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Los lisosomas
Actividad de los lisosomas análoga en ciliados
Kevin Andrés Guzmán Bastidas1
Mario Andrés Pantoja España2
Kevin David Gonzales Peréz3
Universidad de Nariño
Departamento de Biología
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
San Juan de pasto
1
1 Estudiante de Biología, Universidad de Nariño. [email protected]. 2 Estudiante de Biología, Universidad de Nariño. [email protected]. 3 Estudiante de Biología, Universidad de Nariño. [email protected].
2
Resumen
Los lisosomas cumplen importantes
funciones dentro de la célula como
orgánulos digestivos tanto del material
exógeno que penetra en la célula por
endocitosis, como también el material
endógeno; en este caso analizamos su
función dentro de los ciliados
(Paramecium spp.) actuando sobre las
células de levadura de pan
(Saccharomyces Cerevisiae). Antes de
iniciar con el experimento se hicieron
ciertos procesos de tinción a las células de
levadura para un mejor reconocimiento y
entendimiento del proceso de digestión
que parten a hacer los protozoarios. Al
momento en que las células de levadura
son ingeridas por los protozoarios, los
lisosomas primarios las identifican y las
encierran en una membrana para que sus
enzimas hidrolíticas puedan actuar
normalmente y realizar el proceso de
degradación, todo este proceso requiere
también de otras estructuras presentes en
la célula como lo son la membrana celular
y el citoesqueleto.
Palabras Claves.
Lisosomas, metabolismo, endocitosis,
exocitosis, citoesqueleto, digestión,
membrana celular.
Abstract
Lysosomes have important functions
within the cell including digestive
organelles both exogenous material
penetrating into the cell by endocytosis,
as well as endogenous material; in this
case we analyze their role in ciliates
(Paramecium spp.) acting on the yeast
cells (Saccharomyces Cerevisiae). Before,
starting certain processes should be done
staining the yeast cells to better
recognition and understanding of the
process of digestion they will do the
protozoan. The time at which the yeast
cells are ingested by protozoan, primary
lysosomes the identified and enclosed in a
membrane for their hydrolytic enzymes
can act normally and perform the
degradation process, this process also
requires other structures present in the
cell such as the cell membrane and
cytoskeleton.
Keywords
Lysosomes, metabolism, endocytosis,
exocytosis, cytoskeleton, digestion, cell
membrane.
Introducción
El conocimiento actual de los
mecanismos por los cuales las proteínas
se dirigen a organelos particulares
comenzó con el descubrimiento de que
los residuos de manosa 6-fosfato de las
enzimas lisosomicas actúan como un
domicilio para entregar estas proteínas a
los lisosomas. El descubrimiento del
domicilio de los lisosomas se efectuó en
estudios de pacientes con una rara
enfermedad hereditaria y letal conocida
como enfermedad de células I. Sin este
descubrimiento no hubiese sido posible
entender el transporte a nivel celular, ni
mucho menos como y cuando actúa cada
vesícula en una función específica sobre
cada sustrato. Los lisosomas son
organelos compuestos de proteínas y una
membrana que lo recubre, las proteínas
son sintetizadas en retículo
endoplasmático rugoso y empaquetadas
en el retículo endoplasmático liso, para
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luego todo el conjunto de proteínas sean
empaquetadas en el aparato de Golgi y
luego ser liberada al citoplasma celular.
Estos organelos tienen varias funciones,
entre la principal se destaca la digestión
celular de nutrientes, aunque se destaca
también el auto-reciclaje, los procesos de
endocitosis y exocitosis. En este ensayo
se describirá detalladamente las
características de los lisosomas y las
funciones.
Los lisosomas
Los lisosomas son orgánulos
esféricos u ovalados que se localizan en el
citoplasma celular, tienen una estructura
muy sencilla, semejantes a las vacuolas,
rodeados solamente por una membrana,
contienen gran cantidad de enzimas
digestivas que degradan todas las moléculas
necesarias para la célula. (Karp, 2009).
Es una vesícula membranosa que contiene
enzimas hidrolíticas, proteolíticas y lipídicas
que permiten la digestión intracelular
(autofagia) y extracelular (heterofagia) de
orgánulos, macromoléculas o de
microorganismos. Se localizan en el citosol,
de tamaño relativamente grande, son
formados por el retículo endoplasmático
rugoso (RER) y luego empaquetados por el
complejo de Golgi. En un principio se pensó
que los lisosomas serían iguales en todas las
células, pero se descubrió que tanto sus
dimensiones como su contenido son muy
variables de acuerdo a la información
genética presente en la célula y al tipo de
proteína que se sintetiza. (Lodish. Berk.
2008.)
Las enzimas lisosomales son capaces de
digerir partículas grandes como bacterias y
también otras sustancias que entran en la
célula por fagocitosis, u otros procesos de
endocitosis. (Nelson y Cox. 2006.)
Eventualmente, los productos de la digestión
son tan pequeños que pueden pasar la
membrana del lisosoma volviendo al citosol
donde son reciclados. Estas vesiculas
utilizan sus enzimas para reciclar los
diferentes orgánulos de la célula,
englobándolas, digiriéndolas y liberando sus
componentes en el citosol. De esta forma el
interior celular se está reponiendo
continuamente. Este proceso se llama
autofagia. Por ejemplo, las células hepáticas
se reconstituyen por completo una vez cada
dos semanas. (Nelson y Cox, 2006.)
Los lisosomas primarios son aquellos que
sólo contienen las enzimas digestivas,
mientras que los lisosomas secundarios, por
haberse fundido con una vesícula de materia
orgánica, contienen sustratos en vía de
digestión: vesículas digestivas que realizan
heterofagia, cuando el sustrato procede del
exterior, y vesículas realizan el proceso de
autofagia, cuando procede del interior.
(Cambell. Smith. Peters, 2006.)
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Figura 1. (Alberts. Bray. Lewis. Raff.
Roberts K. Watson. 2002.)
Las enzimas de un lisosoma comparten una
propiedad importante: todas alcanzan su
actividad óptima en un pH acido, por lo que
son hidrolasas acidas. El pH óptimo de estas
enzimas se sitúa por debajo del pH del
compartimiento lisosómico, que se aproxima
a 4.6. La elevada concentración interna de
protones se mantiene mediante una bomba
de protones (una ATP-asa de H+) presente
en la membrana que limita al organelo (ver
figura 1). Las membranas lisosomicas
contienen diversas proteínas integrales muy
glucosiladas cuyas cadenas de carbohidratos
se cree que forman un recubrimiento
protector que protege a la membrana contra
el ataque de las enzimas que encierra.
(Alberts. Bray. Lewis. Raff. Roberts.
Watson. 2002.)
Aunque los lisosomas tienen una colección
predecible de enzimas (Ver Figura 2), su
apariencia en las micrografías electrónicas
no es distintiva ni uniforme. Su tamaño es
variable, desde estructuras relativamente
grandes (más de 1 μm de diámetro) hasta
vesículas muy pequeñas (25 a 50 nm de
diámetro) (Ver figura 3). (Lodish. Beerk.
Zipursky. Matsudaira. Baltimore. Darnell.
2002.)
Figura 2. (Gerald. 2009.)
Los lisosomas también tienen un papel clave
en la rotación de organelos, esto es, la
destrucción regulada de los propios organelo
de la célula para su reposición. Durante este
proceso, denominado autofagia, un organelo,
como la mitocondria mostrada en la figura,
es rodeado por una membrana doble.
Después, la membrana externa se fusiona
con un lisosoma para producir un
autofagolisosoma, en el cual el organelo
encerrado se degrada y los productos de
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degradación se hacen disponibles para la
célula. Se calcula que una mitocondria se
somete a la autofagia cada 10 minutos en
una célula hepática de mamífero. (Becker.
Kleinsmith. Hardin. 2006.)
Figura 3. (Gerald. 2009.)
Si la célula requiere de nutrimentos, se
observa un aumento notorio de la autofagia.
En estas condiciones, la célula adquiere la
energía para mantener su vida mediante el
canibalismo de sus propios organelos. En
años recientes se ha demostrado que la
autofagia también ayuda a proteger al
organismo contra amenazas intracelulares
que van desde agregados proteínicos
anormales hasta bacterias invasoras. Incluso
puede servir como una vía que conduce a la
muerte programada de células malignas.
(Paniagua. 2007)
El papel de los lisosomas en la autofagia se
resume en la figura (Ver figura 4). Una vez
que se completa el proceso digestivo en el
autofagolisosoma, el organelo se conoce
como cuerpo residual. Según sea el tipo
celular, el contenido del cuerpo residual
puede eliminarse de la célula mediante
exocitosis o conservarse dentro del
citoplasma por tiempo indefinido como un
gránulo de lipofuscina. La cantidad de
gránulos de lipofuscina se incrementa a
medida que el individuo envejece; la
acumulación es muy evidente en las células
de vida prolongada, como las neuronas, en
las que estos gránulos se consideran una
característica principal del proceso de
envejecimiento. (Ville. 1996.)
Figura 4. (Gerald, K. 2009.)
Proteínas motoras de vesículas
Las redes de filamentos formadas por las
proteínas del citoesqueleto permiten a la
célula adoptar una variedad de formas,
dividirse, organizar y moverse. El
citoesqueleto está conformado por proteínas
de actina y tubulina, que forman por uniones
entre proteínas filamentos y microtúbulos.
Estas proteínas son capaces de dar
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movimiento independientemente de otras
proteínas, también sobre estas proteínas se
mueven proteínas motoras de miosina,
quinesina y dineína.
Los descubrimientos acerca de las proteínas
motoras y su transformación de energía
química en energía mecánica, lo realizaron
los científicos James Spudich, Michael
Sheetz y Ronald Vale. Sheetz y Spudich
observaron el movimiento de pequeñas bolas
constituida por miosina sobre el filamento
de actina. Posteriormente, en los 80, Bruce
Schnapp y Tom Reese demostraron que los
filamentos del axón de una célula nerviosa
extraído de un calamar gigante no eran de
actomiosina, sino microtúbulos. Ronald Vale
y Michael Sheetz demostraron que la
proteína motor podía absorberse a
superficies y bolas que se deslizaban sobre
microtúbulos, en los ensayos fue donde se
descubrió una proteína motor, la quinesina
que se mueve hacia el extremo positivo del
microtúbulos. Más tarde, Robert Valle
descubriría el movimiento opuesto hacia el
polo negativo, a lo cual se denominó dineína
citoplasmática. (Andreu, Jose. 2012)
Figura 5. (Andreu, Jose. 2012)
Figura 5. Modelo molecular de quinesina
(arriba), mostrando los dos dominios
motores conectados a un esquema del tallo y
a los dominios de unión a la carga a
trasportar. Los modelos de miosina (debajo)
ilustran el movimiento de sus cabezas
motoras sobre un filamento de actina, que se
produce al liberarse el fosfato inorgánico
después de la hidrólisis del ATP. Figuras
reproducidas de los artículos "Molecule of
the month" por David S. Goodsell en el
RCSB Protein Data Bank
(http://www.rcsb.org/pdb).
Detoxificación
Los hepatocitos, las células típicas del
hígado, tienen un retículo endoplasmático
liso muy desarrollado. En él se sintetizan las
lipoproteínas que transportaran al colesterol
y a otros lípidos al resto del organismo. En
sus membranas se encuentran también
enzimas, como la familia de proteínas P450,
responsables de la eliminación de productos
del metabolito potencialmente tóxicos, así
como algunas toxinas liposolubles
incorporadas durante la ingesta. La
superficie de membrana del retículo se
adapta a la cantidad de enzimas
decodificadoras sintetizadas, la cual depende
a su vez de la cantidad de tóxicos presentes
en el organismo. (Molist. Pilar. 2011)
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Metodología
Preparación de cultivo de levadura
Para el correcto desarrollo de la práctica
de laboratorio, se realizó un
procedimiento protocolario con el fin de
re-activar a las células de levadura
obtenidas de material de panadería, éste
consistió en agregar a la muestra de
levadura una porción de agua azucarada
12 horas antes del desarrollo de la
práctica. De esta manera se logró una
actividad dinámica durante el proceso
estudiado.
Marcaje de cultivos de levadura a
diferentes temperaturas
Se tomaron 3 muestras del cultivo de
lavadura de 1ml cada una y se las
depositó en 3 tubos de ensayo. Se expuso
cada tubo a diferentes temperaturas, el
primero a 4°C por medio de baño de
hielo, el segundo a 30°C por medio de
baño María, y el tercero a temperatura de
ebullición cercano a 100°C por medio de
baño María. Cada exposición se realizó
por un plazo de 10 minutos.
Al término de la exposición y de forma
inmediata, se agregó 0.5 mL de Rojo
Congo (3,3'-([1,1'-bifenil]-4,4'-diil)bi(4-
aminonaftalen-1-sulfonato)de sodio) al 0.5%
en cada uno de los tres tubos. Se agitó
cada tubo y posteriormente se los dejó en
reposo durante 5 minutos. Se observó al
microscopio una muestra de cada uno de
los tubos para verificar el grado de tinción
de las levaduras, de esta manera se
seleccionó el cultivo de levaduras que
indicó una tinción más notable para
cumplir el objetivo de la práctica de una
manera más eficaz.
El anterior procedimiento fue llevado a
cabo siguiendo los pasos consignados en
el Manual de Biología General (Burbano,
Mena, Álvarez, Solarte, Guerrero, Weich,
Lagos, 2013, p.77), no obstante debido a
protocolos ejercidos, el porcentaje de
dilución del colorante Rojo Congo se
incrementó en 1% y en consecuencia se
trabajó con una solución del colorante al
5%. (Burbano et al. (2003) sugiere
trabajar con una solución de Rojo Congo
al 4%. (p.78)).
Preparación y observación de muestra
experimental: Levaduras marcadas vs
Paramecios
Para la muestra de control se realizó un
montaje en un portaobjetos con una gota
de la muestra de cultivo de paramecios
(agua estancada) y se observó su
comportamiento previo.
En un portaobjetos se agregó una gota
extraída del cultivo de levadura con la
mejor tinción junto con una gota de la
muestra de cultivo de paramecios y se
finalizó el montaje ubicando un
cubreobjetos sobre las muestras
combinadas, esta fue la muestra
experimental. Se observó la muestra a
través del microscopio óptico siguiendo la
actividad de los paramecios y su
interacción con las levaduras buscando
detectar actividad lisosomicas (cambio de
color) en los paramecios. Se graficaron y
esquematizaron los procesos observados
en paramecios y levaduras tanto de la
muestra de control como en la muestras
experimental.
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Resultados
El objetivo del experimento, fue observar
la función de los lisosomas de manera
análoga en ciliados, para este estudio era
necesario agua de charca con paramecios
guardado por dos semanas en un lugar
poco iluminado y el cultivo de levaduras
que se prepara con 30 mL de agua
destilada, 0,3 gr de levadura de pan y 0,3
gr de glucosa o sacarosa dejando incubar
a 30 grados por 12 horas.
Antes de empezar a observar la actividad
de los lisosomas fue necesario teñir las
levaduras con rojo Congo, que se preparó
con el mismo colorante al 0,5% diluido
en agua y escoger el mejor cultivo de
levaduras para poder hacer un mejor
análisis y cumplir el objetivo de la
práctica. El proceso fue el siguiente:
Se escogió el cultivo de levaduras
expuesto a temperatura de ebullición ya
que presento una coloración rojo
brillante, tanto en el medio acuoso como
en el precipitado conformado por células
de levadura, lo que indico una tinción
adecuada para la práctica.
Terminado el proceso de tinción de las
células de levadura se procedió a observar
la actividad de los lisosomas en los
ciliados, para lo cual se preparó una placa
que contenía unas gotas del cultivo de
levadura previamente teñido (90 - 100
grados) con unas gotas del cultivo de
ciliados (paramecios) y se llevó al
microscopio. (Ver fotografías 1.)
Siguiendo el recorrido de un paramecio se
pudo observar que este ingería a las
células de levadura (fagocitosis) para ello
se intensifica el movimiento de los cilios
situados cerca y dentro del citostoma
creándose de esta manera una corriente de
agua y partículas hacia su interior, los
lisosomas primarios identificaban el
material que entra en la célula y se
empezaba con el proceso de degradación,
al momento en el que el lisosoma
secundario degradaba la célula de
levadura este se tornó de color azul
debido a que el interior del lisosoma es
acido; luego de un tiempo de seguir al
paramecio la materia azul al interior de
algunos lisosomas se desvaneció y en su
lugar aparecieron unas partículas verdes
que probablemente eran sustancias de
desecho, después de un tiempo se pudo
observar procesos de exocitosis en donde
dichas partículas de color verde fueron
expulsadas por un costado de la célula a
través de la membrana plasmática.
Temperatura a la cual se expuso el cultivo
de levaduras.
Reacción de las levaduras al ser teñidas
con el rojo congo.
0 - 4 grados
El cultivo se tiñó inicialmente de color rojo,
después de 10 minutos expuesto a 0-4
grados, el cultivo tomó un color azul opaco
y al observar la muestra en el microscopio,
la levadura no tenía tinción roja.
30 grados
El cultivo se tiñó inicialmente de color rojo,
luego de ser expuesto por 10 minutos a
temperatura de 30 grados, la muestra se
tornó de un color vino tinto. Al observar la
muestra en el microscopio, se pudo apreciar
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una pobre tinción en la levadura.
90 -100 grados
El cultivo se tiñó inicialmente de color rojo
y se mantuvo así hasta el final del proceso;
al observar la muestra en el microscopio se
ve una buena tinción en las levaduras.
Tabla N_ Resultados de la tinción del
cultivo de levaduras.
Fotografías, 1.
a).
b).
En las fotografías (a) y (b) se muestra el proceso endocitico echo por el Paramecium SPP, en la fotografía (a) en un objetivo de 10X, se observa las células de (Saccharomyces Cerevisiae), de color rojo y los paramecios en el respectivo campo fagocitando las células de levadura de pan. En la fotografía (b) se observa como este protozoario ha digerido y tiene las células de levaduras de pan en el citoplasma.
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Discusión
En el cultivo de levaduras expuesto a 0-4
grados se observó una coloración azul
claro; este hecho indica que el medio en
el que se encontraba la levadura se tornó
levemente acido. Al observar este cultivo
al microscopio se observó una tinción
nula de rojo Congo; esto se debe a que la
baja temperatura disminuyó la porosidad
y la permeabilidad relativa de la pared
celular evitando que el colorante penetre
y tiña la célula de levadura.
En el cultivo de levadura expuesto a 30
grados se observó una coloración rojo
oscuro indicando que la mayor parte del
colorante tiño el medio donde se
encontraban las levaduras saturándolo,
mientras que, según las observaciones por
microscopio, las células de levadura no
presentaron tinción eficiente; esto indicó
que la porosidad de la pared celular de la
levadura al ser expuesta a 30 grados no
fue suficientemente acta como para que el
colorante penetrara. (Anexo Fotografía)
En el cultivo expuesto a temperatura de
ebullición, se observó una coloración rojo
brillante, tanto en el medio acuoso como
en el precipitado conformado por las
células de levadura, lo que indico una
tinción adecuada para el desarrollo de la
práctica. Al observar la muestra en el
microscopio se evidencio que las células
de levadura presentaron una buena
coloración roja debido a que las altas
temperaturas aumentaron notablemente la
porosidad de la pared celular permitiendo
el ingreso del colorante a la celular.
La preparación de rojo Congo que se
utilizó consistió en este mismo colorante
al 0,5% diluido en agua y no al 0,4%
como indicaba la guía. Esto debido al
protocolo levemente diferente en el que se
basó para realizar la preparación.
Ya en el proceso de observación de los
paramecios frente a las células de
levadura teñidas, estos organismos
arrastraban células de levaduras hacia sí
mismos generando corrientes por medio
de sus cilios; al momento en que las
células de levadura se encontraban dentro
del paramecio se pudo apreciar un
material de color azul al interior de unas
endomembranas que fueron identificadas
como lisosomas que contenían células de
levadura en proceso de degradación, el
colorante rojo Congo que teñía las
levaduras se tornó de color azul debido al
medio ácido en el que se encontraban (el
interior de un lisosoma). Luego de un
tiempo de seguir al paramecio se observó
que la materia azul se desvaneció y en su
lugar aparecieron unas partículas verdes
que probablemente eran sustancias de
desecho; se llegó a esta hipótesis luego de
presenciar procesos exocíticos del
paramecio en donde dichas partículas de
color verde fueron expulsadas del citosol
por un costado de la célula a través de la
membrana plasmática.
Conclusiones
Se logró verificar el proceso de digestión
realizado por los lisosomas de manera
análoga en el interior de los ciliados. En
el experimento las células de levadura
fueron ingeridas por los paramecios a
través del citostoma que es una especie de
invaginación para capturar el alimento,
una vez ingeridas las levaduras, los
lisosomas presentes en el paramecio
empezaron reaccionar. En el momento
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que el paramecio iba a ingerir las
levaduras se producía una corriente de
agua debida, a que los cilios de este
organismo intensificaban su movimiento. Se comprobó la acidez del interior de los
lisosomas que brinda un ambiente
propicio para la actividad de las enzimas
hidrolíticas.
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