Biochemia

stresu oksydacyjnego

Wykład 5

Oksygenazy hemowe - nowe funkcje starych enzymów

Aktywność oksygenaz hemowych

oksygenaza hemowa

Ferritin

uszkodzenie tkanek

białka

hemowe

Fe2+uszkodzenie tkanek

bilirubina ochronabiliwerdyna

CO

ochrona

rozpuszczalna cylaza

guanylanowa

cGMPGTP

pompa żelazowa

ochrona

Hem

ochronap38

BvR

Skutki braku HO-1 u myszy

Na istotność HO-1 wskazuję skutki jej braku u myszy: zwiększona

peroksydacja lipidów, uszkodzenie śródbłonka i wątroby, niedorozwój

gonad, niepłodność, przedwczesna śmierć.

- Fibroblasty myszy HO-1-/- są bardzo wrażliwe na stres oksydacyjny.

After Poss & Tonegawa, PNAS 1997.

0

100

200

300

400

HO-1+/+

Enhanced free radicals production

by murine HO-1-/- fibroblasts

% F

luore

scene o

f untr

eate

d c

ells

cells treated with

50 M hemin for 24 h

0

20

40

60

80

100

Reduced survival of

murine HO-1-/- fibroblasts

cells treated with

100 M hemin for 24 h

% S

urv

ival

HO-1-/- HO-1+/+ HO-1-/-

*

*

Yet et al. FASEB J. 2003.

Brak HO-1 nasila tworzenie blaszek miażdżycowych

lesion

lesion

lipid accumulations

Yet et al. FASEB J. 2003.

barwienie na elastynę

barwienie na makrofagi

Brak HO-1 nasila tworzenie blaszek miażdżycowych

Yet et al. FASEB J. 2003.

Tworzenie neointimy 14 dni po uszkodzeniu tętnicy udowej

u myszy HO-1-/-

Duckers et al. Nature Med. 2001

WT mice HO-1-/- mice

Brak HO-1 nasila tworzenie neointimy

Taha et al. J Physiol Pharmacol 2009

Isotypic

Control

WT LPS

Bright

field

WT

Control

HO-1 KO

Control

HO-1 KO

LPS

Wpływ braku HO-1 na reakcję zapalną

TNF

[Immunohistochemistry]

TN

Fα

[pg/m

L]

0

1000

2000

3000

WT KO

Serum

0

40

80

120

160

Media

TN

Fα

[pg/m

L]

WT KO

VCAM-1

Brak HO-1 u człowieka

U jedynego znanego pacjenta pozbawionego HO-1:

* obecność wysoce oksydowanych lipoprotein niskiej gęstości (LDL)

we krwi

* bardzo duża wrażliwość komórek śródbłonka na uszkodzenia

Nasilające się reakcje zapalne i ciągły stres oksydacyjny

prowadzą do:

* poważnych uszkodzeń śródbłonka

* tworzenie nacieków tłuszczowych i blaszek miażdżycowych w

tętnicach

Dulak et al. Antioxidant Redox Signal 2002

HO-1 zwiększa syntezę VEGF(szczurze VSMC)

(Hemina: aktywator HO-1; SnPPIX: inhibitor HO-1)

0

50

100

150

200

250

control hemin hemin

SnPPIX

*

#

0

50

100

150

200

VEG

Fpro

tein

[% o

f contr

ol]

*

#

hemin

SnPPIX

hemincontrol

HO

-1 a

cti

vit

y [

% o

f contr

ol]

HO-1

activityVEGF

expression

Nadekspresja HO-1 zwiększa syntezę VEGF poprzez

aktywację promotora

(komórki HMEC-1 transfekowane przejściowo pcDNA-HO1)

Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal 2003

VEG

F [

% o

f contr

ol]

0

50

100

150

200

250

300

*

VEGF protein

control b-gal HO-1

0

0.3

0.6

0.9

1.2

1.5

VEG

F/G

APD

H r

ati

o

*

VEGF mRNA

control b-gal HO-1

Lum

inesc

ence [

% o

f contr

ol]

0

100

200

300

400

b-gal HO-1

*

VEGF promoter activity

pGL2-VEGF

Brd

U incorp

ora

tion

[% o

f contr

ol]

0

20

40

60

80

100

120

intact VEGF SnPP

1 M

SnPP

3 MSnPP

10 M

CuPP

10 M

**

Endothelial cell proliferation

Cry

tsal vio

let

stain

ing

[% o

f contr

ol]

0

20

40

60

80

100

120

intact VEGF VEGF

SnPPIX

VEGF

CuPPIX

*

Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal 2003

Endothelial cell migration

Tube

formation

Capillary

sprouting

control VEGF

VEGF + SnPPIX VEGF + CuPPIX

control

VEGF + SnPPIX VEGF + CuPPIX

Zahamowanie aktywności HO-1 zmniejsza potencjal angiogenny

śródbłonka

VEGF

Józkowicz et al. Antioxid Redox Signal 2003, 2007

0

50

100

150

200

250

300

VEGFbgal cDNA CORM

cum

ula

tive length

of

spro

uts

[% o

f re

fere

nce] * *

VEGF

HO-1 cDNA

VEGF VEGF

HO-1

CO

cGMP

p38

PKG CREB

PKA

AP-1AP-1

PI3K Akt

VEGF HO-1 cDNA

gal cDNA

VEGF +

VEGF + VEGF + CORM

Nadekspresja HO-1 lub podanie CO ułatwia tworzenie kapilar

Deshane et al. J Exp Med, 2007

HO-1 jest konieczna do proangiogennego działania SDF-1

HO-1-/-

Grochot-Przeczek et al., in preparation.

Wpływ braku HO-1 na proliferację EPC

[PCNA staining]

EPC WT EPC KOVEGF VEGFcontrol control

*

*

0

20

40

60

80

100

Control

% o

f posi

tive c

ells

WT

KO

VEGF

30 ng/ml

Lectin

AcLDL

KO control KO VEGF

WT control WT VEGF

*

*

Grochot-Przeczek, in preparation, Deshane et al. J Exp Med, 2007

WT

KO

WT

KO

0

10

20

30

40

50

num

ber

of

cells

control SDF-1 CM

*

**

control SDF-1 CM

HO-1 ułatwia migrację EPC

Control H2O2 50 uM

Annexin

V p

osi

tive c

ells

[% o

f contr

ol]

*

** #

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900HO-1 +/+

HO-1 -/-

Wpływ braku HO-1 na wrażliwość EPC na stres oksydacyjny

Grochot-Przeczek et al., in preparation.

Apoptosis[Annexin V staining]

Kanulacja komory oka za pomocą (igła

30 gauge)

2 h of ciśnienia

hydrostatycznego (80-90 mmHg)

Usunięcie igły i reperfuzja (drugie oko-

kontrola)

Podanie EPC znakowanych PKH67

dye do ciała szklistego

Deshane et al. J Exp Med, 2007.

0

5

10

15

20

25

30

35

HO-1+/+ HO-1-/-

SD

F-1

(pg/m

g p

rote

in)

Injured (LE)

Control (RE)

##

Model niedotlenienia siatkówki u myszy

HO-1+/+

Rh-agglutinin Merged PKH 67

Deshane et al. J Exp Med, 2007

HO-1-/-

Rh-agglutinin Merged PKH 67

Wpływ braku HO-1 na aktywność EPC

Yoshida et al. Circulation 2001.

Niski poziom ekspresji HO-1 nie wystarcza do cytoprotekcji

WTHO-1+/-

0

1

2

3

4

5

6

WT HO-1+/-

*

Infarct sizeCK release

(Myszy WT i myszy HO-1+/-)

Polimorfizm promotera HO-1 u ludzi

Yamada et al. Am J Hum Genet 2000; Chen et al. Eur Heart J 2004.

(GT)n

Exon 1

Częstość (GT)n w populacji

Kaneda et al. ATVB 2002

Yamada et. al. Am J Hum Genet 2000

Częstość (GT)n w populacji

Chen et al. Eur Heart J 2004

Częstość (GT)n w populacji

HO

-1/E

F2

HO

-1/E

F2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 35 36 37

Longer

0

0.1

0.2

0.3

0.4

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 35 36 37

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 35 36 37

Number of (GT)n repeats

0

0.2

0.4

0.6

22 23 24 25 27 28 29 30

Shorter

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

22 23 24 25 27 28 29 30

0

0.4

0.8

1.2

1.6

2

22 23 24 25 27 28 29 30

Number of (GT)n repeats

0

0.4

0.8

1.2

44 45 47 48 49 50 51 52 54 57 58 59 60 63 64 65 66 67

CoPPIXBoth

0

0.1

0.2

0.3

44 45 47 48 49 50 51 52 54 57 58 59 60 6364 65 66 67

H2O2

0

1

2

3

4

15d-PGJ2

44 45 47 48 49 50 51 52 54 57 58 59 60 63 64 65 66 67

Number of (GT)n repeats

HO

-1/E

F2

Wpływ polimorfizmu promotora na ekspresję HO-1

Taha et al. ATVB 2010.

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38

allele

fre

quency

number of GT repeats

S M L

Taha et al. ATVB 2010.

Częstość alleli (GT)n HO-1 w populacji

*

***

0

0.004

0.008

0.012

S M L

HO

-1/E

F2

0

0.06

0.12

0.18

S M L

HO

-1/E

F2

**

***

control

H2O2

0

0.2

0.4

0.6

S M L

HO

-1/E

F2 CoPP

***

0

0.4

0.8

1.2

1.6

S M

HO

-1/E

F2 15d-PGJ2

*

**

0

0.04

0.08

0.12

S M L

HO

-1/E

F2 LPS

*

0

0.01

0.02

S M L

HO

-1/E

F2

IFN

0

0.01

0.02

S M LH

O-1

/EF2

hemin

0

0.03

0.06

0.09

S M L

HO

-1/E

F2

hypoxia

L

Wpływ polimorfizmu promotora na ekspresję HO-1

Taha et al. ATVB 2010.

*

**

***

***

* **

***

***

* *

** *** *

*

**0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

control hemin CoPPIX H2O2 15d-PGJ2 IFN LPS hypoxia

HO

-1/E

F2

S M L

Taha et al. ATVB 2010.

Wpływ polimorfizmu promotora na ekspresję HO-1

***

**

0

100

200

300

400Brd

U r

educti

on [

% o

f contr

ol]

S M Lcontrol

Wpływ polimorfizmu HO-1 na proliferację śródbłonka

VEGF

Taha et al. ATVB 2010.

0

2000

4000

6000

8000

S M L

length

of

capilla

ries

[AU

]

control VEGF

VEGFcontrol

0

100

200

300

mig

rati

on [

%of

contr

ol]

S M Lcontrol

VEGF

VEGFcontrol

Taha et al. ATVB 2010.

Wpływ polimorfizmu HO-1 na migrację śródbłonka

[ELISA]

IL-1

#

#

*

*

0

50

100

150

200

250

S M L

IL-1

β[p

g/m

l]

Allele

#

#

Control

LPS

Wpływ polimorfizmu promotora na reakcję zapalną

Taha et al. ATVB 2010.

[ELISA]

ICAM-1 E-selectin

IL-6 TNF

Taha et al. ATVB 2010.

Wpływ polimorfizmu promotora na reakcję zapalną

*

0

5

1

0

15

20

25

S M L

GSH

: G

SSG

[nm

ol/

mg]

GSH : GSSG

0

1.0

2.0

3.0

S M L

Glu

tath

ione [

nm

ol/

mg]

**Total glutathione

0

0.4

0.8

1.2

1.6

S M L

GSH

[nm

ol/

mg]

GSH

S M L

**

0

0.4

0.8

1.2

GSSG

[nm

ol/

mg] GSSG

[HPLC]

Wpływ polimorfizmu promotora HO-1 na status oksydacyjny

Taha et al. ATVB 2010.

control100 200 400 800

H2O2 [uM]

***

****** ***

******

*

*

0

20

40

60

80

100

120

MT

T [

% o

f contr

ol]

Test redukcji MTT

Time [h]

0

20

40

60

80

0 3 6 12 24

annexin

[%

of

cells]

*

Barwienie na aneksynę-V

S M L

Taha et al. ATVB 2010.

Wpływ polimorfizmu HO-1 na żywotność śródbłonka

Oksygenaza hemowa-1

Skutki indukcji HO-1:

• Cytoprotekcja

(oporność na stres oksydacyjny)

• Immunomodulacja(zahamowanie zapalenia, regulacja

komórek Treg)

• Modulacja angiogenezy

heme

HGF

inflammatory

cytokines

oxidants hypoxia

irradiation

chemo-

therapy

after Otterbein et al. 2003

heme

Berberat et al. Clin Cancer Res 2005

Ekspresja HO-1 w liniach raka trzustki

Panc-1 MIAPaCa Colo 357 SU.86.86

Marinissen et al. JBC 2006

GPCR indukuje ekspresję HO-1

Berberat et al. Clin Cancer Res 2005

Ekspresja HO-1 w nowotworze trzustki

Nowis et al. Oncogene 2006.

HO-1 jest indukowana przez PDT linii C26 adenocarcinomy

Częstość alleli HO-1 (GT)n wśród osób zdrowych

i chorych na OSCC lub OSF

Chang et al. Br J Cancer 2004.

OSCC - oral squamous cell carcinoma

OSF - oral submucous fibrosis

Longer (GT)n repeat allele in HO-1 promoter is associated with the risks of

areca-related OSCC, while the shorter (GT)n repeat allele may have protective

effects for OSCC.

Marinissen et al. JBC 2006

Inhibicja HO-1 zwiększa transformację fibroblastów

indukowanej GPCR

Marinissen et al. JBC 2006

DMBA PMA

HO-1 +/+ HO-1 -/+ HO-1 -/-

Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej

Red - PCNA Blue - DAPI Green - lectin

Waś et al. under revision

Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej

10 20 300

100100

125

150

* * ** * *

***

*** *

Time [weeks]

Weig

ht

incre

ase

[%

] +/++/

--/-

HO-1 +/+ HO-1 -/+ HO-1 -/-

10 20 300

25

50

75

100

w 4 w 6

w17 w 26 w 27

Time [weeks]

Mic

e w

ith t

um

ors

[%]

+/++/

--/-

10 20 300

25

50

75

100

Time [weeks]

Surv

ival [%

]

+/++/

--/-

Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej

Waś et al. under revision

Waś et al. under revision

papilloma

carcinoma

papilloma

carcinoma

HO-1 +/+

HO-1 -/+

HO-1 -/-

Dwuetapowy model karcinogenezy chemicznej

Waś et al. under revision

Wpływ HO-1 na fibroblasty z nadekspresją c-myc

* *

*

*

#

# #

0

0.1

0.2

0.3

control DMBA c-myc

cyclin-D

1/E

F2 *

* *

B

*

#

0

0.2

0.4

0.6

0.8

cyclin-D

2/E

F2 C

control DMBA c-myc

*

0

0.01

0.02

0.03 D

cyclin-D

3/E

F2

control DMBA c-myc

Expression of cell cycle regulating genes

+/+

+/-

-/-

positive

controltransformed

fibroblasts

negative

control

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

+/+num

ber

of

colo

nie

s/fi

eld

*

*

+/- -/-

Clonogenic assay

Fibroblasts overexpressing c-myc

HO-1 +/+ HO-1 -/+ HO-1 -/-

• Myszy C57Bl/6 x FvB o różnym genotypie HO-1

• Dożylne lub podskórne podanie komórek czerniaka B16(F10)-luc-GF

B

Wpływ HO-1 w podścielisku na wzrost czerniaka

Luciferase activity

Lucif

era

se a

cti

vit

yGFP expression

B16(F10)-WT B16(F10)-luc-GFP

Waś et al. in preparation

Waś et al., in preparation

Pro

life

rati

ng c

ells

[%]

Apopto

tic c

ells

[%]

Volu

me [

mm

3]

0 25 50 75 1000

25

50

75

100

125

HO-1 +/+

HO-1 +/-

HO-1 -/-

Czas od zaszczepienia [dni]P

rzeżycie

[%

]

Wpływ HO-1 w podścielisku na wzrost czerniaka

Surv

ival [%

]

time after injection

time after injection

Wpływ HO-1 w podścielisku na zasiedlanie płuc

przez komórki czerniaka

Waś et al., in preparation

HT

WT

KO

HT

Lum

inesc

ence f

rom

lungs

1000000

2000000

3000000

4000000

5000000

6000000

0

WT HT KO

Waś et al. Am J Pathol, 2006

• Dożylne lub podskórne podanie

komórek czerniaka z normalnym lub

podwyższonym poziomie HO-1

Wpływ nadekspresji HO-1 na komórki czerniaka

• Myszy C57Bl/6 o normalnym poziomie

HO-1

Waś et al. Am J Pathol, 2006.

HO-1 zwiększa żywotność i potencjał angiogenny

komórek czerniaka

Wzrost guzów czerniaka B16(F10) i B16(F10)-HO1

Wielkość guza Obszary nekrotyczne

Waś et al. Am J Pathol, 2006

Waś et al. Am J Pathol, 2006

Struktura guzów czerniaka B16(F10) i B16(F10)-HO1

CD45 staining - FACS analysis

0

10

20

30

40

50

WT HO-1 overexpression

Perc

enta

ge o

f le

ukocyte

s (%

of

all)

*WT

HO-1 overexpression

H&E staining

Waś et al. Am J Pathol, 2006.

Naciek zapalny w czerniaku B16(F10) i B16(F10)-HO1

Serum Tumor

Was et al. Am J Pathol 2006

Unaczynienie czerniaków B16(F10) i B16(F10)-HO1

Waś et al. unpublished

0

100

200

Mig

rati

on [

% o

f contr

ol]

B16(F10)-luc-GFP B16(F10)-luc-GFP

-HO1

*

0

100

200

Invasi

on [

% o

f contr

ol]

*

B16(F10)-luc-GFP B16(F10)-luc-GFP

-HO1

Migracja komórek czerniaka B16(F10) i B16(F10)-HO1

0

20

40

60

80

0 1 2 3weeks after injection

nu

mb

er o

f m

eta

sta

ses WT

HO-1

p=0.054

*

*

HO-1 zwiększa liczbę

przerzutów w płucach

Waś et al. Am J Pathol, 2006.

*

*

Wpływ HO-1 na przerzutowanie czerniaka

Day of experiment

0

20

40

60

80

10 20 30 40 50

Surv

ival ra

te [

%]

WT

HO-1

100

P=0.017

Waś et al. Am J Pathol, 2006.

Wpływ nadekspresji HO-1 w komórkach czerniaka

na przeżywalność myszy

*

*

*

*

Nowis et al. Oncogene, 2006.

Wpływ nadekspresji HO-1 w komórkach adenokarcinomy

na skuteczność PDT

Wpływ HO-1 na wzrost guzów endothelioma

Marinissen et al. JBC 2006

HO-1

Fe2+

biliverdin

bilirubin

CO

↑ Proliferation:- keratinocytes

- endothelium

- angioma

- pancreatic cancer cells

- melanoma

- lung cancer cells

- hepatoma

- sarcoma

↓ Proliferation:- epithelium

- astroglia

- T-lymphocytes

- fibroblasts

- smooth muscle cells

- breast carcinoma

- papillary thyroid carcinoma

- gastric cancer cells

Mediators:↑ p38, EGF, EDG-7,

FGFR-1

↓ p21, BTG-2

p21cGMP

p38

caveolin cyclin A

- cyclin A

- cyclin E1

- cyclin D

- cdk-2

ERK1/2

ferritin

iron pomp

iron

availability

Mediators:↑ p21, p38, caveolin-1

↓ cdk-2, cyclin A, E, D1,

↓ ERK1/2

↓ iron availability

Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal, 2007.

Wpływ HO-1 na szlaki transdukcji sygnału

HO-1biliverdin

bilirubin

CO

cGMP

p38

↓ Inflammation- melanoma IL-10

INF ,

IL-

1b,

TNF,

IL-6

iNOS

Fe2+

ROS

ferritin

iron pomp

AP-1

NF B

E-selectin

ICAM-1

VCAM

Mediators↑ IL-10, TNFR-1, LSP-1

↓ INF , IL-1b, TNF, IL-6, iNOS, T 4

↓ ROS, E-selectin, ICAM , VCAM

JNK

Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal, 2007.

Wpływ HO-1 na szlaki transdukcji sygnału

↓ Apoptosis:- endothelium

- fibroblasts

- vascular smooth

muscles

- hepatoma

- melanoma

- thyroid carcinoma

- chronic myelogenic

leukemia

- gastric cancer cells

- colon cancer cells

- bladder cancer cells

ROS

Mediators↑ Akt, Bcl, cIAP-1, p21,

↑MT1X, SOD-2, GSTA1, ATF4,

↑ MDR, Mrp

↓ ROS, Bax, p53

↓ cytochrome c release,

HO-1

Fe2+

biliverdin

bilirubin

CO

cGMP

ferritin

iron pomp

cytochrome c

release, p53

p21PKGAkt

p38

Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal, 2007.

Wpływ HO-1 na szlaki transdukcji sygnału

HO-1

Fe2+

biliverdin

bilirubin

CO

cGMP

p38

ferritin

iron pomp

VEGF expression

VEGF signaling

SDF signaling

SDF-1

VEGF

IL-8

TNF

TP↑ Angiogenesis

- glioma

- melanoma

- pancreatic cancer

- lung carcinoma

- Kaposi sarcoma

Mediators↑ VEGF, EGF,

↑ Tb4, HYAL-1, MCT-1

PKG

PKA

Akt

Jozkowicz et al. Antioxidant Redox Signal, 2007.

Wpływ HO-1 na szlaki transdukcji sygnału

HO-1 activation

↑↓ tumor cell proliferation↓ inflammatory response

↑ immunosuppression

↑ angiogenesis↑ metastasis

tumorigenesis

radiotherapy

chemotherapy

photodynamic therapy

more invasive tumors

Jozkowicz et al. Antioxidant Redoc Signal. 2007.

Wpływ HO-1 na nowotworzenie

Oncogene-like potential

Very new:

Dziękuję

Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej