve verbindingen die polymeriseren tot rood-bruin gekleurde melanines (Figuur 2.1). Omdat deze bruinkleuring ongewenst is en veel economische schade oplevert is een goede remmer van deze bruiningsreactie gewenst. Als modelsysteem zal het PPO uit appels worden bestudeerd, zowel in vivo als in vitro.

Figuur 2.1 Reactiemechanisme van polyphenol oxidase

In het in vivo gedeelte wordt het effect van een aantal bekende voedseladditieven op de kleuring van appels bestudeerd. In het in vitro gedeelte van het experiment zal worden ingegaan op methoden die men gebruikt om de activiteit van het appel PPO te kwantificeren. De kleurvorming tijdens de enzymreactie met en zonder remmers wordt gevolgd door middel van UV-VIS spectrofotometrie. Voorts zal met behulp van een oxygraaf worden bestudeerd welk effect de remmers op de zuurstof consumptie van het enzym hebben. Door combinatie van de gevonden resultaten kunnen verschillende remmingsmechanismen van PPO gevonden worden en eventueel nieuwe remmers ontwikkeld worden zodat de bruinkleuring van groente en fruit verminderd kan worden. In het tweede experiment zal worden ingegaan op methoden die men gebruikt om de werking van lactaat dehydrogenase (LDH) te bestuderen. De activiteit van LDH met betrekking tot de reductie van pyruvaat en oxamaat door NADH zal worden bepaald. Voorts zal met behulp van fluorescentie worden bestudeerd hoe sterk het enzym NADH bindt. Omdat de structuur van LDH met en zonder substraten bekend is, is het mogelijk ‘te zien’ hoe substraten aan het enzym binden. Door de uitkomst van de verschillende experimenten te combineren is het mogelijk het werkingsmechanisme van een enzym op moleculair niveau te ontrafelen. Hierdoor kunnen we ons een voorstelling maken hoe enzymen als biokatalysator werken, m.a.w. hoe enzymen (eiwitten) leven mogelijk maken!

- 18 -

Blok 2

(IN VIVO) ACTIVITEIT EN REMMING VAN POLYPHENOL OXIDASE Doel van het experiment In dit experiment wordt het effect van verschillende voedseladditieven op de bruinkleuring van appel onderzocht, zowel in vivo als in vitro. In het in vivo experiment (1) worden appelpartjes geincubeerd met bekende remmers en een substraat voor het appel PPO, waarna in de tijd naar de effecten wordt gekeken. Het in vitro experiment (2) wordt uitgevoerd met een appelextract dat PPO bevat. De eigenschappen van het enzym en de werking van een aantal remmers worden bestudeerd met verschillende methodes. De kleuringsreactie wordt gemeten door catechol, een diphenolisch substraat, door het PPO te laten oxideren waarbij de absorptietoename wordt geregistreerd door een spectrofotometer. Verder wordt de zuurstofconsumptie tijdens deze reacties gemeten in een oxygraaf. Door het combineren van deze experimenten kun je er achter komen hoe de gebruikte remmers werken. Het zou duidelijk moeten worden dat remming van enzymen op verschillende wijzen tot stand gebracht kan worden. Hierbij wordt verschil gemaakt tussen remmers die op het enzym aangrijpen, remmers die de reactieproducten beinvloeden en "remmers" die het enzym dusdanig veranderen dat het zijn katalytische activiteit verliest. 1) in vivo experiment Vul 100 mL bekerglazen met 80 mL van de onderstaande vloeistoffen: 1. Water 2. 0.2 M citroenzuur 3. 5 mM L-cysteine 4. 1% vitamine C (natrium ascorbaat) 5. 200 μM kojic acid 6. 1% NaSO3 7. 0.1% catechol Schil een appel, verdeel deze in 8 partjes en dompel 1 partje gedurende 5 minuten onder in elk van bovenstaande vloeistoffen. Leg ze daarna op tafel en observeer de partjes. Laat het achtste partje als controle in aanraking met lucht. Beschrijf het uiterlijk van alle partjes direct na dippen, na 1 uur, aan het einde van de middag (na 3 uur) en na 16-24 uur. Maak eventueel foto's met je mobiele telefoon. Vraag 1 Welke appelpartjes worden het snelst bruin en welke remmer is het beste? 2) in vitro experimenten Bereiding appel extract: Breng 250 mL water aan de kook in een 500 mL bekerglas Blender 1 geschilde appel (zonder klokhuis) met 200 mL 50 mM HEPES buffer pH 6.8 en filtreer dit mengsel over een vouwfilter (extract A). Neem 2 mL van extract A in een glazen buis en houdt dit 5 minuten in het kokende water en laat afkoelen (extract B). Bewaar beide extracten op ijs!

- 19 -

Werkingsmechanismen redoxenzymen

a) Absorptiemeting Pipetteer de volgende oplossingen in reageerbuizen en noteer de kleur na 5 minuten en 1 uur. (Buffer = 0.5M HEPES pH 6.8; Substraat = 1% catechol).

Reactie Buffer Substraat* Remmer Water* Enzym extract

1 0.1 ml 0 ml 0 ml 1.02 mL 0.1 mL A 2 0.1 ml 1 ml 0 ml 0.02 mL 0.1 mL A 3 0.1 ml 1 ml 0.02 mL 1% vit C 0 mL 0.1 mL A 4 0.1 ml 1 ml 0.02 mL 1% NaSO3 0 mL 0.1 mL A 5 0.1 ml 1 ml 0 mL 0.02 mL 0.1 mL B

*schudden voor gebruik om te verzadigen met zuurstof Voeg 1 mL 1% NaSO3 oplossing toe aan de bruingekleurde bui(s)zen en noteer de kleurverandering. Vraag 2 Verklaar de geobserveerde kleurverschillen tussen de reacties, ook in de tijd. Vraag 3 Wat doet NaSO3 met de gevormde melanines? Wat vertelt dit over de efficiëntie van sulfiet als remmer van de bruinkleuring? Waarom zou er bij dit experiment substraatoplossing zijn toegevoegd? De kleurvorming kan ook bekeken worden met de spectrofotometer bij 420 nm. Herhaal reacties 2, 3 en 4 uit bovenstaande tabel in cuvetten. Pipetteer alles behalve de enzymoplossing in de cuvet, mix goed en zet de absorptie op nul met deze oplossing (blanco). Voeg 0.1 mL extract A toe, mix en volg de absorptie in de tijd (door middel van een papierrecorder) en noteer de snelheden. Vraag 4 Verklaar de verschillen in reactiesnelheid en aanvang van de reactie.

- 20 -

Blok 2

b) Zuurstofmeting In het bovenstaande experiment werd de PPO activiteit gemeten aan de hand van kleurvorming. Omdat het enzym zuurstof verbruikt (zie Figuur 2.1) kan de PPO activiteit ook met een zuurstofmeter (oxygraaf) worden geregistreerd. De zuurstofconsumptie wordt onder precies dezelfde omstandigheden gevolgd als de absorptiemeting. De werking van een oxygraaf wordt bij de urinezuurproef van blok 3 uitgelegd (zie ook theorie). Pipetteer de oplossingen uit onderstaande tabel in het reactievaatje en start de reactie door toevoeging van het extract A of B. Volg de zuurstofconcentratie in de tijd met de recorder. (Buffer = 0.5M HEPES pH 6.8; Substraat = 1% catechol).

Reactie Buffer Substraat * Remmer Water* Enzym extract

1 0.2 mL 2 mL 0 mL 0.4 mL 0 mL 2 0.2 mL 2 mL 0 mL 0.2 mL 0.2 mL A 3 0.2 mL 2 mL 0.2 mL 1% vit C 0 mL 0.2 mL A 4 0.2 mL 2 mL 0.2 mL 1% NaSO3 0 mL 0.2 mL A 5 0.2 mL 2 mL 0 mL 0.2 mL 0.2 mL B 6 0.2 mL 0 mL 0 mL 2.2 mL 0.2 mL A

*schudden voor gebruik om te verzadigen met zuurstof Vraag 5 Een oplossing verzadigd met zuurstof bevat bij 25 °C 0.26 mM zuurstof. Bereken de zuurstof consumptie per minuut voor elk monster. Hoe verklaar je de gevonden resultaten van het zuurstof verbruik? Wat is de reden voor afname in zuurstof in de reactie zonder enzym (1)? Hoe zou je thuis de resultaten van reactie 5 kunnen toepassen?

- 21 -

Werkingsmechanismen redoxenzymen

HET WERKINGSMECHANISME VAN LACTAAT DEHYDROGENASE Doel van het experiment De onderstaande proeven worden uitgevoerd met als doel inzicht te verkrijgen in enzymkatalyse en de bijbehorende thermodynamica. 1. De activiteit van lactaat dehydrogenase (LDH) met pyruvaat, oxamaat en lactaat wordt

bij verschillende pH’s gemeten en er wordt gewacht totdat de reactie in evenwicht is gekomen.

2. De binding van NADH aan het enzym wordt gevolgd met behulp van fluorescentie. 3. Met behulp van de fluorescentie waarden wordt de bindingsconstante van NADH aan

LDH bepaald. 4. Bij de activiteitsmetingen is de reactie gevolgd totdat de NADH concentratie niet meer

verandert. Dit geeft aan dat de reactie in evenwicht is en met behulp van de extinctieveranderingen zullen de concentraties van de reactanten worden uitgerekend. De concentraties van de reactanten in de evenwichtssituatie worden gebruikt om de standaard vrije energie van de reactie uit te rekenen.

5. De kristalstructuur van het enzym wordt op het computerscherm bestudeerd. Door de experimenten te combineren ben je in staat te begrijpen hoe het enzym de reactie katalyseert. Tevens hopen we dat je dan enig inzicht hebt verkregen in de manier waarop enzymen werken, namelijk door het verlagen van de activeringsenergie waardoor reacties die zonder katalysator niet plaatsvinden nu gecontroleerd in de cel kunnen verlopen. EXPERIMENTEN MET LACTAAT DEHYDROGENASE (LDH-1) Het meten van de LDH activiteit In dit experiment wordt de activiteit van LDH gemeten met behulp van een spectrofotometer. De activiteit van het hartspier LDH isoenzym wordt bepaald door de absorptie van NADH, een van de substraten in de reactie, bij 340 nm in de tijd te volgen. Er worden vier experimenten uitgevoerd waarbij de activiteit met pyruvaat ± oxamaat + NADH en met lactaat + NAD+ wordt bepaald. De reactievergelijking is:

pyruvaat + NADH + H+ lactaat + NAD+ 1) LDH activiteitsmeting met pyruvaat bij pH = 7.0 Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven handelingen uit: • Voeg 0.97 mL 0.1 M KPi (kaliumfosfaat buffer) pH 7.0 toe. • Voeg 0.01 mL 10 mM pyruvaat toe en meng de oplossing in de cuvet. • Plaats de cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de ‘set ref’ knop. • Voeg 0.01 mL 10 mM NADH toe en meng. • Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut. • Voeg 0.01 mL LDH (0.1 mg/mL ) toe, meng en plaats de cuvet zo snel mogelijk na het

mengen terug in de spectrofotometer. • Meet de absorptiedaling op de recorder totdat de uitlezing stabiel is. 2) LDH activiteitsmeting met oxamaat bij pH = 7.0 Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven handelingen uit: • Voeg 0.96 mL 0.1 M KPi pH 7.0 toe.

- 22 -

Blok 2

- 23 -

• Voeg 0.01 mL 10 mM oxamaat toe en meng de oplossing in de cuvet. • Plaats de cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de ‘set ref’ knop. • Voeg 0.01 mL 10 mM NADH toe en meng. • Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut. • Voeg 0.01 mL LDH (0.1 mg/mL ) toe en meng. • Registreer de absorptie veranderingen. Wanneer er geen noemenswaardige reactie

optreedt, wordt aan de cuvet 0.01 mL 10 mM pyruvaat toegevoegd. Na toevoegen van pyruvaat en mengen moet de cuvet zo snel mogelijk teruggeplaatst worden in de spectrofotometer en wordt de absorptie gedurende ongeveer 3 minuten gevolgd.

Figuur 2.2 Het absorptie spectrum van NADH en NAD+

3) LDH activiteitsmeting met pyruvaat bij pH = 8.5 Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven handelingen uit: • Voeg 0.96 mL 0.1 M Tris-HCl buffer pH = 8.5 toe. • Voeg 0.01 mL 10 mM pyruvaat toe en meng de oplossing in het cuvet. • Plaats het cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de ‘set ref’ knop. • Voeg 0.01 mL 10 mM NADH toe en meng. • Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut. • Voeg 0.02 mL LDH (0.1 mg/mL ) toe, meng en plaats het cuvet zo snel mogelijk na het

mengen terug in de spectrofotometer. • Meet de absorptiedaling op de recorder totdat de uitlezing stabiel is. 4) LDH activiteitsmeting met lactaat bij pH = 8.5 Voeg aan een 1 mL cuvet de volgende oplossingen toe en voer de aangegeven handelingen uit: • Voeg 0.97 mL 0.1 M Tris-HCl buffer pH = 8.5 toe. • Voeg 0.01 mL 1 M lactaat toe en meng de oplossing in het cuvet. • Plaats het cuvet in de spectrofotometer en zet de absorptie op nul via de ‘set ref’ knop. • Voeg 0.01 mL 10 mM NAD+ toe en meng. • Meet de absorptie gedurende ongeveer 1 minuut. • Voeg 0.01 mL LDH (0.1 mg/mL) toe, meng en plaats het cuvet zo snel mogelijk na het

mengen terug in de spectrofotometer. • Meet de absorptietoename op de recorder totdat de uitlezing stabiel is.

Werkingsmechanismen redoxenzymen

Het bepalen van de bindingsconstante van NADH aan LDH mbv fluorescentie De binding van NADH aan LDH kan bestudeerd worden door de verandering van de NADH fluorescentie te meten. Het blijkt namelijk dat de NADH fluorescentie toeneemt als NADH aan het enzym bindt. Een toename van de NADH fluorescentie wordt ook gevonden als men NADH in een meer apolair oplosmiddel oplost. Vandaar dat te verwachten is dat het bindingsoppervlak van NADH in het enzym apolair is. Tijdens de bindingsexperimenten reageert NADH niet omdat er geen pyruvaat wordt toegevoegd. Het effect van dit tweede substraat wordt nagebootst door oxamaat toe te voegen. Dit molecuul is een isosterisch en isoelectronisch analoog van pyruvaat en bindt analoog aan pyruvaat aan het enzym. Maar omdat de methylgroep van pyruvaat is vervangen door een aminegroep is NADH niet in staat oxamaat te reduceren. Dit komt door de electronenstuwende eigenschappen van de aminegroep. Als het goed is heb je met de activiteitsmetingen gezien dat oxamaat geen afname van de NADH absorptie geeft, en dus niet wordt omgezet door LDH. Uitvoering van het experiment en instellen van de Jenway fluorimeter - De fluorescentie wordt gemeten met de Jenway fluorimeter via methode 2 ‘NADH’. De

fluorescentie wordt geregistreerd als RFU. Vooraf moet de fluorimeter op de juiste gevoeligheid worden ingesteld. Pipetteer 0.96 mL ethanol en 0.04 mL NADH (0.1 mM) in een 1 mL cuvet. Meng en stel via de gain de fluorescentie in tussen 100 en 120 RFU.

Figuur 2.3 Absorptie en fluorescentie emissiespectrum van NADH.

In figuur 2.3 is het absorptiespectrum van NADH weergegeven en het uit de absorptie voorkomende emissiespectrum van het fluorescentielicht. NADH absorbeert voldoende licht tussen de 300 en 360 nm en de fluorescentie kan met een fliter dat licht met een golflengte boven de 395 nm doorlaat worden gedetecteerd. Licht laten absorberen bij 350 of 360 nm (dan is de intensiteit van een halogeenlamp hoger dan bij 340 nm) en de fluorescentie meten boven de 395 nm kan prima met een Jenway fluorimeter. Links staat het absorptiespectrum van NADH, rechts het fluorescentie emissiespectrum. Merk op dat de schaalverdeling op beide y-assen verschilt en dat fluorescentie optreedt bij hogere golflengten dan lichtabsorptie.

- 24 -

Blok 2

1) NADH fluorescentie in buffer, het effect van de binding aan LDH en het effect van oxamaat - Pipetteer 0.93 mL KPi buffer (0.1 M, pH 7.0) in een 1 mL cuvet. Meet de fluorescentie.

Schijf dit getal op in tabel 2.1 onder 1. - Voeg nu 0.04 mL NADH (0.1 mM) toe, meng, meet de fluorescentie en schrijf het getal

op in tabel 2.1 onder 2. - Voeg aan het cuvet 0.03 mL LDH (2.5 mg/mL) toe, meng, meet de fluorescentie en

schrijf het getal op in tabel 2.1 onder 3. - Voeg aan het cuvet 0.01 mL oxamaat (10mM) toe, meng, meet de fluorescentie en

schrijf het getal op in tabel 2.1 onder 4.

meting medium [NADH] μM

[LDH] μM

[oxamaat]μM

fluorescentie (RFU)

NADH fluorescentie

1 buffer - - - 2 buffer 4 - - 2-1 3 buffer 4 2.14 - 3-1 4 buffer 4 2.14 100 4-1 5 ethanol - - - 6 ethanol 4 - - 6-5

Tabel 2.1 Fluorescentie van NADH onder verschillende condities.

2) NADH fluorescentie in ethanol - Vul een cuvet met 0.96 mL ethanol. Meet de fluorescentie en schrijf het getal op in tabel

2.1 onder 5. - Voeg nu 0.04 mL NADH (0.1 mM) toe, meng, meet de fluorescentie en schrijf het getal

op in tabel 2.1 onder 6. Wat nu gemeten is (Tabel 2.1), is de fluorescentie van 4 μM NADH in buffer (2-1), van 4 μM NADH in aanwezigheid van 2.14 μM LDH (3-1), en van 4 μM NADH, 2.14 μM LDH en 100 μM oxamaat (4-1). Voorts is de fluorescentie van 4 μM NADH in ethanol gemeten (6-5). 3) NADH fluorescentie bij oplopende lactaat dehydrogenase concentraties Voor het bepalen van een bindingsconstante zijn een groot aantal metingen bij een vaste NADH concentratie en variabele LDH concentraties nodig. Om het pipetteren te verminderen zullen deze waarden virtueel worden verkregen. De gemeten fluorescentie van 4 μM NADH (meting 2-1) en de fluorescentie van 4 μM NADH + 2.13 μM LDH (meting 3-1) worden in het programma LDHEXP ingevoerd. De getallen worden gebruikt om een volledige titratie te simuleren. In de simulatie wordt bij een vaste NADH concentratie (4 μM) de hoeveelheid LDH opgevoerd. De gesimuleerde getallen moeten in tabel 2.2 worden ingevuld. 4) Het effect van een apolaire omgeving op de NADH fluorescentie. Vergelijk de fluorescentie van NADH in buffer (waterige omgeving, meting 2-1) met de fluorescentie in ethanol (meting 6-5). Welke conclusie kan je hieruit trekken als je beseft dat de diëlectrische constante van ethanol 24.9 is, die van water 80.4?

- 25 -

Werkingsmechanismen redoxenzymen

Additionele gegevens 1. Een functioneel LDH enzym in vivo bestaat uit vier subunits. 2. Het molecuulgewicht van het hier te gebruiken varkenshartspier enzym is 35112 g per

subunit, dus is 2.5 mg/mL 71.2 μM LDH subunits. 10 μL LDH van 2.5 mg/mL in 1 mL geeft een concentratie van 0.71 μM LDH-subunits.

3. Elke subeenheid heeft een katalytische plaats en bindt één molecuul NADH, en één molecuul pyruvaat of oxamaat.

LDH (ml)

[LDH] μM

NADH fluorescentie

0 0

0.01 0.71 0.03 2.14 0.06 4.27 0.10 7.12 0.15 10.68 0.21 14.95 0.28 19.94 0.36 25.63 0.45 32.04 0.55 39.16 0.66 46.99 0.78 55.54

Tabel 2.2 Effect van een toenemde LDH concentratie op de NADH fluorescentie. De NADH concentratie is steeds 4 μM.

HET UITWERKEN VAN HET LDH EXPERIMENT (LDH-2) A) De activiteitsmeting van lactaat dehydrogenase 1. Trek een raaklijn aan de extinctiedaling geregistreerd op de recorderrol. Doe dit voor de

vier activiteitsmetingen. Gebruik het gegeven dat de schaal op de recorder loopt van extinctie nul naar extinctie 1.

2. Bereken uit de absorptiedaling de initiële activiteit van LDH onder de experimentele omstandigheden van de vier uitgevoerde activiteitsmetingen. De activiteit moet worden gegeven in μmol NADH geoxideerd per seconde per mg LDH (μmol s-1 mg-1). Gebruik de recordersnelheid (meestal 3 cm per minuut) om de beginactiviteit uit te rekenen. Voor de berekening moet je de formule E = ε x c x l (de wet van Lambert-Beer) gebruiken. Bereken het turnovergetal van LDH per subunit. 1 mg LDH = 28.5 nmol subunits. De ε voor NADH = 6.3 mM-1cm-1. De lichtweg van de cuvet ( l) = 1 cm.

3. Vergelijk de metingen van pyruvaat en pyruvaat + oxamaat bij pH 7.0. Is het mogelijk om op basis van bovenstaande uitgerekende gegevens te bepalen of oxamaat remt en zo ja of oxamaat een competitieve dan wel een niet-competitieve remmer is?

4. Als dit niet mogelijk is welke experimenten moet men dan uitvoeren om dit wel te kunnen bepalen? Zie Biochemistry (6de editie p. 226 – p. 227).

- 26 -

Blok 2

B) Het bepalen van de standaard vrije energieverandering van de reductie van pyruvaat tot lactaat door NADH Als we om ons heen kijken zien we dat sommige processen vanzelf lijken te verlopen. Bijvoorbeeld een glas thee koelt vanzelf af of ijsklontjes smelten vanzelf bij kamertemperatuur. Dit is door te trekken naar biologische processen. Een cel lijkt spontaan te kunnen leven en zich te kunnen vermenigvuldigen. Complexe reacties zoals de biosynthese van DNA of eiwitten verlopen spontaan. Dit is alleen mogelijk omdat enzymen reacties die (vrije) energie nodig hebben kunnen koppelen aan (vrije) energie leverende reacties. Enzymen zijn te beschouwen als schakel tussen de dode stof en leven. In dit experiment zal nader worden ingegaan op vrije energie. Het concept vrije energie is afkomstig uit de thermodynamica. Vrije energie geeft aan of reacties kunnen plaatsvinden. Meer informatie is in het theoriedeel onder “vrije energie en redox potentiaal “ te vinden. Als bij een reactie de vrije energieverandering negatief is dan kan de reactie plaatsvinden. Dit is ook het geval bij de reacties van pyruvaat en NADH of van lactaat en NAD+ gekatalyseerd door het enzym lactaat dehydrogenase. Het enzym katalyseert de reactie naar de evenwichtssituatie. In evenwicht is het vrije energieverschil tussen substraten en producten nul. 1. Bereken uit de beginextinctie van NADH en de extinctieveranderingen na toevoegen

van LDH de concentraties NADH, pyruvaat, lactaat en NAD+ in evenwicht bij pH 7 en pH 8.5 (experimenten 1, 3 en 4). Gebruik hierbij de door de assistent bepaalde pyruvaatconcentratie.

2. Bereken met behulp van de Excel sheet de standaard vrije energie en de evenwichtsconstante van de reactie bij pH 7.0 en 8.5. Bereken ook de vrije energie als 1 % van de NADH is omgezet/gevormd (het begin van de reactie). Klopt de theorie dat een reactie zal plaatsvinden als de vrije energie negatief is?

3. Geef aan wat de standaard vrije energie betekent en verklaar waarom deze pH afhankelijk is.

4. Probeer een verklaring te vinden wanneer de experimenteel bepaalde standaard vrije energie niet in overeenstemming is met de literatuurwaarde. Denk hierbij aan de zuiverheid van de gebruikte reagentia, de nauwkeurigheid waarmee de reagentia kunnnen worden toegevoegd in relatie tot de eindconcentraties van de reactanten. Geef ook aan welk van de drie experimenten (pH 7.0 en 8.5 gestart met pyruvaat en NADH of het experiment bij pH 8.5 gestart met lactaat en NAD+) waarschijnlijk de betrouwbaarste waarde op zal leveren.

C) Het bepalen van de bindingsconstante van NADH aan LDH Zoals reeds gegeven neemt de fluorescentie van NADH toe als het aan LDH bindt. Je kunt aannemen dat de verandering van de NADH fluorescentie rechtevenredig is met de concentratie van het enzym-NADH complex. Daarom zijn de waarnemingen geschikt om de bindingsconstante te bepalen van NADH aan LDH. Voorts kunt je aannemen dat de binding van NADH aan één subeenheid van LDH de binding van NADH aan een andere subeenheid niet beïnvloedt.

- 27 -

Werkingsmechanismen redoxenzymen

De NADH fluorescentie toename kan uitgedrukt worden als een fractionele verzadigingsgraad (Y) van de binding van NADH aan LDH: LDHvrij + NADHvrij LDH-NADHcomplex Y = [LDH-NADH]complex / ([LDH-NADH]complex + [NADH]vrij) (1) De waarde van Y varieert tussen de fluorescentie van het vrije NADH (geen LDH aanwezig) en de maximale toename van de fluorescentie wanneer alle NADH gebonden is (FluorMAX, overmaat LDH). Y varieert dus tussen 0 en 1. De dissociatieconstante van het LDH-NADH complex is: KD = ([LDH]vrij*[NADH]vrij)/[LDH-NADH]complex (2) M.b.v. formule (2) is [LDH-NADH]complex uit te drukken in [LDH], [NADH] en KD, en in te vullen in (1). Na het delen van de teller en noemer door [NADH]vrij en vermenigvuldigen met KD ontstaat: Y= [LDH]vrij / ([LDH]vrij +KD) (3) Dit is een formule van een hyperbool en die vergelijkbaar is met de Michaelis-Menten vergelijking. Als in plaats van Y de fractionele snelheid van een enzym (V0/Vmax) wordt gelezen, is de formule (3) gelijk aan de Michaelis-Menten vergelijking: V0/Vmax = S / (S+KM). Er is echter een groot verschil tussen activiteitsmetingen van een enzym en een bindingsstudie. In de hierboven beschreven formules zijn [LDH] en [NADH] de concentraties van de niet-gebonden moleculen. Bij een activiteitsmeting is de substraatconcentratie vaak vele malen groter dan de enzymconcentratie en dan is [S]ongebonden ~ [S]toegevoegd. Deze laatste waarde weet men omdat men die toevoegt aan het incubatiemengsel. In dit experiment zijn alleen de toegevoegde concentraties van NADH en LDH bekend. Het probleem is nu te achterhalen wat de concentraties [LDH]ongebonden en [NADH]ongebonden zijn. Deze zijn te bepalen als de concentratie van het LDH-NADH complex bekend is. De vrije concentratie is dan de toegevoegde concentratie min de gebonden concentratie. Wanneer je dus kans ziet een relatie te vinden tussen de fluorescentie en de concentratie van het LDH-NADH complex, kan de KD eenvoudig met formule (2) worden uitgerekend. Gebruik voor de berekening van de dissociatieconstante de Excel-sheet waarmee de standaard vrije energie is uitgerekend. Kies het tab-blad KD. In de sheet wordt een oplossing gegeven voor het numeriek schatten van de dissociatieconstante. Probeer de Excel-sheet te begrijpen. Indien je er niet uitkomt overleg dan met de assistent. Verslag over het bepalen van de KD van het NADH-LDH complex 1. Geef in het verslag de grafiek van de toename van de NADH fluorescentie bij de

verschillende LDH concentraties. 2. Geef aan waarom de NADH fluorescentie in ethanol hoger is dan in water. 3. Bepaal uit de waarden van de toename van de NADH fluorescentie tegen de oplopende

LDH concentratie de dissociatieconstante van NADH en LDH. Beargumenteer in het verslag hoe je de fluorescentie van het LDH-NADH complex hebt kunnen koppelen aan een concentratie.

4. Geef de bepaalde KD met bijbehorende eenheid. Geef ook aan waarom je juist deze waarde hebt gekozen.

- 28 -

Blok 2

COMPUTER GRAPHICS VAN LDH (LDH-3) Er wordt van uitgegaan dat je het theoretisch deel van deze proef hebt bestudeerd. Dan weet je dat door kinetiekgegevens te combineren met structuurgegevens men in staat is een werkingsmodel voor een enzym op te stellen. Dit is ook het belangrijkste leerdoel van dit in silico experiment. Om dit experiment zinvol door te werken is het noodzakelijk dat je de volgende zaken paraat hebt: • de structuur van de aminozuren • het begrip pKa in relatie tot de ladingseigenschappen van de aminozuurresiduen • de begrippen ionogene binding, van der Waals interactie, waterstofbindingen en het

hydrofobe effect De onderstaande opdrachten moet je uitvoeren via het programma “Swiss pdb Viewer” dat op de computers die op de practicumzaal staan, aanwezig is. Indien je dit experiment nog eens wilt herhalen, kunt je de benodigde files via de Internet site van dit practicum ophalen. Een beknopte handleiding van de Swiss pdb Viewer waarin wordt aangegeven hoe men de verschillende opdrachten kan uitvoeren, is toegevoegd aan het theoretisch deel van deze handleiding. Aan de hand van de resultaten op het scherm bent je in staat de gestelde vragen in het verslag te beantwoorden. OPDRACHTEN EN VRAGEN COMPUTER GRAPHICS EXPERIMENT (LDH-3) 1) Het bepalen van de toegankelijkheid van het katalytisch centrum van LDH - Zet de ldh2 structuur op het scherm.

De gegevens hiervoor zijn aanwezig in de file ldh2.pdb. Dit is een tekstfile met de coördinaten van alle zichtbare (= X-ray verstrooiende) atomen in het kristal van haaispier ldh met NADH en oxamaat gebonden. Waterstofatomen zijn in de structuur niet zichtbaar omdat ze niet voldoende X-rays verstrooien. Oxamaat is een structuuranaloog van pyruvaat. De methyl groep van pyruvaat is in oxamaat een amino groep. Oxamaat bindt op de plaats van pyruvaat maar de keto groep van oxamaat kan niet door NADH gereduceerd worden. Zie ook de activiteitsmeting van LDH.

- Tracht het katalytisch centrum in het eiwitmolecuul te vinden. Dit kan door NADH en oxamaat op te zoeken. Dit gaat gemakkelijker door NADH en oxamaat een aparte kleur te geven en ze met de ‘stick’ optie of de CPK optie weer te geven. Zoek de structuurformules van NADH, pyruvaat, lactaat en oxamaat op.

- Draai het molecuul nu zodanig dat NADH en oxamaat zoveel mogelijk van ‘bovenaf’ zichtbaar zijn. Geef hierna de opdracht om alle atomen met hun van der Waals omvang weer te geven. Als je niet weet wat ‘van der Waals’ omvang betekent zoek het dan op in een (Biochemie) boek.

Vraag 1 Is het katalytisch centrum direct vanuit de oplossing bereikbaar voor de substraten van het enzym? Beargumenteer je antwoord met een schermafdruk. - Van het scherm wordt nu een afdruk gemaakt via het wegschrijven van een

‘screendump-file’. Dit gaat via een ‘File, save, Image’ opdracht. Deze en de andere schermafdrukken moeten naar de assistent via de email worden opgestuurd. Geef je file een duidelijke naam. Bijvoorbeeld groep1-afdruk1.

- Na deze handelingen wordt de structuur van het scherm verwijderd.

- 29 -

Werkingsmechanismen redoxenzymen

Opdracht 2: het effect van de substraatbinding op de conformatie van LDH - Zet de ldh1 structuur op het scherm. ldh1 is het haaispier enzym zonder gebonden

substraten. Vervolgens wordt de ldh2 structuur opgehaald en over de ldh1 structuur heen geprojecteerd. ldh2 is het enzym met NADH en oxamaat gebonden.

- De conformatie van een eiwit kan het meest inzichtelijk op het scherm worden getoond door alleen de ruggegraat (backbone) van de polypeptide keten weer te geven. Doe dit voor LDH1 en LDH2. Maak ook de plaats van het katalytisch centrum zichtbaar. Dit gaat door NADH en oxamaat met hun van der Waals omvang in de LDH2 file weer te geven. Gebruik de informatie die je nu op het scherm ziet om de onderstaande vragen te beantwoorden.

Vraag 2 a. Beschrijf het effect van de binding van NADH en oxamaat op de conformatie van het

eiwit. b. Welk gedeelte van het eiwit (zoek de nummers van de aminozuurresiduen op in de

structuur) verandert het meeste van conformatie? Deze conformatieovergang is de snelheidsbepalende stap in de katalyse van LDH en is aangegeven in het schematische figuur van de katalytische cyclus (zie theoriedeel).

- Maak van het scherm een file via een ‘File, save, Image’ opdracht. Opdracht 3: het bestuderen van het katalytisch centrum van LDH - Zet de file kc.pdb op het scherm. In deze file zijn alleen de belangrijkste aminozuren

van de NADH en oxamaat bindingsplaatsen weergegeven. Alle andere aminozuren zijn weggehaald uit de oorspronkelijke ldh2.pdb file. Dit is gedaan om de interacties tussen NADH en oxamaat met de aminozuurresiduen goed te kunnen zien.

- In het katalytisch centrum tref je de volgende aminozuren aan: Val31, Arg106, Asp166, Arg169, His193 en Ile249. In het theoriedeel is aangegeven welke eigenschappen van LDH veranderen wanneer de genoemde aminozuren worden vervangen door de aangegeven aminozuren. Het is zeer nuttig om bij de beantwoording van de vragen de structuur en functionele eigenschappen van de genoemde aminozuurresiduen paraat te hebben. Deze zijn te vinden in Biochemistry (6de editie, hoofdstuk 2). Om te zien met welke atomen je te maken hebt is het handig om de atomen te kleuren in de standaardkleuren. Maak een ‘Stick’ afbeelding en manipuleer de structuur zodanig dat je een zo goed mogelijk overzicht hebt over de verschillende aminozuurresiduen.

- Van het scherm wordt via een ‘File, save, Image’ opdracht een file gemaakt. Vraag 3 Wat is de afstand tussen de C4 van NADH (vanaf dit koolstofatoom wordt een hydride naar pyruvaat overgedragen) en de C1 van oxamaat (oxm2 C1)? Zou deze afstand klein genoeg zijn voor de overdracht van een hydride? Hierbij moet je je realiseren dat er een overlap van de moleculaire orbitalen moet plaatsvinden voordat er een reactie kan plaatsvinden. De globale straal (> 95% van de electronen bevinden zich binnen deze straal) van de elektronenwolken rondom een aantal groepen is in Å (10-10 m): -OH, 1.4; -NH2, 1.5; -CH2-, 2.0; -CH3, 2.0; -C=O, 2.0. De straal rondom atomen is: H, 1.2; C, 1.7; N, 1.5; O, 1.4; S, 1.8; P, 1.9. Vraag 4 a. Via welke interacties binden moleculen aan eiwitten (enzymen)? b. Welke aminozuurresiduen zijn betrokken bij de binding van oxamaat (pyruvaat)? c. Tot welke categorie(n) zou je deze binding(en) rekenen? d. Welke binding zou de meeste vrije energie geven? Vraag je af of er veel watermoleculen in het katalytisch centrum aanwezig kunnen zijn.

- 30 -

Blok 2

Vraag 5 Welk aminozuurresidu in het katalytisch centrum is in staat een proton te leveren of op te nemen bij neutrale pH? Dit proton is nodig voor de protonering van de ketogroep van pyruvaat of moet worden opgenomen bij de deprotonering van de hydroxylgroep van lactaat. Deze groep is essentieel voor de katalyse. Vraag 6 De pKa van het aminozuurresidue dat een proton zou kunnen leveren is mogelijk te laag om bij een pH ≥ 7.5 voldoende geprotoneerd te zijn. Welk aminozuurresidu is in staat de pKa van het protonleverende aminozuurresidue naar hogere waarden te verschuiven?

Figuur 2.3 De overgangstoestand voor de reversibele reductie van pyruvaat door NADH Vraag 7 Welke aminozuurresiduen zouden de overgangstoestand stabiliseren? Anders gezegd, welke aminozuurresiduen induceren een polarisatie in de carbonylbinding van pyruvaat/oxamaat. De overgangstoestand is schematisch weergegeven in figuur 2.3. Vraag 8 Zijn er in de structuur apolaire aminozuurresiduen te vinden in het bindingsoppervlak van NADH? Deze micro-omgeving van NADH op het enzymoppervlak verklaart de toename van de NADH fluorescentie door binding. Vraag 9 Kunt je een verklaring geven voor de afname van de NADH fluorescentie nadat oxamaat is gebonden aan het NADH-LDH complex? Zie ook de resultaten van het NADH fluorescentie experiment. Tip: NADH is fluorescent en NAD+ niet.

- 31 -

Werkingsmechanismen redoxenzymen

- 32 -

Slotopmerking Door middel van de uitgevoerde opdrachten en het beantwoorden van de vragen hopen we dat je gezien hebt hoe de aminozuurresiduen van een eiwit specifieke interacties met een coenzym (cosubstraat) en een substraat aangaan bij binding van genoemde moleculen. Door deze interactiemogelijkheden is een eiwit in staat de reactanten als het ware specifiek te solvateren, te omringen met aminozuurresiduen in plaats van watermoleculen. Mede hierdoor worden de twee substraten op het enzymoppervlak zeer precies ten opzichte van elkaar gelokaliseerd. Daarnaast heeft het eiwit via een geprotoneerde histidine een proton beschikbaar dat nodig is om de ketogroep van pyruvaat te protoneren tijdens de hydride aanval op het C2 atoom van pyruvaat. Verder stabiliseert het enzym de overgangstoestand voor de zo juist beschreven reactie en verlaagt het de vrije energie van de thermodynamische ‘drempel’ van de reactie. Door al deze interacties is de reversibele reductie van pyruvaat door NADH mogelijk. VERSLAG OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 2 PPO • Presenteer de berekeningen en de antwoorden op de gestelde vragen bij de PPO

experimenten LDH • Presenteer de berekeningen en de antwoorden op de gestelde vragen bij de LDH-2 en

LDH-3 experimenten.

Blok 3

GLOBAAL OVERZICHT OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 3 De experimenten van blok 3 hebben de kwantitatieve analyse met behulp van enzymen als gemeenschappelijk factor. Het eerste deel bestaat uit voorbeelden van biochemische analysemethoden in de klinische chemie. Met behulp van enzymen zal de concentratie van urinezuur in urine worden bepaald. Vervolgens zal de activiteit van aminotransferases in serum worden bepaald. Deze gegevens ondersteunen een diagnose over het verloop van een hartaanval of leverziekte. Naast klinisch chemische experimenten is de theorie van electroforese en isoenzymen een leerelement in dit blok. Experimenteel zal de aanwezigheid van isoenzymen in vleesproducten worden aangetoond met behulp van een isoelectrisch focusseringsexperi-ment.

Figuur 3.1 Kristallen van natriumuraat veroorzaken gewrichtsontstekingen, die meestal in de grote teen beginnen.

URINEZUURBEPALING Doel van het experiment Het doel van deze proef is om de concentratie urinezuur in urine volgens twee methoden zo nauwkeurig mogelijk te bepalen. Hierbij zal geoefend worden in het gebruik van een zuurstofelectrode en vormen het uitwerken van de spectrofotometrische en polarogra-fische experimenten een leerdoel op zich. De overall reactie voor het bepalen van urinezuur is:

Urinezuur + O2 + H2O → 5-hydroxyisouraat + H2O2 → allantoine + CO2

Figuur 3.2 De vorming van allantoïne uit urinezuur via 5-hydroxyisouraat.

- 33 -

Klinische en forensische biochemie

Bepalingsmethode: uricase 1) Urinezuur + 2H2O + O2 allantoine + H2O2 + CO2 katalase 2) H2O2 + methanol 2H2O + formaldehyde 3) formaldehyde + 2 acetylaceton + NH3 3,5 diacetyl-1,4-dihydrolutidine (DDL) + 3 H2O De hoeveelheid urinezuur kan kwantitatief bepaald worden door de vorming van DDL te meten of door het zuurstofgebruik te registreren. DDL BEPALING De urinezuurconcentratie kan gemeten worden door de gevormde hoeveelheid DDL spectrofotometrisch te bepalen. Het experiment wordt in duplo uitgevoerd. Pipetteer volgens het schema de oplossingen in schone en krasvrije 3 mL plastic cuvetten. Meng de inhoud van de cuvetten en incubeer de met parafilm afgesloten cuvetten 1 uur bij 37 °C en meet daarna de extinctie bij 410 nm tegen een cuvet gevuld met gedemineraliseerd water. Zorg ervoor dat de cuvetten aan de buitenkant droog en schoon zijn.

cuvet 1 2 3 4 5 urinezuurbepalingsmengsel 2.50 2.50 2.50 2.50 2.50

urine (5x verdund met demiwater) - 0.25 0.25 0.25 0.23 demi water 0.48 0.25 0.23 0.13 0.15

2 mM urinezuur - - - 0.10 0.10 uricase (2.5 mg/ml) 0.02 - 0.02 0.02 0.02

ZUURSTOFMETING - Bestudeer eerst de theorie over de werking van een polarografische zuurstofelectrode. - Kalibreer de electrode door het meetvaatje met 3 mL H2O te vullen en te roeren zonder

dop, totdat de uitlezing van de electrode niet meer verandert. De temperatuur staat op 30 ºC ingesteld. Nadat de barometerstand (=luchtdruk) is opgezocht op het Internet (www.met.wau.nl), is de hoeveelheid opgeloste zuurstof bij 30 ºC uit grafiek 8 in het theorie-deel te bepalen. De luchtdruk wordt weergegeven in kPa. 1 kPa = 7.5 mm Torr (kwikdruk).

- Vul de reactiekamer met 2.5 mL urinezuurbepalingsmengsel. Voeg daarna 0.1 mL onverdunde urine toe. Sluit de vloeistof af met de dop en zorg ervoor dat alle luchtbelletjes uit het reactievaatje in de capillaire buis verdwenen zijn. Volg de zuurstof concentratie gedurende 5 minuten.

- Start de reactie door 0.02 mL uricase met een ‘Hamilton’ spuit door het gaatje in de dop toe te voegen. Let op dat je geen gat in het membraan prikt! Volg het zuurstofverbruik totdat alle urinezuur geoxideerd is.

- Herhaal de meting met 0.05 mL urine . - Bepaal het exacte gehalte van de gebruikte urinezuurstandaard. Pipetteer 2.5 mL

urinezuurbepalingsmengsel en 0.2 mL urinezuurstandaard (± 2 mM) in het reactievaatje van de oxygraaf. Vervolg het experiment zoals hierboven is aangegeven.

Samenstelling urinezuurbepalingsmengsel Volume (ml)

Oplossing 1 0.6 M ammoniumfosfaat pH 7.0 + 1.7 M methanol 50 Oplossing 2 20 mM acetylaceton 2.5 Oplossing 3 20 mg/ml katalase (1000 units/ml) 0.05

- 34 -

Blok 3

KLINISCHE ENZYMACTIVITEITEN Het doel van het experiment Het nauwkeurig kunnen uitvoeren van een gekoppelde spectrofotometrische enzymactiviteitsmeting en het kunnen interpreteren van de juistheid van het verkregen resultaat door een vervolgexperiment uit te voeren. Daarnaast wordt geoefend in het omzetten van een meetresultaat naar enzymunits (μmol substraat omgezet per minuut per liter serum). Inleiding De cellen van hogere organismen zijn sterk gedifferentieerd en zijn gegroepeerd in weefsels met specifieke functies. Deze specialisatie wordt door het cellulaire enzympatroon bepaald. Van het feit dat cellen enzymologisch te karakteriseren zijn wordt in de klinische chemie veelvuldig gebruik gemaakt. Bij ziekte sterven cellen af en lyseren. De inhoud van de cel komt in het bloed terecht. De meting van weefselspecifieke enzymen in het bloed kan de medicus helpen een objectieve diagnose te stellen. Vragen zoals “welke orgaan is beschadigd, wat is de omvang van de beschadiging en hoe verloopt het herstellingsproces?” kunnen mede door enzymactiviteitsmetingen beantwoord worden. In deze proef zal in serum de activiteit van glutamaat oxaloacetaat transaminase (GOT) en glutamaat pyruvaat transaminase (GPT) getest worden. De absolute hoeveelheid en de verhouding van deze enzymactiviteiten geeft informatie over het functioneren van het hart en de lever. Achtergrondinformatie Twee veel toegepaste indicatorenzymen voor het functioneren van lever en hart zijn het glutamaat oxaloacetaat transaminase (GOT) en glutamaat pyruvaat transaminase (GPT). Beide zijn enzymen die onder meer in het cytoplasma voorkomen en dus bij beschadiging van het celmembraan relatief snel in de bloedbaan terechtkomen. Beide enzymen komen nagenoeg in alle lichaamscellen voor, maar de concentraties verschillen sterk. In hartcellen is de GOT concentratie relatief hoog en in levercellen is de GPT concentratie relatief hoog. Als iemand een hartinfarct heeft gekregen stijgt in 95% van de gevallen binnen 4-6 uur de GOT activiteit in het serum tot 30 U/l (1 U/l = 1 μmol substraat omgezet per min per liter serum bij 30 ºC). Na 24-48 uur wordt de maximum GOT activiteit bereikt (50-150 U/l) die indicatief is voor de omvang van het getroffen gebied. Na 4-7 dagen zakt de GOT activiteit in het serum weer naar normale waarden (maximaal 12 U/l). De GPT activiteit kan beschouwd worden als een indicator voor sterfte van levercellen. Bij gezonde mensen is de GPT activiteit lager dan 12 U/l, bij een chronische leverontsteking is GPT > 20 U/l en bij een acute hepatitis of vergiftiging worden waarden tussen 150 en 500 U/l gevonden. Ondanks dat de concentratie GOT in levercellen relatief laag is, kan een verhoogde GOT activiteit (150-500 U/l) in het serum ook veroorzaakt worden door een massale leversterfte zoals wordt waargenomen bij een acute hepatitis. Dit wordt veroorzaakt door het feit dat het GPT in levercellen alleen in hoge concentratie in het cytoplasma voorkomt, terwijl het GOT in zowel het cytoplasma als in de mitochondriën voorkomt. Als cellen meer dan alleen maar beschadigd worden en volledig lyseren, komt ook de inhoud van de mitochondriën in de bloedbaan terecht. Vandaar dat men om te kunnen discrimineren tussen sterfte van hartcellen of levercellen, altijd beide transaminases moet meten. Als naast een verhoging van de GOT activiteit ook de GPT activiteit verhoogd is, duidt dit op een levercelsterfte. Bij gezonde mensen is de verhouding GOT/GPT ≈ 1.3 (DeRitis- quotiënt). Bij een hartaanval is GOT/GPT > 1.3 en bij een leverziekte is GOT/GPT < 1.3.

- 35 -

Klinische en forensische biochemie

GOT EN GPT ACTIVITEITSMETINGEN GOT bepaling α-ketoglutaraat + aspartaat glutamaat + oxaloacetaat oxaloacetaat + NADH malaat + NAD+

Reagentia: - Buffer/aspartaat oplossing: 0.1 M Na fosfaat pH 7.4; 40 mM L-aspartaat (Asp) - 10 mM NADH - 0.25 mg/mL malaatdehydrogenase (MDH) - 0.25 M α-ketoglutaraat (α-KG) Voordat je begint met pipetteren moet je weten hoe de spectrofotometer met recorder werkt. De extinctieveranderingen worden bij 340 nm gemeten. Pipetteer in een cuvet met een werkbaar volume tot 1.2 mL:

Asp-buffer 0.80 mL MDH 0.01 mL Serum 0.20 mL

- Meng de inhoud van de cuvet en incubeer de cuvet 5 min bij 30°C. - Plaats de cuvet in de spectrofotometer. - Stel de spectrofotometer in op 0 door op “set ref” te drukken. - Voeg nu 0.01 mL NADH toe meng en meet de extinctie. - De reactie wordt gestart door 0.04 mL α-KG toe te voegen. Meng en plaats de cuvet

snel in de spectrofotometer en volg de reactie op de recorder. - Wanneer de extinctieverandering groter is dan 0.4 per min, moet de activiteitsmeting

worden herhaald met een vier keer verdund serumpreparaat. - Voorts moet gecontroleerd worden of de detectiereactie snel genoeg verloopt. Bedenk

hiervoor een experiment en overleg met de assistent voordat je de proef werkelijk uitvoert.

GPT bepaling α-ketoglutaraat + alanine glutamaat + pyruvaat pyruvaat + NADH lactaat + NAD+

De procedure voor de GPT activiteitsmeting is precies hetzelfde als die van de GOT meting behalve dat de buffer en het enzym verschillend zijn. Bepaal ook of de detectiereactie snel genoeg is geweest. Reagentia: - Buffer/alanine oplossing: 0.1 M Na fosfaat pH 7.4, 40 mM L-alanine (Ala) - 10 mM NADH - 0.25 mg/mL lactaat dehydrogenase (LDH, spiertype) - 0.25 M α-ketoglutaraat (α-KG)

- 36 -

Blok 3

ISOENZYMEN EN ISOELECTRISCH FOCUSSEREN Doel van het experiment Het doel van dit experiment is het uitvoeren van een isoelectrisch focussering experiment en het meten van isoenzymactiviteit in een gel. Bovendien moet na kleuring de gel worden geïnterpreteerd. De volgende vleespreparaten die door de assistent zijn gemaakt zullen onderzocht worden op het isoenzym patroon van het enzym fosfoglucomutase. 1. 100% rundvlees (biefstuk), 2. rundergehakt 3. ‘slavink’ 4. 100% varkensvlees (hamlap) 5. 100% rundvlees (hart) 6. 60% hamlap, 20% biefstuk, 20% water Na een succesvol experiment is het mogelijk om aan de hand van het fosfoglucomutase isoenzym patroon een uitspraak te doen over de aanwezigheid van rundvlees (spier of hart) en varkensvlees in rundergehakt en slavinken. Slavinken behoren naast varkensvlees ook rundvlees te bevatten. Opmerkelijk is dat op de AH verpakking niet wordt aangegeven of het runderskeletspier of runderhart betreft.

Figuur 3.3 AH Slavinken. Een gekruide gehaktvulling met daaromheen een dun lapje

varkensvlees, gesneden van de varkensbuik. • Algemeen: Varkens/rundvleesproduct. • Ingrediënten: 62% varkensvlees, 18% rundvlees, tarwezetmeel, paneermeel, plantaardige

olie, specerijenextracten, paprika, zout, peper, azijn, melkeiwit, maltodextrine, smaakversterker (E621), voedingszuren (citroenzuur, E262, E325), anti-oxidanten (E301, E331), stabilisator (xanthaangom).

• Bereiden: Koekenpan: verhit boter en/of olijfolie in een koekenpan. Bak de slavinken rondom bruin en op matige temperatuur in ca. 18 minuten gaar. Regelmatig keren.

• Bewaren: In de koelkast, te consumeren tot de uiterlijk vermelde datum. Geschikt om in te vriezen op de dag van aankoop, dan binnen 3 maanden gebruiken. Voor gebruik ontdooien.

Het Pharmacia PhastSystem: preparaateisen en gevoeligheid van de techniek Voor de isoelectrofoccusering (IEF) maken we gebruik van het Pharmacia PhastSystemTM electroforese apparaat. Voor de eiwitscheiding wordt gebruik gemaakt van een kant-en klare gel van polyacrylamide (5% acrylamide en 3% crosslinker) met een dikte van 0.35 mm. De gel is gehecht aan een plastic plaat en bevat amfolieten die een scheiding van eiwitten met een isoelectrisch punt (pI) van 5 tot 8 mogelijk maakt. Het monstervolume dat per preparaat nodig is bedraagt 1-6 μL. Voor een goede scheiding mag de

- 37 -

Klinische en forensische biochemie

bufferconcentratie niet hoger zijn dan 0.05 M en de zoutconcentratie niet hoger dan 0.5 M NaCl. De eiwitconcentratie van het op te brengen preparaat is afhankelijk van de detectiemethode. Voor een standaard Coomassie Brilliant Blue (CBB) kleuring moet de eiwitconcentratie per polypeptideketen minstens 20-30 μg/mL zijn en maximaal 2 mg/mL. Voor een meer gevoelige zilverkleuring zijn de waarden 1-5 μg/mL en 0.1 mg/mL. In ons geval zal de gel niet op de aanwezigheid van eiwit worden gekleurd, maar op de aanwezigheid van het enzym fosfoglucomutase. HANDLEIDING VOOR HET GEBRUIK VAN HET PHARMACIA FASTSYSTEM VOOR HET ISOELECTRISCH FOCUSSEREN VAN DE WEEFSELPREPARATEN Het isoelectrisch focusseren telt drie stappen: • het instellen van de pH gradiënt in de gel • het opbrengen van de vleespreparaten • het focusseren Het voltage wordt per stap aangepast (zie onderstaande handleiding Pharmacia PhastSystemTM). Tijdens het instellen van de pH gradiënt, de pre-focuseringsstap, kan de sample applicator klaargemaakt worden. Controle- en uitvoeringsstappen - Zijn de electrodes en de koelplaat schoongemaakt door de voorganger? Zo nee, maak

ze schoon met demiwater. Als het goed is staan de electrodes in de lage stand. - Zet het apparaat aan en stel de stand-by temperatuur in door op de toetsen ‘SEP stand-

by temp’ en ‘do’ te drukken. - Maak de sample applicator 6*4 klaar. Hiertoe wordt een stuk ParafilmR op de sample

applicator-mal gelegd met het beschermende papier naar boven. Wrijf nu met een pen of vinger over de beschermde parafilm zodat er in het parafilm putjes ontstaan. Leg het parafilm op een vlak en stevig oppervlak en verwijder het beschermende papier.

- Vul de putjes in het parafilm met 6 μL van de te onderzoeken preparaten. Druk de pipetpunt niet helemaal leeg, anders produceer je belletjes die de capillaire werking van de sample applicator kunnen verstoren.

- Breng per gel 100 μL water op in het midden van het rood omlijnde gelkoeloppervlak. - Haal een gel uit de koelkast (een IEF 5-8), en let op of de beschermende folie mee uit

het pakket komt. Leg de gels met behulp van een pincet en zonder luchtbellen in te sluiten op het koeloppervlak binnen de rode lijnen. Let op dat je de plastic onderkant op de plaat legt en niet de gel met het beschermfolie. Zuig het eventuele overtollige water met papier op.

- Zuig met de sample applicator via de capillaire werking het preparaat op (ongeveer 4 μL zal worden opgezogen).

- Als laatste stap voor het starten van de electroforese wordt het beschermende plastic film van de gels gehaald als deze nog aanwezig is. Vervolgens wordt de electrodehouder voorzichtig op de gels geplaatst. Daarna wordt de sample applicator in de middelste stand in de houder bevestigd. De sample applicator mag niet met de hand op de gel geduwd worden. Dit zal later via het programma automatisch gebeuren.

- Het deksel wordt gesloten en via het intoetsen van: ‘SEP start stop’; number of gels ‘2’ in geval van twee gels anders ‘1’ intoetsen; ‘do’; start SEP method ‘7’ of ‘1’ (apparaatafhankelijk. Let op dat de juiste pH gradiënt in de display verschijnt), ‘do’ wordt de electroforese gestart.

- De electroforese zal ongeveer 30 min in beslag nemen.

- 38 -

Blok 3

De electroforese wordt bij 15 °C uitgevoerd en bestaat uit de volgende stappen: De pre-focussing De pre-focussing stap vindt plaats bij ongeveer 2.5 mA (bij het gebruik van één gel) met een oplopend voltage vanaf ± 200 V naar 750 V totdat 75 Vh bereikt is. Dit duurt ongeveer 9 min. Het opbrengen van de preparaten. De sample applicatorarm gaat programmagestuurd naar beneden en bij een voltage van 200 V diffundeert het preparaat de gel in. Het totale vermogen dat gedurende dit traject (ongeveer 4.5 min) door de gel wordt gestuurd is 15 Vh. Het focusseren Het focusseren vindt plaats bij een constant vermogen van 3.5 W per gel. Dit wordt bereikt met een amperage van ongeveer 2 mA en een voltage aan het begin van het experiment van 1400 V. Door een toenemende weerstand in de gel zal het voltage tijdens het focusseren oplopen. Gemiddeld is het voltage 1650 V. Na ongeveer 15 min is er 410 Vh door de gel gegaan en wordt het proces gestopt. Het beëindigen van het focusseren Door middel van een ‘piep’ wordt aangegeven dat het focusseren is afgelopen. Hierna blijft een spanning over de gel van ongeveer 100 V gehandhaafd. Dit om de diffusie van de eiwitten tegen te gaan. Om dit te bereiken is het amperage ingesteld op 0.1 mA. Om af te sluiten moet op ‘SEP start stop’ gedrukt worden en moet bevestigd worden via het indrukken van ‘do’. Tijdens het focusseren kan begonnen worden met het maken van de agarose-gel die gebruikt gaat worden voor de fosfoglucomutase activiteitsmeting. In situ ACTIVITEITSBEPALING VAN FOSFOGLUCOMUTASE De weefselspecifieke fosfoglucomutase isoenzymen in de preparaten zijn met behulp van isoelectrisch focusseren in een gel gescheiden. Dit is uitgevoerd met het Pharmacia FastSystem in een IEF 5-8 gel. Hieronder wordt de samenstelling gegeven van het reactiemengsel om de fosfoglucomutase activiteit van de preparaten in een gel te meten. Uitvoering Tijdens de electroforese wordt een agarose-gel gemaakt waarin de reactanten voor de activiteitskleuring van fosfoglucomutase zijn opgelost. Oplossing 1 Aan 10 mL 0.125 M Tris-HCl buffer pH 7.4 in een maatcylinder van 25 mL wordt toegevoegd:

- 40 mg glucose 1-fosfaat - 5 mg NADP+ - 15 μL glucose 6-fosfaat dehydrogenase - 0.5 mL NBT (nitro blue tetrazolium) (0.5 % oplossing in demiwater) - 0.5 mL PMS (phenazine methosulfate) (0.2% oplossing in demiwater)

Oplossing 2 - Los 0.15 g agarose op in 10 mL 0.125 M Tris-HCl buffer pH 7.4 in een reageerbuis door

eerst deze te vortexen en daarna voorzichtig te verwarmen in een vlam in de zuurkast terwijl er voorzichtig geschud wordt.

- 39 -

Klinische en forensische biochemie

- Breng de agarose-oplossing na oplossen over in een waterbad van 600C. Aan oplossing 1 in de maatcylinder wordt na enige minuten oplossing 2 toegevoegd. Meng beide oplossingen voorzichtig door de maatcyclinder met parafilm af te sluiten. Na twee keer omzwenken wordt de inhoud van de maatcylinder snel maar voorzichtig en zonder bellen over de hydrofiele kant van een 6*12 cm GelBond plastic blad gegoten. Deze hoeveelheid is voldoende voor twee gels. Laat de agarose-gel stollen en bewaar de gel in het donker.

- Na de electroforese wordt de electroforese gel ondersteboven, dus met de gelkant en niet het plastickant, voorzichtig op de agarose-gel gelegd. Probeer het insluiten van luchtbellen te voorkomen.

- De ‘gel-sandwich’ wordt gedurende ongeveer 30 minuten in het donker gekleurd. Als de bandjes goed zichtbaar zijn wordt de gel gedigitaliseerd via een foto of een scan. Vraag de assistent je te helpen.

Figuur 3.4 Slavinkpreparaat en mengsel 62% hamlap en 18 % biefstuk. Nadat het weefsel (cellen) in een ‘potterbuis’ is stukgewreven worden de oplosbare celcomponenten via centrifugatie gescheiden van de hele cellen, kernen en extracellulair onoplosbaar materiaal (o.a. bindweefsel). Het in de slavinken aanwezig harde vet werkt als een prop die verhindert dat de meniscus zich na het centrifugeren weer horizontaal kan instellen.

- 40 -

Blok 3

- 41 -

VERSLAG OVER DE EXPERIMENTEN VAN BLOK 3 Urinezuurbepaling 1. Geef in het verslag de gevonden waarden van de DDL bepaling en de

zuurstofmetingen. Bereken uit deze getallen de juiste concentratie van de urinezuurstandaard en de concentratie van urinezuur in de urine. Geef aan hoe je de berekening hebt uitgevoerd. εDDL 410nm = 8.0 mM-1cm-1.

2. Vergelijk de resultaten van beide bepalingsmethoden. Welke methode geeft de meest betrouwbare uitkomst?

GOT-GPT metingen 1. Geef de reactievergelijking van de door GOT en GPT gekatalyseerde reactie en geef aan

met welke volgreactie de activiteit gedetecteerd wordt. 2. Geef in je verslag aan hoe je het aantal units GOT en GPT per liter serum uit gemeten

extinctieveranderingen hebt berekend. (1 unit is die hoeveelheid enzym die per min 1 μmol product produceert bij 30°C). εNADH bij 340 nm = 6.3 mM-1cm-1.

3. Geef aan hoe je hebt gecontroleerd dat de gemeten GOT en GPT activiteit ook echt de activiteit van de GOT en GPT enzymen was en niet die van de detectie-enzymen.

4. Waarom is het zo belangrijk bij een bekende temperatuur, in dit geval bij 30°C, de activiteit te meten?

5. Bepaal het “DeRitis” quotiënt. 6. Welke conclusies kan je trekken uit de GOT en GPT metingen en uit de waarde van het

“DeRitis” quotiënt met betrekking tot een mogelijke ziekte van de patiënt? Isoelectrisch focusseren 1. Presenteer een scan van de gel. 2. Tracht uit de samenstelling van de fosfoglucomutase reactiemix te achterhalen volgens

welke reacties de activiteit van fosfoglucomutase in de agarose-gel gedetecteerd is. (Info: PMS oxideert NAD(P)H en gereduceerd PMS reduceert NBT; gereduceerd NBT is niet oplosbaar en slaat neer).

3. Beschrijf het fosfoglucomutase isoenzym patroon. Is het mogelijk op basis van dit patroon een uitspraak te doen over de aanwezigheid van rundvlees en varkensvlees in het rundergehakt?

4. Kan je op basis van de resultaten hard maken dat de inhoud van het vleesproduct van Albert Heijn (‘slavink’) in overeenstemming is met het label (zie figuur 3.3) dat op het vleesproduct aanwezig is? Vraag je af of de testmethode goed genoeg geweest is om de aangegeven samenstelling te kunnen detecteren. Realiseer je dat runderhart ook rundvlees is en dat glycogeen een belangrijke energiebron voor spiercontractie is in skeletspier maar niet in hartspier. Hartspier mag namelijk niet verzuren.

Theorie

THEORIEDEEL: ABSORPTIE EN FLUORESCENTIE Inleiding Lichtabsorptie en fluorescentie zijn kwantummechanische verschijnselen, vandaar dat deze fysische begrippen hier in eenvoudige termen besproken zullen worden. Wanneer een molecuul licht absorbeert, is de energie van het lichtquant gelijk is aan het verschil tussen twee energieniveaus van het molecuul. Licht in het UV- en zichtbare gebied is in staat electronen van organische moleculen met geconjugeerde bindingen of metalen met electronen in de d-orbitalen vanuit de elektronische grondtoestand naar een aangeslagen toestand te doen overgaan. De elektronische energieniveaus zijn verbreed door gesuperponeerde vibratie- en rotatie energieniveaus (figuur 1).

Figuur 1 Quantum-mechanische voorstelling van lichtabsorptie en fluorescentie. Het primaire absorptieproces waarbij een elektron vanuit de elektronische grondtoestand naar een aangeslagen baan overgaat, vindt plaats in ongeveer 10-15 s. Daarna valt het elektron binnen 10-13 s terug naar het laagste energieniveau van de eerste aangeslagen toestand. Er zijn verschillende manieren om terug te komen in de grondtoestand. Essenti-eel hierbij is dat de opgenomen energie wordt afgegeven. Dit kan door: - de overdracht van een gedeelte van de energie op een ander molecuul via een botsing

(warmteafgifte aan de omgeving). - energie afgifte door het uitzenden van licht. - een reactie van het geactiveerde molecuul met een ander molecuul. - het gebruiken van de energie voor de dissociatie van een binding in het molecuul. Als het molecuul terugvalt naar de grondtoestand onder het uitzenden van licht noemt men dit proces fluorescentie (E = hν). De golflengte van het uitgezonden fluorescentie licht is altijd groter dan die van het geabsorbeerde licht. Dit komt omdat het geëxciteerde elektron (zie figuur 1) door het stralingsloos terugvallen naar het laagste energieniveau van de eerste aangeslagen toestand, energie verliest. Door het verschil in golflengte van het excitatielicht en de fluorescentie kan men eenvoudig met een filter de fluorescentie scheiden van het exciterende licht. Dit kan met een afkapfilter. Dit is een filter dat licht met een kleinere golflengte (het excitatielicht) dan de afkapgolflengte absorbeert en licht met een grotere golflengte (het fluorescentielicht) doorlaat.

- 42 -

Theorie

SPECTROFOTOMETRIE Opbouw spectrofotometer Een extinctiemeting (=kleurmeting) wordt met een spectrofotometer uitgevoerd. De componenten waaruit zo’n apparaat is opgebouwd worden schematisch in figuur 2 weergegeven. Vanuit een lamp wordt het lamplicht een monochromator ingestuurd. In de monochromator wordt van het lamplicht via een rooster of prisma een spectrum gemaakt dat op de uitgangsspleet van de monochromator wordt geprojecteerd. Omdat een rooster of prisma nooit 100% perfect is, zal het monochromatisch licht altijd een klein tot zeer klein percentage lamplicht bevatten. Door aan de golflengteknop te draaien schuift het spectrum langs deze relatief smalle spleet waardoor er licht met een klein golflengtegebied door de uitgangsspleet van de monochromator op het in de lichtweg staand cuvet valt (sample cell). De oplossing in het cuvet absorbeert licht. Het restant licht valt op de fotomultiplier die een stroompje afgeeft dat via een versterker op de recorder of de display zichtbaar gemaakt wordt. De versterkingsfactor van de fotomultiplier kan worden ingesteld door de hoogspanning op de fotomultiplier te variëren. Bij eenvoudige spectrofotometers is de hoogspanning niet instelbaar. Wel wordt vaak automatisch door een knop als ‘set ref’ in te drukken een tegenspanning gegeven waarmee het signaal dat naar de display gaat op nul gezet.

Figuur 2 Schematische voorstelling van de opbouw van een spectrofotometer. Theorie van extinctiemetingen Voor de meesten van jullie is de wet van Lambert-Beer reeds behandeld. Kort samengevat zegt de wet van Lambert dat de afname (-dI) van de intensiteit (I) van een lichtbundel door de absorptie van licht over een zeer klein stukje van de lichtweg (dl) rechtevenredig is met de intensiteit (I) van de lichtbundel ter plaatse. In formule -dI/dl = k*I. Daarnaast ontdekte Beer dat een zelfde relatie opgaat voor de relatie tussen de lichtabsorptie en de concentratie van de absorberende stof. Op elke positie in de lichtweg is de lichtabsorptie rechtevenredig met de concentratie van de absorberende stof. In formule -dI/dl = c*I. Gecombineerd geldt dus -dI/dl = c*k*I. Wanneer deze differentiaalvergelijking geïntegreerd wordt van het begin van het cuvet (I = I0 en l = 0) tot het eind van het cuvet (l = l) wordt de volgende formule voor de intensiteit van de lichtbundel (I) na het doorlopen van een lichtweg van 1cm verkregen:

- 43 -

Theorie

ln(I0/I) = k*c*l; I = I0e-k*c*l of op basis van de 10log (ln x = log x/log e): log(I0/I) = log(e)*k*c*l; I = I0*10-0.4343*k*c*l (1) I0 = de intensiteit van de lichtbundel die binnentreedt aan het begin van het cuvet. I = de intensiteit van de lichtbundel nadat het licht een afstand l heeft afgelegd in het cuvet waarbij er licht is geabsorbeerd. 0.4343*k is een molecuul afhankelijke constante en wordt de extinctiecoëfficiënt ε genoemd. De eenheid is M-1cm-1. c = de concentratie van de absorberende moleculen. l = de weglengte van het licht door het cuvet, meestal 1cm. De factor ‘ε*c’ wordt de extinctie (E) of absorptie (A) van de oplossing genoemd. De formule, I = I0*10-ε*c*l, geeft de lichtintensiteit aan nadat de lichtbundel een cuvet heeft doorlopen. Bovendien geeft de formule aan dat de lichtintensiteit ten gevolge van lichtabsorptie exponentieel afneemt met de doorlopen weglengte. Tevens geeft de formule aan dat log(I0/I) rechtevenredig is met de concentratie van de absorberende moleculen (log(I0/I) = ε*c*l). De uitvoering van een extinctiemeting Als er een extinctiemeting wordt uitgevoerd, plaatst men eerst een cuvet zonder het monster in de lichtweg en meet de hoeveelheid licht die op de fotomultiplier valt (de blancometing). Deze hoeveelheid licht geeft een signaal (Iblanco) van de fotomultiplier. Daarna plaatst men het cuvet met het monster in de lichtweg en meet hoeveel licht er nu op de fotomultiplier valt: Imeting. Tussen de twee metingen in is de I0 niet veranderd. De I0 is de lichtintensiteit die via de lamp en monochromator het cuvet intreedt. De relatie tussen het concentratieverschil van de absorberende stof in de twee cuvetten en het signaal van de fotomultiplier van de twee metingen is: - voor de blanco geldt dat logI0/Iblanco = ε*cbl*l - voor het monster geldt dat logI0/Imeting = ε*cm*l - het verschil is ( l = 1cm): ΔE = logI0 / Imeting - logI0 / Iblanco

= ε* (cm-cbl). ΔE = logIblanco - logImeting = ε * Δc Bij een moderne spectrofotometer bestaat de mogelijkheid om de blanco op “0” te zetten. Vaak heeft het apparaat een knop met “set ref”. Wat gebeurt er dan? Met behulp van electronica wordt het signaal dat van de fotomuliplier afkomt en verwerkt wordt door een logaritmische versterker op 1 gezet. Dit signaal is dan het signaal van de blanco. Omdat log 1 nul is verschijnt er 0.000 op de display. Als nu het cuvet met het monster wordt gemeten zal er lichtabsorptie optreden en wordt het signaal kleiner dan 1 omdat er in dit geval minder licht op de fotomultiplier valt. De logaritme van een getal kleiner dan 1 is een negatief getal. De electronica zorgt ervoor dat nu de negatieve logaritme van het signaal (I) van de fotomultiplier wordt weergegeven (-logI). Dit wordt dan een positief getal en is direct het lichtabsoptieverschil tussen de blanco en het monster. Omdat de blanco op “0” was gezet geeft het getal op de display de extinctie aan en via de extinctiecoëfficient is de concentratie van de absorberende stof eenvoudig uit te rekenen. E = ε * c

- 44 -

Theorie

Het is belangrijk om je te realiseren dan wanneer men praat over de extinctie van een oplossing, men het verschil in lichtabsorptie tussen de oplossing en een blanco heeft gemeten. Deze blanco bevat alle ingrediënten die ook in de oplossing aanwezig zijn behalve de stof waarvan men de lichtabsorptie wil meten. De termen extinctie en absorptie worden in de Biochemie door elkaar gebruikt. In de fysische chemie is de absorptie van een oplossing het deel van het invallende licht dat geabsorbeerd wordt. In formule is de absorptie dan (I0-I)/I0, waarbij I0-I de hoeveelheid licht is die geabsorbeerd is. Strooilicht als foutenbron Al het licht dat op de fotomultiplier valt en dat niet de golflengte heeft waarop de monochromator is ingesteld, of dat niet door het meetcuvet is gegaan en toch de fotomultiplier bereikt, noemt men strooilicht. Naast een niet goed afsluitend cuvettencompartiment, veroorzaakt de monochromator het meeste strooilicht. Dit is lamplicht dat op een of andere manier niet gesplitst in golflengten op de uitgangsspleet van de monochromator terechtkomt. Als er sprake is van strooilicht dan is het licht dat op de fotomultiplier valt, opgebouwd uit twee componenten: Im en Is

- Im (het monochromatische licht) en Is (het strooilicht). - Im wordt wel door concentratie veranderingen van de absorberende stof in het cuvet

beïnvloed en Is niet of nauwelijks. - Dit heeft tot gevolg dat in geval van de aanwezigheid van strooilicht

ΔE = log[(Im blanco+Is)/(Im+Is)]. - Als er geen strooilicht is dan is ΔE = log[(Im blanco)/(Im)]. - Als het monster veel licht absorbeert, is Im klein ten opzichte van Im blanco. In dit geval

vergroot Is de noemer van de breuk (Im blanco+Is)/(Im+Is) meer dan de teller. - Omdat Im altijd kleiner is dan Im blanco betekent dit dat strooilicht de waargenomen

extinctie altijd zal verlagen. Uit het bovenstaande blijkt dat de verhouding strooilicht/monochromatisch licht de nauwkeurigheid van een extinctiemeting beïnvloedt. Deze verhouding wordt ongunstig als de intensiteit van het lamplicht bij een bepaalde golflengte laag wordt. Dit is bijvoorbeeld het geval bij een wolfraamlamp bij golflengten beneden 350 nm.

Samenvatting lichtabsorptie Wanneer moleculen licht absorberen neemt de lichtintensiteit van de lichtbundel exponentieel af in de oplossing. Hierdoor is de relatie logaritme van de lichtintensiteit - absorptie lineair. Hiervan wordt door de fabrikanten van spectrofotometers gebruik gemaakt. Een spectrofotometer geeft op de display een logaritme van de lichtintensiteit weer. Vandaar dat de relatie ΔE (verschil in extinctie tussen monster en blanco) en Δc lineair is. De constante die beide grootheden gelijk maakt is de molaire extinctiecoëfficiënt ε. ΔE = ε Δ c

- 45 -

Theorie

FLUORIMETRIE De opbouw van een fluorimeter en het meten van fluorescentie. De basiscomponenten zijn in figuur 3 weergegeven. Qua opbouw verschilt een fluorimeter weinig met een spectrofotometer, maar er zijn twee belangrijke verschillen. Omdat de intensiteit van de fluorescentie vaak vele malen zwakker is dan de intensiteit van de exciterende lichtbundel moet gezorgd worden dat er nauwelijks of geen exciterend licht op de fotomultiplier valt. Dit zou een hoog achtergrondsignaal geven hetgeen de nauwkeurigheid van de fluorescentiemeting nadelig beïnvloedt. Bij een fluorescentiemeting wordt via een filter of monochromator een golflengtegebied geselecteerd dat vervolgens door een cuvet wordt geleid.

Figuur 3 Een schematische voorstelling van de opbouw van een fluorimeter.

In de cuvet wordt licht door de aanwezige moleculen geabsorbeerd. Dit verschilt niet van een normale extinctiemeting. De intensiteit van de lichtbundel neemt dus exponentieel af met de afgelegde afstand in het cuvet. Onder een hoek van 90º wordt de uitgezonden licht via een filter door een fotomultiplier gemeten. Wel is het mogelijk dat door verstrooiing door stofdeeltjes in het cuvet een gedeelte van de exciterende lichtbundel van richting wordt veranderd. Dit licht wordt dan door het afkapfilter dat tussen het cuvet en de fotomultiplier is geplaatst tegengehouden. De moleculen die licht hebben geabsorbeerd en in een aangeslagen toestand zijn geraakt, gaan binnen 10-8 s terug naar de grondtoestand waarbij een gedeelte van de moleculen licht zal uitzenden (fluorescentie). Dit licht wordt in alle richtingen uitgezonden. Het afkapfilter tussen het cuvet en de fotomultiplier is zo gekozen dat het excitatielicht geabsorbeerd en het fluorescentielicht doorgelaten wordt. Het doorgelaten licht wordt vervolgens door de fotomultiplier geregistreerd. FACTOREN DIE DE INTENSITEIT VAN DE FLUORESCENTIE BEÏNVLOEDEN A) De intensiteit van de exciterende lichtbundel Zoals hierboven is weergegeven, is de lichtabsorptie rechtevenredig met de concentratie van de absorberende moleculen en wordt er altijd een percentage van de intensiteit van de lichtbundel ter plaatse geabsorbeerd. Omdat de fluorescentie rechtevenredig is met het aantal moleculen dat aangeslagen wordt, zal een twee keer intensere lichtbundel twee keer zoveel moleculen aanslaan en dus een twee keer grotere fluorescentie ten gevolg hebben. Dus door de intensiteit van de lichtbundel op te voeren wordt de fluorescentie

- 46 -

Theorie

rechtevenredig verhoogd. Het verschil in lichtintensitiet verschilt van apparaat tot apparaat en is een belangrijke reden waarom de fluorescentie apparaat afhankelijk is. Ook de gevoeligheid van de fotomultiplier voor licht is een oorzaak voor een verschil in gevoeligheid tussen apparaten. B) De concentratie van de absorberende stof (zelf-quenching) Gezien het bovenstaande (meer absorptie, meer fluorescentie) zou men kunnen denken dat een hogere concentratie van de absorberende stof rechtevenredig meer fluorescentie zou geven. Dit is niet het geval. Hierbij dient men zich te realiseren dat extinctie- en fluorescentiemetingen essentieel verschillen. Bij een extinctiemeting meet men de intensiteit van de lichtbundel nadat deze het gehele cuvet doorlopen heeft. Door lichtabsorptie is de intensiteit van de lichtbundel in het cuvet exponentieel met de afgelegde weg afgenomen. In de fluorescentie-instelling doorloopt de lichtbundel uit de monochromator ook het cuvet maar nu onder een hoek van 90º ten opzichte van de fotomultiplier. Ook nu weer neemt de intensiteit van de lichtbundel exponentieel af met de doorlopen weglengte. Vanuit elk punt in de lichtweg wordt t.g.v. de lichtabsorptie fluorescentie uitgezonden die via het afkapfilter door de fotomultiplier wordt geregistreerd. De waargenomen fluorescentie is dus een directe afspiegeling van de absolute hoeveelheid licht die in het cuvet geabsorbeerd wordt. De relatie tussen de concentratie van de absorberende stof en de hoeveelheid geabsorbeerd licht is niet lineair. Dit is als volgt in te zien: de absorptie is op elke plek in het cuvet rechtevenredig (k) met de I (de intensiteit van de lichtbundel) ter plaatse en de concentratie van de absorberende moleculen. Een deel (fractie) van het geabsorbeerde licht wordt weer uitgezonden. De intensiteit van de fluorescentie is dus: fractie*k*c*I. De I neemt door de absorptie (A = ε*c = ln(10)*ε*c=k*c) af volgens formule (1): I = I0*e-k*c*x (1) (I0 = de intensiteit van de lichtbundel die op het cuvet valt; x = de afgelegde lichtweg) De fluorescentie op positie x is, f(x) = fractie*k*c*I(x) = fractie*k*c* I0*e-k*c*x De formule f(x) is te integreren en wordt dan F(x) = fractie*k*c*I0*1/(-k*c)*e-k*c*x en geeft als integraal tussen x = 1 en x = 0 cm: F(1)-F(0) = fractie*I0(1- e-k*c). De fluorescentie die bij een bepaalde concentratie c uit een cuvet komt is dus: F(1)-F(0) = fluorescentie uit een cuvet = fractie*I0(1- e-k*c). Deze formule geeft de relatie tussen de waargenomen fluorescentie en de concentratie van de absorberende en fluorescerende stof. Uit de formule blijkt dat de toename van de fluorescentie bij een oplopende concentratie van de fluorescente stof exponentieel afvlakt. Het deel van de formule tussen de ‘haakjes’ nadert dan naar 1 omdat de e-macht naar nul gaat. De relatieve afname van de fluorescentie bij hogere concentraties noemt men zelf-quenching. Quenching in zijn algemeenheid is het verschijnsel dat men minder fluorescentie waarneemt dan dat men op grond van de feitelijke concentratie van de fluorescerende moleculen zou verwachten. Naast zelf-quenching worden hieronder nog een aantal factoren behandeld die de hoeveelheid fluorescentie beïnvloeden. C) Kwantumefficiëntie In principe zouden alle moleculen die licht absorberen fluorescent kunnen zijn, maar deze eigenschap is sterk molecuul afhankelijk. De verhouding tussen de geabsorbeerde

- 47 -

Theorie

lichtquanta en de uitgezonden lichtquanta noemt men de kwantumefficiëntie. Er zijn moleculen, zoals fluoresceïne die 60-90 % van het geabsorbeerde licht weer uitzenden. Andere moleculen, zoals NADH, hebben slechts een kwantumefficiëntie van 2 %. Bij deze moleculen gaat het electron van de aangeslagen toestand relatief vaak terug naar de grondtoestand door energieoverdracht op de oplosmoleculen. Naast de structuur van het molecuul spelen ook de omgevingsfactoren een belangrijke rol in de kwantumefficiëntie. Factoren zoals polariteit, viscositeit en temperatuur bepalen de kwantumefficiëntie. Vooral de polariteit en viscositeit zijn belangrijke factoren omdat deze informatie geven over de micro-omgeving van fluorescente groepen in eiwitten. Dit kan een fluorescente groep zijn die aan het eiwit gebonden is, zoals NADH. De meeste eiwitten hebben intrinsieke fluorescente groepen. Deze zijn de aromatische aminozuurresiduen tryptofaan en tyrosine. Conformatieveranderingen in eiwitten veroorzaken soms een verandering van de polariteit van de fluorescente groep hetgeen zich manifesteert via een veranderende fluorescentie. Ook de binding van een fluorescente groep aan een eiwit kan een verandering van de polariteit van de micro-omgeving ten gevolg hebben die zich als een fluorescentie verandering laat registreren. D) Verandering van de verhouding stralend/stralingsloos verval (quenching) Sommige ionen (b.v. Br- of I-) nemen bij een botsing met een aangeslagen molecuul de energie van het terugvallende elektron effectief op zodat er geen licht wordt uitgezonden. E) Absorptie van het uitgezonden licht Het uitgezonden licht kan door de fluorescerende moleculen zelf worden geabsorbeerd, maar omdat het excitatie- en het emissiespectrum nauwelijks overlappen (zie figuur 1), is deze bijdrage meestal gering. Wel is absorptie door andere moleculen, waarvan het absorptiespectrum een significante overlap met het emissiespectrum vertoont, een niet te verwaarlozen bijdrage.

SAMENVATTING VAN DE VERSCHILLEN TUSSEN EEN EXTINCTIE- EN EEN FLUORESCENTIEMETING In de fluorescentie instelling wordt het fotomultipliersignaal lineair versterkt. Bij een goed geconstrueerd apparaat zal er uitsluitend fluorescentielicht op de fotomultiplier vallen. Hierdoor kan men de versterking opvoeren en dit geeft de mogelijkheid om zeer kleine lichthoeveelheden te kunnen waarnemen. Fluorescentie is om deze reden veel gevoeliger te meten dan lichtabsorptie. In het geval van lichtabsorptie meet je de afname van je 100% signaal. Een kleine afname van 100% is veel minder goed electronisch te versterken dan een kleine toename met geen signaal als uitgangspunt. Een nadeel van fluorescentie is dat de grootte van het signaal apparaat afhankelijk is. Bij het ene apparaat is de lichtintensiteit die op het cuvet valt anders dan bij het andere apparaat en de gevoeligheid van de fotomultiplier verschilt van apparaat tot apparaat. Dit heeft tot gevolg dat men het signaal van een fluorimeter altijd moet ijken. Dit is bij een extinctiemeting niet nodig omdat een extinctiemeting altijd ten opzichte van een blanco plaatsvindt. Hierdoor wordt de uitkomst van de meting onafhankelijk van de intensiteit van de lichtbundel.

- 48 -

Theorie

Handleiding Jenway fluorimeter Startmenu: measure setup results Submenu's setup: measure setup results storage instrument setup filter status Als je begint ga naar setup om een methode te kiezen. De keuze bepalen gaat via de omhoog/beneden/links/rechts toetsen en enter om de keus te effectueren. Kies binnen het menu setup het item measure setup en method ID. Selecteer met de pijltoetsen de methode ( 001 of 002). Methode 001 is MUB. Via MUB kan je tot ongeveer 2 μM MUB meten. De methode gaat ervan uit dat het apparaat geijkt is met 0.5, 1.0, en 1.5 μM MUB. De gain wordt via auto set gain ingesteld. De gain is dan rond de 42%. Als je dan gaat meten wordt de output direct in μM gegeven. Let op, het staat fout in de software van het apparaat. Daar staat μM/L. Methode 002 is NADH. Deze meet het signaal dat uit de versterker komt. De gain staat vast op xx. De gain is bij te stellen bij een meting. Voor de binding van NADH aan LDH is de gain op 60% gezet. Het meten gaat via measure. Kies het submenu read. Aan elke methode is een output gekoppeld. Deze wordt binnen setup via het submenu results storage ingesteld: timed read on, intervals (s) 10, auto save on, auto print on. De andere submenu items, instrument setup en filter status zijn voor standaard gebruik niet relevant. Via results zijn de in de fluorimeter opgeslagen data op het kleine schermpje te zien. Dit menu moet gebruikt worden om de opgeslagen data in het apparaat te wissen.

- 49 -

Theorie

VRIJE ENERGIE EN REDOX POTENTIAAL Alle (biochemische) reacties in een cel zorgen ervoor dat we een cel als levend kunnen beschouwen. Men kan zich afvragen hoe dat leven mogelijk is. Een eerste observatie zou kunnen zijn dat de omstandigheden blijkbaar zodanig zijn dat de reacties in een cel spontaan verlopen met behulp van een enzym. Vanuit de chemie (thermodynamica) is bekend aan welke voorwaarden een reactie moet voldoen wil deze spontaan kunnen ver-lopen. Dit wordt aangegeven door het concept vrije energie. Elk systeem (b.v een chemische reactie) bij een constante druk streeft naar een zo laag mogelijke vrije energie. De vrije energie (G, Gibbs energie) is opgebouwd uit twee termen: de enthalpie (H, warmte inhoud van de moleculen) en de entropie (S, energie verspreiding). G = H – TS. Als er sprake is van een reactie bij constante temperatuur en druk wordt de vrije energie verandering ΔG = ΔH – T ΔS. Zoals hierboven aangegeven kan een reactie spontaan verlopen als de vrije energie daalt. Dit betekent dat de vrije energie van de producten minder moet zijn dan van de substraten. De ΔG van de reactie moet negatief zijn. Alle reacties in een cel hebben een negatieve ΔG, ook reacties die ogenschijnlijk nooit spontaan kunnen verlopen zoals de biosynthese van DNA of eiwitten. Dankzij enzymen die vrije energie leverende reacties kunnen koppelen aan vrij energie vereisende reacties, is biosynthse mogelijk. Met recht kan gesproken worden dat enzymen de schakel zijn tussen de dode stof en de levende cel. Tijdens het practicum zal de reductie van pyruvaat door NADH worden bestudeerd. De reactie is:

pyruvaat (A) + NADH (B) + H+ lactaat (C) + NAD+ (D) Deze reactie is opgebouwd uit twee redox reacties: pyruvaat wordt gereduceerd tot lactaat en NADH wordt geoxideerd tot NAD+.

pyruvaat + 2e + 2H+ lactaat

NADH NAD+ + 2e + H+

De relatie tussen de vrije energie en de redox potentiaal wordt in Biochemistry (6de editie p. 506– p. 509) behandeld. Deze relatie is relatief simpel. ΔG = - nFΔE. n = het aantal electronen die bij de redox reactie betrokken is, F is de Farady constante. R is de gasconstante en T is de temperatuur in graden Kelvin. De relatie geldt ook voor de standaard vrije energie en standaard redox potentiaal. Dus ΔG = ΔG0 + RTln( [C] [D]/[A] [B] [H+]) - nFΔE Delen door –nF geeft ΔE = ΔE0 - (RT/nF) x ln( [C] [D]/[A] [B] [H+]) Dit is de wet van Nernst. Als je de [H+]-term uit de logaritme haalt, de ln omzet in een 10log (factor 2.3) en bij 20 °C werkt wordt de RT/nF ln term 0.0591/n log. De Nernst formule wordt dan: ΔE = ΔE0 - 0.0591/n x log (1/[H+]) - 0.0591/n x log( [C] [D]/[A] [B])

- 50 -

Theorie

De ΔE0 geldt voor een [H+] van 1M dus pH = 0. In de biochemie worden de standaard redox potentialen vaak bij pH = 7 gegeven. De H+-afhankelijke term is dan in de E0 verwerkt. Als er in een redox reactie één proton of meerdere protonen (het aantal protonen = p) zijn betrokken dan beinvloedt de pH de niet-concentratie term volgens de volgende formules: ΔE0 - 0.0591/n x log (1/[H+]p). pH = -log[H+]. ΔE0 - 0.0591/n x p x pH De concentratie onafhankelijke term van het redoxkoppel pyruvaat/lactaat neemt 0.059 V per pH eenheid af (p = 2 en n=2) en dat van het redox koppel NAD+/NADH 0.0295 V per pH eenheid (p = 1 en n=2). In de Excel sheet die beschikbaar is via de internet site van dit vak (Blackboard of http://biochemistry.wur.nl/pbc/index.html) worden de hierboven behandelde redox reacties via berekeningen nader toegelicht. Voorts bevat de Excel sheet een voorbeeldberekening van de vrije energie van de reactie. Deze kan gebruikt worden om de experimentele data in te voeren van de door jou bepaalde evenwichtsconcentraties. De verkregen ΔG0 kan dan vergeleken worden met de theoretische ΔG0 die uit de standaard redoxpotentialen volgt. LACTAAT DEHYDROGENASE Inleiding Voor het verkrijgen van inzicht in het werkingsmechanisme van enzymen is de structuur van het enzym onontbeerlijk. De afgelopen jaren is de structuurbepaling van enzymen en eiwitten in een stroomversnelling geraakt. Deze ontwikkeling is mogelijk gemaakt door het beschikbaar komen van geavanceerde apparatuur voor het opnemen van de Röntgen verstrooiingspatronen van een eiwitkristal, snelle computers voor het uitrekenen van de Röntgen verstrooiingspatronen en het zichtbaar maken van driedimensionale structuren op een computerscherm. De tweede factor is de ontwikkeling van de recombinant DNA technologie. Met behulp van deze technologie is het relatief eenvoudig geworden om via het sequencen van DNA de aminozuurvolgorde van een eiwit te bepalen. Ook zijn methoden ontwikkeld om eiwitten op grote schaal te produceren en te modificeren. Door deze ontwikkelingen is het bepalen van de driedimensionale structuur van een eiwitmolecuul vergeleken met 30 jaar geleden eenvoudiger en vooral sneller geworden. Naast kristallografie worden multidimensionele NMR technieken gebruikt voor de structuurbepaling van kleinere eiwitten (< 50 kDa). Voor het op moleculair niveau doorgronden van enzymkatalyse is kennis van de structuur van een enzym noodzakelijk. Met alleen deze informatie is het werkingsmechanisme van een enzym echter niet volledig op te helderen omdat structuurfluctuaties vaak essentieel zijn voor de katalyse. Kristallen geven slechts informatie over één structuur tenzij men kristallen kan groeien van verschillende conformaties van het eiwit, geïnduceerd door de binding van substraten/remmers. Algemene eigenschappen van lactaat dehydrogenase (Biochemistry hoofdstuk 8, 6de editie p. 223) Lactaat dehydrogenase (LDH) is een belangrijk enzym in een aantal metabole routes. Het vormt de spil in het evenwicht tussen het anabolisme en het katabolisme van koolhydraten. De reactievergelijking van de door LDH gekatalyseerde reactie is:

- 51 -

Theorie

pyruvaat + NADH + H+ lactaat + NAD+ In de anaërobe glycolysereacties van de skeletspier is LDH het laatste enzym in een serie, die de omzetting van glucose (glycogeen) in lactaat katalyseren waarbij er per glucose molecuul twee moleculen ATP gevormd worden. Het in de spier gevormde lactaat diffundeert naar het bloed waar het na opname door de lever wordt omgezet in pyruvaat en vervolgens via de reacties van de gluconeogenese in glucose of glycogeen. In aërobe weefsels zoals hartspier, wordt lactaat opgenomen uit het bloed en via LDH omgezet in pyruvaat dat daarna via de citroenzuurcyclus en ademhalingsketen wordt geoxideerd waarbij er per lactaat ongeveer 14 moleculen ATP worden gevormd. Mensen hebben twee LDH genen. Een H- en een M-type. De aminozuurvolgorde is voor 75% identiek. Een werkzaam lactaat dehydrogenase bestaat uit vier subeenheden die elk een katalytische plaats hebben. Met twee genen zijn dus vijf combinaties mogelijk die allen worden aangetroffen. De differentiële expressie van de twee LDH genen is weefselspecifiek. Het H-type enzym heeft een hoge affiniteit voor de substraten (werkt dus reeds optimaal bij lage substraatconcentraties) maar wordt bij wat hogere pyruvaatconcentraties geremd. Deze eigenschappen zorgen ervoor dat in hartspier (met overwegend H-type enzym, H4) bij een hoge pyruvaatproductie, pyruvaat niet omgezet wordt in lactaat. In skeletspier waar overwegend het M-type aanwezig is (M4), wordt bij een hoge pyruvaatproductie, pyruvaat wel omgezet in lactaat. De hartspier kan hierdoor niet verzuren en ophouden met werken, de skeletspier kan wel tijdelijk een grote inspanning leveren, maar verzuurt dan wel.

Figuur 4 Isoenzymen van lactaat dehydrogenase.

Zoals bij elke chemische reactie bepalen de concentraties van de reactanten de richting van de reactie. Voor de door LDH gekatalyseerde reactie bepalen dus de concentraties van pyruvaat/lactaat en NAD+/NADH en de pH of de reactie naar links of naar rechts zal verlopen. Daarnaast katalyseren weefselspecifieke isoenzymen de heen- en teruggaande-reactie met verschillende snelheden en is de substraatremming (pyruvaatremming) verschillend. Hartcellen bevatten het isoenzym H4 (vier identieke subeenheden van het type H, die tezamen een enzymcomplex vormen). Skeletspiercellen en levercellen bevatten veel isoenzym M4. H4 wordt geremd door hoge pyruvaatconcentraties zal dus niet de lactaatvorming katalyseren. Het enzym katalyseert bij voorkeur de oxidatie van lactaat. M4 heeft geen last van de pyruvaatremming en wordt dus gebruikt in cellen voor de reductie van pyruvaat naar lactaat.

- 52 -

Theorie

Het kinetisch gedrag van LDH is karakteristiek voor nagenoeg alle pyridine nucleotide (NAD(P)(H)) afhankelijke dehydrogenasen. NADH bindt eerst aan het enzym gevolgd door pyruvaat. Na de hydride (H-) overdracht vanaf NADH naar pyruvaat en protonering van de ketogroep, verlaat lactaat als eerste het enzym, gevolgd door NAD+. Dit type reactie wordt een geordend sequentieel mechanisme genoemd. In het onderstaande schema zijn de acht intermediaire vormen van het enzym weergegeven:

Figuur 5 De verschillende conformaties van LDH in een volledige reactiecyclus. Het bepalen van de verschillende reacties van een katalytische cyclus De verschillende reacties en hun snelheidsconstantes zijn bepaald met klassieke ‘steady-state’ en snelle ‘pre-steady-state’ kinetiek. Bij steady-state kinetiek meet men de langzaamste stap(pen) van de katalytische cyclus. Door bijvoorbeeld de substraatconcentratie(s) te variëren van een enzymactiviteitsmeting, krijgt men informatie over de reacties waarbij de binding van de substraten aan het enzym van belang zijn. De tijdschaal van deze experimenten is vanaf een paar seconden tot enige minuten. Bij pre-steady-state kinetiek kijkt men naar eigenschappen van het enzym tijdens het ‘eerste rondje’ van de katalytische cyclus. Men mengt enzym zeer snel met het substraat (binnen 2 milliseconden) en kijkt naar een of meerdere eigenschappen van het enzym, het substraat of het enzym-substraatcomplex. Een eigenschap die waardevolle informatie kan geven over de katalytisch cyclus is de tryptofaan fluorescentie. In alle eiwitten is de tryptofaan fluorescentie afhankelijk van zijn micro-omgeving en die kan veranderen met de verschillende conformaties van het enzym. Door nu de tryptofaan fluorescentie te volgen in de tijd, tijdens het eerste rondje van de cyclus, kan men informatie krijgen over conformatie veranderingen in het enzym. Bijvoorbeeld: het vrije enzym heeft een grote tryptofaan fluorescentie. Deze is lager wanneer NADH is gebonden. Ook kan men de fluorescentie van een fluorescent substraat volgen. Bijvoorbeeld de NADH fluorescentie neemt toe wanneer NADH bindt aan LDH. Wanneer nu naast NADH, pyruvaat bindt neemt de fluorescentie van het gebonden NADH weer af en deze verdwijnt volledig wanneer NAD+ en lactaat zijn gevormd. Uit dit soort pre-steady-state experimenten bepaalt men de snelheidconstantes van de verschillende deelreacties van de katalytische cyclus (Figuur 4).

- 53 -

Theorie

Plaatsgerichte mutagenese Naast de opheldering van de structuur en de reactiekinetiek is het maken en karakteriseren van mutant enzymen een belangrijk hulpmiddel om het werkingsmechanisme van enzymen te begrijpen. Met behulp van plaatsgerichte mutagenese is men tegenwoordig in staat heel specifiek aminozuurresiduen in enzymen te veranderen. Nadat een amino-zuurresidu is veranderd wordt het effect op kinetische eigenschappen van het enzym bestudeerd. In de tabel 1 zijn een aantal aminozuurveranderingen in LDH en hun kinetisch effecten samengevat. Deze gegevens zijn ook te vinden in Biochemistry 6de editie p. 6-10, p. 14-17, p. 27-34 en p. 147-148.

Aminozuurverandering Effecten op eigenschappen LDH

Arg106 Gln106 Hydride overdracht sterk gereduceerd (<0.07 % van de wild type activiteit). De pyruvaat binding is verzwakt, maar er is geen effect op de coenzymbinding. Tevens neemt de NADH fluorescentie niet significant af na het toevoegen van oxamaat. Dit gebeurt wel bij het wild-type enzym.

Asp166 Ala106 Asp166 Asn106

Vermindering van de bindingsaffiniteit voor pyruvaat maar niet voor lactaaat. Tevens wordt een verlaging van de hydride overdrachtssnelheid gevonden.

Arg169 Gln106 De bindingsaffiniteit voor pyruvaat is slechts 0.05% Ile249 Asn249 Verlaging van de bindingsaffiniteit voor NADH en

pyruvaat.

Swiss PDB viewer - Het op het scherm zetten van een eiwitstructuur: klik op ‘File’, ‘Open PDB-file’. De files met de structuren (extensie.pdb) bevinden zich in de practicumcomputers in de directory D:\practicum of elders. De moleculen worden weergegeven als een draadstructuur gekleurd naar atoomtype. - Het werken met het Control panel: haal het Control panel te voorschijn door op ‘Window’, ‘Control panel’ te klikken. Hierin staat de aminozuurvolgorde met een aantal attributen. Let op: als je meerdere structuren in één scherm hebt geladen, geeft de naam linksboven in het Control panel aan welke structuur actief is. Als je op die naam klikt, krijg je een lijst met alle geladen structuren en kun je een andere structuur selecteren dan de actieve structuur. Een vinkje in het hokje ‘visible’ onder de naam geeft aan of een structuur zichtbaar is; door hierop te klikken kun je een structuur laten verdwijnen. Je kunt aminozuren of andere residuen selecteren in de lijst door op de naam te drukken met de linker muistoets. Een geselecteerd aminozuur wordt rood weergegeven in de lijst. Met de ‘Ctrl’ of ‘Shift’ toets ingedrukt kun je meerdere residuen selecteren. - Het kleuren van een (deel van een) molecuul: a) klik op ‘Color’ en kies een optie, bijv.: ‘by CPK’: deze optie kleurt op atoomtype (CPK-kleuren: wit: C; blauw: N; rood: O; geel: S); ‘by layer’: hiermee kan je een verschillende kleur aan twee over elkaar geprojecteerde moleculen geven. b) voor het kleuren van een deel van een molecuul of een afzonderlijk aminozuur/ cofactor: zoek de residuen die je wilt kleuren (bijv. NAD) op in het Control panel (let op als je meerdere structuren geladen hebt dat de goede structuur actief is), klik op het blokje achter de naam van het residu. Op het scherm dat verschijnt kun je nu een kleur kiezen.

- 54 -

Theorie

Om de kleurinstelling van een item ongedaan te maken, moet het item worden geselecteerd en het kleurinstelwindow zonder selectie via het indrukken van de enterknop worden afgesloten. - Het maken van een Stick of CPK structuur: ‘Ball-and-Stick’ is niet mogelijk, wel een ‘stick’ structuur. Klik op ‘Display’, ‘Use Open GL rendering’ en daarna nog eens op ‘Display’, ‘Render in solid 3D’. Beide opties zijn nu ‘aangevinkt’. ‘CPK’ (of ‘Van der Waals’) structuur kan worden weergegeven door in het Control panel achter de naam van een residu met de linker muisknop te klikken in de kolom gemerkt ‘::ν’. (dit werkt alleen als ‘Use Open GL rendering’ en ‘Render in solid 3D’ geselecteerd zijn). Klikken met de ‘Shift’ knop ingedrukt geeft alle residuen als CPK weer. - Het verplaatsen/inzoomen/roteren van structuren op het scherm: dit gebeurt met de tweede t/m vierde knop van de knoppenbalk. Hand: verplaatsen; vierkant: in/uitzoomen; gebogen pijl (default): draaien. De beweging wordt uitgevoerd door de muis te bewegen met de linker muisknop ingedrukt (N.B.: de cursor moet zich bevinden in het scherm waarin de afbeelding staat). Als je structuur ‘kwijt’ bent, klik dan op de meest linkse knop in de knoppenbalk. De structuur verschijnt dan weer midden op het scherm. - Het identificeren van atomen: klik op de achtste knop van de knoppenbalk (met plaatje ‘Leu 41?’). Klik vervolgens op een atoom in de structuur. Je krijgt dan iets als ‘Met54CE’ op je scherm. Dit betekent dat je hebt geklikt op het C-ε atoom van aminozuur 54, een methionine. Om de labels weer te verwijderen: klik op ‘Display’, ‘Label kind’, ‘Clear user labels’. - Het meten van afstanden tussen atomen: klik op de vijfde knop van de knoppenbalk (plaatje ‘1.5 Å’). Klik vervolgens op een atoom in de structuur. Klik daarna op een tweede atoom, en de afstand tussen de atomen verschijnt op het scherm (Let op de dialoog in rood die onder de knoppenbalk verschijnt! Soms heb je net iets naast een atoom geklikt en is er niets geselecteerd). Om de labels weer te verwijderen: klik op ‘Display’, ‘Label kind’, ‘Clear user labels’. - Het weergeven van de polypeptide backbone als een ribbon structuur: Zorg ervoor dat ‘Use Open GL rendering’ in de ‘Display’ scrollbar geselecteerd is. Houd daarna de ‘Shift’ toets ingedrukt en klik in het Control panel ergens in de kolom ‘ribn’ (de kolom voor de blokjes). Om de backbone en de zijketens van het scherm te halen met de ‘Shift’ toets ingedrukt klikken in de kolommen ‘show’ en ‘side’ van het Control panel. Ribbons of andere structuurelementen kunnen van een kleur worden voorzien door eerst via het rechter ‘driehoekje’ ribbons te selecteren. Daarna wordt via de ‘col’ kolom de selecteerde items, in dit geval ribbons, gekleurd. Via deze methode is het mogelijk de ribbons van over elkaar geprojecteerde structuren een verschillende kleur te geven. Naast ribbons kunnen alle onder het rechter ‘driehoekje’ teken staande items geselecteerd en gekleurd worden. Let op: het is niet mogelijk om in een ribbonstructuur aminozuren te identificeren of afstanden te bepalen. Dit kan wel als naast de ribbon ook de backbone is geselecteerd (vinkjes in de eerste kolom). - Gedeelten van een structuur van het scherm halen of er juist opzetten: dit kan gedaan worden door de vinkjes in de kolommen ‘show’ en ‘side’ in het Control panel te verwijderen of weer terug te zetten. Dit kan voor het hele molecuul tegelijk (door de ‘Shift’ toets ingedrukt te houden), voor gedeeltes of voor aparte aminozuren/co-factoren. Een vinkje in ‘side’ heeft alleen effect als er ook een vinkje in ‘show’ staat. N.B.: NADH en

- 55 -

Theorie

oxamaat staan alleen in de structuur van ldh2, en wel helemaal onder in de lijst, na de aminozuren. De drieletterige afkorting van NADH is NAD, en die van oxamaat is OXM. - Het verwijderen van een structuur: ‘File’, ‘close’ - Het maken van een schermafdruk: Via de optie File, Save, Image kan een bitmap van het scherm gemaakt worden. Deze file wordt op het gebied C:\Biochemie\practicum Biologische Chemie gezet. Geef als filenaam bijvoorbeeld groep6-opdracht1. Deze files worden later door de assistent bekeken en zijn via een foto-editing programma uit te printen. Maak naast de bitmap-files ook aantekeningen van wat je ziet om de vragen te kunnen beantwoorden. - Manual: klik op ‘Help’, ‘Local manual’ voor een toelichting op de opties van het programma URINEZUURBEPALING Inleiding Urinezuur is het product van de purine nucleotide afbraakroute in mensen. Mensen missen het enzym uricase dat het slecht oplosbare urinezuur omzet in het beter oplosbare allantoine. Te hoge concentraties urinezuur geven aan dat er iets niet in orde is met het purine metabolisme of de afvoer via de nieren. Jicht is een ziekte die veroorzaakt wordt door een te hoge urinezuurconcentratie. In vroegere tijden werd jicht geassocieerd met overdadig eten en drinken. Deze personen dronken veel wijn uit loden bekers en kregen een loodvergiftiging. Hierdoor werkten onder meer de nieren niet meer goed en werd urinezuur niet efficiënt uitgescheiden. Daarnaast zijn er een aantal nog niet opgehelderde metabole stoornissen waarbij een te hoge purineproductie de oorzaak is van een te hoge urinezuurvorming. Verder zijn er verschillende ziektes/medische behandelingen bekend die een te hoge urinezuurproductie tot gevolg hebben. Bijvoorbeeld bij bestraling wordt er veel DNA afgebroken en dit heeft dan een sterk verhoogde purine afbraak en urinezuurvorming tot gevolg. Allopurinol wordt gebruikt om de urinezuurproductie te beperken via de remming van xanthine oxidase. Dit enzym katalyseert de laatste stap in het purine katabolisme, de omzetting van xanthine in urinezuur. Ontstekingsremmers worden gebruikt om de pijnlijke gevolgen van de natriumuraatkristallen in de gewrichten te verminderen. Er is een medische discussie over de limieten van een urinezuurtest. De concentratie van urinezuur in het bloed varieert sterk van dag tot dag en gedurende het jaar. Verhogende factoren zijn een eiwitrijk dieet met vooral veel orgaanvlees, sardines, ansjovis en alcohol. Daarnaast wordt de urinezuurconcentratie verhoogd door vasten en extreem sporten. Boven 0.42 mM urinezuur in het serum spreekt men van hyperuricemia. Als de urinezuurconcentratie hoger wordt dan 0.48 mM slaat natriumuraat neer in de weefsels. In de urine worden bij mannen waarden tussen de 1en 4 mM uraat (de gedeprotoneerde vorm van urinezuur, pKa = 5.8) gevonden. De waarden bij vrouwen zijn iets lager. HET PRINCIPE VAN DE ZUURSTOFELECTRODE Een zuurstofelectrode is een speciale electrochemische cel. De cel is van de oplossing gescheiden door een plastic membraan dat alleen doorlaatbaar is voor gassen. De electrode bestaat uit twee draden. Een platina- en een zilverdraad die beiden in een KCl oplossing steken. Er wordt tussen de electrodes een potentiaal van 0.6V aangebracht. De platina-electrode krijgt een negatieve spanning ten opzichte van de zilver-electrode. De reacties die optreden staan in figuur 6 weergegeven.

- 56 -

Theorie

Figuur 6 De electrode reacties van een zuurstofelectrode. Zoals in het schema wordt aangegeven loopt er een stroom door de cel die rechtevenredig is met de hoeveelheid O2 die in de cel aanwezig is. Door de electrode reacties is de O2

concentratie in de cel nagenoeg nul. Hierdoor zal O2 vanuit de oplossing de cel in diffunderen. Deze diffusie is rechtevenredig met de O2 concentratie in de oplossing. Dus vlak bij het membraan neemt de O2 concentratie af. Door te roeren wordt de O2 concentratie rond het membraan aangevuld en wordt de diffusiesnelheid naar de electrochemische cel bepaald door de O2 concentratie in de oplossing. Omdat de oplosbaarheid van O2 in water bij een groot aantal temperaturen bekend is, is de electrode eenvoudig te ijken door water gethermostateerd te roeren. In figuur 7 is de oplosbaarheid van zuurstof in water bij verschillende temperaturen en bij een vaste luchtdruk van 760 mm Hg weergegeven. Daarnaast bepaalt de luchtdruk de hoeveelheid O2 die opgelost is. Deze varieert maximaal 10% in Nederland. De luchtdruk is via het internet te vinden op www.weer.nl of www.met.wau.nl (meteostation Haarweg). Let goed op dat er onder de dop geen luchtbellen aanwezig zijn. Deze verstoren de meting omdat er dan vanuit de luchtbellen zuurstof het reactiemengsel in diffundeert waardoor een lagere zuurstofconsumptie wordt gemeten.

Figuur 7 De temperatuurafhankelijke oplosbaarheid van zuurstof (in mM) in water bij een luchtdruk van 760 Torr.

- 57 -

Theorie

ELECTROFORESE Het principe van electroforese (Biochemistry 6de editie p. 71 – p. 74) Bij electroforese worden de moleculen onder invloed van een electrisch veld gescheiden op basis van hun verschil in lading en grootte. De scheiding wordt in polyacrylamide- of in agarose-gels uitgevoerd. Wanneer een molecuul met een lading z zich in een electrisch veld bevindt met een veldsterkte E, ondervindt het een kracht. Hierdoor krijgt het molecuul een snelheid v. De snelheid wordt afgeremd door de wrijving met het oplosmiddel. De wrijving (f) is weer afhankelijk van de grootte en vorm van het molecuul (r) en viscositeit van het medium (η), zodat de bewegingssnelheid (v) dus afhangt van de lading van het molecuul, de wrijvingscoëfficiënt met het oplosmiddel en de sterkte van het electrisch veld. In een formule uitgedrukt: v = z*E/f waarbij f=6πηr. Daarnaast moeten de moleculen door de poriën van de gel bewegen. Als grote of langwerpige moleculen in een electroforese gel vertraagd worden komt dit omdat ze maar in een paar oriëntaties door de poriën kunnen diffunderen. Deze moleculen kunnen slechts in de lengterichting van de moleculen door de poriën en niet dwars. Kleinere moleculen kunnen in meer oriëntaties door de poriën diffunderen en zullen mede daarom sneller bewegen. Dit heeft tot gevolg dat grotere moleculen meer zullen worden vertraagd dan de kleinere moleculen. Gelelectroforese is momenteel de meest gebruikte techniek voor de analyse van eiwit- en nucleïnezuur preparaten. Vanwege de grote chemische en mechanische stabiliteit worden polyacrylamide gels veelvuldig in onderzoekslaboratoria gebruikt. Polyacrylamide wordt gevormd door een radicaalpolymerisatie van acrylamide. De polyacrylamide polymeren worden onderling verbonden met behulp van N,N,-methyleen-bisacrylamide. SDS polyacrylamide gelelectroforese (SDS-PAGE) Een eiwitpreparaat kan eenvoudig met behulp van SDS-PAGE worden onderzocht op polypeptide samenstelling. SDS-PAGE is een afkorting van Sodium Dodecyl Sulphate PolyAcrylamide GelElectrophoresis. Het eiwitpreparaat wordt met SDS gedenatureerd. Hierbij dissociëren de eiwitcomplexen en ontvouwen de polypeptideketens. Tegelijk worden eventueel aanwezige intra- en intermoleculaire disulfide bruggen met 2-mercaptoethanol gereduceerd. Het SDS vormt een complex met polypeptiden van ongeveer 1.2/1 (gram SDS/gram polypeptide). Hierdoor krijgen de SDS polypeptide complexen een sterk negatieve lading die de eigen lading van de polypeptide volledig overschaduwt. De SDS polypeptideketen complexen krijgen dus bij benadering een uniforme negatieve ladingsdichtheid. De vorm van SDS-polypeptide complexen blijkt ook nog redelijk regelmatig te zijn waardoor de migratiesnelheid door een gel alleen afhankelijk is van het molecuulgewicht van het polypeptide. Deze feiten vormen de achtergrond van de SDS-PAGE techniek. Isoelectrisch focusseren Het principiële verschil tussen isoelectrisch focusseren en electroforese is dat bij isoelectrisch focusseren de electroforese in een gel met een pH gradiënt wordt uitgevoerd, terwijl bij PAGE de pH in de gel vast is. Indien de pH gradiënt in de gel goed gekozen is, zullen de eiwitten bij isoelectrisch focusseren op basis van hun isoelectrische punten (pI) gescheiden worden. Dit is als volgt in te zien. De nettolading van een eiwit is net als dat van de aminozuren waaruit een eiwit is opgebouwd afhankelijk van de pH. Bij een lage pH zal een eiwit een positieve lading hebben, bij een hoge pH een negatieve lading. Ergens tussen beide extremen in zal de nettolading nul zijn. De pH waarbij dit het geval is, noemt men de pI, het isoelectrisch punt van het eiwit. In een electrisch veld zal een eiwit afhankelijk van zijn nettolading in de richting van de anode (+ pool) of in de richting van de kathode (- pool) bewegen. Wanneer het eiwit in een

- 58 -

Theorie

gel met een pH gradiënt beweegt, zal de lading van het eiwit met de veranderende pH afnemen. Het eiwit blijft bewegen totdat het eiwit bij zijn pI waarde is aangekomen en geen nettolading meer heeft. Zolang de pH gradiënt in de gel stabiel is zal de diffusie die bij andere chromatografische technieken piekverbreding geeft niet optreden omdat het eiwit steeds weer terugbeweegt naar de pH waarde van zijn isoelectrische punt. Deze eigenschap, het concentreren van de moleculen is uniek voor het isoelectrisch focusseren. De stabiele pH gradiënt in de gel wordt gevormd door speciale buffers aan de gel toe te voegen, de zogenaamde amfolieten. Dit zijn alifatische polyamino-polycarboxyl zuren. Tijdens de electroforese treden er bij de electroden redoxreacties op. Bij de anode (+ pool) is dit de oxidatie van H2O. De anode wordt zuur. Bij de kathode (- pool) vindt reductie van H+ plaats. De kathode wordt dus basisch. Deze pH gradiënt zet zich ook in de gel voort als deze niet sterk gebufferd wordt. Geladen moleculen (waaronder eiwitten en amfolieten) gaan onder invloed van het electrisch veld door de gel migreren. De eiwitten vanaf de plaats waar ze zijn opgebracht en de amfolieten door de gehele gel. De amfolieten bereiken hun pI veel sneller dan eiwitten omdat de amfolieten veel kleiner zijn en sneller diffunderen. Ook kan men voordat de eiwitten opgebracht worden, de gel met amfolieten prefocusseren. Gezien hun amfolitisch karakter bufferen de amfolieten de pH lokaal en houden hiermee de door de electrode reacties veroorzaakte pH gradiënt in stand. Tweedimensionale (2-D) gelelectroforese De combinatie van isoelectrisch focusseren van eiwitten en SDS-PAGE in een richting loodrecht op de richting van het isoelectrisch focusseren, noemt men 2-dimensionale gelelectroforese. Het oplossend vermogen van de combinatie van deze twee electroforese technieken is zeer groot. ISOENZYMEN (Biochemistry 6de editie p. 283) Isoenzymen zijn enzymen dezelfde reactie katalyseren maar verschillen in hun aminozuurvolgorde. Meestal hebben isoenzymen verschillende katalytische eigenschappen zoals verschillende KM waarden of wordt de activiteit op een verschillende manier gereguleerd. Isoenzymen worden altijd door verschillende genloci gecodeerd. Men neemt aan dat isoenzymen zijn ontstaan door genduplicatie gevolgd door gendivergentie. Wanneer een enzym op eenzelfde locus op een chromosoom verschilt van het enzym op het complementaire chromosoom dan spreekt men niet van isoenzymen maar van genetische verschillen per individu. Bovendien kan het zo zijn dat er expressie vanaf beide allelen plaatsvindt in heterozygoten. Tijdens het practicum wordt het isoenzympatroon van fosfoglucomutase bestudeerd. Dit enzym verbindt het glycogeen metabolisme met het glucose metabolisme. Er zijn bij de mens 5 loci voor fosfoglucomutase bekend. In spierweefsel zijn drie isoenzymen duidelijk aantoonbaar. Twee komen uit spiercellen zelf (een cytoplasmatische en een ER-membraan gebonden enzym) en een isoenzym uit rode bloedcellen. Deze drie isovormen zijn duidelijk aantoonbaar, maar als langer gekleurd wordt komen er nog twee spots op de gel bij. Bovendien kan fosfoglucomutase gefosforyleerd of gedefosforyleerd aanwezig zijn (fosforylering in spierweefsel vindt plaats via de CaM kinase. Zie Biochemistry 6de editie, p. 389 – p. 391). Omdat de aminozuurvolgorde verschilt, verschillen isoenzymen in isoelectrisch punt. Via deze eigenschap kunnen isoenzymen van elkaar gescheiden worden met isoelectrisch focusseren.

- 59 -

Theorie

- 60 -

β-GLUCURONIDASE ALS REPORTERENZYM VOOR GENEXPRESSIE Het Ti-transformatiesysteem Een veelgebruikte methode om planten te transformeren (denk aan het transgene soja en maïs) is gebruik maken van het transformatie systeem zoals dit in de bacterie Agrobacterium tumefaciens aanwezig is. Deze bacterie bevat een zogenoemd TI plasmide (Tumor Inducerend plasmide). Via dit plasmide kan de bacterie een gedeelte van het plasmide-DNA in het DNA van de plant inbrengen waarna de plant tumorweefsel gaat vormen. Uitgaande van dit natuurlijk voorkomend transformatie systeem zijn vectoren ontwikkeld waarmee elk willekeurig stuk DNA in het genoom van de meeste planten kan worden ingebracht. Voor andere organismen, bijvoorbeeld de mens, zijn soort gelijke vectorsystemen in ontwikkeling. Op basis van dit soort natuurlijk voorkomende virussen zijn vectoren ontwikkeld om onder meer gentherapie te kunnen bedrijven. Verdere informatie is te vinden in Biochemistry 6de editie p. 157– p. 159. Een standaard construct voor de TI-transformatie bevat de volgende elementen: een promotor gevolgd door de sequentie coderend voor een (reporter)enzym gekoppeld aan het gen dat codeert voor een antibioticum resistentie (nodig voor de selectie van de getransformeerde plantencellen). Het geheel wordt tussen de z.g.n. ‘borders’ (ongeveer 25 baseparen per stukje) van het TI-plasmide geplaatst. Al het DNA dat zich tussen het ‘bor-der’-DNA bevindt, wordt in het DNA van de plant ingebouwd. Daarnaast moeten de genen die de eiwitten produceren die het TI-plasmide mobiliseert en overdraagt ook in de transformerende bacterie aanwezig zijn. Het E.coli β-glucuronidase enzym is zo geschikt om als reporterenzym te gebruiken omdat planten een zeer lage endogene β-glucuronidase enzymactiviteit bezitten. Tevens is het β-glucuronidase een stabiel enzym en heeft het geen cofactoren nodig die moeten worden ingebouwd tijdens de biosynthese van het enzym. Daarnaast is de activiteit van het enzym gevoelig te meten. In dit practicum zal de β-glucuronidase activiteit met behulp van fluorescentie worden gemeten. Activiteiten rond de 1-10 pmol/min/mg plant materiaal kunnen met de practicumapparatuur eenvoudig en betrouwbaar worden gemeten.