Bevezetés a BioinformatikábaBevezetés a BioinformatikábaFehérjékFehérjék t téérszerkezetrszerkezetee

Kozlovszky Miklós

m.kozlovszky@ieee.org

3. Előadás

IsmétlésIsmétlés

Információ kódolás– Jelkészlet: IUPAC– Fileformátumok

Genbank PDB FASTA ASN.1

Ismétlés II.Ismétlés II.

Enzimek: szubsztrát->tranzíciós állapot-> produktum

Kötődési modellek– Kulcs-zár– Indukált illesztés

Aktív hely, szubsztrát kötő helyFehérje adatbázisok

– PDB, Swiss-prot

Felhasználási területek I.Felhasználási területek I.

Molekulastruktúra megjelenítés– Számítógépes grafikával– Aktív centrumok meghatározása– Másodlagos szerkezet analízis– Domén identifikáció– Molekulageometria analízis– Molekulák közötti kapcsolati területek– Molekulafelszín vizualizáció– Elektrostatikus potenciál számolás

Fehasználási területek II.Fehasználási területek II. Fehérjeazonosítás

– Aminosav összetétel/tömeg/izoelektromos pont stb. alapján– Struktúra klasszifikáció, fehérje azonosításhoz

Struktúra illesztés, összehasonlítás– Rokonsági (pl. evolúciós) kapcsolatok kutatása

Fizikai tulajdonságok predikciója a szekvenciából– Térszerkezet-predikció – Oldószer általi hozzáférhetőség predikciója– Transzmembrán hélixek predikciója– Kölcsönhatások predikciója– Töltésviszonyok predikciója– Felszíni struktúrák, üregek meghatározása (hozzáférési pontok!)

Fizikai tulajdonságok Fizikai tulajdonságok és a szekvencia I.és a szekvencia I.

Aktív területek jóslása– http://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/ligplot/

ligplot.html

Topológia-cartoon (segít a vizualizációban)– http://www3.ebi.ac.uk/tops/

Fizikai tulajdonság és a Fizikai tulajdonság és a szekvencia II.szekvencia II.

Naccess (Oldékonyság/oldhatóság)– A hozzáférhető molekulákat számolja PDB file-ból– http://wolf.bms.umist.ac.uk/naccess/

Elektrosztatikus potenciál számolás + molekula dinamika+ brown mozgás szimulációk– UHBD (University of Houston Brownian Dynamics)

http://adrik.bchs.uh.edu/uhbd.html

Struktúra osztályozásStruktúra osztályozás

Adatbankok – SCOP (structural Classification of Proteins)

http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/

– CATH hasonló a SCOP-hoz, csak más szempontok alapján

osztályozhttp://www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/cath/cath.html

Kérdés:Kérdés:Miért kell térszerkezetet Miért kell térszerkezetet jósolnijósolni??

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

1984 1986 1988 1990 1992 1994 1996 1998 2000

Year

Num

ber

of e

ntri

es

Sequences (PIR)

Structures (PDB)

VálaszokVálaszok

A kísérletek– költségesek– nehezen automatizálhatóak– sok időbe kerülnek

In silico:– Olcsó, „gyors”,automatizálható => pontatlan

Ha tudjuk a szerkezetet– következtethetünk a funkcióra

Ha többféle vizsgálatot használunk csökken a tévedés veszélye

SzekvenciaSzekvencia<<??>strukt>struktúraúraSzent grál kereséseSzent grál keresése

CASP– Aminosav szekvenciából struktúra jóslás– Két évente rendezik a versenyt– http://predictioncenter.org/– Népszerű verseny (sok algoritmus)– A verseny nyílt, az algoritmusokat többféle

szempont alapján rangsorolják

Másodlagos struktúrajóslás Másodlagos struktúrajóslás pontosság mérésepontosság mérése

Q3 mérőszám– N-aminosavak száma a láncban

– Nr3-helyesen jósolt struktúra (alfa-hélix, stb.)

Sov mérőszám (Segment overlap score) (Burkhard Rost et al.) Erősebb mint a Q3

Büntetőpontokat ad ha nem összefüggő a szekvencia (lukakért)

– Megjegyzés Legyünk mindig konzervatívak, érdemes átlagos értékekkel számolni,

Egyszerű statisztikák, nincs bennük „fontossági” mérőszám

Szürke szín=egyezés

• Első generációs algoritmusok (70-es évek) egyszerű aminosav sorrenden alapultak:• Chou & Fasman (1974) (Aminosav táblázatból)• Lim (1974)• Garnier, Osguthorpe & Robson (1978)• Q3 pontosság kb: 50-55%

• Második generációs algoritmusok (80-as évek)Peptid szegmenseken alapulnak:• GOR III (1987) ismert aminosav sorrendből felállított

struktúrák alapján gyakoriságot vizsgál• Neurális hálózatokkal: Qian & Sejnowski (1988)

• Korábbi algoritmusokból kapott tudást MI-vel megtámogatták

• Q3 pontosság kb: 60-65%

Megoldások, eszközök I.Megoldások, eszközök I.

Megoldások, eszközök II.Megoldások, eszközök II.

Harmadik generációs algoritmusok (90-es évek)Evolúciós információk alapján, többszörös szekvencia illesztéssel• PHD (Q3 ~ 70%)

-Rost B, Sander, C. (1993)• PSIPRED (Q3 ~ 77%)

- http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/- Jones, D. T. (1999) - Sok éven át vezette a CASP-ot

Negyedik generációs algoritmusok? – Max 88% felső korlát?

Strukturálatlan részek Strukturálatlan részek predikciójapredikciója

Viszonylag új területA genom kb. 1/5-e ilyen területeket kódolDISOPRED (2004, Ward et al.)

– http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/disopred/

Fold recognitionFold recognition

Viszgált Szekvencia

Fold adatbázis

Hasonlóság mérése

Pont, vagy potenciál

Megoldások, eszközökMegoldások, eszközök THREADER, Jones et al. (1992)

– Nem próbál pontos struktúrát meghatározni– Elég hatékony, de lassú is– Kisebb szerkezeti struktúrákhoz jól használható, teljes

modellekre kevésbé– Az eredmények nehezen értelmezhetők– ftp://bioinf.cs.ucl.ac.uk/pub/threader/manual.pdf

Transzmembrán-hélixek Transzmembrán-hélixek Nagyon fontos terület (80-as évektől)

– (Sejt)membránokhoz/ba kapcsolódás– Membránfehérjék szükségesek alapvető dolgokhoz pl:fotoszintézis,idegi

aktiváció,légzés,immunválasz,sejtközötti jelátvitel,stb…. Fehérje struktúrákat keresünk, melyek:

– Adott helyeken hélix szerkezetűek (17-25 aminosav hossz)– Meghatározott helyeken hidrofób struktúrájuk van– Használható szoftverek

TMHMM

– www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/ TOPPRED2

– http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/toppred.html MEMSAT

– http://saier-144-37.ucsd.edu/memsat.html

Kb. 90-95%-os pontosság

3D 3D Jóslási módszerek általánosságbanJóslási módszerek általánosságban

Egyszerűnek tűnik, de nem az… Két út

– Homológia modellezés (Összehasonlítjuk ismert dolgokkal)

http://salilab.org/modeller/– Ab-initio-jóslás

(Kezdeti szekvenciából jósolunk) Már a másodlagos szerkezeteknél is gondban vagyunk, hátmég ha

bonyolítjuk a dolgot! (Samudrala- RAMP)

Harmadik út...– Hibrid módszereket alkalmazunk

Modell ellenőrzésModell ellenőrzés

Fontos, mert messze vagyunk a 100%-tól– VERIFY-3D

http://nihserver.mbi.ucla.edu/Verify_3D/

– PROCHECK http://www.biochem.ucl.ac.uk/~roman/procheck/

procheck.html

– WHAT IF http://swift.cmbi.kun.nl/whatif/

Fehérjeszerkezet megismerési Fehérjeszerkezet megismerési metodikák (ismétlés)metodikák (ismétlés)

Különválasztás legjellemzőbb tulajdonságok alapján– Méret (SDS-poliakrilamid, gélelektroforézis,

ultracentrifugálás, gélszűrés és kromatográfia– Oldékonyság (oldószerek, detergensek,pH érték)– Töltés (elektroforézis,elektroforézis pH grádiensben)– Kötődési affinitás– Aminosavak mennyiségi meghatározása– Aminosav sorrend meghatározása– 3D fehérjeszerkezet (rtg. kristallográfia, NMR)

ElektroforézisElektroforézis

Elektroforézis (ismétlés) – Oldatban lévő különböző molekulatömegű és töltésű

(ionizált) részecskék elektródák (anód: +, katód: –) közötti elektromos erőtér hatására ellentétes töltésük szerint vándorolnak.

– Markerek használata– Gél mint vivő közeg

(pl. poliakrilamid – PAGE, agaróz,stb.)– nx100V,mx10perc, a végén festés/rögzítés– A gél (vivőanyag) pórusmérete változtatható

Elektroforézis pH grádiensben

Tömegspektrometria Tömegspektrometria – mass spectrometry -– mass spectrometry -

Jelenleg az egyik leghatékonyabb vizsgálati módszer J.J.Thomson (1910-es évek) – izotóp kutatás 1950-es évektől szerves vegyületekre is alkalmazzák MA: Gyors (20-30 perc)->összetett elegyek minőségi

és mennyiségi elemzése Ionos részecskéket választunk el fajlagos tömegük

(töltésegységre eső tömegük: m/z) szerint csökkentett nyomáson, elektromos, vagy mágneses mezők segítségével.

Felhasználási területek:BioTech, gyógyszerkutatás, környezetvédelem, ellenőrzés (pl.:víz, élelmiszer)

Tömegspektometria alapjaTömegspektometria alapja

Az elválasztott ionok intenzitását folyamatosan mérjük, s így egy ionáram intenzitás - fajlagos tömeg függvénykapcsolathoz, az ún. tömegspektrumhoz jutunk.

Nincs két olyan szerves vegyület, amelyiknek a tömegspektruma (a legintenzívebb ion intenzitására normált, ún. karakterisztikus tömegspektruma) azonos lenne.

Magyarul:megkapjuk a vizsgált peptidek pontos molekulatömegét. Ennek alapján a fehérje azonosítható.

Egy általános tömegspektrométer részeiEgy általános tömegspektrométer részei Mintabeviteli rendszer Ionforrás, ionoptikával, mely ionokat gerjeszt az alábbi

módszerekkel:– Elektronütközéssel

50-75eV energiájú elektronokat ütköztet Gáz fázis->bomlás nélkül kell párologtatni a vegyületet,stabilitás! Elterjedt (adatbankok)

– Kémiai ionizációval (reagens gázzal ütközteti a vegyületet)– Gyors atom bombázással (FAB) (hőérzékenyek dolgokhoz használják)– Mátrix közvetítésével végzett lézer deszorpciós ionizációval (kíméletes!)

lásd a következőkben:MALDI

Analizátor Detektor Vákuumrendszer Számítógép szabályzó és adatkezelő (gyűjtő, feldolgozó, archiváló)

funkcióval.

Jól szabályozható ionizáció lehetővé teszi termikusan igen érzékeny anyagok (enzimek,

hormonok, nagy tömegű biomolekulák, fehérje szekvenciák, stb. tömegspektrometriás vizsgálatát.

A lézer forrásból származó gerjesztő energiát egy mátrix veszi fel és közvetíti a vizsgálandó molekulák felé.

A keletkezett ionokat azután egy nagy térerejű gyorsító rendszer (60-100 kV) kiszívja

Deszorbeálja a kondenzált fázisból Azután a detektor érzékeli

MALDIMALDIMatrix-Assisted Laser Desorption Ionization Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization

Analízátor típusokAnalízátor típusok Az elválasztás többféle elv alapján oldható meg. Repülési idő (TOF: time of flight) -> TOF-MALDI Analizátos lehet még: elektromos (pl. kvadropól, rádiófrekvenciás,

ioncsapda, omegatron), mágneses analizátorú, elektrosztatikus, kettős fókuszálású, tandem, stb.

eV = KE = mv2/2

Kinetikus energia

Tömeg-töltés (Mass-to-charge) arány

Elektr. mezőenerg.

20 40 60 80 100

50

100

m/z

Rel. int.%

M+.

86

58

57

4129

Röntgen kristallográfiaRöntgen kristallográfiaKristályosítani kell hozzá az anyagokat

– Nagy és tiszta protein kristályok – Nehéz előállítás– Sok fehérjét nem „lehet” kristályosítani

Pl. a vízre érzékeny membránproteinek elveszítik formájukat

NMRNMRNuclear Magnetic ResonanceNuclear Magnetic Resonance

Pauli (1924-25): „az atommagnak is van impulzus, és ezáltal mágneses momentuma”

Edward M. Purcell & Felix Bloch (1946) Több mint fél tucat Nobel-díj idáig az NMR kutatások

segítségével Felhasználási területek:

– Gyógyszeripar, anyagtudományok, kémia, élelmiszeripar,stb.

Egyszerüsített működése:– Az anyagot rádióhullámokkal gerjesztjük,

miközben erős elektromos térben van– Figyeljük a választ, nagyon érzékenyen :)