Universidade de So Paulo

Instituto de Fsica

Bioestimulao da protena de membrana Na,K-ATPase por laser

de baixa intensidade: atividade e propriedades estruturais

Gustavo Scanavachi Moreira Campos

Dissertao de mestrado apresentada ao

Instituto de Fsica para a obteno do ttulo

de Mestre em Cincias

Banca Examinadora:

Profa. Dra. Rosangela Itri (Orientadora) (IFUSP)

Prof. Dr. Leandro Ramos Souza Barbosa (IFUSP)

Prof. Dr. Pietro Ciancaglini (FFCLRP/USP)

So Paulo, So Paulo - 2014

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FICHA CATALOGRFICA Preparada pelo Servio de Biblioteca e Informao do Instituto de Fsica da Universidade de So Paulo

Campos, Gustavo Scanavachi Moreira Bioestimulao da protena de membrana Na,K-ATPase por laser de baixa intensidade: atividade e propriedades estruturais. So Paulo, 2014. Dissertao (Mestrado) Universidade de So Paulo. Instituto de Fsica. Departamento de Fsica Aplicada Orientador: Profa. Dra. Rosangela Itri rea de Concentrao: Estrutura dos Lquidos e Slidos; Cristalografia Unitermos: 1.Biofisica; 2. Fsica da matria condensada; 3. Protenas da membrana; 4. Laser de estado slido; 5. Fsica. USP/IF/SBI-082/2014

Dedicatria

Aos meus pais Jefferson e Ana Maria,

Que so meus exemplos de dedicao, amor e que jamais mediram esforos

para prover o melhor possvel. Obrigado pelo incansvel incentivo, por eu ter um corpo

nesta nova experincia e lembrem-se que sem vocs eu no chegaria a lugar algum,

logo, minhas conquistas so suas tambm! Minha eterna gratido!

Aos meus irmos Carol e Filipe,

Companheiros de jornada que sempre cuidaram de mim por eu ser o mais novo!

Obrigado pelos exemplos de conduta, pela amizade, pelo amor imensurvel e

certamente pelos bons exemplos de bons estudantes que foram e continuam sendo!

Ao Luis Gabriel,

Sobrinho maravilhoso que ainda no completou o seu segundo ano de vida!

Nenm, hoje voc ainda no sabe ler (nem falar) e j se tornou o ser mais amado de

toda a famlia! Bem vindo!

Agradecimentos Especiais

Primeiramente agradeo a Deus pela oportunidade bendita e aos espritos

amigos pelas inspiraes e por sempre estarem presentes! Que os irmos possam sempre

me auxiliar a trilhar o melhor caminho.

s minhas avs que sempre me encheram de orgulho pelos admirveis exemplos

de dedicao e fora! Aos meus avs que j se encontram no plano espiritual,

especialmente, ao v Lus que nos deixou muita saudade, sempre lembrado por todos

por sua alegria, felicidade e amor!

s minhas tias, tios, primas e primos!

Ao meu cunhado Gean e minha cunhada Rachel!

Aos meus amigos Alessandro e Victor, que conviveram comigo por 5 anos na

mesma repblica! Aos atuais amigos de repblica Artur e Claudio!

Aos amigos de infncia de Mucuri!

Aos amigos de Resende Bella, Fred, Gui, Joo, Marcio, Pereira, Pelife, Nath,

Silvana... j estamos a 6 anos distantes mas continuamos com a mais nobre amizade!

Aos amigos que longe se encontram Carol, Duda, Haidar, Valentina, Ze...!

Aos amigos de So Paulo que fazem desta cidade minha casa: Arthur S., Babi,

Chris, Gerson, Lari, Tamara...! Aos amigos da Fsica e dos times de esportes!

Aos colegas de Laboratrio de So Paulo Andreza, Pradeep, Raffa e Robert pelas

inmeras horas de conversas, risadas e por tornarem o local de trabalho muito

agradvel. s funcionrias Ellen e Lia pela disposio em ajudar.

Aos amigos de Ribeiro Preto que me acolheram em sua repblica Bruno, Gil,

Lucas, Vitor S. e Victor F.! E Elisa e famlia pelos almoos deliciosos!

Aos colegas de Laboratrio de Ribeiro Preto Amanda, Ana, Bruno, Camila, Cris,

Dani, Heitor, Juliana, Larissa, Mayt, Simone e Thuanny que me acolheram no

laboratrio com muita amizade, companheirismo e sempre estiveram dispostos em

ajudar. Obrigado!

E por fim, mas no menos importante, orientadora Rosangela Itri! Muito

obrigado pela oportunidade de aprendizado e trabalho, por dividir os conhecimentos

cientficos, por estar sempre disposio em ajudar e pelas inmeras horas dispensadas

para que este projeto fosse concludo!

Agradecimentos

Ao professor Pietro Ciancaglini pela oportunidade de utilizar a infraestrutura do

seu laboratrio e pelo auxilio na preparao e execuo dos experimentos.

Ao professor Leandro Ramos Souza Barbosa pelas inmeras discusses sobre os

resultados e auxilio nas anlises de SAXS.

Ao pesquisador Mateus Borba Cardoso pela preparao da linha de SAXS 1 do

Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron.

Aos professores e funcionrios do Instituto de Fsica USP e da Faculdade de

Filosofia Cincias e Letras de Ribeiro Preto USP.

Ao CNPq, CAPES e FAPESP pela bolsa e auxlios concedidos ao laboratrio,

Nascer, morrer, renascer ainda e

progredir sempre, tal a lei.

Allan Kardec.

ndice

NDICE DE GRFICOS .................................................................................................... II

NDICE DE EQUAES ................................................................................................... V

NDICE DE TABELAS .................................................................................................... VII

LISTA DE ABREVIAES ................................................................................................ IX

RESUMO ................................................................................................................... X

ABSTRACT ............................................................................................................... XII

1. INTRODUO .................................................................................................... 1

1.1. NA, K-ATPASE ................................................................................................. 1

1.2. BIOESTIMULAO DE NA,K-ATPASE POR IRRADIAO DE LASER DE BAIXA POTNCIA ......... 6

2. OBJETIVOS ...................................................................................................... 10

2.1. GERAL: .......................................................................................................... 10

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS: ................................................................................... 10

3. MATERIAIS E MTODOS ................................................................................... 11

3.1. FRAO DE MEMBRANA RICA EM NA,K-ATPASE ..................................................... 12

3.2. SOLUBILIZAO E PURIFICAO DE NA,K-ATPASE EM C12E8 ...................................... 13

3.3. NA,K-ATPASE RECONSTITUDA EM PROTEOLIPOSSOMO ............................................ 14

3.4. ESPECTROSCOPIA DE ABSORO UV/VISVEL ......................................................... 15

3.5. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENA: MTODO DE HARTREE .................... 17

3.6. DETERMINAO DA CONCENTRAO DE FOSFATO: MTODO DE HEINONEM E LAHTI ........ 20

3.7. MEDIDA DE ATIVIDADE ENZIMTICA: CINTICA DESCONTNUA .................................... 22

3.8. ESPALHAMENTO DE LUZ DINMICO (DLS) ............................................................. 25

3.9. ESPALHAMENTO DE RAIO-X A BAIXOS NGULOS (SAXS) .......................................... 31

3.10. BIOESTIMULAO DA NA,K-ATPASE POR LASER DE BAIXA POTNCIA ........................ 40

4. RESULTADOS E DISCUSSO .............................................................................. 43

4.1. NA,K-ATPASE SOLUBILIZADA E PURIFICADA EM C12E8: ESTUDO INICIAL POR SAXS E DLS .. 43

4.2. CARACTERIZAO DE NA,K-ATPASE EM C12E8 APS UTILIZAO DE FILTRO DE 220 NM .... 47

ESPECTROSCOPIA DE ABSORO UV-VIS ................................................................. 47

ESPALHAMENTO DE LUZ DINMICO ........................................................................ 50

ATIVIDADE ENZIMTICA E CONCENTRAO .............................................................. 53

CONCLUSES PARCIAIS: NA,K-ATPASE SOLUBILIZADA E PURIFICADA EM C12E8 .............. 54

4.3. EFEITO DA ADIO DE DODECIL SULFATO DE SDIO NOS ESTADOS AGREGADOS/OLIGOMRICOS

DA NA,K-ATPASE SOLUBILIZADA E PURIFICADA EM C12E8: ANLISE DE SAXS ....................................... 59

4.4. BIOESTIMULAO DA NA,K-ATPASE .................................................................... 73

FRAO DE MEMBRANA RICA EM NA,K-ATPASE ....................................................... 73

NA, K-ATPASE RECONSTITUDA EM PROTEOLIPOSSOMO ............................................. 76

COMPARAO DA IRRADIAO ENTRE NA,K-ATPASE EM FRAO DE MEMBRANA E

RECONSTITUDA EM PROTEOLIPOSSOMO .............................................................................................. 78

CONCLUSES SOBRE A BIOESTIMULAO DA NA,K-ATPASE ........................................ 84

5. CONCLUSO .................................................................................................... 91

7. REFERNCIAS .................................................................................................. 93

I

ndice de Figuras

Figura 1 - Esquema da Na,K-ATPase adaptado de Morth e col (2007). O esquema

apresenta as trs subunidades (,,) e os trs domnios intracelulares de (A, N, P). A

subunidade est em vermelho, a est amarelo e a est em verde claro. O domnio A

est em roxo, o N est em marrom e o P est em laranja. Em azul est o C-terminal. .... 2

Figura 2 Esquematizao do Ciclo de Albers-Post (adaptado de Gadsby e col (2012)).

.......................................................................................................................................... 4

Figura 3 Efeitos da irradiao com laser tipo diodo (InGaAIP, 685 nm, 25 mW) na

atividade da Na,K-ATPase (0,1 mg/mL) presente em: () frao de membrana, ()

solubilizada em C12E8 e () vesculas de DPPC:DPPE. (Extrado de Santos e col (2007)).

.......................................................................................................................................... 8

Figura 4 - Rim ao ser extrado (esquerda), rim cortado ao meio (direita), pedao maior

ainda no sofreu incises e pedao menor j est preparado para ser triturado. ............ 12

Figura 5- Espectroscopia de Absoro. .......................................................................... 15

Figura 6- Esquema de Espalhamento de Luz Dinmico (extrado de Giacomelli (2009)).

........................................................................................................................................ 26

Figura 7 - Arranjo experimental esquemtico utilizado na tcnica de SAXS (adaptado de

Barbosa e col. (2012)). ................................................................................................... 32

Figura 8 - Representao de Kratky para trs conformaes da BSA (extraido de Barbosa

e col (2012)).................................................................................................................... 35

Figura 9 Estrutura cristalogrfica do dmero ()2 da Na,K-ATPase (Kanai et al., 2013)

esquerda. direita est a estrutura cristalogrfica do monmero (). A cor muda

gradualmente do N-terminal (azul) at o C-terminal (vermelho) para as subunidades e

(Kanai et al., 2013). ..................................................................................................... 39

II

Figura 10 Esquema do procedimento de irradiao. ................................................... 40

Figura 11 Membrana porosa de 220 nm. ..................................................................... 47

Figura 12 - Grfico de AUC para amostra de Na,K-ATPase solubilizada em C12E8 e

filtrada obtido por Yoneda (2014). Distribuio do coeficiente de sedimentao c(S) vs.

Coeficiente (S) das amostras de Na,K-ATPase solubilizada aps a filtrao (100 nm) nas

concentraes de 60 g/mL (preto) e 100 g/mL (vermelho). A corrida foi de 14 h com

uma velocidade de 12000 rpm, a 13 C (Extrado de Yoneda (2014)). ......................... 55

Figura 13 - Propriedades das espcies observadas nos experimentos a 12000 rpm

(Extrado de Yoneda (2014)). ......................................................................................... 56

ndice de Grficos

Grfico 1 - Calibrao da concentrao de protena pelo mtodo de Hartree, utilizando

BSA. ............................................................................................................................... 19

Grfico 2 - Absoro x Comprimento de onda para soluo padro de Fosfato. ........... 21

Grfico 3 - Absoro em 355nm para soluo padro de Fosfato.................................. 22

Grfico 4 Medida de Atividade pelo mtodo descontinuo em funo da soluo de

protena. .......................................................................................................................... 24

Grfico 5 Curvas de SAXS de Na, K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8,

concentrao da protena de 0,8 mg/mL, submetida a diferentes doses de irradiao (A).

(B) curvas tericas de SAXS do monmero e dmero (PDB 3WGV Kanai et al., 2013),

obtidas pelo programa CRYSOL (Svergun et al., 1995). (C) funo de distribuio de

distncias p(r) correspondentes s intensidades de espalhamento das amostras de Na,K-

ATPase submetidas a diferentes doses de irradiao e do monmero e do dmero. ...... 44

III

Grfico 6 - Medidas de DLS identificando a existncia de diferentes populaes na

amostra de Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8, concentrao da protena

era de 0,55 mg/mL, atividade especfica de 415 U/mg. ................................................ 46

Grfico 7 Espectro de Absoro para Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8

antes e aps filtrao com poro de 220 nm. ................................................................... 48

Grfico 8 - Absoro em 280 nm da enzima Na,K-ATPase solubilizada e purificada em

C12E8 em funo do tempo. ............................................................................................ 49

Grfico 9 - DLS para analisar a influncia do filtro na amostra de Na,K-ATPase

solubilizada e purificada em C12E8. A concentrao era de 0,68 mg/mL e 0,55 mg/mL,

antes e aps a filtrao, respectivamente. ....................................................................... 51

Grfico 10 - DLS da amostra de Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 em

funo do tempo. A concentrao da protena era de 0,54 mg/mL. ............................... 52

Grfico 11 - Atividade Especfica em funo da concentrao da Na, K-ATPase

solubilizada e purificada em C12E8 em relao ao filtro de 220nm. ............................... 53

Grfico 12 - Aumento da atividade especfica da Na,K-ATPase solubilizada e purificada

em C12E8 e perda de concentrao aps utilizar o filtro de 220 nm. .............................. 54

Grfico 13 Funo de distribuio de distncias, p(r), para a Na,K-ATPase solubilizada

e purificada em C12E8 antes e aps a utilizao do filtro com poro de 100 nm. ............ 60

Grfico 14 - SAXS para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 ausncia de

SDS e na presena de 0,5 mM e 1 mM de SDS (A), a concentrao da protena era de

0,46 mg/mL. (B) SAXS para o monmero e o dmero tericos (PDB 3WGV). Os mesmos

dados so apresentados com a intensidade de espalhamento em escala logartmica nos

grficos inseridos em (A) e (B). ..................................................................................... 61

IV

Grfico 15 - (A) Representao de Kratky para o monmero e o dmero tericos (PDB

3WGV) e para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 na ausncia de SDS e

adicionando 0,5 mM e 1 mM de SDS amostra purificada. (B) comparao entre a

amostra de protena na ausncia de SDS e as curvas tericas; (C) comparao entre a

amostra de protena com adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS; e (D) comparao entre as

curvas experimentais. A concentrao da protena era de 0,46 mg/mL. ........................ 62

Grfico 16 - (A) Representao de Guinier para o monmero e o dmero tericos (PDB

3WGV) e para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 na ausncia de SDS e

aps adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS amostra purificada. As setas indicam o maior

valor de utilizado no ajuste de uma equao linear: amostras experimentais (seta azul),

monmero e o dmero tericos (seta preta). (B) curvas tericas (smbolos abertos) com os

respectivos ajustes de uma equao linear (linha slida); (C) curvas experimentais

(smbolos abertos) com os respectivos ajustes de uma equao linear (linha slida). A

concentrao da protena era de 0,46 mg/mL. ................................................................ 64

Grfico 17 (A) Funo de distribuio de distncias para o monmero e o dmero

tericos (PDB 3WGV) e para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 na

ausncia de SDS e aps adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS. (B) comparao entre a

amostra de protena na ausncia de SDS e aps adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS; (C)

comparao entre a amostra de protena aps adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS e o

dmero terico. A concentrao da protena era de 0,46 mg/mL. .................................. 66

Grfico 18 - Atividade especfica da Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8

seguida de adio de SDS. A concentrao da protena era de 0,46 mg/mL ................. 70

Grfico 19 - Biomodulao da Na,K-ATPase presente na frao de membrana. A

concentrao da protena era de 1,53 mg/mL. Para cada ponto experimental foram

V

irradiados 100 L de amostra para realizar medidas de atividade em triplicata (3 medidas

de 30 L de amostra). ..................................................................................................... 74

Grfico 20 - Monitoramento da variao da atividade da Na,K-ATPase em frao de

membrana em funo do tempo ps irradiao. A concentrao da protena era de 1,53

mg/mL. Cada ponto experimental corresponde as medidas de irradiao de 100 L de

amostra para realizar medidas de atividade em triplicata (3 medidas de 30 L de amostra).

........................................................................................................................................ 75

Grfico 21 - Biomodulao da Na,K-ATPase reconstituda em proteolipossomo. A

concentrao da protena era de 1,68 mg/mL. Para cada ponto experimental foram

irradiados 35 L de amostra para realizar medidas de atividade em triplicata (3 medidas

de 10 L de amostra). ..................................................................................................... 76

Grfico 22 - Variao da atividade da Na,K-ATPase reconstituda em proteolipossomo

em funo do tempo ps irradiao. A concentrao da protena era de 1,68 mg/mL. Cada

ponto experimental corresponde as medidas de irradiao de 35 L de amostra para

realizar medidas de atividade em triplicata (3 medidas de 10 L de amostra)............... 77

Grfico 23 Irradiao com o laser de = 532 nm: Proteolipossomo x Frao de

membrana. ...................................................................................................................... 79

Grfico 24 Irradiao com o laser = 650 nm: Proteolipossomo x Frao de membrana.

........................................................................................................................................ 80

Grfico 25 Irradiao com o laser = 780 nm: Proteolipossomo x Frao de membrana.

........................................................................................................................................ 82

ndice de Equaes

Equao 1 - Lei de Beer Lambert ................................................................................... 15

VI

Equao 2 Atividade Enzimtica. ................................................................................ 24

Equao 3 - Atividade Enzimtica Especfica. ............................................................... 25

Equao 4 - Exemplo de Atividade Especfica. ............................................................. 25

Equao 5 Mdulo do Vetor de Espalhamento de Luz. .............................................. 26

Equao 6 - Intensidade mdia do campo eltrico associado ao feixe de luz espalhado.

........................................................................................................................................ 27

Equao 7 Funo de auto correlao. ........................................................................ 27

Equao 8 - Equao de Siegert para sistemas dluidos. ................................................ 28

Equao 9 - Relao entre funo de auto correlao do campo eltrico e a taxa de

decaimento da funo de auto correlao do campo eltrico. ........................................ 28

Equao 10 - Taxa de decaimento e coeficiente de difuso translacional das partculas

espalhadoras.................................................................................................................... 28

Equao 11 - Equao de Stokes-Einstein. .................................................................... 29

Equao 12 - Relao entre auto correlao do campo eltrico, taxa de decaimento da

funo de auto correlao do campo eltrico e coeficiente de difuso para uma

distribuio polidispersa de tamanhos de partculas....................................................... 29

Equao 13 - Equao do Z average. ............................................................................. 30

Equao 14 - ndice de polisperso. ............................................................................... 30

Equao 15 Mdulo do vetor de espalhamento utilizado para anlise dos dados de

SAXS. ............................................................................................................................. 32

Equao 16 - Intensidade de Espalhamento de SAXS. .................................................. 33

Equao 17 - Intensidade de Espalhamento de SAXS para sistema isotrpico. ............ 33

Equao 18 - Intensidade de SAXS para sistema isotrpico e no interagente. ............ 34

Equao 19 - Lei de Guinier. .......................................................................................... 35

VII

Equao 20 - Equao Linear para representao de Guinier. ....................................... 36

Equao 21 - Raio de giro de Guinier obtido a partir do contraste de densidade eletrnica

. ................................................................................................................................. 36

Equao 22 - Transformada de Fourier para obter . .................................................. 37

Equao 23 - Raio de Giro obtido a partir da funo de distribuio de distncias . . 37

Equao 24 - Raio de giro para soluo com diferentes estados oligomricos. ............. 38

Equao 25 - Definio de Potncia. .............................................................................. 41

Equao 26 - Definio de Dose. ................................................................................... 41

ndice de Tabelas

Tabela 1 - Patologias relacionadas Na,K-ATPase (Tabela extrada de Rose e Valdes,

1994). ................................................................................................................................ 5

Tabela 2 - Comparao do raio de giro e distncia mxima obtidos pela funo de

distribuio de distncias para o monmero e o dmero e para a Na,K-ATPase

solubilizada e purificada em C12E8 aps irradiaes. Como os valores de e Dmax so

os mesmos para todas amostras medidas, estes valores esto apresentados uma nica vez

na coluna Amostras experimentais. ................................................................................ 45

Tabela 3 - Coeficientes do ajuste linear obtidos para o monmero e o dmero tericos e

para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 na ausncia de SDS e aps adio

de 0,5 mM e 1 mM de SDS amostra purificada........................................................... 65

Tabela 4 - Valores de e (0) obtidos atravs da lei de Guinier para o monmero e o

dmero e para a Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8 na ausncia de SDS e

aps adio de 0,5 mM e 1 mM de SDS amostra purificada. ...................................... 65

VIII

Tabela 5 - Comparao do raio de giro obtido pela lei de Guinier e pela funo de

distribuio de distncias para o monmero e o dmero tericos e para a Na,K-ATPase

solubilizada em C12E8 e purificada na ausncia de SDS e aps adio de 0,5 mM e 1 mM

de SDS amostra de protena purificada........................................................................ 67

IX

Lista de Abreviaes

ADP Adenosina Difosfato

ATP Adenosina trifosfato

AUC Ultracentrifugao Analtica

BSA Albumina de Soro Bovino

C12E8 Octaetileno Glicol Monododecil ter

Cys Cistena

DLS Espalhamento de luz dinmico

DPPC Dipalmitoilfosfatidilcolina

DPPE Dipalmitoilfosfatidiletanolamina

EDTA cido Etilenodiamino Tetra-Actico

KCl Cloreto de Potssio

HEPES cido N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-2-etanossulfnico)

PDB Protein Data Bank (Banco de dados de protenas)

Phe Fenilalanina

RPM Rotaes Por Minuto

SAXS Espalhamento de raios-X a baixos ngulos

SDS Dodecil Sulfato de Sdio

TCA cido Tricloroactico

TDS - Tris dodecil sulfato;

Tris Tris-(hidroximetil)-aminoetano

Trp Triptofano

Tyr Tirosina

X

Resumo

A Na, K-ATPase uma protena que realiza o transporte ativo de ctions, se

encontra na membrana plasmtica de praticamente todas clulas animais e formada por

trs subunidades: (110 kDa), (50 kDa) e (10 kDa).

Neste trabalho, realizou-se a extrao da protena Na,K-ATPase de rim de coelho

que foi preparada em 3 diferentes condies (i) frao de membrana rica em Na,K-

ATPase; (ii) solubilizada e purificada em C12E8 e (iii) reconstituda em DPPC: DPPE

lipossomo (1:1 lipdio:lipdio, 1:3 lipdio:protena).

Atravs de medidas de Espalhamento de Luz Dinmico (DLS), Espectroscopia de

Absoro (ABS) e Espalhamento de Raio-X a Baixos ngulos (SAXS), associadas

medidas de atividade enzimtica, constatou-se que a amostra de Na,K-ATPase

solubilizada e purificada em C12E8 constituida por diferentes agregados/oligmeros em

soluo. Com o intuito de eliminar os grandes agregados/oligmeros da amostra realizou-

se a filtrao (poro de 220 nm) e a adio do surfactante dodecil sulfato de sdio (SDS)

e ambos procedimentos foram capazes de eliminar as populaes de grandes agregados

e/ou grandes oligmeros. A retirada destas populaes pelo filtro promoveu um aumento

de atividade especfica da enzima. J o SDS deve promover alteraes conformacionais

na estrutura da protena que causam a inativao da mesma.

Investigou-se variaes de atividade da Na, K-ATPase atravs da irradiao da

protena presente em frao de membrana e reconstituda em lipossomo por meio de trs

lasers de baixa intensidade com comprimentos de onda diferentes: = 532 nm (5 mW),

= 650 nm (50 mW) e = 780 nm (50 mW). Demonstrou-se que a variao da atividade

XI

enzimtica depende do valor de dose de energia depositada, independe do comprimento

de onda estudado neste intervalo e retorna para o nvel basal aps 6 horas.

XII

Abstract

The Na, K-ATPase is an active cation transporter protein, which is found in the

plasma membrane of virtually all animal cells and it is comprised of three subunits:

(110 kDa), (50 kDa) and (10 kDa).

In this work, we performed the extraction of protein Na, K-ATPase from the

kidney of adult rabbit for three different enzyme preparations (i) membrane-bound

fraction; (ii) C12E8 solubilized and purified and (iii) reconstituted in DPPC: DPPE

liposome (1: 1 - lipid: lipid, 1:3 - lipid:protein).

Dynamic Light Scattering (DLS), Absorption Spectroscopy (ABS) and Small

Angle X-ray Scattering (SAXS) were employed, associated with enzyme activity

measurements. The results revealed that Na, K-ATPase C12E8-solubilized and purified is

composed by different aggregates/oligomers. With the aim of eliminating large

aggregates/oligomers from the protein sample, filtration (pore size 220 nm) and surfactant

sodium dodecyl sulfate (SDS) addition were used. Both procedures were able to eliminate

populations composed of large aggregates and/or large oligomers. The removal of these

populations by the filter promoted an increase in the specific activity of the enzyme. On

the other hand, SDS must promote conformational changes in the protein structure that

inactivate thereof.

Finally, here we also investigated variations of Na, K-ATPase activity present in

the membrane-bound fraction and reconstituted in liposome under irradiation of three

low-intensity lasers with different wavelengths: = 532 nm (5mW), = 650 nm (50 mW)

and = 780 nm (50 mW). The results give support to the conclusion that the change in

the enzymatic activity depends upon the amount of energy dose deposited, it is

II

independent of the wavelength in the studied range and returns to the basal level after 6

hours.

1

1. Introduo

1.1. Na, K-ATPase

A protena Na,K-ATPase uma protena de membrana celular que est presente

em quase todas as clulas eucariotas e controla direta ou indiretamente muitas funes

celulares essenciais (Rose e Valdes, 1994).

Esta protena faz parte da famlia das ATPases tipo P, que representam uma famlia

de transportadores ativos de ons caracterizados pela formao de um estado intermedirio

fosforilado (Kaplan, 2002; Apell, 2004). A Na,K-ATPase utiliza a energia livre de Gibbs

originada na hidrlise do ATP para transportar os ons de Na+ para fora e K+ para dentro

da clula (Apell, 2004). Este transporte ativo, pois ocorre contra o gradiente de

concentrao de cada um dos ons e para cada molcula de ATP hidrolisada so

transportados 3 ons de Na+ e 2 ons de K+ (Skou e Esmann, 1992). Em um animal em

repouso, cerca de 25% do ATP celular consumido pela Na,K-ATPase (Martin, 2005).

O transporte ativo realizado pela Na,K-ATPase gera o potencial eletroqumico ao

longo da membrana citoplasmtica que fornece energia para o transporte secundrio

intracelular de metablitos e nutrientes como a glicose e os aminocidos, e ons como o

clcio, cloretos e fosfatos. Alm disso, este potencial eletroqumico essencial para a

regulao do volume celular e para o potencial de ao dos msculos e transmisso do

impulso nervoso (Rose e Valdes, 1994; Apell, 2004; Skou e Esmann, 1992).

A Na,K-ATPase pode ser formada por diferentes associaes entre duas

subunidades principais e (Rose e Valdes, 1994). Uma estrutura cristalizada foi obtida

por Morth e col (2007), e est esquematizada na Figura 1. A subunidade (Figura 1)

possui massa molecular de aproximadamente 110 kDa e contm aproximadamente 1000

2

resduos de aminocidos (Jorgensen et al., 2003). Possui 10 segmentos do tipo

transmembrana 5 alas extracelulares e 4 intracelulares em sua estrutura (Jorgensen et al.,

2003; Kaplan, 2002; Khlbrandt, 2004; Yoneda, 2014). A parte extracelular compreende

os domnios A (atuador), N (ligao do nucleotdeo) e P (fosforilao) (Figura 1). O

domnio N o de ligao do ATP e o domnio P catalisa a transferncia do grupo -fosforil

para a enzima (Figura 1). Durante o ciclo cataltico, o domnio P interage com o domnio

N levando a auto fosforilao. Alm disso, o domnio P interage com o domnio A

levando a desfosforilao (Kaplan, 2002; Reinhard et al., 2012; Yoneda, 2014).

Figura 1 - Esquema da Na,K-ATPase adaptado de Morth e col (2007). O esquema apresenta as trs

subunidades (,,) e os trs domnios intracelulares de (A, N, P). A subunidade est em vermelho, a

est amarelo e a est em verde claro. O domnio A est em roxo, o N est em marrom e o P est em

laranja. Em azul est o C-terminal.

A subunidade (Figura 1) composta por cerca de 370 aminocidos e possui

massa molecular aparente de cerca de 50 kDa. Esta subunidade apresenta um nico

3

segmento transmembrana, aproximadamente 30 resduos so expostos no citosol e 300

formam a poro extracelular (Skou e Esmann, 1992; Hasler et al., 1998; Kaplan, 2002;

Jorgensen et al., 2003). Funes esto sendo atribudas subunidade : processos

relacionados polaridade da clula, como a adeso e mobilidade celular, transio de clula

epitelial a mesenquimal e transformao oncognica; afinidade aparente da enzima pelo K+;

alm de ser essencial para a translao, estabilidade e correta insero da subunidade

na membrana (Hasler et al. 1998; Barwe et al., 2007).

Alm das subunidades e , a Na,K-ATPase, em alguns tecidos, pode apresentar

outra subunidade que modula a atividade da enzima pela mudana da afinidade aparente

pelo sdio, potssio e ATP (Gerring, 2008). Esta subunidade chamada de (Figura 1),

possui um nico segmento transmembrana e uma massa molecular de cerca de 10 kDa

(Gerring, 2006).

A menor unidade funcional da Na,K-ATPase ligada membrana ainda no

conhecida. Alguns autores defendem que um monmero (Ward e Cavieres, 1993;

Martin et al., 2000; Takeda e Kawamura, 2001) suficiente para a enzima ser ativa e

manter a estrutura, mas outros defendem que necessrio um oligmero de ordem maior,

podendo ser um dmero ()2 (Thoenges e Schoner, 1997; Antolovic et al., 1999; Santos

e Ciancaglini, 2003; Laughery et al., 2004; Pilotelle-Bunner et al., 2008) ou at mesmo

um tetrmero ()4 (Mahaney et al., 1990; Taniguchi et al., 2001; Donnet et al., 2001).

Apesar de no haver um consenso nesta questo, sabe-se que as seguintes isoformas so

capazes de realizar a atividade cataltica: , 2, 3, 2, 22, 23, 3, 32, 33, 4 e

43 (Blanco, 2005).

Alm destes oligmeros formados entre e , existem as estruturas formadas por

apenas uma das subunidades. Em animais muitas isoformas de e esto presentes, como

4

por exemplo a 1 e 1 presentes praticamente em todos os tecidos; 2 e 2 so encontradas

predominantemente no crebro; 3 localizada principalmente no corao e no crebro; 4

e 3 encontradas nos testculos (Matin-Vassalo et al., 1989; Rose e Valdes, 1994; Malik

et al., 1996; Khlbrandt, 2004; Blanco, 2005; Madan et al., 2007; Morth et al., 2007).

Em humanos as subunidades so encontradas na forma no crebro, olho,

corao, rim, pulmo, msculo liso, tireoide e no tero; 2 no crebro, olho, corao,

msculo liso e tireoide; e 3 no crebro, corao e olho e 4 no corao (Matin-Vassalo et

al., 1989; Rose e Valdes, 1994; Malik et al., 1996; Blanco, 2005; Madan et al., 2007;

Morth et al., 2007).

A hidrlise do ATP realizada pela Na,K-ATPase descrita pelo modelo de

Albers-Post esquematizado na Figura 2 (Gadsby et al., 2012).

Figura 2 Esquematizao do Ciclo de Albers-Post (adaptado de Gadsby e col (2012)).

5

Neste ciclo a Na,K-ATPase apresenta dois estados conformacionais distintos: uma

forma E1 que tem alta afinidade pelos ons sdio e os stios de ligao so acessados pelo

meio intracelular. Nesta conformao a enzima libera 2 K+ (indicado na Figura 2 com

uma seta, as bolas laranjas representam os ons potssio) no interior da clula e 3 Na+

(bolas verdes Figura 2) se ligam, so ocludas e a protena fosforilada. Na forma E2 a

protena apresenta alta afinidade pelo on potssio e os stios de ligao ficam disponveis

para o meio extracelular. Os ons de sdio so liberados no meio externo, os ons de

potssio so ligados e a ligao do K+ estimula a desfosforilao do estado P-E2.K2,

liberando um fosfato livre (Pi, indicado pela estrela na Figura 2), resultando no estado

ocludo E2.K2. Aps isto os ons de potssio so liberados no meio intracelular e outra

molcula de ATP se liga enzima para recomear o ciclo de Albers-Post (Skou e Esmann,

1992; Gadsby et al., 2012).

Como j foi mencionado a Na,K-ATPase est presente em quase todos os animais

e possui vrias funes fisiolgicas. A regulao desta enzima, bem como das isoformas,

pode ter um papel importante na etiologia de muitos processos patolgicos (Rose e

Valdes, 1994). A Tabela 1 abaixo relaciona algumas doenas originadas pela no

regulao, por alterao na expresso e/ou mau funcionamento da Na,K-ATPase em

humanos.

Patologia Nmero de Referncias

Doenas Cardacas 4

Hipertenso 10

Doenas Renais 4

Diabetes e doenas metablicas 8

Anormalidades Fetais 3

Alzheimer 4

Doenas no Pulmo 3

Tabela 1 - Patologias relacionadas Na,K-ATPase (Tabela extrada de Rose e Valdes, 1994).

6

A lista completa com as subdivises das doenas e com as referncias encontra-

se no artigo de reviso Understanding the Sodium Pump and Its Relevance to Disease

escrito por Rose e Valdes, 1994.

Outro papel fisiolgico da Na,K-ATPase contribuir para a manuteno da

temperatura corporal. Isto ocorre, pois parte da energia liberada pela hidrlise do ATP

convertida em forma de calor (Noske et al., 2010).

Alm disso, a Na,K-ATPase pode ser utilizada como alvo de drogas, por exemplo

a subunidade o nico receptor conhecido de glicosdeos cardacos e, por isso,

utilizada como alvo de drogas para o tratamento clnico de insuficincia cardaca e

arritmias (MacGregor e Walker, 1993; Schwinger et al., 2003).

1.2. Bioestimulao de Na,K-ATPase por irradiao de laser de baixa potncia

Bioestimulao ou Biomodulao so processos pelos quais uma enzima ou

protena tem sua atividade aumentada (ou estimulada) devido a sua interao com a luz

(geralmente na regio do visvel). Existem diversos grupos de pesquisa que centram seus

estudos na interao da luz em sistemas biolgicos (Letokhov, 1983; Wilson, 1989; Yu

et al., 1994; Marra et al., 1997; Walsh, 1997; Kilanczyk et al., 2002; Vinck et al., 2003;

Kujawa et al., 2004; Kassak et al., 2006; Hamblin e Demidova-Rice, 2007; Hu et al.,

2007; Santos et al., 2007).

De maneira interessante, existem alguns trabalhos na literatura que reportam

variao de atividade da Na,K-ATPase aps irradiao com laser de baixa potncia.

Kilanczyk e col (2002) fizeram o estudo da influncia de um laser vermelho (670 nm, 7

7

mW de potncia) na atividade enzimtica da Na,K-ATPase presente na membrana de

clulas ghosts obtidas a partir de eritrcitos humanos.

Cabe acrescentar que as clulas ghosts so resduos da reao ps-hemoltica de

clulas vermelhas do sangue. Assume-se que estes resduos so desprovidos de estrutura

intracelular e consistem, principalmente, de protenas transmembranas fixadas

membrana celular (Schwoch e Passow, 1973).

Os autores variaram a dose de energia entre 19 95 J/cm2 e constataram o aumento

da atividade em todos os casos, sendo a maior delas de 400% para a dose de 57 J/cm2.

Kujawa e col (2004) utilizaram um laser infravermelho (810 nm, com diferentes

potncias de sada: 10 mW, 200 mW e 400 mW) para irradiar clulas ghosts obtidas a

partir de eritrcitos humanos que continham as protenas Mg-ATPase e Na,K-ATPase na

membrana celular. Neste estudo, os autores demonstraram que as mesmas doses de

energia estimulam a atividade enzimtica quando entregues em pequenas taxas de dose

de energia e inibem a enzima para altas taxas de dose.

Assim como Kilanczyk e col (2002), Kassak e col (2006) realizaram a irradiao

de Na,K-ATPase presente em clulas ghosts obtidas a partir de eritrcitos humanos,

utilizando um laser verde (532 nm, 30 mW de potncia) para este estudo. Os autores

reportaram um acrscimo na atividade da Na,K-ATPase de 52% para a dose de 19 J/cm2

e que este aumento foi linear em funo da dose de energia chegando a 120% para a dose

de 63,3 J/cm2.

O grupo do Prof. Pietro Ciancaglini (Departamento de Qumica da USP, Ribeiro

Preto) tambm estudou a influncia da interao de luz na atividade da protena (Santos

8

et al., 2007). No referido trabalho os autores estudaram a influncia da dose de energia

depositada (com laser de InGaAIP, 685 nm, 35 mW de potncia) na atividade da enzima,

sendo que esta foi extrada de membrana de rim de coelho e os estudos forma realizados

com diferentes preparaes da enzima: i) frao de membrana; ii) solubilizada e

purificada na presena do surfactante no inico C12E8 e iii) reconstituda em lipossomos

(com um sistema de membrana modelo, constitudo por DPPC:DPPE (1:1) proporo

molar).

A Figura 3 reproduz os resultados obtidos (com permisso dos autores) por Santos

e col. (2007).

Figura 3 Efeitos da irradiao com laser tipo diodo (InGaAIP, 685 nm, 25 mW) na atividade da Na,K-

ATPase (0,1 mg/mL) presente em: () frao de membrana, () solubilizada em C12E8 e () vesculas de

DPPC:DPPE. (Extrado de Santos e col. (2007)).

Para o sistema da Na,K-ATPase na frao de membrana, foi evidenciado que

doses entre 4 24 J/cm2 no alteram de forma significativa a atividade da protena.

Entretanto, doses de 32 a 40 J/cm2 aumentam em cerca de 28 % a atividade ATPase da

9

protena, enquanto que doses acima de 40 J/cm2 no produzem um efeito maior (Figura

3). Por outro lado, para o sistema da enzima reconstituda em lipossomo de DPPC:DPPE

(1:1), uma dose de 4 8 J/cm2 levou a um aumento de atividade ATPase da enzima de 36

a 40 %, em relao protena no irradiada nas mesmas condies. Os autores tambm

evidenciaram que o aumento da dose aps cerca de 8 J/cm2 no altera de forma

significativa a atividade da protena (Figura 3). O efeito da irradiao na Na,K-ATPase

isolada e purificada na presena do surfactante C12E8 mostrou ser muito similar ao efeito

evidenciado na enzima reconstituda em vesculas de DPPC:DPPE (Figura 3).

Embora o aumento da atividade da Na,K-ATPase seja incontestvel (Kilanczyket

al., 2002; Kujawa et al., 2004; Kassak et al., 2006; Santos et al., 2007) - Figura 3), o

mecanismo de atuao pelo qual a Na,K-ATPase tem sua atividade estimulada; a

influncia do meio em que est inserida; a dependncia do comprimento de onda bem

como potncia do laser, ainda no foram bem compreendidos.

Assim, nesta dissertao de mestrado temos como objetivo estender o trabalho de

Santos e col. (2007), buscando definir se e como a bioestimulao da Na,K-ATPAse

depende do comprimento de onda dos ftons incidentes, da potncia do laser (ou da

energia depositada) e da importncia do mimtico de membrana natural (ou seja, o

microambiente onde a enzima est associada: frao de membrana, solubilizada ou

reconstituda)

10

2. Objetivos

2.1. Geral:

O objetivo desta dissertao investigar as variaes de atividade enzimtica da

Na,K-ATPase, em 3 preparaes diferentes: (frao de membrana, solubilizada e

purificada C12E8, ou reconstituda em lipossomos), sob irradiao de ftons de baixa

intensidade (potncia de laser menor que 50 mW), em trs comprimentos de onda

diferentes (532 nm - verde, 650 nm - vermelho e 780 nm - infra-vermelho) em funo da

dose de energia depositada.

2.2. Objetivos Especficos:

1) Preparar a protena nos 3 diferentes preparaes (i) frao de membrana rica

em Na,K-ATPase; (ii) solubilizada e purificada em C12E8 e (iii) reconstituda

em lipossomo.

2) Investigar por SAXS, DLS e Espectroscopia de Absoro possveis estados de

agregao/oligomerizao e estabilidade temporal da protena solubilizada e

purificada em C12E8.

3) Determinar as variaes da atividade enzimtica da Na,K-ATPase nos 3

diferentes meios ao de lasers (dose de energia depositada e comprimento

de onda).

11

3. Materiais e Mtodos

Nesta dissertao de mestrado, todas as preparaes da protena Na,K-ATPase

extrada de rim de coelhos (Oryctolagus cuniculus), conforme descrio a seguir, foram

realizadas no Laboratrio de Nanobiotecnologia Aplicada: Sistemas Mimticos de

Biomembranas do Departamento de Qumica da FFCLRP/USP de Ribeiro Preto, sob a

superviso do Professor Pietro Ciancaglini e da Doutora Juliana Sakamoto Yoneda. Os

procedimentos para obteno da protena em membrana natural e purificada em C12E8

seguiram os protocolos descritos por Santos e col. (2002), enquanto que os procedimentos

para a preparao da protena reconstituda em proteolipossomo esto descritos por

Santos e col. (2005).

Os reagentes utilizados neste projeto foram obtidos na melhor pureza disponvel

no mercado. Adenosina trifosfato (ATP), albumina de soro bovino (BSA), cido N-(2-

hidroxietil)piperazina-N'-2-etanossulfnico (HEPES), octaetileno glicol monododecil

ter (C12E8), cido tricloroactico (TCA), tris(hidroximetil)-aminoetano (Tris), dodecil

sulfato de sdio (SDS) e o cloreto de potssio (KCl) foram adquiridos na empresa Sigma.

cido etilenodiamino tetra-actico (EDTA), Folin Ciocalteau, imidazol, sulfato de cobre

pentahidratado foram comprados na empresa Merck. Acetona, cido ctrico, carbonato de

sdio, hidrxido de sdio, molibdato de amnio, tartarato de sdio e potssio e sacarose

foram adquiridas na empresa Mallinckrodt AR. Fosfato de Potssio Monobsico na

empresa J.T Baker. Os lipdios dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) e

dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE) foram comprados na Sigma. Todas as solues

foram preparadas usando gua Milli-Q (Millipore Direct-Q, resistncia de 18.2 M).

12

3.1. Frao de membrana rica em Na,K-ATPase

Os rins extrados dos coelhos foram recebidos como na Figura 4 (esquerda).

Utilizando uma tesoura e um bisturi realizaram-se cortes e incises para remoo das

partes indesejadas que foram descartadas. A regio de interesse a parte escura do rim

que rica em Na, K-ATPase (Figura 4).

Figura 4 - Rim ao ser extrado (esquerda), rim cortado ao meio (direita), pedao maior ainda no sofreu

incises e pedao menor j est preparado para ser triturado.

As partes de interesse foram colocadas em uma soluo tampo (preparao) de

Imidazol 20 mM em pH 6.8 contendo sacarose 250 mM, EDTA 6 mM e Tris 6 mM, onde

foram trituradas utilizando um homogeneizador (SuperOhm) por 30 segundos (Santos et

al., 2002).

A soluo homognea foi centrifugada (Sorvall RC-5B Superspeed Centrifuge) a

10 000 g por 35 min a 4 C. O pellet foi descartado (gorduras e impurezas) enquanto que

o sobrenadante foi ultracentrifugado (Hitachi - Himac CP 70MX) a 180 000 g por 1 hora

a 4 C (Santos et al., 2002).

Tecido escuro

rico em Na, K-ATPase.

http://www.gmi-inc.com/sorvall-rc-5b-superspeed-centrifuge.html

13

Aps a ultracentrifugao, o pellet constitudo de frao de membrana rica em

Na,K-ATPase foi ressuspenso utilizando a soluo tampo de preparao mencionada

anteriormente. Aps estes procedimentos, as amostras foram estocadas na geladeira a 4

C.

3.2. Solubilizao e Purificao de Na,K-ATPase em C12E8

A partir da preparao de membrana natural contendo Na,K-ATPase descrita

acima, quantifica-se a concentrao da protena total conforme metodologia que ser

descrita no item 3.4. Sabendo-se a concentrao da protena na membrana natural,

preparou-se uma soluo de C12E8 (98% de pureza, Sigma) com esta mesma

concentrao. A solubilizao em detergente foi feita misturando a soluo de C12E8 com

a soluo da frao de membrana numa relao protena:detergente de 1:1 (p/p), a 4C, e

os resduos no solubilizados foram retirados por centrifugao a 100 000 g por 1 hora a

4 C (Santos et al., 2002).

A Na,K-ATPase solubilizada foi purificada em sistema HPLC kta (Amersham

Biosciences) empregando-se col.una de Sepharose 6FF (2,6 x 200 cm), equilibrada e

eluda com tampo Tris.HCl 5 mM, pH 7,0, contendo EDTA 1 mM, KCl 150 mM e C12E8

0,005 mg/mL, a 4C. O eluato foi monitorado continuamente a 280 nm (banda de

absoro do Triptofano, conforme ser descrito no item 3.6.1) e as fraes coletadas

foram acompanhadas por atividade PNFFase (Santos et al., 2002). As fraes que

apresentaram atividade foram reunidas e concentradas em sistema Amicon (Santos et al.,

2002). Aps este procedimento as amostras que correspondem a Na,K-ATPase

solubilizada e purificada em C12E8 foram estocadas na geladeira a 4 C.

14

3.3. Na,K-ATPase reconstituda em proteolipossomo

A mistura de fosfolipdios DPPC e DPPE na razo molar 1:1 (Santos et al., 2005)

foi dissolvida em clorofrmio e espalhada nas paredes internas de tubos de ensaio,

seguido de evaporao do solvente atravs da passagem de uma corrente de nitrognio.

Para garantir a completa remoo do solvente, os filmes lipdicos foram mantidos a vcuo

por 1 hora. Em seguida os filmes foram ressuspensos em tampo Tris.HCl 5 mM, pH 7,0,

contendo EDTA 1 mM, KCl 150 mM e C12E8 10 mg/mL e deixados em banho

temperatura de 60C durante uma hora com agitaes a cada 10 minutos em Vortex.

Posteriormente a mistura lipdio-detergente foi sonicada por 1 minuto, utilizando-se um

sonicador de ponta (VibraCell VC-600) e deixada por 1 hora temperatura ambiente

(Santos et al., 2005, Yoneda, 2014).

mistura de lipdio-detergente foi adicionada a amostra de protena solubilizada

e purificada em C12E8 numa razo lipdio-protena de 1:3, por 10 minutos em banho de

gelo. O detergente foi ento removido pela adio da resina Bio-Beads (200 mg/mL), em

intervalos de 5, 10 e 45 minutos. A resina foi centrifugada em centrfuga clnica (FANEM

Excelsa Baby I, dimetro = 15 cm) a 3.000 rpm por 10 minutos e, finalmente, a

suspenso de vesculas foi ultracentrifugada por 1 hora, a 100.000 g a 4C, obtendo-se

assim os proteolipossomo (Santos et al., 2005; Yoneda, 2014). Este procedimento de

preparao de proteolipossomo chamado de co-solubilizao (Santos et al., 2005). As

amostras foram estocadas na geladeira a 4 C.

Para se determinar o tamanho do proteolipossomo foram realizadas medidas por

espalhamento de luz dinmico (DLS) utilizando um N5 Submicron Particle Size Analyser

(Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) equipado com um laser de hlio-nenio (

15

= 632.8 nm). As medidas foram feitas em um ngulo de 90 e os valores obtidos so

resultado da mdia de 5 repeties (5 minutos com intervalos de 1 min entre as medidas).

Desta maneira, determinou-se que os proteolipossomo possuam o dimetro mdio de 700

nm.

3.4. Espectroscopia de Absoro UV/Visvel

A espectroscopia de absoro no ultravioleta e visvel a tcnica experimental na

qual se incide radiao eletromagntica de comprimentos de onda entre 200 e 800 nm em

uma amostra e mede-se a razo da intensidade de luz antes (I0) e aps (I) a amostra

(Bernath, 2005), como esquematizado na Figura 5:

Figura 5- Espectroscopia de Absoro.

A equao que descreve a absoro em um meio homogneo, pouco denso e

transparente dada pela Lei de Beer-Lambert (Goldemberg, 1972):

= 010 : = log

0 = , =

Equao 1 - Lei de Beer Lambert

onde o coeficiente de extino molar dos centros absorvedores (M-1cm-1), L

o caminho tico (cm) e c a concentrao dos centros absorvedores (M). Em casos onde

h espalhamento de luz, o valor de dado pela contribuio dos centros absorvedores e

dos centros espalhadores, ou seja: = + .

16

O espectro de absoro de protenas apresenta apenas 2 bandas de absoro (Leach

e Schera, 1960; Noble et al, 2007) na regio entre 200 e 300nm, uma centrada em 220 nm

devido s ligaes peptdicas e outra dada pelas cadeias laterais da Cisteina Cys (250

nm), Fenilalanina - Phe (257 nm), Tirosina Tyr (274 nm) e Triptofano Trp (280 nm)

sendo o pico mximo de absoro em 280 nm, pelo fato do coeficiente de extino molar

do Triptofano ser o maior (=5600 M-1cm-1) (Coulter et al, 1935; Wetlaufer et al, 1958;

Vajdos et al, 1995).

O espectro de absoro para protenas, que no possuem grupos metlicos, deve

ser zero para os comprimentos de onda maiores que 320 nm (Grimsley e Pace, 2004).

Caso no seja, valores significativos de absoro devem ser analisados como

espalhamento de luz causado pela existncia de diferentes estados oligomricos da

protena na soluo. Do ponto de vista experimental, isto ocorre pois o espalhamento de

luz reduz a intensidade de ftons aps a amostra e o espectrofotmetro identifica absoro

como sendo a razo entre a intensidade de luz antes e aps a amostra.

Do ponto de vista fenomenolgico, este efeito explicado pelo espalhamento de

Rayleigh (Leach e Schera, 1960), que demonstrou que a intensidade do espalhamento de

luz depende do inverso do comprimento de onda elevado quarta potncia ( -4) e

proporcional ao tamanho do centro espalhador elevado a sexta potncia ( d6) (Leach e

Schera, 1960; Bernath, 2005). Desta maneira, possvel perceber que o espectro de

absoro possui contribuio do espalhamento de luz em todos os comprimentos de onda,

mas esta contribuio maior para comprimentos de onda na regio dos 200 nm e diminui

para maiores comprimentos de onda.

17

A concentrao da protena pode ento ser calculada medindo-se a absoro ()

em 280 nm (proporcional absoro do Trp) e utilizando-se a equao de Beer-Lambert

(Equao 4) (Vajdos et al, 1995; Noble et al, 2007). Entretanto, no foi possvel utilizar

este mtodo para determinar a concentrao da Na,K-ATPase, pois a amostra possua

espalhamento de luz (item 4.1). Sendo assim, a intensidade de absoro no era

diretamente proporcional concentrao (Leach e Schera, 1960; Grimsley e Pace, 2004).

Por outro lado, a presena de estados oligomricos da protena pode ser

evidenciada no espectro de absoro para comprimentos de onda maiores de 320 nm.

Desta maneira, utilizamos a tcnica de absoro UV-Vis para investigar variaes da

concentrao (em = 280 nm) e as mudanas no estado oligomrico (em = 350 nm) da

Na,K-ATPase ao ser filtrada com um filtro com 220 nm de poro (item 4.2). Alm disso,

o monitoramento do espectro de absoro da Na,K-ATPase foi realizado para investigar

a estabilidade da amostra aps a filtrao (item 4.2).

As medidas do espectro de absoro foram realizadas utilizando-se o

espectrofotmetro UV-Vis Ultrospec 5300 Pro da Amersham Biosciences (Amersham

Biosciences, Corp, NJ, USA) com uma cubeta de quartzo com caminho timo de 1 cm.

O espectro foi medido de 200 a 750 nm com passo e velocidade de varredura de 1 nm e

1856 nm/min, respectivamente

3.5. Determinao da concentrao de protena: Mtodo de Hartree

A determinao da concentrao de protena foi realizada pelo mtodo descrito

por Hartree (1972), com algumas adaptaes. Este mtodo consiste em adicionar 20 L

de dodecil sulfato de sdio (SDS) 20% (p/v) e 170 L de H2O a 10 L de protena. Na

sequncia, adiciona-se 180 L do Reagente A (2g de tartarato de sdio e potssio, 100g

http://pt.wikipedia.org/wiki/Dodecil_sulfato_de_s%C3%B3dio

18

de carbonato de sdio e 20g de hidrxido de sdio dissolvidos em 1 L de gua)

aguardando 10 minutos em banho trmico a 50 C; 20 L do Reagente B (2g de tartarato

de sdio e potssio, 1g de sulfato de cobre pentahidratado e 0,4g de hidrxido de sdio

dissolvidos em 1 L de gua) esperando 10 minutos temperatura ambiente. Por fim,

adiciona-se 600 L de Folin Ciocalteau, diludo 15 vezes, aguardando 10 minutos em

banho trmico a 50 C. Aps esfriar, l-se a absorbncia da mistura em 650nm (Hartree,

1972) e obtm-se o valor da absoro em funo do volume da protena: L .

O mtodo de Hartree (1972) modificou o mtodo de biureto de Lowry e col.

(1951) tornando-o mais sensvel pela adio do reagente de Folin Ciocalteus. Do ponto

de vista bioqumico, o mtodo de Hartree (1972) pode ser explicado da seguinte maneira:

a protena reage com sulfato de cobre alcalino na presena do tartarato de sdio e potssio

resultando em um complexo de cobre tetradentado. Este complexo formado pela ligao

de quatro ligaes peptdicas com um tomo de cobre (conhecida como reao de biureto)

que confere uma colorao violeta de pouca intensidade para amostra. Para deixar o

mtodo mais sensvel (Hartree, 1972), adiciona-se o reagente de Folin Ciocalteus, que

reduzido ao complexar com os grupos aromticos da protena, resultando em um

complexo de cor azulada muito intensa que possui absoro entre 650nm e 750nm

(Lowry, et al. 1951; Hartree, 1972; Legler, et al. 1985).

O mtodo descrito acima foi utilizado para determinar a concentrao da protena

total presente na frao de membrana e da Na,K-ATPase solubilizada e purificada em

C12E8 e tambm da enzima reconstituda em proteolipossomo.

Para utilizar este mtodo necessrio fazer uma curva de calibrao com uma

protena padro. No nosso caso, utilizamos albumina de soro bovino (BSA) na

19

concentrao de 1 g/L e medimos a absoro em 650 nm para diferentes volumes de

protena, como mostra o Grfico 1.

0 2 4 6 8 10 12

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

Pontos Experimentais

Auste Linear

Absor

o d

a B

SA

padr

o e

m 6

50 n

m (

un.a

rb.)

Massa (g)

Curva de Calibrao: Mtodo de Hartree

Coeficiente angular: 0.0171 (1)

Grfico 1 - Calibrao da concentrao de protena pelo mtodo de Hartree, utilizando BSA.

Conforme podemos observar, existe uma relao linear entre o valor de absoro

e a quantidade de protena em soluo. Portanto, ao fazer o ajuste linear obtm-se o

coeficiente angular, que possui a unidade de medida de g . O fator padro definido

como o inverso deste valor, ou seja, em g

.

Para determinar a concentrao de uma protena multiplica-se o valor medido

L pelo fator padro determinado

g , resultando na unidade de medida

gL ,

que a concentrao da protena.

20

3.6. Determinao da concentrao de fosfato: Mtodo de Heinonem e Lahti

A quantificao de fosfato inorgnico proveniente da hidrlise do ATP pela Na,K-

ATPase foi determinado pelo mtodo descrito por Heinomen e Lahti (1981).

Inicialmente uma soluo padro de fosfato, foi obtida dissolvendo-se 0,272g de

KH2PO4 (fosfato de potssio monobsico) em 800 mL de H2O, na presena de 10 mL de

H2SO4 (cido sulfrico) e completando com H2O para 1L, resultando numa concentrao

de 1 mol Pi/mL. Para se obter a curva de calibrao, diferentes volumes da soluo

padro de fosfato foram usadas e completado o volume com gua para 0,5 mL. A esta

soluo foi adicionado o volume de 0,5 mL de molibdato de amnio (10mM) agitando

por 10 segundos, 1 mL de acetona P.A. agitando por 10 segundos e 0,5 mL de cido

ctrico (0,4M) agitando por 10 segundos.

O Grfico 2, abaixo, mostra os respectivos espectros de absoro para

concentraes crescentes de fosfato, que complexaram com o molibdato e foram

estabilizadas pelos outros reagentes.

21

320 340 360 380 400 420 440

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Ab

so

r

o (

un

.arb

.)

(nm)

Volume de Fosfato (L):

25

50

75

100

125

150

175

200

Espectro de Absoro do Complexo

Grfico 2 - Absoro x Comprimento de onda para o complexo formado na reao da soluo de

fosfato padro com os reagentes descritos no mtodo de Heinonem e Lahti.

Conforme percebemos do Grfico 2, o mximo de absoro ocorre para

comprimento de onda da ordem de 355 nm. Assim, para este comprimento de onda

construiu-se o Grfico 3 de valor de absoro em funo da quantidade de fosfato, que

resultou numa relao linear. O inverso do coeficiente angular o fator padro

(nmol ) de proporcionalidade entre volume de fosfato e o valor de absoro.

22

0 50 100 150 200

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

Pontos Experimentais

Ajuste Linear

Ab

so

r

o fo

sfa

to p

ad

ro

em

35

5 n

m (

un

.arb

.)

Quantidade de fosfato (nmol)

Curva Padro - Mtodo de Heinonem e Lahti

Coeficiente Angular: 0,0036 (1)

Grfico 3 - Absoro em 355nm do complexo formado na reao da soluo de fosfato padro

com os reagentes descritos no mtodo de Heinonem e Lahti.

Como o fator padro o inverso do coeficiente angular, obtm-se neste caso o

valor de 277 (7) nmol .

3.7. Medida de Atividade Enzimtica: cintica descontnua

Como j mencionado anteriormente (item 1.1) a Na,K-ATPase hidrolisa uma

molcula de ATP formando uma molcula de adenosina difosfato (ADP) e um fosfato

inorgnico (Pi). Pode-se ento quantificar a atividade enzimtica da protena medindo-se

o Pi utilizando o mtodo descrito por Heinonen e Lathi (1981).

Para medir ento a atividade da Na,K-ATPase, o meio reacional foi HEPES 50

mM contendo ATP 3 mM, pH 7,5 em presena de KCl 10 mM, MgCl2 5 mM e NaCl 50

mM em volume final de 1,0 mL (Santos et al., 2005). A reao foi iniciada pela adio

de enzima ao meio reacional, deixada por um perodo de tempo pr-estabelecido e cessada

pela adio de 0,5 mL de soluo gelada de cido tricloroactico (TCA ) 30% (p/v). As

23

amostras foram centrifugadas a 10 000 rpm, a 10 C por 10 minutos. Na sequncia,

adicionou-se molibdato de amnio (10mM), acetona P.A. e cido ctrico (0,4M) seguindo

o mesmo protocolo descrito anteriormente (item 3.6). Aps este procedimento, a amostra

possuia uma cor amarelada e mediu-se a absoro em 355 nm (Heinonen e Lahti, 1981).

As determinaes da concentrao de fosfato inorgnico (Heinonem e Lahti,

1981) e de concentrao da protena (Hartree, 1972) foram realizadas em triplicata e os

correspondentes erros experimentais foram determinados como sendo a diferena entre a

mdia de cada valor e o ponto experimental de maior valor. Isto feito pois seria invivel

realizar a propagao dos erros da atividade, que est ligado com os erros de todo o

processo, que por sua vez muito extenso (se inicia na extrao de protena e segue

acumulando incerteza at a medida de absoro).

Para melhor explicar o mtodo de anlise da atividade enzimtica apresentamos

um exemplo no Grfico 4. Obteve-se os valores da absoro em 355 nm de fosfato

inorgnico em funo do volume de protena (mantendo o mesmo tempo de reao, no

caso de 20 minutos).

24

0.00 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Pontos Experimentais

Ajuste Linear

Absor

o e

m 3

55 n

nm

(un.a

rb.)

Volume (mL)

Curva para o clculo de atividade enzimtica

Coeficiente angular: 5,3 (3)

Grfico 4 Medida de Atividade pelo mtodo descontinuo em funo da quantidade de protena.

A equao para obter a atividade enzimtica descrita como (Santos et al., 2005):

= 3

() (min)

Equao 2 Atividade Enzimtica.

onde o valor da absoro medido pelo espectrofotmetro, F o fator padro

determinado pela dosagem do fosfato, V o volume da enzima em mL, t o tempo de

reao em minutos. A medida de absoro utiliza apenas um tero da amostra, portanto a

atividade enzimtica precisa ser multiplicada pelo fator de correo: 3.

A unidade de medida da atividade enzimtica, K, , onde adota-se =

(min)

.

25

Outra grandeza obtida a atividade enzimtica especfica, chamada de Kesp,, que

a atividade enzimtica normalizada pela concentrao da protena. Esta dada pela

seguinte equao (Santos et al, 2005):

=

Equao 3 - Atividade Enzimtica Especfica.

onde C a concentrao da protena, dada em , obtida atravs do mtodo

de Hartree (Hartree, 1972). A unidade de medida para a atividade enzimtica especfica

.

Para o exemplo dado no Grfico 4, a concentrao da protena de 0,26 g

L .

Portanto a atividade enzimtica e a atividade enzimtica especfica so:

= 5,3.

= 5,3 3 277

20= 220 =

220

0,26 = 846

Equao 4 - Exemplo de Atividade Especfica.

3.8. Espalhamento de Luz Dinmico (DLS)

Para compreender a teoria do DLS necessrio utilizar a teoria ondulatria da luz.

Uma fonte emite luz monocromtica que incide sobre uma soluo contendo centros

espalhadores. O feixe de luz espalhado segundo um ngulo em relao direo do

feixe de luz incidente na amostra (Berne e Pecora, 2000), como esquematizado na Figura

6.

26

Figura 6- Esquema de Espalhamento de Luz Dinmico (extrado de Giacomelli (2009)).

onde o vetor do feixe incidente, o vetor do feixe espalhado e o vetor

de espalhamento, cujo mdulo dado pela seguinte Equao 5 (Berne e Pecora, 2000):

| | =40

sin

2

Equao 5 Mdulo do Vetor de Espalhamento de Luz.

0 o ndice de refrao do meio e o comprimento de onda do feixe incidente.

Quando as molculas da soluo so iluminadas pelo feixe de luz incidente, as

cargas eltricas constituintes da amostra experimentam uma fora devida ao campo

eltrico associado radiao eletromagntica (Maxwell, 1865; Griffiths, 1981) e, por isso,

so aceleradas. Estas cargas eltricas aceleradas emitem radiao e a superposio de

todos estes campos eltricos emitidos resulta no campo eltrico espalhado, que depende

da posio instantnea de cada um destes centros (emissores) espalhadores (Berne e

Pecora, 2000; Arzenek, 2010; Enoki, 2010).

27

A posio dos centros espalhadores muda devido s flutuaes trmicas

acarretando uma variao da intensidade () do campo eltrico espalhado a cada

instante de tempo t e esta flutuao na intensidade dada por (Berne e Pecora, 2000):

(0, ) = 1

()

0+

0

Equao 6 - Intensidade mdia do campo eltrico associado ao feixe de luz espalhado.

onde 0, , so o tempo inicial e total da medida, respectivamente.

O sistema em questo possui a propriedade estacionria, o que significa que no

depende do tempo inicial 0. Estas so hipteses assumindo que o sistema pode ser

representado pela mecnica estatstica, supondo que as partculas no interagem entre si,

o movimento dos centros espalhadores browniano e que e o tempo de experimento tende

ao infinito (Berne e Pecora, 2000).

Por outro lado, seja t um tempo qualquer, o valor de ( + ) to prximo de

() quanto menor for o valor de , pois as partculas tm pouco tempo para mudar de

posio. Essa dependncia de () com ( + ) pode ser introduzida na Equao 6

resultando na funo de auto correlao de intensidade de luz (Berne e Pecora, 2000;

Arzenek, 2010):

(0) () = lim

1

() ( + )

0

, que pode ser reescrita na forma:

(2)() = lim

1

() ( + )

0

Equao 7 Funo de auto correlao.

28

Pela equao de Siegert possvel obter a funo de auto correlao (1)() do

campo eltrico a partir da funo (2)() (Berne e Pecora, 2000):

(2)() = (1 + |(1)()|2)

Equao 8 - Equao de Siegert para sistemas dluidos.

onde um parmetro que depende do equipamento.

A taxa de decaimento da funo (1), definida como , est relacionada a

frequncia de relaxao do movimento da partcula e obtida a partir do ajuste da funo

de auto correlao (1). Os parmetros (1) e possuem a seguinte relao de

proporcionalidade (Berne e Pecora, 2000; Enoki, 2010):

(1)() ~

Equao 9 - Relao entre funo de auto correlao do campo eltrico e a taxa de decaimento

da funo de auto correlao do campo eltrico.

Existem alguns algoritmos para obter o valor de atravs do ajuste da funo de

auto correlao do campo eltrico. Os dois principais so os Mtodos dos Cumulantes

(Koppell, 1972) e o Mtodo de Contin (Provencher, 1982).

Uma vez obtida a taxa de decaimento pode-se calcular o valor da difuso

translacional D das partculas espalhadoras como (Enoki, 2010):

= D x 2

Equao 10 - Taxa de decaimento e coeficiente de difuso translacional das partculas

espalhadoras.

29

Por outro lado, Stokes e Einstein derivaram uma equao para a disperso de

partculas esfricas imersas em um fluido que seguem o regime de movimento browniano

tal que:

= 6

Equao 11 - Equao de Stokes-Einstein.

onde a constante de Boltzmann, a temperatura absoluta, a viscosidade

do fluido e r o raio da partcula esfrica. Desta maneira possvel obter o raio

hidrodinmico mdio a partir do coeficiente de difuso D.

importante acrescentar que o sentido fsico do raio hidrodinmico mdio obtido

pelo DLS o valor do raio de uma esfera rgida que possui o mesmo coeficiente de difuso

translacional das partculas espalhadoras da amostra.

Geralmente a amostra apresenta partculas de tamanhos distintos o que significa

que a funo (1)() deve ser dada pela soma de exponenciais n, que implicam em

valores de D diferentes (Arzenek, 2010):

(1)() ~ = 2

Equao 12 - Relao entre auto correlao do campo eltrico, taxa de decaimento da funo de

auto correlao do campo eltrico e coeficiente de difuso para uma distribuio polidispersa de

tamanhos de partculas.

Para uma distribuio de tamanhos de raio podemos obter um valor do tamanho

efetivo do raio hidrodinmico fazendo-se a mdia das distribuies de tamanho

encontradas ponderada pela porcentagem de cada uma das populaes. Este o chamado

Mdia Z ou Z average (Z) (Berne e Pecora, 2000; Arzenek, 2010):

30

=

Equao 13 - Equao do Z average.

Onde o nmero de partculas com tamanho .

Outro parmetro importante em medidas de Espalhamento de Luz Dinmico o

ndice de polidisperso PI, que uma estimativa do nmero de populaes de diferentes

tamanhos de raios hidrodinmicos presentes na amostra. Este ndice calculado pela

frmula (Arzenek, 2010):

= 2

2

Equao 14 - ndice de polisperso.

onde o desvio padro da distribuio de tamanhos caso ela fosse uma

distribuio gaussiana. O PI pode ser visto como a varincia relativa das distribuies de

tamanho e para valores < 0.2 a amostra considerada monodispersa (Arzenek, 2010).

As medidas de DLS foram realizadas utilizando um N5 Submicron Particle Size

Analyser (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA) equipado com um laser de hlio-

nenio ( = 632.8 nm). As medidas foram feitas em um ngulo de 90 e os pontos

experimentais so resultado da mdia de 5 repeties. Cada repetio dura 5 minutos com

intervalos de 1 min entre elas.

A configurao do experimento e o processamento dos dados foram realizados

pelo programa PCS Control (Beckman Coulter, Inc., Fullerton, CA, USA). Este software

utiliza o Mtodo dos Cumulantes (Koppell, 1972) para obter os valores de e substitui o

31

raio pelo dimetro na Equao 11. Desta maneira os valores obtidos so os dimetros

hidrodinmicos.

No caso da amostra de Na,K-ATPase solubilizada e purificada em C12E8, foram

realizadas medidas de DLS antes e aps a utilizao do filtro com poro de 220 nm e

realizou-se o monitoramento a cada 3 horas (at 12 horas) aps a filtrao. O clculo do

Z average foi feito para obter o valor do dimetro mdio e a variao dos mesmos em

relao ao filtro e ao tempo.

Os grficos de distribuio de tamanhos possuem o eixo das ordenadas expressos

em porcentagem de intensidade de luz espalhada. Sendo assim, possvel analisar apenas

o tamanho das populaes presentes na amostra e no a quantidade delas, pois partculas

grandes espalham mais luz, geram um pico de intensidade grande, mas no indicam que

esto em grande quantidade. Como visto anteriormente, isto ocorre pois o espalhamento

de luz depende do raio da partcula elevado sexta potncia (aproximao de Rayleigh)

(Arzenek, 2010).

3.9. Espalhamento de Raio-X a Baixos ngulos (SAXS)

A tcnica do Espalhamento de Raio-X a Baixos ngulos (SAXS) possibilita a

obteno de informaes estruturais de macromolculas em soluo atravs da anlise do

espalhamento de Raios-X causado por esta amostra (Guinier e Fourmet, 1955; Glatter e

Kratky, 1982; Barbosa et al., 2012).

O arranjo experimental de SAXS est apresentado na Figura 7. Um feixe

proveniente de uma fonte de Raios-X de alta intensidade passa por um monocromador

(ou filtro), se torna monocromtico e colimado para atingir a amostra. O feixe

32

transmitido ( ) absorvido no Beam Stopper e o feixe espalhado ( ) medido pelo

detector (Barbosa et al., 2012).

O dado obtido a partir do SAXS a variao da intensidade do raio-x espalhado,

(), em funo do vetor de espalhamento , que se correlaciona com o ngulo de

espalhamento 2 e com o comprimento de onda pela Equao 15 (Barbosa et al., 2012):

Figura 7 - Arranjo experimental esquemtico utilizado na tcnica de SAXS (adaptado de Barbosa e col..

(2012)).

| | =4

sin

Equao 15 Mdulo do vetor de espalhamento utilizado para anlise dos dados de SAXS.

A intensidade de espalhamento () o resultado da interao do feixe de raio-x

com os eltrons da amostra, sendo proporcional Transformada de Fourier do contraste

de densidade eletrnica ( )entre os centros espalhadores e o meio considerado

continuo, tal que (Glatter e Kratky, 1982):

33

() = 1 |( ) |2

Equao 16 - Intensidade de Espalhamento de SAXS.

onde V o volume total do objeto espalhador, o vetor de posio dos centros

espalhadores dentro do objeto espalhador e a integral calculada em todo o volume V.

As chaves indicam a mdia de todos as posies e orientaes possveis de todos os

objetos espalhadores no sistema. Por fim, ( ) a densidade de espalhamento local

definido como a multiplicao da densidade eletrnica pelo raio do eltron (Barbosa et

al., 2012).

Para um sistema isotrpico, a intensidade de espalhamento () pode ser reescrita

(Santos et al 2003; Barbosa et al., 2010) como o produto de uma funo (), chamada

fator de forma, com uma funo (), chamada funo de interferncia, como na Equao

17:

() = () ()

Equao 17 - Intensidade de Espalhamento de SAXS para sistema isotrpico.

um parmetro que depende do arranjo experimental e da densidade numrica

dos objetos espalhadores (no nosso caso, protenas) .

O fator de forma () diretamente correlacionado estrutura do objeto

espalhador em soluo (Barbosa et al., 2012), ou seja, permite obter informaes sobre a

conformao, tamanho e forma da protena (Glatter e Kratky, 1982; Barbosa et al., 2012).

A funo () derivada da interao entre os centros espalhadores (Barbosa et

al., 2012). Para um sistema suficientemente diludo os objetos espalhadores no

34

interagem entre si e funo de interferncia aproximadamente 1 (Santos et al., 2003).

Desta maneira a intensidade () proporcional () (Santos et al., 2003; Barbosa et

al., 2010):

() = (), ()~1

Equao 18 - Intensidade de SAXS para sistema isotrpico e no interagente.

Uma informao sobre o estado oligomrico da protena pode ser obtida

diretamente da Equao 18, pois a intensidade de espalhamento para o ngulo = 0 ( =

0) diretamente proporcional massa molecular do objeto espalhador e, portanto,

quantidade de monmeros que forma um agregado proteico responsvel pelo

espalhamento de raio-x (Barbosa et al., 2012).

Uma anlise preliminar do estado conformacional da protena pode ser realizada

utilizando-se a representao de Kratky (Glatter e Kratky, 1982; Barbosa et al., 2012).

Esta consiste em graficar a intensidade de espalhamento multiplicada pelo quadrado do

vetor de espalhamento, ()2, em funo do vetor de espalhamento, .

A Figura 8 mostra a representao de Kratky para trs estados conformacionais

da protena albumina de soro bovino (BSA). So curvas simuladas por Barbosa e col.

(2012):

35

Figura 8 - Representao de Kratky para trs conformaes da BSA (extraido de Barbosa e col.

(2012)).

Atravs da representao de Kratky da Figura 8 pode-se identificar a protena na

forma nativa por uma curva em forma de sino com um pico bem definido e sua posio

depende do tamanho mdio da protena (quanto mais para esquerda maior o tamanho).

Estados conformacionais intermedirios (semi flexvel) apresentam um pico menos

intenso, mais alargado e os valores de ()2 aumentam com o crescimento de . J a

protena desenovelada no possui pico e a curva cresce em funo do vetor de

espalhamento (Barbosa et al., 2012).

Outra representao que auxilia na anlise dos dados de SAXS a representao

de Guinier (Guinier e Fourmet, 1955). Segundo a Lei de Guinier a curva de espalhamento

para 0 pode ser aproximada por:

( 0) (0)

22

3

Equao 19 - Lei de Guinier.

Calculando o logaritmo natural da Equao 19 chega-se a uma equao linear:

36

ln ( 0) = ln (0) + ln

22

3 ln ( 0) = ln (0)

22

3

ln ( 0) = ln (0)

2

32

=

Equao 20 - Equao Linear para representao de Guinier.

A Equao 20 mostra a relao linear entre ln ( 0) e 2. Portanto possvel

realizar um ajuste linear da curva experimental e obter o raio de giro de Guinier e

(0) a partir dos coeficientes da reta ajustada.

O raio de giro de Guinier corresponde ao valor quadrtico mdio da

distncia da flutuao de densidade eletrnica do objeto espalhador, ( ), em relao

ao seu centro de gravidade e pode ser definido pela Equao 21 (Guinier e Fourmet, 1955;

Barbosa et al., 2012):

2 =

2 ( )

( )

Equao 21 - Raio de giro de Guinier obtido a partir do contraste de densidade eletrnica ( ).

O (0) a intensidade de espalhamento extrapolada para 0. Esta medida no

possvel de ser realizada, pois para = 0 o espalhamento muito intenso e h o Beam

Stopper antes do detector para impedir que o feixe atinja e danifique o detector.

Podemos ainda obter informaes sobre a protena estudada atravs da funo de

distribuio de pares de eltrons () (Guinier e Fourmet, 1955; Glatter e Kratky, 1982).

Esta obtida atravs da transformada de Fourier do fator de forma (),

37

consequentemente da (), pois estas duas s diferem pela constante . A transformada

dada por (Barbosa et al, 2010):

() = (1

22) ()()2

0

sin()

Equao 22 - Transformada de Fourier para obter ().

A () chamada de funo de distribuio de distncias quando o sistema

homogneo (Barbosa et al., 2012). Neste caso ela representa a probabilidade de encontrar

dois elementos espalhadores separados por uma distncia dentro do volume da partcula

espalhadora (Barbosa et al., 2010).

A partir da funo de distribuio de distncias possvel determinar a dimenso

mxima (Dmax) da protena, que o valor de quando () = 0 (Barbosa et al., 2012).

Do ponto de vista fsico este parmetro representa a maior distncia entre dois centros

espalhadores dentro do volume do objeto espalhador.Com a funo () pode-se obter

raio de giro da protena (Barbosa et al., 2012). A Equao 23 apresenta a relao entre

o e a funo () (Guinier e Fourmet, 1955; Glatter e Kratky, 1982; Barbosa et al.,

2012):

2 =

2()

0

2 ()

0

Equao 23 - Raio de Giro obtido a partir da funo de distribuio de distncias ().

Para solues de protena que apresentam diferentes estados oligomricos o

resultado do raio de giro deve ser interpretado como a mdia ponderada do raio de giro

de todas as espcies presentes na amostra (Barbosa et al., 2012):

38

=

Equao 24 - Raio de giro para soluo com diferentes estados oligomricos.

onde o raio de giro de uma dada espcie e a quantidade de cada espcie.

Para se obter a () a partir da () utiliza-se softwares que realizam a integral

da Equao 22 por iteraes numricas. Dois exemplos de softwares com esta funo so

os o GNOM (Svergun, 1992) e o GIFT (Bergmann et al., 2000; Popovski, 2009). Neste

projeto as () foram obtidas utilizando o GIFT (Bergmann et al., 2000; Popovski, 2009).

O GIFT (Bergmann et al., 2000; Popovski, 2009) converte a transformada de

Fourier (Equao 22) em um problema de mnimo dos mltiplos quadrados que depende

de um parmetro de estabilizao para avaliar o erro entre a soluo obtida e a curva

experimental. Este parmetro chamado de Multiplicador de Lagrange (Popovski,

2009). Como a estabilidade da soluo depende das especificaes utilizadas para iniciar

a iterao numrica, o GIFT varia os valores de inicializao e obtm diferentes solues.

Para identificar qual soluo mais se aproxima dos dados experimentais analisa-se o valor

do Multiplicador de Lagrange de cada soluo obtida (Bergmann et al., 2000; Popovski,

2009).

Para anlise da funo P(q), pode-se iniciar a mesma atravs da simulao de

curvas toricas de SAXS a partir da estrutura cristalogrfica da protena, se conhecida, e

compar-las aos dados experimentais. As semelhanas e diferenas entre as curvas podem

auxiliar na compreenso da conformao da amostra de protena.

39

A estrutura cristalogrfica do dmero ()2 da Na,K-ATPase obtida por Kanai e

col. (2013) foi utilizada neste trabalho para construir a curva terica do dmero ()2

(PDB 3WGV - Figura 9 esquerda). O monmero () foi obtido ao retirar uma unidade

do dmero (Figura 9 direita) atravs do software CRYSOL (Svergun et al., 1995).

Figura 9 Estrutura cristalogrfica do dmero ()2 da Na,K-ATPase (Kanai et al., 2013)

esquerda. direita est a estrutura cristalogrfica do monmero (). A cor muda gradualmente do N-

terminal (azul) at o C-terminal (vermelho) para as subunidades e (Kanai et al., 2013).

Todos os experimentos de SAXS de amostras de Na, K-ATPase solubilizadas e

purificadas em C12E8 pr e ps irradiao foram realizados no Centro Nacional de

Pesquisa em Energia e Materiais, Laboratrio Nacional de Luz Sncrotron Linha de

SAXS 1, em Campinas. O comprimento de onda do feixe de raio-x foi de 1.488 ,

temperatura ambiente com distncia da amostra ao detector de aproximadamente 1300

mm. As amostras foram colocadas no porta amostra entre duas janelas de mica com 1 mm

de espaamento e este arranjo estava perpendicular ao feixe incidente.

40

Os dados foram obtidos com 5 minutos de exposio ao feixe, o sinal foi recebido

por um detector bidimensional. O sinal foi normalizado levando em considerao a

variao da intensidade do feixe de raio-x durante o tempo do experimento e o sinal de

fundo foi retirado aps medir o espalhamento da soluo tampo.

Com o objetivo de desagregar a Na,K-ATPase purificada em C12E8, filtrou-se a

amostra com um filtro de 100 nm de poro, adicionou-se o surfactante dodecil sulfato de

sdio (SDS) soluo e a concentrao do surfactante na amostra foi de 0,5 mM e 1 mM.

Mediu-se a curva de SAXS imediatamente aps a adio do SDS.

3.10. Bioestimulao da Na,K-ATPase por laser de baixa potncia

A medida foi realizada utilizando 3 lasers: = 532 nm com potncia ajustvel

entre 0 e 5 mW; = 650 nm com potncia fixa de 50 mW e =780 nm com potncia

ajustvel entre 0 e 50 mW. Utilizou-se a potncia mxima de cada um dos lasers que

foram posicionados a uma distncia de 25 cm perpendicularmente ao plano da soluo de

protena, como esquematizado na Figura 10.

Figura 10 Esquema do procedimento de irradiao.

Aps a irradiao, uma alquota de Na,K-ATPase era adicionada ao meio

reacional e realizava-se o procedimento de medida de atividade como descrito no item

3.7. No caso da frao de membrana foram irradiados 100 L de amostra para realizar

Laser

Irradiao

Amostra

Altura: 25 cm

41

medidas de atividade em triplicata (3 medidas de 30 L de amostra). No caso

proteolipossomos foram irradiados 35 L de amostra (3 medidas de 10 L de amostra).

Alm disso, realizaram-se medidas de atividade para verificar a estabilidade da

bioestimulao. Para isto irradiaram-se amostras de Na,K-ATPase (proteolipossomo e

frao de membrana), mantidas fora do gelo aps a irradiao e mediu-se a atividade

enzimtica de 2 em 2 horas at 6 horas. Para cada uma dessas medidas de atividade

manteve-se um controle que foi a amostra de protena sem irradiao mantida fora do

gelo pelo mesmo perodo de tempo que as amostras irradiadas.

O padro internacional adota a dose, J/cm2, como a unidade de medida de

irradiao por laser. Portanto, para padronizar os valores de irradiao do experimento,

medimos o tamanho do spot dos laser (cm2).

Por outro lado, sabemos que a potncia se relaciona com a energia tal que:

=

Equao 25 - Definio de Potncia.

Onde a potncia, energia e o tempo de irradiao. Com o valor da potncia

do laser, do tempo de irradiao cronometrado durante o experimento e do tamanho do

spot (A), o valor da dose foi calculado como mostra a Equao 26:

= : = ()

(2) =

()

(2)

Equao 26 - Definio de Dose.

42

Para obter o tamanho do spot mediu-se o raio do fei