Bioherbicida Feijao de Porco

Avaliao de extratos das folhas e sementes de feijo-de-porco (Canavalia ensiformis) como bioerbicidas

ps-emergentes e identificao de aleloqumicos via cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC)

ISEQUIEL DOS SANTOS MENDES

Orientadora: MARIA OLMPIA DE OLIVEIRA REZENDE

Janeiro, 2011

Dissertao apresentada ao Instituto de Qumica de So Carlos, da Universidade de So Paulo para obteno do ttulo de Mestre em Cincias na rea de Qumica Analtica.

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DEDICATRIA

A meus pais, a quem devo tudo o que tenho e o que sou.

A meus irmos e irms, que esto sempre por perto.

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AGRADECIMENTOS

Quero aqui agradecer a tudo e a todos que contriburam ou proporcionaram um

ambiente agradvel e propcio para tudo o que produzi at este momento.

A todos que passaram ou esto ainda no Laboratrio de Qumica Ambiental: Jussara, Raquel, Joel, Clever, Silvia, Paulo Roberto, Fernanda, Tlio, Flvia, Claudinha, Rachid, Leandro (primo), obrigado pelo apoio, colaborao e valiosas dicas que contriburam muito para realizao deste trabalho.

galera do sindicato, Bruno Palmito (presidente), Robertinha (secretria), Rgis 50to, Livia Pedrita, Danielly Michelly, pessoal que esteve comigo todo o tempo, pela amizade e os timos momentos que passamos nos divertindo abrindo aquelas ampolas geladas.

Aos professores com quem tive contato direto durante o curso, em especial profa. Salete e ao prof. Gilberto Chierice, cuja colaborao e ajuda foram determinantes para continuidade deste trabalho.

Ao pessoal do CAQI, BIBLIOTECA, SEO de PS-GRADUAO e das OFICINAS pela colaborao, disposio e eficincia nos trabalhos realizados e tambm CAPES pelo financiamento concedido para realizao do trabalho.

Um agradecimento especial Sra Maria Diva Landgraf, uma pessoa que possui brilho prprio, e consegue iluminar a quem esteja junto a ela, meu muito obrigado a voc Lorinha.

Um ltimo agradecimento, porm o mais importante, Profa. Dra. MARIA OLIMPIA DE OLIVEIRA REZENDE. Agradeo pela oportunidade dada, pela dedicao e seriedade durante todo tempo, onde se manteve sempre muito prestativa no desenvolvimento e concluso deste trabalho.

A TODOS, MUITO OBRIGADO !!!

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RESUMO

A utilizao de compostos qumicos no controle de pragas que afetam negativamente a produo agrcola tem sido objeto de muitas crticas por parte de ambientalistas e pesquisadores devido aos problemas ambientais proporcionados por tais substncias. Nos ltimos anos tem-se dedicado bastante tempo e recursos em pesquisas que levem descoberta de produtos para controle de pragas que tragam nenhum ou o menor prejuzo possvel ao ambiente. Neste sentido, o estudo da alelopatia busca a utilizao de compostos oriundos da prpria natureza para uso no combate a espcies invasoras em plantaes, na esperana de ter-se um controle prtico e efetivo sobre plantas daninhas minimizando-se a contaminao ambiental. Neste trabalho foram utilizaram-se extratos aquosos de sementes e folhas da leguminosa feijo-de-porco (Canavalia ensiformis) como um bioerbicida ps- emergente aplicado no controle das plantas daninhas trapoeraba (Commelina benghalensis) e corda-de-viola (Ipomoea grandifolia), e foi avaliada tambm a seletividade dos extratos com relao a cultivares de soja (Glycine max) convencional e transgnica. Foram preparados tratamentos em seis diferentes concentraes e aplicados em trs diferentes perodos, sendo avaliados seus efeitos de toxicidade e seletividade sobre o desenvolvimento das plantas daninhas e da soja. Os resultados foram submetidos anlise de varincia e aplicou-se o teste F a 1% de probabilidade, mostrando que os tratamentos mais eficazes no controle das invasoras foram aqueles preparados a partir das sementes de feijo-de-porco nas concentraes 25 e 50 g L-1, que interromperam completamente o desenvolvimento as plantas daninhas, sem causar, no entanto qualquer efeito aparente sobre a soja, tanto transgnica quanto convencional. Foram realizadas tambm determinaes cromatogrficas para identificao de compostos fenlicos em amostras de folhas de feijo-de-porco. Mediante a comparao com compostos padro e variao de comprimento de onda na regio do ultravioleta-visvel foi possvel identificar os compostos cido clorognico, cido p-ansico, naringina e rutina, cujas concentraes encontradas, relativas s amostras, foram de 4,42 mg L-1, 6,0 mg L-1, 3,75 mg L-1 e 5,0 mg L-1 respectivamente.

Palavras chave: Canavalia ensiformis, trapoeraba, corda-de-viola, cidos fenlicos, bioerbicidas, ps-emergncia.

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ABSTRACT

The use of chemicals to control pests that adversely affect agricultural production has been treated with great concern due environmental issues provided by such substances. In the last years much time and money were devoted in researchs leading to discovery products to control pests that bring no or the least damage to the environmet. In this sense, the use of allelopathic species for controlling invasive species is an environmental friendly technique. In this work aqueous extracts of seeds and leaves of Jack bean (Canavalia ensiformis) were used as a post-emergent bioherbicide succesfully applied for control of dayflower (Commelina benghalensis) and morningglory (Ipomoea grandifolia), and selectivity on conventional and transgenic soybean (Glycine max) cultivars. Treatments were prepared in six different concentrations and applied in three different periods, being analyzed the effects of toxicity and selectivity on the development of weeds and soybean. The results were subjected to analysis of variance and applied the F test at 1% probability, showing that the most effective treatments in controlling the weeds were those prepared from seeds of Jack bean at concentrations of 25 and 50 g L-1, that totally controlled weeds, however causing no apparent injury on soybeans, both transgenic and conventional. Chromatographic analysis were also performed for identification of phenolic compounds in samples of Jack bean leaves. By comparison with standards and changes in wavelength on ultraviolet-visible spectra was possible to identify clorogenic acid, p-anisic acid, naringin and rutin compounds at concentrations of 4.42 mg L-1, 6.0 mg L-1, 3.75 mg L-1 and 5.0 mg L-1 respectively.

Keywords: Canavalia ensiformis, benghal dayflower, morningglory, phenolic acids, bioherbicides, post-emergent.

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ndice de tabelas

Tabela I: Informao sobre o aparecimento da agricultura1 ------------------------------------------------ 13

Tabela III: Mapa dos herbicidas resumido31 -------------------------------------------------------------------- 22

Tabela IV: Padres, solventes e outros materiais utilizados neste trabalho --------------------------- 33

Tabela V: Caracterizao fsica do solo utilizado ------------------------------------------------------------- 34

Tabela VI: Caracterizao qumica do solo utilizado --------------------------------------------------------- 34

Tabela VII: Massas de extratos aquosos obtidas a partir de 300g de material vegetal previamente seco e modo ----------------------------------------------------------------------------------------------------- 36

Tabela VIII: Condies cromatogrficas empregadas nas anlises das amostras de folhas ----- 40

Tabela IX: Descrio dos conceitos aplicados as avaliaes de toxicidade SBCPD56 ----------- 43

Tabela X: Escala de conceitos da ALAM* utilizada para avaliao da porcentagem de eficcia de controle de plantas daninhas -------------------------------------------------------------------------------- 43

Tabela XI: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre corda-de-viola em dose nica --------------------------------------------------------- 44

Tabela XII: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre corda-de-viola em duas etapas, sendo a 2 aplicada 3 dias aps a 1 ---- 45

Tabela XIII: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre corda-de-viola em 5 doses ------------------------------------------------------------- 45

Tabela XIV: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre trapoeraba em dose nica ------------------------------------------------------------- 45

Tabela XV: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre trapoeraba em duas etapas, sendo a 2 aplicada 3 dias aps a 1 --------- 46

Tabela XVI: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre trapoeraba em 5 doses ----------------------------------------------------------------- 46

Tabela XVII: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, dos efeitos dos tratamentos sobre corda-de-viola ------------------------------------------------------------------------------------------- 47

Tabela XVIII: Avaliao segundo ALAM, da porcentagem de controle dos tratamentos sobre corda-de-viola ---------------------------------------------------------------------------------------------------- 48

Tabela XIX: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, dos efeitos dos tratamentos sobre trapoeraba ------------------------------------------------------------------------------------------------ 50

Tabela XX: Avaliao segundo ALAM, da porcentagem de controle dos tratamentos sobre trapoeraba -------------------------------------------------------------------------------------------------------- 51

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Tabela XXI: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para o tratamento ES-50 sobre plantas daninhas e cultivares de soja --------------------------------------------------------------------- 53

Tabela XXII: Biomassa seca obtida para corda-de-viola ---------------------------------------------------- 55

Tabela XXIII: Biomassa seca obtida para trapoeraba -------------------------------------------------------- 56

Tabela XXIV: Compostos identificados com seus respectivos tempos de reteno e comprimento de onda que absorvem na regio do UV-Vis ------------------------------------------------------------ 64

Tabela XXV: Limites de deteco (LOD) e quantificao (LOQ) para os compostos determinados ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 64

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ndice de figuras

Figura I: Espectros na regio do UV-Vis para os compostos padro utilizados no trabalho ........ 40

Figura II: Grfico ilustrando a relao entre as biomassas secas de corda-de-viola ................... 55

Figura III: Grfico ilustrando a relao entre as biomassas secas de trapoeraba ........................ 56

Figura IV: Cromatograma comparativo para identificao e seletividade entre os compostos

rutina e cido ferlico em = 325 nm ................................................................................. 58

Figura V: Cromatograma comparativo para identificao e seletividade entre os compostos rutina

e cido ferlico em = 265 nm ........................................................................................... 59

Figura VI: Cromatograma comparativo para identificao do cido p-ansico atravs de padro

em = 325 nm .................................................................................................................... 59

Figura VII: Cromatograma comparativo para identificao do cido p-ansico atravs de padro

em = 265 nm .................................................................................................................... 60

Figura VIII: Cromatograma comparativo para identificao dos compostos cido clorognico e

naringina na amostra atravs de padro em = 340 nm ................................................... 61

Figura IX: Cromatograma comparativo para identificao dos compostos cido clorognico e

naringina na amostra atravs de padro em = 290 nm ................................................... 61

Figura X: Grfico representando a curva analtica do composto rutina ....................................... 62

Figura XI: Grfico representando a curva analtica do composto cido p-Ansico ....................... 62

Figura XII: Grfico representando a curva analtica do composto cido clorognico ................... 63

Figura XIII: Grfico representando a curva analtica do composto naringina ............................... 63

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Sumrio

RESUMO............................................................................................................ 6

ABSTRACT ........................................................................................................ 7

ndice de tabelas ................................................................................................ 8

ndice de figuras ............................................................................................... 10

1. Introduo .................................................................................................... 13

1.1. Histrico ................................................................................................. 13 1.2. Herbicidas .............................................................................................. 19 1.3. Alelopatia ............................................................................................... 25 1.4. Feijo-de-porco (Canavalia ensiformis) ................................................. 28 1.5. Cromatografia ........................................................................................ 29

2. Objetivos ...................................................................................................... 32

3. Materiais e Mtodos ..................................................................................... 33

3.1. Materiais ................................................................................................ 33

3.1.1. Substncias padro de referencia, solventes e outros materiais .... 33 3.1.2. Equipamentos ................................................................................. 33

3.2. Mtodos ................................................................................................. 34

3.2.1. Local, cultura e condies gerais do experimento .......................... 34 3.2.2 Obteno dos extratos aquosos de folhas e sementes de feijo-de-porco (Canavalia ensiformis) ..................................................................... 35 3.2.2.1. Terminologia utilizada .................................................................. 37 3.2.3. Procedimento de Aplicao dos extratos ........................................ 37 3.2.4. Extrao das amostras e condies para anlise cromatogrfica .. 39

4. Resultados e Discusso ............................................................................... 42

4.1. Experimentos utilizando extratos de folhas e sementes de feijo-de-porco (Canavalia ensiformis) ........................................................................ 42

4.1.1. Avaliao dos efeitos observados ................................................... 42 4.1.2. Avaliao do volume timo para aplicao ..................................... 43

4.2. Avaliao dos dados obtidos aps aplicao dos extratos .................... 47

4.2.1. Avaliao dos tratamentos aplicados sobre corda-de-viola ............ 47

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4.2.3. Avaliao da seletividade do tratamento ES-50 aplicado sobre parcelas constitudas pelas plantas daninhas e soja ................................ 52

4.3. Anlise de Massa Seca ......................................................................... 54

4.4. Anlise cromatogrfica via HPLC .......................................................... 57

5. Concluses ................................................................................................... 67

6. Referncias Bibliogrficas ............................................................................ 69

Introduo

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Instituto de Qumica de So Carlos - USP 2011 13

1. Introduo

1.1. Histrico

Desde seus primeiros passos na tragetria evolutiva, quando o homem

primitivo desceu das rvores h alguns milhares de anos, a humanidade luta

para sempre viver mais, e melhor. Ainda na Pr-histria ocorreram algumas

descobertas que auxiliaram o homem neste sentido, dando-lhe suporte

tecnolgico para se tornar a espcie dominante sobre a Terra. A roda e o fogo

so indiscutivelmente as mais importantes e conhecidas, e pode-se agrupar a

essas tambm, a descoberta, ou mais especificamente a observao que o

homem fez na natureza, que o levou a criar um modo de obteno de seu

alimento que hoje se conhece como agricultura.

Tabela I: Informao sobre o aparecimento da agricultura1

Onde foi inventada a agricultura Regio Cultivares 1 Referncia Crescente Frtil Trigo, cevada e ervilha 10.500 a.C. China Arroz e milhete 9.500 a.C. Mesoamrica Milho, feijo e abbora 5.500 a.C. Andes/Amaznia Batata e mandioca 5.500 a.C. Leste dos EUA Sorgo e arroz selvagem 4.500 a.C.

A Tabela I traz alguns dados sobre datas e locais do surgimento de

algumas plantaes, exemplos de cultivares que atravessaram milnios sem

perder sua importncia e que, consequentemente, ainda fazem parte da base

alimentar humana.

Nos primrdios, o homem notou que alguns dos gros coletados para a

sua alimentao poderiam ser enterrados com o intuito de produzir novas

Introduo

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plantas iguais s que os originaram. Surgia nesse instante o embrio da

agricultura, a prtica de plantio de sementes que trouxe o aumento da oferta de

alimentos, e as plantaes passaram a ser cultivadas muito mais prximas dos

povoados diminuindo os perigos da busca por alimento, o que representou

enorme vantagem para o homem da poca2.

A experincia ao longo do tempo permitiu tambm aos primeiros

agricultores a seleo entre os gros com caractersticas de maior interesse

(tamanho, produtividade, sabor). Trigo e cevada cresciam entre as rvores no Oriente Mdio (13 mil anos atrz), muito mais abundantes e nutritivos que outras espcies, e foram os principais entre as primeiras plantas

domesticadas1.

impossivel estimar a importncia do trigo para a humanidade, pois foi esse alimento que deu a estabilidade necessria para que o homem criasse as

bases da civilizao ocidental, Babilnia, Egito, Roma, Grcia e mais tarde as

civilizaes do norte e oeste europeu e, qualquer outra civilizao que tenha

sido formada, teve sua base fundada graas a algum tipo de agricultura de

cereais3.

Com o progresso, houve um natural aumento nas populaes, e com ela

tambm a necessidade de se aumentar a produo alimentar. Esse aumento

esbarrou em alguns obstculos principais, como as restries devidas a espao

fsico reduzido para plantio (principalmente na Europa) e doenas e pragas que atacavam as plantaes.

O termo Praga pode ser definido de muitas formas, uma delas est no

D.O.U.16 como qualquer espcie, raa ou bitipo vegetal ou animal ou agente

patognico danoso para as plantas ou produtos vegetais. A Conveno

Introduo

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Internacional de Proteo Vegetal (CIPV) realizada em novembro de 1997 pela FAO (Diviso da ONU para Agricultura e Alimentao), sintetizou a definio como qualquer espcie, raa ou bitipo vegetal ou animal ou agente patgeno

daninho para as plantas ou produtos vegetais17.

Assim como o conceito de praga, o conceito de planta daninha

bastante amplo e relativo. Para Lorenzi18, por exemplo, planta daninha

qualquer vegetal que cresce onde no desejado, e ainda nessa linha, para Kissmann19 nenhuma planta intrinsecamente nociva, de acordo com as

circunstncias ela pode ser desejada, indiferente ou indesejada. Para controlar ou eliminar uma praga pode-se utilizar compostos

qumicos conhecidos como pesticidas. Agroqumico, agrotxico, praguicida e

biocida tambm so nomes comumente dados aos pesticidas, utilizados pelo

setor industrial, por agricultores, ecologistas e pesquisadores20.

No Brasil, a Lei No 7.802, de 11 de julho de 1989, define agrotxicos e afins no seu artigo 2o, pargrafo I, inciso (a): os produtos e os agentes de processos fsicos, qumicos ou biolgicos, destinados ao uso nos setores de

produo, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrcolas, nas

pastagens, na proteo de florestas, nativas ou implantadas, e de outros

ecossistemas e tambm de ambientes urbanos, hdricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composio da flora ou da fauna, a fim de preserv-las da ao danosa de seres vivos considerados nocivos.

No termo agrotxico esto tambm includos os desfolhantes,

dessecantes, reguladores de crescimento de plantas e insetos, e so

desconsiderados os medicamentos de uso veterinrio, fertilizantes (ou nutrientes) e agentes de controle biolgico21.

Introduo

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Seguindo a definio da lei, todos os produtos so classificados no por

sua origem, e sim de acordo com sua finalidade, que o controle de seres

nocivos. Sendo assim, tanto os agroqumicos sintticos quanto os de origem

natural e at geneticamente modificados so enquadrados nessa lei, e seguem

o Decreto no 4.074, de 8 de janeiro de 200222 que regulamenta a lei e estabelece condies para produo, manipulao, comercializao etc. O

registro e avaliao de agroqumicos no Brasil est sob responsabilidade do

Ministrio da Agricultura Pecuria e Abastecimento (MAPA), a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA) e o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente (IBAMA)23.

A classificao dos pesticidas feita levando-se em conta alguns

detalhes quanto ao seu raio de ao e objetivo. Inseticidas so usados para erradicar insetos, fungicidas para fungos, herbicidas para plantas daninhas,

rodenticidas para eliminar roedores, acaricidas para caros entre outros. De

acordo com as caractersticas qumicas e estruturais, tais compostos tambm

so agrupados em organoclorados, organofosforados, s-triazinas, carbamatos,

urias substitudas, fenoxicidos, acetanilidas, sais de amnio e piretrides24.

A diviso entre os pesticidas comerciais se d aproximadamente da

seguinte maneira, 60% so herbicidas, 25% inseticidas e 15% fungicidas. Os

pesticidas so muito utilizados na agricultura na tentativa de se obter uma

colheita mais produtiva, mas apesar de sua intensa utilizao, ainda grande o

percentual de perdas, chegando a cerca de 37% da produo total, onde a

ao de insetos indesejveis responde por cerca de 13%, patgenos 12%, e plantas daninhas 12%25.

Introduo

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O uso dos pesticidas cresceu muito a partir da segunda guerra mundial e

est estreitamente ligado s mudanas introduzidas nos modelos de produo

e cultivo, que ampliaram muito a produtividade agrcola sem proporcional

aumento de rea plantada.

No incio de seu uso, os pesticidas foram responsveis por boa parte

desse aumento de produo, pois eliminando as pragas, melhoravam muito as

chances de se obter uma boa colheita4, hoje a situao bem diferente segundo Hawken6, que mostra que o uso de pesticidas sintticos aumentou

cerca de 20 vezes desde meados do sculo XX, e as perdas totais na produo

esperadas devido aos insetos, que deveriam diminuir com uso de

agroqumicos, aumentou de 7% para cerca de 13% em todo o mundo,

chegando a 20% nos Estados Unidos.

O composto dicloro-difenil-tricloroetano, mais conhecido como DDT,

surgiu na dcada de 40, logo aps a Segunda Guerra Mundial, como uma

soluo para muitos problemas. Foi tamanha sua capacidade de acabar com

as pragas, to rapidamente e sem efeitos danosos aparentes, que valeu ao

entomologista suo Paul Hermann Mller o prmio Nobel de medicina (1948) devido sua descoberta das propriedades inseticidas relativas ao DDT7.

Movimentos contrrios interveno qumica na agricultura j existiam desde que essa prtica se iniciou, porm crticas mais expressivas comearam

a surgir e demonstrar a relevncia dos problemas causados pelo novo padro

produtivo. Em 1962, o lanamento do livro primavera silenciosa, da biloga

norte americana Rachel Carson8, denunciava os problemas causados pelo uso

indiscriminado de pesticidas, sendo o maior deles o DDT, que atualmente

Introduo

____________________________________________________________________________


proibido em mais de 80 pases. Seu uso ainda permitido em alguns lugares

no combate a insetos transmissores de doenas tropicais como malria.

Os prejuzos ambientais causados esto quase em equilbrio com os benefcios que os pesticidas trouxeram e ainda trazem produo agrcola e

ao combate de enfermidades humanas.

No incio de seu uso, a eficcia em combater doenas como malria,

febre amarela, dengue e outras parasitoses desencadeou o uso abusivo destes

produtos em todo o mundo, e a proliferao destes insumos passou a afetar

alm das espcies alvo, tambm o ambiente, contaminando solos, gua,

alimentos, animais e aves, chegando desta forma ao homem, uma vez que os

compostos e misturas so txicos, possuindo alto grau de estabilidade qumica

e sendo bioacumulados3,7,8.

Organizaes internacionais de controle ambiental e sade pblica entre

outras, esto sempre preocupadas e determinadas a controlar o poder

destrutivo desses produtos, criando regulamentaes tanto para a utilizao

quanto para o controle da produo, estocagem e liberao de herbicidas.

O Cdigo Internacional de Conduta sobre Distribuio e Uso de

Pesticidas foi aprovado pelo Conselho da Organizao das Naes Unidas

para a Agricultura e a Alimentao (FAO), que fala sobre a responsabilidade dos governos na regulamentao dessas substncias, a necessidade de ajuda a pases com dificuldades tcnicas para assumirem os riscos de sua utilizao,

e da importncia de contar com boas prticas de produo e comercializao15.

Introduo

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1.2. Herbicidas

O processo fitossanitrio na agricultura, assim como os primeiros

produtos utilizados comeam a existir a partir da intensificao da prpria

agricultura. Os primeiros exemplos de herbicidas conhecidos foram produtos

inorgnicos (enxofre e cobre) e alguns cidos. Sulfato de cobre tem ao fungicida e uma mistura de sulfato de cobre e carbonato de amnio utilizada

na horticultura.

Seu uso como herbicida no est relacionado com a agricultura, mas

sim no controle de plantas aquticas exticas e razes de outras plantas

invasivas prximas a encanamentos contendo gua. A maior parte das

espcies de algas pode ser controlada com uma concentrao baixa de sulfato

de cobre26.

O uso de fel de lagarto verde na proteo de mas, extratos de

pimenta, tabaco, vinagre, aguarrs, leo de peixe, entre outros, so exemplos

de agroqumicos utilizados na poca de Plnio, o Ancio (23-79 d.C), catalogados em seu livro chamado Histria Natural27.

Os herbicidas apresentam algumas caractersticas prprias como,

atividade, uso, modo e mecanismo de ao, grupo qumico ou tipo de

vegetao controlada, caracteristicas essas que direcionam e determinam o

modo como sero utilizados, o tipo de alvo que atingiro, e como esse alvo

ser afetado pelos mesmos.

A escolha do herbicida adequado depender diretamente dessas

caractersticas, assim como o resultado de sua ao sobre o alvo e a cultura

onde ser aplicado.

Introduo

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A atividade de um herbicida determina basicamente a regio onde o

mesmo atuar na planta; herbicidas de contato so os que agem apenas na

rea onde so aplicados; herbicidas sistmicos apresentam a capacidade de

atuar ou ter controle em toda a planta.

A absoro do herbicida o que determinar sua atividade e

deslocamento na planta, a sensibilidade da mesma a este herbicida e como

ser a atuao sobre o metabolismo. Existe a necessidade de que este

herbicida penetre na planta e chegue ao seu destino, at a organela onde ir

atuar, pois o herbicida simplesmente atingir as folhas ou ser aplicado no solo

no significa que sua ao ser efetiva.

Sua atuao dentro da planta se d em locais especficos, denominados

stios de ao, fazendo alteraes em rotas biossintticas e dificultando alguma

funo essencial ao desenvolvimento e sobrevivncia da mesma11.

Mecanismo de ao e modo de ao so pontos importantes de um

herbicida, que ajudam a entender como a estrutura da planta afetada pelo princpio ativo.

O mecanismo de ao diz respeito aos efeitos do herbicida sobre o

metabolismo das plantas, descrevendo normalmente os locais e os eventos

que promovem esses efeitos.

O resultado da seqncia destes eventos aparece na forma de sintomas

externos visveis apresentados pelas plantas em suas folhas, razes, flores e

caules. Esses sintomas, que aparecem desde o primeiro contato do herbicida

com a planta at sua morte, so o que se denomina modo de ao.

Apesar de um mesmo herbicida poder influenciar os mais variados

processos metablicos dentro da planta, seu alvo freqentemente a

Introduo

____________________________________________________________________________


destruio das membranas dos cloroplastos, causando danos fotossntese e

interrompendo a transformao que produz energia necessria ao seu

metabolismo28.

Em relao aplicao, os herbicidas podem ser classificados de duas

formas: os pr-emergentes, quando aplicados antes do plantio da cultura, e os

ps-emergentes, quando aplicados aps a germinao das sementes

plantadas.

Para efeito de ao dos herbicidas, as plantas daninhas so

discriminadas de acordo com o nmero de cotildones que possuem,

monocotiledneas ou dicotiledneas, e tambm de acordo com o tipo de folha,

que podem ser folhas largas ou folhas estreitas.

De acordo com essas caractersticas, pode-se tambm classificar o

herbicida quanto seletividade, que indica o tipo de planta daninha que

afetada pelo mesmo.

Herbicidas so seletivos quando atuam sobre ou afetam o

desenvolvimento de apenas uma determinada espcie, sem incomodar ou

tendo pouco impacto sobre as demais. So no seletivos quando sua ao

letal a todas as espcies, sejam elas plantas de folhas largas ou folhas estreitas, mono ou dicotiledneas11,28.

A Tabela III apresenta um resumo com os principais mecanismos de

ao dos herbicidas e algumas caractersticas como local de aplicao,

atividade, modo de translocao, tipo de plantas afetadas e regio de atuao

dos herbicidas14,30.

Introduo

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Tabela II: Mapa dos herbicidas resumido31

Local de aplicao

Atividade e modo de translocao Mecanismo de ao

Plantas daninhas controladas

Folhagem

Sistmicos Inibidores da ACCase Inibidores de ALS Inibidores de EPSPs Mimetizadores da Auxina

P PDC PD D

Contato

Inibidores da FS I Inibidores da PROTOX

PD D

Inibidores de GS PDC

Solo

Mveis Inibidores do FS II Inibidores de carotenides D D

Imveis Inibidores da parte area Inibidores de mitose PC P

P = poceas (gramneas); C = ciperceas (herbceas); D = dicotiledneas; ACCase = enzima AcetilCoenzima A Carboxilase; GS = enzima Glutamina Sintetase; ALS = enzima Acetolactato Sintase; EPSPs = enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato Sintase; FS I e II = Fotossistema I e II; PROTOX = enzima Protoporfirinognio Oxidase.

O fato de o desenvolvimento de uma planta daninha necessitar as

mesmas condies exigidas por outras culturas gera um ambiente de

competio por gua, luz, nutrientes e espao fsico, ocasionando perdas na

produo da cultura desejada. As plantas daninhas interferem tambm no modo de colheita, pois tanto

a manual quanto a mecnica so prejudicadas. Exemplos so as espcies Mimosa invisa (malistra ou dormideira), que fere as mos durante a colheita manual, Ipomoea grandifolia (corda-de-viola) e Commelinna benghalensis

Introduo

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(trapoeraba), que atrapalham a colheita mecnica, pois impedem a perfeita ao do maquinrio utilizado4.

Ento, diante desses fatos, trabalhou-se em medidas visando enfrentar

essas duas barreiras principais. O espao para expanso das culturas na

Europa esgotou-se rapidamente, por ser limitado, e a ateno foi voltada na

direo da manipulao e criao de produtos que promovessem a eliminao

das pragas.

A chamada Revoluo Verde fez com que tecnologia e capital atuassem

diretamente no campo e na natureza, fomentando a produo de insumos

industrializados, mquinas, adubos, defensivos, organismos geneticamente

modificados, entre outros.

Se por um lado, esse domnio do modo de obteno de vveres resultou

no evidente melhoramento do padro de vida, por outro, essa nova sociedade

agrcola formada, produziu tambm grandes danos natureza, desmatamentos

da vegetao nativa para implantao de monoculturas, procurando maior

quantidade com menor variedade, lanando mo do uso de produtos qumicos

para o controle de pragas, comprometendo e causando contaminao de solos,

guas, fauna e flora5.

Os herbicidas atingem o homem e a outros animais pela exposio

direta ou por acumulao no organismo via ingesto de alimentos e gua

contaminados. Essa contaminao acontece pela exposio oral, ocular,

drmica e inalao, e dependendo do grau de toxicidade, da via de intoxicao,

e do tempo de exposio, produzem efeitos dos tipos agudo (danos que aparecem em menos de 24 horas, imediatamente aps a exposio a uma

nica dose, geralmente bastante alta), crnico (surgem aps longos perodos

Introduo

____________________________________________________________________________


de contato a doses de baixa concentrao ou a exposies repetidas

substncia) e alrgico (caracterizados por reaes que algumas pessoas apresentam depois de expostas ao produto)7,9,10.

Outro problema inesperado e de grande relevncia a diminuio e

muitas vezes a perda total da capacidade de controle que os herbicidas

sintticos apresentam com relao s plantas alvo. A preocupao com o

surgimento de plantas resistentes a herbicidas em determinadas situaes,

como: uso repetitivo do mesmo herbicida ou de outro com semelhante

mecanismo de ao, tem sido alertada11.

A resistncia apresentada pelas plantas pode ser devido a fatores que

fazem com que as mesmas consigam evitar que o herbicida atinja seu alvo. Reaes do metabolismo das plantas presena dos herbicidas, perda de

afinidade do herbicida pelo local de ao e reduo da concentrao do

mesmo no local de ao so alguns desses fatores12,13.

O aparecimento de plantas resistentes foi relatado inicialmente no final

dos anos 60, associados aplicao de herbicidas da classe das triazinas11.

Registros mostram a existncia de aproximadamente 197 espcies de plantas

daninhas resistentes (115 dicotiledneas e 82 monocotiledneas), sendo 22 delas encontradas no Brasil at o ano de 200913,14.

Introduo

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1.3. Alelopatia

A capacidade que as plantas tm de interferir no desenvolvimento de

suas semelhantes, liberando substncias na atmosfera ou no solo, j era observada desde a Antigidade. No sculo III a.C., Teofrasto recomenda na

Grcia o cuidado com o cultivo de couve junto a videiras, pois substancias volteis liberadas pela primeira interferem negativamente no desenvolvimento

da segunda.

A meno sobre esse conceito de antipatia entre plantas aparece em

vrios escritos da Renascena. A incompatibilidade percebida entre algumas

espcies provocada pela liberao de substncias volteis ou por exalao

radicular de toxinas.

O pesquisador alemo Hans Molisch reuniu as palavras gregas alllon e

pathos para formar o termo alelopatia, citando-o em 1937 pela primeira vez. A

palavra significa prejuzo mtuo, e segundo Molisch, alelopatia "a capacidade de as plantas, superiores ou inferiores, produzirem substncias qumicas que,

liberadas no ambiente de outras, influenciam de forma favorvel ou no o seu

desenvolvimento"31,32.

A Sociedade Internacional de Alelopatia define alelopatia como: Cincia

que estuda qualquer processo envolvendo principalmente metablitos

secundrios produzidos por plantas, algas, bactrias e fungos que influenciam

o crescimento de sistemas biolgicos com efeitos positivos ou negativos33.

Produtos do metabolismo secundrio so produzidos pelas plantas e

estocados em grande nmero, e quando tais compostos so

posteriormente..liberados para o ambiente podem interferir no desenvolvimento

Introduo

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de outras espcies, afetando seu crescimento e at inibindo a germinao de

sementes.

O acesso de outras plantas s substncias alelopticas pode acontecer

de diversas formas, como lixiviao dos tecidos, ao em que as toxinas so

levadas das partes altas para as razes, absoro de compostos aromticos

que volatilizam das folhas, flores, caules, exudao atravs das razes,

liberando grande nmero de compostos na rizosfera, afetando direta ou

indiretamente as interaes planta/planta34,35,36.

So vrios os estudos realizados no sentido de se conhecer as espcies

com atividades alelopticas no intuito de aplicao como bioerbicidas,

conhecendo-se seus efeitos inibitrios, suas fontes e seu comportamento no

ambiente37.

Existem diversas interaes bioqumicas que envolvem o fenmeno da

alelopatia, segundo Harborne38 fraes volteis contendo terpenos e

sesquiterpenos resultantes do metabolismo secundrio das plantas, e

compostos fenlicos so os principais responsveis pela inibio da

germinao de sementes, crescimento de plantas, alm de outros processos

fisiolgicos.

Esses compostos possuem em comum um anel aromtico rodeado por

um ou mais grupos hidroxila associados diretamente estrutura cclica.

Tendem a ser solveis em gua, e podem estar ligados a acares, possuem

atividade anti-sptica, antiinflamatria, do ponto de vista farmacolgico, alm

da capacidade de inibir atividade enzimtica.38

Outros compostos tambm encontrados em extratos vegetais so os

polifenis taninos, flavonides, e cidos fenlicos. Esses compostos interagem

Introduo

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com sistemas biolgicos como bactrias e vrus, so antioxidantes e formam

complexos irreversveis com protenas, inibindo processos enzimticos e

interferindo no desenvolvimento das plantas.39

Os flavonides so compostos derivados do ncleo flavona, sendo que

as vrias classes so diferenciadas entre si pelo grau de insaturao e de

oxidao no seguimento dos trs carbonos intermedirios. So comumente

extrados de material vegetal com metanol, etanol, ou combinao destes com

gua.40

Os cidos fenlicos esto reunidos em dois grupos: derivados do cido

hidroxicinmico, e derivados do cido hidroxibenzico. Os derivados do cido

hidroxicinamico so compostos fenlicos de ocorrncia natural que possuem

um anel aromtico com uma cadeia carbnica, constituda por trs carbonos,

ligada ao anel. Os cidos p-cumrico, ferlico, cafico e sinptico so os

hidroxicinmicos mais comuns na natureza41.

Dentre as espcies com potencial aleloptico j investigado, Almeida42

identificou potencialidades alelopticas nas gramneas forrageiras Brachiaria

decumbens, Brachiaria humidicola e Brachiaria brizantha cv. Marandu em

nveis que possibilitaram redues expressivas na germinao de diferentes

plantas. Podem ser citados tambm como exemplos, a marica (Mimosa bimucronata), erva-mate (Ilex paraguariensis), pitanga (Eugenia uniflora) e carvalho brasileiro (Roupala brasiliensis), entre outras.43 Souza Filho44 considera a alelopatia uma alternativa vivel no manejo de plantas daninhas, devido a seu excelente potencial de interao e importncia ecolgica, assim

como a possibilidade de fornecer novas estruturas qumicas para produo de

bioativos que combatam as pragas e sejam menos danosos ao ambiente.

Introduo

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1.4. Feijo-de-porco (Canavalia ensiformis)

Canavalia ensiformis, conhecida comumente como feijo-de-porco, uma planta da famlia Fabaceae muito cultivada como cobertura verde, suas

razes possuem associao simbitica com bactrias fixadoras de nitrognio

dispensando a utilizao de fertilizantes nitrogenados35,45, no entanto pouco

utilizada com o objetivo de formao de pastagens, pois no muito aceita por parte dos animais.

Foi muito bem utilizado como cultura intercalar em rotao com milho e

feijo caup em plantio de coqueirais, cultivados em solos alterados de baixa fertilidade na Regio do Maraj, surgindo como alternativa capaz de minimizar tanto os danos causados ao solo pela prtica tradicional dos monocultivos

sucessivos, como tambm de amortizar os custos de manuteno e

investimento nas lavouras de coqueirais.46

Segundo Correa47, o valor principal dessa espcie aparece em sua

notvel rusticidade e poder de adaptao aos solos de baixa fertilidade com a

propriedade de imediatamente enriquec-los.

Vrios estudos foram desenvolvidos com essa espcie de planta, como

por exemplo, os trabalhos fitoqumicos realizados por Santos48 mostrando que

a Canavalia ensiformis fonte de compostos das classes alcalides,

cianoglicosdeos, saponinas, terpenides, flavonides e taninos.49

Santos et al50 avaliaram o potencial aleloptico de extratos obtidos das

folhas de C. ensiformis sobre a germinao de sementes das espcies Cassia

tora (mata-pasto), Mimosa pudica (malcia) e Cassia occidentalis (fedegoso), plantas daninhas encontradas em pastagens, concluindo que tal leguminosa

Introduo

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apresenta forte potencial aleloptico, e que extratos obtidos com solventes de

maiores constantes dieltricas foram os mais eficientes na inibio da

germinao das sementes testadas.

Mendona51 determinou os aleloqumicos de extratos aquosos de

sementes de Canavalia ensiformis via HPLC e avaliou a atividade aleloptica

sobre a germinao das plantas daninhas corda-de-viola (Ipomoea grandifolia) e trapoeraba (Commelinna benghalensis). O estudo aleloptico apresentou resultados satisfatrios com relao inibio de germinao das sementes

das plantas daninhas.

1.5. Cromatografia

Pode-se dizer que a data de 21 de Maro de 1903, marca

definitivamente o nascimento da cromatografia, numa conferncia realizada na

seco de biologia da Sociedade de Cincias Naturais de Varsvia, onde

Mikhail S. Tswett demonstrou sua mais importante concluso sobre separao

de pigmentos de clorofila.

Tswett viva e metaforicamente descreveu a sua descoberta: Como raios

luminosos num espectro, os vrios componentes de uma mistura de pigmentos

so separados numa coluna de carbonato de clcio, permitindo a respectiva

determinao qualitativa e quantitativa. Designo por cromatograma, a

preparao obtida como resultado deste processo e a correspondente

metodologia por mtodo cromatogrfico.52 Apesar do termo croma de seu

nome, a cromatografia no trata das cores dos componentes de uma amostra,

Introduo

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e pode ser conceituada como um mtodo fsico-qumico de separao, em que

os constituintes da amostra a serem separados so particionados entre duas

fases, uma estacionria (geralmente de grande rea) e a outra mvel (um fludo insolvel na fase estacionria), que percola pela primeira. A partir de ento, iniciou-se o desenvolvimento da tcnica analtica mais

poderosa em separao, quantificao, e identificao (quando acoplada espectrometria) dos dias atuais. conhecida como cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC), quando a fase mvel um lquido, e cromatografia gasosa (CG) quando a fase mvel um gs.53 A HPLC o tipo mais verstil e mais amplamente empregado de

cromatografia por eluio. Essa tcnica utilizada pelos qumicos para separar

e determinar espcies em uma grande variedade de materiais orgnicos,

inorgnicos e biolgicos.

Flavonides so compostos comumente analisados por HPLC, onde

colunas octadecilslica (C18) em fase reversa so as mais utilizadas. Outras tcnicas como a eletroforese capilar (EC) e a CG so tambm utilizadas para anlise de flavonides, no entanto, em determinaes via CG os compostos

devem possuir caractersticas adequadas tcnica, como volatilidade (ponto de ebulio at 300 oC), serem termicamente estveis, com massa molar menor que 500 g mol-1 no apresentando grupos carboxlicos, hidroxilas ou

aminas, pois estes so retidos irreversivelmente na coluna.43

A no ser que sejam derivatizados, no se pode incluir nessas condies compostos das classes dos sais orgnicos e inorgnicos,

aminocidos puros, polmeros, corantes salinos, compostos inicos e

termicamente instveis. A tcnica HPLC no necessita da volatilidade, mas da

Introduo

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solubilidade das amostras na fase mvel e da interao com a fase

estacionria.53

As amostras analisadas em HPLC juntamente com suas propriedades sofrem enorme influncia da fase estacionria, que participa diretamente da

separao dos componentes presentes. Esta influncia da fase mvel no

to marcante na CG, onde a separao ocorre devido a interaes entre as

espcies analisadas e a fase estacionria. A fase mvel neste caso atua mais

como veculo para o transporte da amostra pela coluna.53

A capacidade de anlise das tcnicas muito bem definida, tanto em

termos de compostos a serem analisados, quanto em limites de deteco e

quantificao. Pode-se trabalhar em HPLC com uma quantidade reduzida de

material, 1 a 20 L de amostra so suficientes para uma anlise, permite

separar rapidamente desde mg at centenas de mg de substncias com muito

boa resoluo. Na CG, pode-se analisar amostras de 1 L a 1 mL, permitindo

separar de ng at mg de substancias ou fraes. Muito rpida para pequenos

volumes com excelente resoluo.55

A preparao da amostra a ser injetada e determinada no cromatgrafo est diretamente ligada forma de extrao da mesma. Os mtodos de

extrao variam conforme a localizao da amostra na matriz e com a proposta

de utilizao da mesma. As tcnicas de extrao mais comumente utilizadas

so: extrao lquido-lquido, em fase slida (SPE), microextrao em fase slida (SPME), extrao com solventes orgnicos (de forma contnua ou descontnua), extrao por fluido supercrtico, sonicao, headspace entre outras.54

Objetivos

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2. Objetivos

Este trabalho tem por objetivos:

avaliar o potencial herbicida de extratos aquosos obtidos a partir de

folhas e sementes de feijo-de-porco (Canavalia ensiformis), aplicados em ps-emergncia sobre as plantas daninhas corda-de-viola (Ipomoea grandifolia) e trapoeraba (Commelina benghalensis), e sobre soja transgnica e soja convencional.

Identificar e quantificar compostos fenlicos e alcalides com carter

aleloptico presentes em amostras de folhas de feijo-de-porco utilizando cromatografia lquida de alta eficincia (HPLC).

Materiais e Mtodos

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3. Materiais e Mtodos

3.1. Materiais

3.1.1. Substncias padro de referencia, solventes e outros materiais

A Tabela IV apresenta os padres, solventes e outros materiais

utilizados no trabalho.

Tabela III: Padres, solventes e outros materiais utilizados neste trabalho

Padres Solventes e solues . cido clorognico (Fluka) . gua Milli-Q Sistema Millipore Waters . cido ferulico (Fluka) . Acetonitrila Mallinckrodt (grau HPLC) . cido p-ansico (Acros) . Metanol Tedia (grau HPLC) . Naringina (Fluka) . Hidrxido de sdio - Synth . Rutina (Acros) . Cloreto de potssio - Synth

Outros materiais

. Nistatina . Filtro seringa 0,45m (Minisart RC 15)

. Nitrognio ultra puro . Papel de filtro comum

. Solo . Seringa 50 L HPLC HAMILTON

3.1.2. Equipamentos

Rotaevaporador FISATOM Mod. 557. Ultrassom BRANSON 2510 Sistema HPLC Shimadzu Moinho de facas Willey Espectrofotmetro UV-Vis-Jasco V-630 pHmetro pH Meter Tec-2 TECNAL Balana analtica SCIENTECH AS 210 Balana Semi Analtica BG 1000 GEHAKA Estufa QUIMIS Dispositivo clevenger modificado Aquecedor fundo redondo 1000 mL

Materiais e Mtodos

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3.2. Mtodos

3.2.1. Local, cultura e condies gerais do experimento

Tanto as sementes quanto as folhas de feijo-de-porco utilizadas no trabalho foram coletadas de amostras cultivadas no Laboratrio de Qumica

Ambiental do Instituto de Qumica de So Carlos USP. As amostras foram

plantadas em caixas de 1 m3 utilizando-se solo retirado de rea para plantao

de soja, encontrado na regio da cidade de So Carlos, localizado latitude 22 0 41.60 S, longitude 47 59 7.30 W. Os dados da caracterizao fsico-

qumica do solo so apresentados nas Tabelas V e VI, demonstrando que o

solo classificado como argila siltosa marrom avermelhado escuro. Este solo

foi utilizado no plantio do feijo-de-porco, assim como para as amostras de plantas daninhas e de soja, onde foram aplicados os extratos avaliados.

Tabela IV: Caracterizao fsica do solo utilizado

Areia % Silte % Argila % Textura 22 34,9 43,1 Argilo-siltosa

Tabela V: Caracterizao qumica do solo utilizado pH

(CaCl2)a Carbono orgnico

(g.kg-1) Umidade

(%)b Teor de matria orgnica (%)c

CTC (cmolc kg-1)d

4,87 14,27 11,36 4,14 12,02 a: determinao da atividade hidrogeninica (25 mL de soluo de cloreto de clcio 0,01 mol L

-1 e 10 g

de amostra). b: em estufa a 65 e 110

oC.

c: calcinao em mufla a 500

oC por 4 h.

d: suspenso em

CH3COOH.

As amostras de folhas e sementes de feijo-de-porco foram coletadas no ms de janeiro de 2009, secas a 40 C em estufa com circulao de ar forada

Materiais e Mtodos

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e posterior triturao em moinho de facas, obtendo-se aproximadamente 450g

de folhas e 650g de sementes.

As sementes das plantas daninhas trapoeraba e corda-de-viola foram

adquiridas junto empresa Agrocosmos, localizada na cidade de Campinas, e as sementes de soja foram cedidas pela Embrapa soja (CNPSO), do Paran. O material foi acondicionado em recipientes plsticos aguardando o momento de

utilizao.

3.2.2 Obteno dos extratos aquosos de folhas e sementes de feijo-de-porco (Canavalia ensiformis)

Os extratos aquosos das folhas e sementes de feijo-de-porco foram obtidos seguindo o procedimento realizado por Santos48 e Mendona51,

colocando-se uma massa de material vegetal colhido (folhas e sementes) previamente seco e modo em gua sob agitao por um tempo determinado.

A uma massa de 300 g deste material, adicionou-se 1 L de gua (0,1% KCl) purificada por processo Milli-Q, deixando sob agitao por 24 horas. A seguir a soluo formada foi filtrada em tecido de algodo, adicionando-se

novamente 1 L de gua purificada, mantendo-se a agitao por mais 24 horas,

sempre a temperatura ambiente.

Finalizando as 48 horas, filtrou-se em tecido de algodo a ltima parcela

de material em agitao, somando com o filtrado anterior e resultando em um

volume lquido final de aproximadamente 1700 mL, descontadas as perdas por

evaporao e transferncia de recipiente. Esse volume foi levado a um

Materiais e Mtodos

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rotaevaporador (45 C) para retirada da gua, a fim de obter-se a massa total do extrato concentrado.

A massa restante obtida aps a concentrao em rotaevaporador, uma

massa gelatinosa, foi ento pesada e, a partir da foram preparados os extratos

aquosos adicionando-se novamente gua purificada, nos volumes necessrios

para obter-se as concentraes desejadas, 10, 25 e 50 g L-1. O volumes preparados foram acondicionados em recipiente de vidro mbar e guardados

em geladeira. As massas obtidas e os volumes preparados esto dispostos na

Tabela VII.

Tabela VI: Massas de extratos aquosos obtidas a partir de 300g de material vegetal previamente seco e modo

Material vegetal

Massa obtida (g)

Volumes H2O adicionados (mL)

Concentraes obtidas (gL-1)

Folhas 25,00 500,00 50,00 Sementes 20,00 400,00 50,00

A partir da concentrao 50 g L-1, foram preparadas as demais

concentraes mediante diluio. Um fato a se notar foi a diferena entre as

guas utilizadas na diluio. A princpio utilizou-se gua purificada por

processo Milli-Q na preparao do extrato para os primeiros ensaios, a seguir

utilizou-se gua diretamente da torneira, e uma terceira preparao foi feita

com a gua retirada da amostra no rotaevaporador.

No houve qualquer diferena nos resultados observados com relao

aos efeitos do extratos sobre as plantas daninhas. Qualquer que seja a gua utilizada para preparao da calda de aplicao, os resultados, os efeitos e o

tempo de ao do extrato so idnticos.

Materiais e Mtodos

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3.2.2.1. Terminologia utilizada

Foram aplicados os extratos da semente de feijo-de-porco em trs diferentes concentraes, 10, 25 e 50 g L-1 que foram identificadas como ES-

10, ES-25 e ES-50, em que E significa Extrato, S significa Semente, e os

valores 10, 25 e 50 correspondem s concentraes preparadas. A

terminologia aplicada aos extratos de folha de feijo-de-porco foi idntica, com S (semente) substitudo por F (folha).

Cada um dos extratos preparados nas diferentes concentraes foi

denominado de tratamento e a unidade experimental contendo as plantas

daninhas onde se aplicou o tratamento foi denominada de parcela.

3.2.3. Procedimento de Aplicao dos extratos

O experimento foi conduzido no perodo de maro a maio de 2009, no

Laboratrio de Qumica Ambiental (IQSC-USP), na cidade de So Carlos-SP. As aplicaes foram feitas por volta das 10 horas da manh, com temperaturas

variando entre 22 e 28 oC. Para a aplicao dos extratos, as sementes das

plantas daninhas e da soja foram plantadas em recipientes plsticos de 15 cm de dimetro.

Foram feitos vrios testes, sendo que o nmero de sementes e a

combinao entre elas em cada recipiente variou, objetivando-se avaliar a ao dos extratos tanto nas sementes das plantas isoladas quanto em conjunto com a soja.

Materiais e Mtodos

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O momento das aplicaes dos tratamentos deu-se a partir da

germinao das sementes das plantas daninhas, no 8 dia do plantio para

trapoeraba e a partir do 5 dia para corda-de-viola (Mendona, 2007).51 Foram escolhidos trs diferentes perodos de tempo para aplicao dos

diferentes tratamentos:

- 1 aplicao: logo aps sua germinao;

- 2 aplicao: 15 dias aps a germinao;

- 3 aplicao: 30 dias aps a germinao,

estando as plantas, nessas condies, em diferentes tamanhos e idades

em cada aplicao.

A ao dos tratamentos foi observada durante 3 a 5 dias at o mximo

de 7 dias. O comportamento e o desenvolvimento da planta sob ao dos

tratamentos foram observados durante todo o perodo das aplicaes, e foi

dada, tambm, ateno ao perodo de 10 dias aps a ltima aplicao, com

objetivo de observar uma eventual recuperao da planta. Os resultados foram comparados com uma amostra controle, preparada nas mesmas condies,

sem, no entanto receber os extratos.

As formas de aplicao de herbicidas em ensaios so normalmente a

utilizao de um pulverizador costal pressurizado, veculos tracionados ou

puxados por trator e at mesmo aeronaves, adequados ao trabalho,

dependendo do tamanho e condies da rea preparada. Neste experimento,

cada unidade experimental constou de um recipiente plstico de pequeno porte

(1 litro) preenchido com solo, no exigindo aparato sofisticado para a aplicao dos tratamentos. Para tanto, a aplicao foi realizada com auxlio de um

Materiais e Mtodos

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dispositivo tipo spray que lana o extrato lquido simulando um pulverizador,

sendo cada borrifada do dispositivo equivalente a um volume de 700 L.

3.2.4. Extrao das amostras e condies para anlise cromatogrfica

Foi feito um trabalho de identificao de compostos fenlicos em

amostras de folhas de feijo-de-porco utilizando-se a cromatografia lquida de alta eficincia. Esses compostos foram escolhidos a partir de estudos

realizados anteriormente por Santos48 e Mendona.51 Os componentes das

folhas de feijo-de-porco foram submetidas extrao por meio de dispositivo clevenger, ao qual se juntou 200 mL de gua purificada por processo Milli-Q e uma massa de 20 g de folhas secas e modas.

O conjunto foi mantido em aquecimento (100 C) por 4 horas, e aps este perodo o volume de gua contendo o material extrado das folhas, cerca

de 8 mL, foi separado e trabalhou-se na preparao das amostras para injeo no cromatgrafo. O volume foi filtrado em filtro seringa Minisart RC 15 com 45

m e dividido em duas partes, as quais foram concentradas em atmosfera de

nitrognio at que atingissem aproximadamente 1 mL cada. A partir disso, uma

amostra chamada amostra aquosa, foi mantida sem alterao, contendo

somente gua, e injetada diretamente no cromatgrafo. segunda parte da amostra chamada hidroalcolica, foi adicionado 1 mL de metanol, solvente com

o qual os compostos procurados tem afinidade, segundo Santos48 e

Mendona51. As amostras foram preparadas em triplicata, fazendo-se trs

injees para cada triplicata.

Materiais e Mtodos

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Figura I: Espectros na regio do UV-Vis para os compostos padro utilizados no trabalho

Tabela VII: Condies cromatogrficas empregadas nas anlises das amostras de folhas de feijo-de-porco

Coluna Comprimento (L) Dimetro Interno (di) Dimetro da Partcula (m)

STR ODS II 15,0 cm 4,6 mm 5,0 m

Fase Mvel A: HCOOH (2% em H2O, pH 3), B: ACN Fluxo da fase mvel 0,8 e 1 mL min-1 Temperatura da coluna 33 oC Volume Injetado (amostra) 20 L Detector UVVis Comprimentos de onda monitorados = 250, 265, 290 e 340 nm

Foram utilizadas substncias padro de referncia para estes

compostos, preparadas em vrias concentraes, e seus resultados

cromatogrficos comparados aos resultados das amostras extradas das folhas

de feijo-de-porco.

-0,5

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

190 240 290 340 390

cido_Clorognico

cido_Ferlico

cido_p-ansico

Naringina

Rutina

Materiais e Mtodos

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A anlise foi feita levando-se em considerao os comprimentos de onda

de absorbncia das substncias padro na regio do UV-Vis, e a Figura I

mostra os grficos espectrofotomtricos com uma varredura de comprimentos

de onda entre 200 e 400 nm para as substncias padro utilizados na

comparao com as amostras.

As condies cromatogrficas utilizadas na anlise das amostras so

apresentadas na Tabela VIII.

Resultados e Discusso

____________________________________________________________________________


4. Resultados e Discusso

4.1. Experimentos utilizando extratos de folhas e sementes de feijo-de-porco (Canavalia ensiformis)

Um dos objetivos deste trabalho foi comprovar a capacidade herbicida e seletividade de extratos preparados a partir de feijo-de-porco e aplicados em ps-emergncia sobre cultivares de soja e plantas daninhas. Nesta etapa, foram preparados extratos de diferentes concentraes a partir de folhas e

sementes de Feijo-de-Porco e os extratos aplicados em amostras de soja transgnica (cultivar CD 214RR), soja convencional (BRS-133 e MG/BR 46 Conquista) e as plantas daninhas trapoeraba (Commelina benghalensis) e corda-de-viola (Ipomoea grandifolia), sendo a aplicao realizada em diferentes volumes, concentraes e perodos de tempo aps a germinao das

sementes.

4.1.1. Avaliao dos efeitos observados

A avaliao utilizada para definir a toxicidade dos tratamentos foi

baseada numa escala conceitual alfabtica (Tabela IX) da Sociedade Brasileira Da Cincia Das Plantas Daninhas SBCPD56, que variou de a at e, com

descrio detalhada dos sintomas apresentados pelas plantas ao final da

aplicao dos tratamentos.


____________________________________________________________________________

Instituto de Qumica de So Carlos - USP 2011 *ASOCIACION LATINOAMERICANA DE MALEZAS ALAM. Recomendaciones sobre unificacin delos sistemas de evaluacin en ensayos de control de malezas. ALAM, v. 1, n. 1, p. 35-38, 1974. 43

Tabela VIII: Descrio dos conceitos aplicados as avaliaes de toxicidade SBCPD56

Conceito Descrio

a Sem injria ou efeito sobre a cultura.

b Injrias leves e/ou reduo de crescimento com rpida recuperao.

c Injrias moderadas e/ou redues de crescimento com lenta

recuperao ou definitivas.

d Injrias severas e/ou redues de crescimento no recuperveis e/ou redues de estande.

e Destruio completa da cultura ou somente algumas plantas vivas.

As avaliaes da porcentagem de controle realizadas aps a aplicao

dos extratos foram baseadas na escala de notas da Asociacion Latino

Americana de Malezas (ALAM), *(1974 apud CHIOVATO57, 2009, p. 35-38) descritas na Tabela X. Os resultados foram submetidos anlise de varincia

com aplicao do teste F a 1%.

Tabela IX: Escala de conceitos da ALAM* utilizada para avaliao da porcentagem de eficcia de controle de plantas daninhas

Porcentagem (%) Descrio do nvel de controle 0 40 Nenhum ou pobre 41 60 Regular 61 70 Suficiente 71 80 Bom 81 90 Muito bom

91 100 Excelente

4.1.2. Avaliao do volume timo para aplicao

Buscando-se um volume adequado para o controle das plantas

daninhas, os tratamentos foram preparados em 6 diferentes concentraes

previamente estabelecidas e aplicados de diferentes modos.


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Para incio, aplicou-se o volume de 700 L/dia/planta, at que o

desenvolvimento da planta fosse totalmente interrompido e a planta morresse.

Apenas 2 das 6 concentraes demonstraram resultado desejado, as concentraes 25 e 50 g L-1 do extrato da semente, que aps cinco aplicaes

seguidas, ou 3,5 mL/planta de extrato, comprovou a eficincia e a planta foi

totalmente controlada (morta), em todos os perodos de aplicao. O resultado foi novamente alcanado aps os mesmos cinco dias, aplicando-se o

tratamento em dose nica.

As Tabelas XI a XVI apresentam o resultado visual obtido aps a

aplicao dos tratamentos, assim como as variaes para volume e modo de

aplicao utilizados na escolha do volume a ser aplicado.

Os dados apresentados so relativos somente s concentraes 25 e 50

g L-1 devido ao interesse maior nas concentraes que conseguem interromper

o desenvolvimento das amostras de estudo. Ainda de acordo com as

observaes, nenhum volume abaixo de 3,5 mL/planta aplicado apresentou

essa capacidade em qualquer dos perodos escolhidos para aplicao, sendo

este o volume adequado para o controle.

Tabela X: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre corda-de-viola em dose nica

Tratamento Dose por planta Modo de aplicao

corda-de-viola poca de avaliao (dias) 0 15 30

ES-25 2800 L Dose nica d c c ES-50 2800 L Dose nica e e d ES-25 1500 L Dose nica b a b ES-50 1500 L Dose nica d c d ES-25 1000 L Dose nica a a a ES-50 1000 L Dose nica b b b ES-25 700 L Dose nica a a a ES-50 700 L Dose nica b a b ES-25 500 L Dose nica a a a ES-50 500 L Dose nica a a a


____________________________________________________________________________


Tabela XI: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre corda-de-viola em duas etapas, sendo a 2 aplicada 3 dias aps a 1

Tratamento Dose por Planta Modo de aplicao

corda-de-viola poca de avaliao (dias)

0 15 30 ES-25 2800 L

Duas aplicaes, sendo a 2 aplicada 3 dias aps a

1

d d c ES-50 2800 L e e d ES-25 1500 L c b c ES-50 1500 L d c d ES-25 1000 L a a a ES-50 1000 L b b b ES-25 700 L a a a ES-50 700 L b a a ES-25 500 L a a a ES-50 500 L a a a

Tabela XII: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre corda-de-viola em 5 doses



ES-25 2800 L

5 doses

d d c ES-50 2800 L e e d ES-25 1500 L c b c ES-50 1500 L d c d ES-25 1000 L a a a ES-50 1000 L b b b ES-25 700 L a a a ES-50 700 L b a a ES-25 500 L a a a ES-50 500 L a a a

Tabela XIII: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre trapoeraba em dose nica


trapoeraba poca de avaliao (dias) 0 15 30

ES-25 2800 L Dose nica c b c ES-50 2800 L Dose nica d d c ES-25 1500 L Dose nica b a b ES-50 1500 L Dose nica c b c ES-25 1000 L Dose nica a a a ES-50 1000 L Dose nica b b b ES-25 700 L Dose nica a a a ES-50 700 L Dose nica b a b ES-25 500 L Dose nica a a a ES-50 500 L Dose nica a a a


____________________________________________________________________________


Tabela XIV: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre trapoeraba em duas etapas, sendo a 2 aplicada 3 dias aps a 1


trapoeraba poca de avaliao (dias)

0 15 30 ES-25 2800 L

Duas aplicaes, sendo a 2 aplicada 3 dias aps a

1

d d d ES-50 2800 L e e e ES-25 1500 L c c c ES-50 1500 L d c d ES-25 1000 L a a a ES-50 1000 L b b b ES-25 700 L a a a ES-50 700 L b b b ES-25 500 L a a a ES-50 500 L a a a

Tabela XV: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para os diferentes volumes aplicados sobre trapoeraba em 5 doses



ES-25 2800 L

5 doses

d d d ES-50 2800 L e e e ES-25 1500 L c c c ES-50 1500 L d c d ES-25 1000 L a a a ES-50 1000 L b b b ES-25 700 L a a a ES-50 700 L b b b ES-25 500 L a a a ES-50 500 L a a a

Aps estes testes, verificou-se que a variao no modo de aplicao no

fator relevante que influencie o resultado da ao dos tratamentos sobre os

alvos, e que o limite mnimo de volume a ser aplicado para obteno do

controle desejado de 3,5 mL. Assim, fica claro que os tratamentos com concentraes 25 e 50 g L-1 so os que tem maior poder de controle sobre o

desenvolvimento das plantas em estudo, sendo o volume timo de aplicao

3,5 mL/planta, e a aplicao em dose nica a recomendada.


____________________________________________________________________________


4.2. Avaliao dos dados obtidos aps aplicao dos extratos

4.2.1. Avaliao dos tratamentos aplicados sobre corda-de-viola

Antes de colocar as sementes nos recipientes onde seriam aplicados os

tratamentos, as mesmas foram acondicionadas em placa de Petri com papel de

filtro e Nistatina (para evitar proliferao de fungos) por alguns dias, at o inicio da germinao, sendo a seguir transferidas para os recipientes que formariam

as parcelas e o controle (branco). Os tratamentos foram preparados alguns dias antes da aplicao, e nas pocas pr-definidas foram aplicados de acordo

com os volumes e os modos de aplicao estabelecidos. Os resultados das

avaliaes de toxicidade (segundo SBCPD)56 e porcentagem de controle (segundo ALAM)* realizadas aps a aplicao dos extratos esto dispostos nas Tabelas XVII e XVIII.

Tabela XVI: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, dos efeitos dos tratamentos sobre corda-de-viola



EF-10 3500 L Dose nica a a a 5 doses (700L) a a a EF-25 3500 L Dose nica a a a 5 doses (700L) a a a EF-50 3500 L Dose nica b b b 5 doses (700L) b b b ES-10 3500 L Dose nica b b b 5 doses (700L) b b b ES-25 3500 L Dose nica d c d 5 doses (700L) d c d ES-50 3500 L Dose nica e e e 5 doses (700L) e e e


____________________________________________________________________________


Os dados da Tabela XVII demonstram que tratamentos ES-25 e ES-50

preparados com a semente de feijo-de-porco so os mais eficientes na interrupo do desenvolvimento das plantas daninhas. Os dados da Tabela

XVIII trazem as porcentagens de controle dos tratamentos, corroborando com

os dados da tabela anterior, que demonstram o poder de controle dos

tratamentos preparados a partir de sementes. Os tratamentos preparados a

partir das folhas apresentaram resultados de controle parcial sobre o alvo, no

interrompendo seu desenvolvimento.

Os dados foram submetidos anlise de varincia e aplicado o teste F a

1% de probabilidade. As mdias seguidas pela mesma letra no diferem

significativamente entre si, sendo o caso dos tratamentos EF-10, EF-25, EF-50

e ES-10, que demonstraram semelhana em todos os aspectos observados,

inclusive anlise visual de controle sobre o alvo.

Tabela XVII: Avaliao segundo ALAM, da porcentagem de controle dos tratamentos sobre corda-de-viola



EF-10 3500 L Dose nica 10a 5a 10a

5 doses (700L) 10a 5a 10a EF-25 3500 L Dose nica 15

a 10a 15a


a 20a 20a

5 doses (700L) 30a 20a 25a ES-10 3500 L Dose nica 20

a 15a 20a


b 85b 95b

5 doses (700L) 95b 90b 95b ES-50 3500 L Dose nica 100

b 95b 100b

5 doses (700L) 100b 100b 100b

ab: Mdias seguidas pela mesma letra na colunas no diferem significativamente entre si pelo teste

F a 1% de probabilidade.


____________________________________________________________________________


A aplicao em 0 (zero) dias foi iniciada no momento da germinao das sementes, antes que a plntula despontasse no solo. Verificou-se que a

semente germinou e a plntula conseguiu crescer (ou desenvolver-se com alguma dificuldade) aps a aplicao dos tratamentos EF-10, EF-25, EF-50, e tambm aps aplicao do tratamento ES-10. Os tratamentos ES-25 e ES-50

foram os nicos a apresentar capacidade de controle total sobre as plantas

daninhas no volume aplicado e nos trs estdios de desenvolvimento da

mesma. Nessas condies, as sementes germinadas no se desenvolveram,

no havendo crescimento da planta jovem, que secou e morreu. As aplicaes dos tratamentos foram realizadas de forma que os mesmos atingissem a planta

em toda sua extenso, ou a maior rea possvel, via dispositivo aplicador

expelindo um jato spray, espalhando eficientemente o tratamento por toda a rea onde a planta se encontra.

O tratamento ES-50 o mais eficiente no controle de corda-de-viola,

seus efeitos comeam a aparecer 24 h aps a aplicao, e os sintomas se

iniciam com uma leve deformao nas bordas laterais das folhas. Com 48 h,

todas as folhas j apresentam sinais de deformao nas bordas, e a folhas menores j comeam a murchar. Com o passar dos dias, os sinais se tornam mais e mais evidentes, as folhas comeam a mudar de cor, trocando o verde

por marrom, num processo muito rpido em que sua estrutura se torna murcha

e seca. No quarto dia aps a aplicao, as plantas j no tm mais folhas verdes, estando deformadas e marrons, e apresentando um aspecto de

doentes ou completamente mortas No quinto dia aps a aplicao, as folhas da

planta esto totalmente secas, o caule torna-se duro e seco, a planta j no cresce e no h possibilidade de recuperao.


____________________________________________________________________________


4.2.2. Avaliao dos tratamentos aplicados sobre trapoeraba

As sementes de Trapoeraba foram germinadas em placa de Petri, e a

seguir transferidas para as parcelas, sendo que necessitam de um tempo maior

para germinarem, em relao corda-de-viola. A partir da germinao, o

procedimento seguido foi idntico ao utilizado para Corda-de-Viola. As Tabelas

XIX e XX apresentam os resultados das avaliaes visuais (segundo SBCPD)56 e porcentagem de controle (segundo ALAM) aps aplicao dos tratamentos, de acordo com os modos e volumes de aplicao.

Tabela XVIII: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, dos efeitos dos tratamentos sobre trapoeraba

Tratamento Dose por planta Modo de

Aplicao trapoeraba

poca de avaliao (dias) 0 15 30

EF-10 3500 L Dose nica a a a 5 doses (700L) a a a EF-25 3500 L Dose nica b a a 5 doses (700L) b a a EF-50 3500 L Dose nica c b b 5 doses (700L) c b b ES-10 3500 L Dose nica b b a 5 doses (700L) b b a ES-25 3500 L Dose nica e e d 5 doses (700L) e e d ES-50 3500 L Dose nica e e e 5 doses (700L) e e e

A Tabela XIX apresenta os resultados das avaliaes visuais (segundo SBCPD)56 aps aplicao dos tratamentos, de acordo com os modos e volumes de aplicao. Os resultados apresentados para os ensaios realizados

com trapoeraba demonstram que no houve diferena significativa dos efeitos

obtidos para corda-de-viola, de acordo com a avaliao visual e que mais uma


____________________________________________________________________________


vez os tratamentos ES-25 e ES-50 so os mais eficientes no controle da planta

daninha.

No entanto, a avaliao visual no demonstra diferena entre os modos

de aplicao, no sendo os mesmos um fator importante no resultado final. A

Tabela XX traz as porcentagens de controle dos tratamentos, demonstrando

que, de acordo com as observaes visuais, apenas os tratamentos ES-25 e

ES-50 apresentam poder de controle total sobre o alvo.

Tabela XIX: Avaliao segundo ALAM, da porcentagem de controle dos tratamentos sobre trapoeraba



EF-10 3500 L Dose nica 10a 5a 10a


a 10a 15a


a 20a 20a


a 15a 20a


b 80b 95b

5 doses (700L) 95b 90b 95b ES-50 3500 L Dose nica 100

b 95b 100b

5 doses (700L) 100b 100b 100b

ab:Mdias seguidas pela mesma letra nas colunas no diferem significativamente entre si pelo teste

F a 1% de probabilidade.

As aplicaes seguiram o mesmo procedimento, sendo 0 (zero) dias iniciado no momento da germinao das sementes, antes que a plntula

despontasse no solo. O resultado demonstrou que tanto trapoeraba quanto

corda-de-viola tiveram ou sofreram os mesmos efeitos quando submetidas aos

tratamentos. A semente germinou e a plntula conseguiu crescer (ou desenvolveu-se com alguma dificuldade) aps a aplicao dos tratamentos EF-


____________________________________________________________________________


10, EF-25, EF-50 e tambm ES-10, sendo igualmente ineficientes para o

controle total da Trapoeraba nos perodos e volumes.aplicados.

Os tratamentos ES-25 e ES-50 foram os nicos a apresentar eficincia

para controlar a Trapoeraba no volume aplicado e nos trs estdios de

desenvolvimento da mesma. O tratamento ES-50 o mais eficiente no controle

da planta daninha e seus efeitos comeam a aparecer 24 h aps a aplicao.

Diferentemente da corda-de-viola, as folhas verdadeiras da trapoeraba

aparecem mais tarde, por volta dos 20 dias aps a geminao, no entanto os

sintomas apresentados pela planta so idnticos. Iniciam com uma leve

deformao nas bordas laterais das folhas, que vai aumentando com o passar

dos dias, murchando a folha que perde a colorao verde, tornando-se

amarelada e marrom. Com 48 h, todas as folhas j apresentam sinais de deformao nas bordas, e a folhas menores j comeam a murchar. Os sinais se tornam mais e mais evidentes, o processo de definhamento muito rpido e

a planta apresenta um aspecto de doente ou morta.

No quinto dia aps a aplicao, as folhas da planta esto totalmente

secas e caindo, o caule se torna duro e seco, a planta j no cresce e no h possibilidade de recuperao.

4.2.3. Avaliao da seletividade do tratamento ES-50 aplicado sobre parcelas

constitudas pelas plantas daninhas e soja

Para avaliao da seletividade utilizou-se o tratamento ES-50, que foi

aplicado sobre parcelas contendo as plantas daninhas utilizadas no


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experimento e alguns cultivares de soja transgnica e soja convencional. As parcelas continham:

- Trapoeraba + Corda-de-Viola + Soja transgnica (CD 214-RR); - Trapoeraba + Corda-de-Viola + Soja convencional (BRS 133); - Trapoeraba + Corda-de-Viola + Soja convencional (MG/BR 46). O tratamento ES-50 foi o escolhido para essa avaliao devido sua

eficincia no controle total das plantas daninhas; foi aplicado o volume de 3,5

mL/planta em dois diferentes modos de aplicao e os resultados foram

observados durante o perodo que foi desde a primeira aplicao at 10 dias

aps a ltima aplicao. Na Tabela XXI esto dispostos os resultados da

avaliao visual (segundo SBCPD) aps a aplicao do tratamento seguindo os modos e volume de aplicao.

Tabela XX: Resultado das avaliaes visuais segundo SBCPD56, para o tratamento ES-50 sobre plantas daninhas e cultivares de soja

Alvos Dose por planta Modo de aplicao Conceito (30 dias) Trapoeraba 3500 L 5 doses (700L) e Dose nica Corda-de-Viola 3500 L 5 doses (700L) e Dose nica Soja (CD 214-RR) 3500 L 5 doses (700L) a* Dose nica Soja (BRS 133) 3500 L 5 doses (700L) a* Dose nica Soj

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