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Bioensayo mediante la utilización de la línea celular de hepatoma de rata H4IIE

Tomás Schöffer Navarro (MV)

septiembre 2010

El bioensayo de la línea celular de hepatoma de rata H4IIE, test in vitro que detecta y semicuantifica COP´s, como son PCB´s, PCDDs, PCDFs, en diferentes matrices

Mide actividad catalítica del citocromo P450, mediante la actividad EROD (Etoxiresorufina –o -detilasa).

La inducción del CYP1A permite oxidar la Etoxiresorufina a Resorufina (fluoresce)

Introducción

Desde los años 70, se reporta el uso de esta línea celular para este tipo de contaminantes (Benedict, 1973)

Deriva de la línea Reuber Hepatoma H-35 (Reuber 1961

Sus principales características son:

Rápido crecimientoBaja actividad basalAltamente inducible Respuesta específica a PCDD/F y DL-PCBs

Línea Celular H4IIE

Esquema de aplicación del bioensayoH4IIE

Cultivo de Células H4IIE


Requerimiento

Fuente estable y consistente de células Alícuota Inicial de células ATCC (CRL-1548): Criopreservada Libre de Mycoplasma arginini : común en cultivos

celulares efectos adverso:• Cambios en el metabolismo• Cambios en el crecimiento celular• Síntesis proteica• Viabilidad• Cambios en DNA y RNA• Cambios morfológicos

Requerimiento

Las células H4IIE pueden ser fácilmente cultivadas de forma rutinaria si se cuenta con el equipamiento y componentes nutricionales necesarios para el cultivo de cualquier célula de mamífero:

Medio de mantención definido Ambiente adecuado Cuidado rutinario



Medio ATCC Medio esencial mínimo

(Eagle) en solución básica de Earle

80% de aminoácidos no esenciales

10% Suero Fetal Bovino (SFB)

10% Suero de Ternero

Medio Tillit (Tillit et al .,1991a)

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)

Aminoácidos no esenciales

Aminoácidos esenciales Pyruvato D-glucosa NaHCO3

15% SFB

Medios de cultivo

Medios de cultivo

Estos medios proveen de factores nutricionales, hormonales o de estroma necesarios para el crecimiento y desarrollo

SFB conllevar a variaciones según lote

Suero Corresponde a una mezcla compleja de pequeñas y grandes biomoléculas con promotores del crecimiento fisiológicamente balanceados y con actividades inhibidoras del crecimiento (Freshney, 1992). Aunque se sabe mucho sobre el rol nutricional de los componentes en el suero, sigue habiendo numerosos factores cuyas funciones fisiológicas que no se entiende


Influencia Suero

Poco clara Alta precisión entre

laboratorio bajo efecto Ejemplos:

Disminución en la actividad del CYP450 en medios libres de suero

Metabolismo de drogas en CYP450 (ibuprofeno)

PLHC-1 (Poeciliopsis lucida) disminución en potencia relativa de TCCD, PCB77, PCB 126 y PCB 169

Biodisponibilidad de TCDD

Utilizar una concentración constante de suero


Influencia Suero

Utilización de medios libre de suero en el bioensayo y con suero durante el cultivo (poco utilizado)

Desarrollo de un medio específico para H4IIE libre de suero poco probable

El uso de medios libre de suero implica:

Un mayor gasto Menor crecimiento celular Necesidad de un medio fisicoquímico más estricto



Incubadora humedificada

37ºC

5% de CO2

Contenedor celular (Easy flask) 75 cm2

Pasaje celular 4-5 días…hasta 10disminuir el riesgo de desvío fenotípico, transformaciones, envejecimiento poblacional

Cambio de medio: c/2-3 días

Condiciones Ambientales y Pasaje celular

Sembrado Celular H4IIE


Las células H4IIE son sembradas en placas de cultivo para luego ser expuestas a extractos de contaminantes ambientales o a químicos conocidos

Esto permite la adecuada réplica de muestras y un mayor numero de muestras a ser testeadas.

Originalmente se utilizaban placas de petri de 60-100 mm de diámetro o flask de cultivos pequeños (25 cm2) poco eficiente

Las placas de microtítulos de pocillos múltiples(48-96) se utilizan en la actualidad


Ventajas:

Permite la réplica de muestras en la misma placa

Utilizan menos espacio en la incubadora para un mismo número de muestras a utilizar

Se necesita menor número de células y medio de cultivo tamaño del pocillo

Desde el punto de vista de seguridad y eliminación volúmenes mucho menores de contaminantes son necesitados para dosificar, logrando la misma concentración de exposición

Ahorro en tiempo en el ensayo EROD fluorómetro lector de placas de microtítulo de multipocillos


Ya sea utilizando placa petri o placa de microtítulo, se deben tomar las medidas necesaria para asegurar que el número de células sembradas sea el mismo en cada placa o pocillo del ensayo

Aunque se cuantifica la cantidad de proteína celular para normalizar la lectura de la actividad de CYP1A lo mejor para disminuir la variabilidad es sembrar la misma densidad celular


Las características de crecimiento de las células son consistentes cuando crecen a la misma densidad y así la exposición a la muestra al químico es pareja

Las células H4IIE se recolectan de flasks de cultivo utilizando tripsina y raspadores de células y se resuspenden en un medio para formar una solución individual de células


Para determinar la concentración celular hematocimetro o cámara de Neubauer

Si necesita aumentar la densidad se pueden centrifugar a baja velocidad (100-500 g) y luego resuspenderla en medio

La densidad a sembrar depende de la superficie de la placa petri o la placa de microtítulo

Tiempo de incubación: 24 horas


Sembrado Celular H4IIE Protocolo

1. Esterilizar c/Luz U.V. 15 min y calibrar por 10 minutos

2. Calcular el volumen de medio a utilizar con la siguiente formula Volumen Total=Nº de placas x 96 pocillos x 0,3 mL

3. DMEM + 15% SFB Volumen DMEM=Volumen total/1.15, Volumen SFB= Volumen total-Volumen DMEM

4. Retirar el medio de cultivo y lavar las células c/ PBS

5. Tripsinizar c/ 4 mL de 0,1% tripsina Incube por 2 minutos


Protocolo

6. Corta la tripsinización con 6mL DMEM+15% SFB

7. Retirar las células (10 mL) tubo de centrifuga de 50 mL

8. Lave el frasco contenedor de células con 10 mL DMEM+15% SFB y ubique los 10 mL en el tubo de centrifuga de 50 mL estéril

9. Cierre el tubo de centrifuga y agítelo en el vortex mixer


10. Calcule la concentración de células Cámara de Neubauer células/mL=Promedio nº células x 10.000

11. Calcule el número de célulasNº de células necesarias=96 x Nº placas x 12.000

12. Luego dividamL de solución células/medio =(Nº de células necesarias/Nº de celulas contadas) x 2

13. Hacer solución de células + medio de cultivo


14. Siembre en microplacas c/ 300 µL

15. Ponga en la campana un dispensador estéril y llénelo con solución células/medio

16. No sembrar pocillo A5, A6 y A7

17. Incubar durante 24 horas a 37º C con concentración de 5% de CO2

Dosificación de Extractos


La dosificación se debe llevar a cabo utilizando “técnicas” asépticas cámara de flujo laminar, al igual que en el cultivo y sembrado

Solvente carrier Isooctano

Se dosifica 2,5-100 µL/pocillo con micropipetas con puntas de plástico o vidrio

Tiempo de incubación24-72 h

El número de dosis a los cuales las células están expuestas van en el rango de 6-10 preparadas con factores de diluciones de 3 a 10 veces

Un amplio rango de dosis debe ser utilizado para los extractos cuando no se conoce la máxima Inducción de CYP1A1 ni la pendiente


La precisa determinación de los TCDD-EQs requiere que la dosificación del extracto cubra todo el rango de inducción en las células H4IIE:

ED50no se sabe si no se conoce el máximo de inducción de la actividad CYP1A producida por el extracto

Existen “técnicas” para utilizar las curvas dosis-respuesta incompletas

Las placas de microtítulo permite obtener un mayor rango de dosis que las placas petri.



Producto de la naturaleza hidrofóbica de PHH se a cuestiona el uso de puntas de platico:

No existen estudios con PHHs respecto a la pérdida de estos compuesto al utilizar puntas de plástico

Heynstrand (2001) Micocisteina-LR se pierde un 4,2%, 4 veces se utiliza se satura

Se ha utilizado pipetas con desplazamento positivo con un estilete (pistón) de acero inoxidable y tubos capilares de vidrio para disminuir este efecto poco práctico .


Solvente Carrier y para dilución Isoocatno

Se sugiere que el solvente no sea más del 0,5% del total de la solución eliminar interferencias o toxicidad del solvente


Tiempo de Incubación: 24 -72 h El tiempo de incubación puede afectar la inducción

del CYP1A1 en H4IIE especifica para cada químco:

TCDD 6-72 h no existe influencia 2,3,7,8-TCDF >72 horas 9 veces más PCB 77 >72 horas 11 veces más

Esto es por el tipo de metabolismo de cada compuesto y el tiempo de incubación


El tiempo de incubación debe ser lo suficiente para permitir el máximo de inducción de CYP1A1 y evitar el metabolismo de los compuestos que inducen a CYP1A

Tiempos:

24 h disminuye la influencia del metabolismo celular

72 h es el más utilizado


Set de dosificación: TCDD Controles: PC, PB, MB Basales Muestras


Protocolo (TCDD x 3)

1. Ubique 8 viales para dosificar 2. Tome 100 µL del stock de TCDD y ubíquelos en el vial 1, ubicado en el pocillo H13. Tome 70 µL y ubíquelos en l viales del 2 al 8 (de G1-A1).4. Realice diluciones seriadas hasta el vial 7 tomando 35 µL del vial H15. Rotule las placas con “TCDD” donde corresponda.6. Dosifique 5 µL en cada pocillo empezando de la columna 1, 5 o 9


Protocolo (Muestras)1. Ubique 8 viales para dosificar 2. Tome 40 µL del extracto y ubíquelos en el vial 1, ubicado en el

pocillo H13. Tome 30 µL y ubíquelos en l viales del 2 al 8 (de G1-A1).4. Realice diluciones seriadas hasta el vial 7 tomando 10 µL del vial

H15. Rotule las placas con el ID del extracto donde corresponda6. Dosifique 5 µL en cada pocillo empezando de la columna 1, 5 o 9

Basales:


Corresponden a pocillos de un espacio donde se dosificaría una “muestra”, el cual no se dosifica. Esto se hace para determinar la actividad basal de las células. Se utilizan de 3-6 espacios en placas diferentesIncubar por 72 h

Medición de la Actividad Catalítica de

CYP1A1

A diferencia de la determinación de la actividad de CYP1A1 por medio de la reacción de AHH que resulta en múltiples productos, la reacción EROD solo produce un producto resorufina

Medición de la Actividad Catalítica de CYP1A1

Protocolos placas de microtítulo = aumenta la celeridad y disminuye el costo bioensayo H4IIE muchas muestras a analizar

Se realiza TODO en la placas: Siembra Dosificación Medición actividad EROD Medición proteína celular


La actividad EROD = la tasa de la detilación de un sustrato éter fenoxano, 7-etxoxiresorufina (7-ER)Resorufina grupo hidroxilo libre (Whyte at al., 2000a)

El bioensayo EROD H4IIE es una modificación del método de Pohl y Fouts (1980)

se realizaba similar al bioensayo AHH en la actualidad la reacción es llevada a cabo en la placa de microtítulo, basados en el trabajo de Kennedy et al. (1993)



Determinación UFA de resorufina

Después de la incubación:

Lavado 2-3 veces c/ H2O destilada o PBS (pH 7.4) células vivas

Lisis celular por shock osmótico agua destilada residual (20 uL) o por congelamiento rápido (-80ºC) y ciclo

de descongelamiento.


Determinación UFA de resorufina

Luego se agrega:

• 7-etoxiresorufina sustrato

• Dicumarol como inhibidor de enzimas oxidoreductasa reducir resorufina o NADPH

• NADPH iniciar la reacción

Todos estos reactivos deben estar a 37ºC

Determinación UFA de resorufina Medición actividad enzimática:

• Ensayo batch: en el cual la cantidad de resorufina producida es medida luego de un periodo de tiempo determinado (Clemons et al., 1996)

• Ensayo cinético: en donde la cantidad de resorufina producida es medida repetidamente con intervalos de 60 a 90 segundos (Tysklind et al., 1994)


Determinación UFA de resorufina Ensayos cinéticos:

• Mayor datos por muestra• Asegura linealidad de la tasa de reacción• Aumenta la confianza en la validez de la estimación EROD• Fácil de llevar a cabo utilizando un scanner para placas de

microtítulo automatizada

La fluorescencia producto de la resorufina se lee con una longitud de onda de exitación de 530 nm y una longitud de onda de 580 nm


Estándar de resorufina:

Una curva de estándar de resorufina debe generarse cada vez que el bioensayo se lleva a cabo

Se hace para comparar la intensidad de la fluorescencia de resorufina producida por células expuestas aextractos ambuentales

Curva de multipuntos 0,06-40 pmol (7 punto) Las UFA de cada pocillo son convertidas a pmol de resorufina

regresión lineal La resorufina stock utilizada se debe chequear con

espectrofotometro absobancia = 571nm


Estándar de proteína:

Para estandarizar la tasa de producción de resorufina (pmol/min) a la proteína celular.

Basado en la reacción de fluorescamina con un grupo amino primario (Udenfriend et al., 1972)

Adaptado por Lorenzen & Kennedy placa de microtítulo mismo pocillo donde se determinó la resorufina

Curva de multipuntos 1,56-25 µg/ pocillo 7 puntos A partir de albumina de suero bovino (BSA) La fluorescencia producto de la proteína se lee con una

longitud de onda de exitación de 400 nm y una longitud de onda de 460 nm


Determinación proteína celular

La proteína celular es utilizada para normalizar la dosis de químico al cual las células fueron expuestos pg TCDD/mg proteína, además de su uso en la normalización de la actividad catalítica de las mediciones EROD

La determinación de la proteína no toma en cuanta el crecimiento celular durante el periodo de exposición

Si el crecimiento se detiene por contacto inhibitorio, la estimación de la proteína va a ser similar en todos los pocillos, aun cuando si hubo diferencias en la concentración de células al momento de sembrar aun así hay que sembrar una concentración similar en todas los pocillos



Protocolo Lectura EROD1. Saque una placa de la incubadora y lave las

células (3 lavados por pocillo)2. Incube las células por 5 min3. Saque las células de la incubadora y:• agregar 20 μL de dicumarol a cada pocillo de la

microplaca, repetir en pocillos A1, A2 y A3• agregar 20 μL de etoxyresorufina a cada pocillo de la

microplaca• agregar 20 μL de βNADPH a cada pocillo de la

microplaca, menos en pocillos A1, A2 y A3

4. Poner la placa en el fluorómetro con el protocolo que corresponda:

• filtro de excitación: 530 nm• filtro de emisión: 580 nm• 20 ciclos de 60’’

5. Retirar la placa y guardar a 5º C6. Repetir con todas las placas

Protocolo Preparación RSTD

1. Ubique 8 tubos ependorf ámbar de 1-8

2. Agregue 500 µL de PBS de 1-7

3. Agregue Resorufina16 µM en 8

4. Hacer diluciones seriadas hasta el tubo 2 tomando 500 µL del tubo 8



Protocolo Lectura RSTD1. Tome una microplaca limpia y dividalas en dos partes iguales,

utilizando la izquierda.2. Dosifique las diluciones de RSTD preparadas:• del tubo ependorf 1 agregue a la fila A1-A6, luego se repite el

proceso pero con el tubo ependorf 2 y se agrega a la fila B1-B6 y así hasta terminar con el tubo 8 en la fila H1-H6.

• agregar 20 μL de etoxiresorufina a todos los pocillo de la división para RSTD

• agregar 20 μL de βNADPH a todos los pocillo de la división para RSTD.

3. Poner la placa en el fluorómetro con el protocolo que corresponda:• filtro de excitación: 530 nm• filtro de emisión: 580 nm• 10 ciclos de 60’’

Protocolo Preparación PSTD

1. Ubique 8 tubos ependorf de 1-8

2. Agregue 500 µL de PBS de 1-7

3. Pese 0,24 g de BSA y disuélvalos en 4 mL de PBS

4. Agregue la solución de BSA en 8

5. Hacer diluciones seriadas hasta el tubo 2 tomando 500 µL del tubo 8


Protocolo Lectura PSTD1. Tome la placa de RSTD y utilice la sección derecha2. Dosifique las diluciones de PSTD preparadas:• del tubo ependorf 1 agregue a la fila A7-A12, luego se repite el proceso

pero con el tubo ependorf 2 y se agrega a la fila B7-B12 y así hasta terminar con el tubo 8 en la fila H7-H12.

• agregar 20 μL de etoxiresorufina a todos los pocillo de la división para PSTD

• agregar 20 μL de βNADPH a todos los pocillo de la división para PSTD• agregar 150 μL de buffer Na2PO4

3. Agitar la placa por 1 min4. Agregar 20 μL de fluorescamina 1.08 µM 5. Agitar 1 min y dejar reposar 106. Poner la placa en el fluorómetro con el protocolo que corresponda:• filtro de excitación: 400 nm• filtro de emisión: 460 nm• 1 ciclos de 60’’



Protocolo Lectura Proteína Celular

1. Utilizar las microplacas guardadas a 5º C

2. Agregue 150 µL de buffer Na2PO4, agite por 1 min

3. Agregue 20 µL de fluorescamina 1.08 µM, agite por 1 min y dejar reposar 10 min

4. Poner la placa en el fluorómetro con el protocolo que corresponda:

• filtro de excitación: 400 nm• filtro de emisión: 460 nm• 1 ciclos de 60’’

Análisis de Datos

Introducción: Los datos obtenidos por el ensayo EROD son gráficados en

curvas dosis-respuesta

Estas curvas proveninte de extractos medioambientales o químicos puros son comparadas con la curva estándar de TCDD para desarrollar los TCDD-Eqs

TCDD-EQs pueden ser determinados de diferentes formas:• Relación de ED50 de TCDD y de la muestra• La relación de las pendiente de la porción lineal de las curvas dosis-

respuesta• La relación de otro estimado de multipunto

Todos se basan en que el extracto induce CYP1A1 mediante el mismo mecanismo que el TCDD dilución de TCDD

Análisis de Datos

Comparación de ED50 o de un punto

Es frecuentemente utilizado por su simplicidad

Solo es válido cuando las curvas dosis respuestas son idénticas y solo difieren en la posición del eje x paralelas y con actividad CYP1A1 igual (eficacia)

Difícil que se den ambas situaciones

Análisis de Datos

Comparación de pendientes/multipuntos Permite utilizar un rango mayor de datos de la curva dosis-respuesta

confianza Solo se utiliza la porción lineal de la curva lo que permite poder

estima TCDD-Eqs de extractos que no han alcanzado su máxima inducción

Comparación de rangos RPF /multipuntos La amplitud del rango indicará el grado certeza de la estimación de

TCDD-EQs Necesita la misma eficacia que el TCDD. Rango 20 a 80% de la respuesta máxima del estándar TCDD = RPF20-80

range Si la respuesta máxima no se determina se asume que el máxima

RPF es la máxima actividad del CYP1A para el extracto en cuestión

Análisis de Datos

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