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BioinformaticaBioinformaticaCorso di Laurea Specialistica in Biologia Cellulare e MolecolareCorso di Laurea Specialistica in Biologia Cellulare e Molecolare
Analisi di Dati di Analisi di Dati di EspressioneEspressione
6/5/20086/5/2008
Stefano Forte
Orario di ricevimentoOrario di ricevimento
• Stefano Forte
Lunedi e Mercoledi 10.00 – 11.00Ufficio 34 dipartimento di Matematica e Informatica (Sopra box bidelli)Tel. 095 7383082email: [email protected]
Le immaginiLe immagini
-Acquisizione di 2 immagini (una per ogni lunghezza d’onda/dye)
-In fase di acquisizione si cerca di bilanciare i due canali.
-Identificazione degli spots (corrispondente ad matrice testuale 2d tramite una griglia di spots)
-Calcolo e sottrazione del background
-Flaging automatico e manuale delle immagini
-Produzione dei log ratios
Log Sample1
Sample2
Preprocessing dei DatiPreprocessing dei Dati
• Dai raw data dobbiamo estrarre l’informazione. Per evitare di estrarre informazioni sbagliate dobbiamo cercare di eliminare l’influenza dell’errore sperimentale
Nella cellula (condizione reale)
sample1 sample2
Gene A 30 30
Gene B
Gene C
10
50
30
20
Nei risultati (condizione dedotta)
sample1 sample2
Gene A 30 45
Gene B
Gene C
10
50
45
30
=
-
+
-
-
+
Il sample2 viene sovrastimato di 1,5 volte. Per riportare i valori alla normalità basta dividere ogni valore per 1,5NORMALIZZAZIONE
Preprocessing dei DatiPreprocessing dei Dati
• Normalizzazione: processing dei dati all’interno della stessa ibridazione.
• Standardizzazione (o Normalizzazione tra gli array): processing dei di tutti gli esperimenti (rende i dati paragonabili tra loro e quindi utilizzabili nello stesso processo di analisi)
NormalizzazioneNormalizzazione
Perché normalizzare?
R
G
Ibridazione dello stesso campione su due canali
L’allontanamento dalla linea x=y è dovuto a errori random e sistematici
NormalizzazioneNormalizzazione
Normalizzare i dati provenienti da una ibridazione self-to-self è banale, ma come ci si comporta con i dati di un esperimento in cui ogni canale (od ogni array nel caso della standardizzazione) rappresenta una diversa sorgente?
Selezione dei geni per BIAS correction
TUTTI I GENI Assunzione: la maggior parte dei geni sono espressi in maniera uguale nelle cellule paragonate, mentre solo una piccola parte dei geni è differenzialmente espressa (<20%).
Geni Housekeeping Assunzione: sulla base della conoscenza biologica un set di geni può essere considerato come egualmente espresso nei campioni comparati.
Spiked-in controls Alcuni controlli vengono immessi nei campioni a concentrazioni note per tarare il sistema
Invariant set Un set di geni viene individuato come costante senza nessuna conoscenza biologica di partenza.
Metodi di normalizzazioneMetodi di normalizzazione
1) Normalizzazione globale (SCALING)
Un singolo fattore di normalizzazione (k) è calcolato per il bilanciamento dei chip o dei canali.
Xinorm = k*Xi
In questo modo si equalizza la media delle intensità
2) Normalizzazione intensità dipendente (Lowess o Loess - Locally Weighted Linear Regression)
Invece di un singolo fattore si utilizza una funzione che compensa i bias intesità-dipendenti.
I vantaggi di LowessI vantaggi di Lowess
La normalizzazione globale è inefficace nella correzione degli errori intesità-dipendenti. Il grafico evidenzia come l’utilizzo di un singolo parametro non è sufficiente allo scopo.
A
M = log(Cy3/Cy5)
Low intensities
M<0: Cy3<Cy5
High intensities
M>0: Cy3>Cy5
Software ToolsSoftware Tools
• Bioconductor:pacchetto di applicazioni per il preprocessing e l’analisi dei dati microarray per l’ambiente statistico open source R
• BRB:plugin per Excel. Interfaccia intuitiva, facile da usare ma meno potente e customizzabile.
Analisi dei datiAnalisi dei dati
Cosa vogliamo sapere dai nostri dati?
1) Quali geni sono responsabili delle differenze tra la condizione A e la condizione B (geni differenzialmente espressi)
2) Quali geni si muovono insieme, nella modalità di espressione, all’interno di uno stesso campione (geni coespressi)
3) Esiste un “classificatore” che ci permette di riconoscere su base molecolare una data condizione?
Analisi dei datiAnalisi dei dati
Da cosa partiamo?
ClusteringClusteringMetodiche per il raggruppamento dei geni (e dei campioni) che mostrano
un comportamento simile dal punto di vista dell’espressione. Il Clustering gerarchico raggruppa i geni ed i campioni in gruppi via via sempre più stretti contenenti geni via via sempre più simili nell’espressione. E’ possibile quindi identificare una gerarchia ed un grado di “parentela” tra i diversi gruppi ottenuti.
ClusteringClustering
• Due geni che mostrano un pattern di espressione genica simile si possono considerare coespressi.
• Ci sono evidenze che molti geni funzionalmente correlati sono coespressi. Ad esempio geni codificanti per elementi di un complesso proteico solitamente hanno simili pattern di espressione.
• Geni coespressi possono dare informazioni sui meccanismi regolatori. Se un sistema regolativo controlla due o più geni questi risulteranno essere coespressi.
ClusteringClustering
Una situazione ideale
La matrice di espressione è una rappresentazione dei dati da un certo numero di esperimenti di miroarray.
Each element is a log ratio(usually log 2 (Cy5 / Cy3) )
Red indicates a positive log ratio, i.e, Cy5 > Cy3
Green indicates anegative log ratio , i.e.,Cy5 < Cy3
Black indicates a logratio of zero, i. e., Cy5 and Cy3 are very close in value
Exp 1 Exp 2 Exp 3 Exp 4 Exp 5 Exp 6
Gene 1
Gene 2
Gene 3
Gene 4
Gene 5
Gene 6
Gray indicates missing data
Expression VectorsExpression Vectors
- Il vettore di epressione genicaè una lista che riporta tutti i valori di espressione di un dato gene su un set di esperimenti (praticamente una riga della matrice di espressione).
I vettori di espressione come punti I vettori di espressione come punti nello “spazio di espressione”nello “spazio di espressione”
Experiment 1
Experiment 2
Experiment 3
Similar Expression
-0.8
-0.60.9 1.2
-0.3
1.3
-0.7Exp 1 Exp 2 Exp 3
G1G2
G3
G4
G5
-0.4-0.4
-0.8-0.8
-0.7
1.3 0.9 -0.6
Distanza e similarità Distanza e similarità
-the ability to calculate a distance (or similarity, it’s inverse) between two expression vectors is fundamental to clustering algorithms
-distance between vectors is the basis upon which decisions are made when grouping similar patterns of expression
-selection of a distance metric defines the concept of distance
La distanza è unamisura (inversa) della similarità tra geni.
Exp 1 Exp 2 Exp 3 Exp 4 Exp 5 Exp 6
Gene A
Gene B
x1A x2A x3A x4A x5A x6A
x1B x2B x3B x4B x5B x6B
Some distances: (MeV provides 11 metrics)
1. Euclidean: i = 1 (xiA - xiB)26
2. Manhattan: i = 1 |xiA – xiB|6
3. Pearson correlation
p0
p1
Clustering gerarchico (HCL)Clustering gerarchico (HCL)
HCL is an agglomerative clustering method which joins similar genes into groups. The iterative process continues with the joining of resulting groups based on their similarity until all groups are connected in a hierarchical tree.
(HCL-1)
Hierarchical ClusteringHierarchical Clustering
g8g1 g2 g3 g4 g5 g6 g7
g7g1 g8 g2 g3 g4 g5 g6
g7g1 g8 g4 g2 g3 g5 g6
g1 is most like g8
g4 is most like {g1, g8}
(HCL-2)
g7g1 g8 g4 g2 g3 g5 g6
g6g1 g8 g4 g2 g3 g5 g7
g6g1 g8 g4 g5 g7 g2 g3
Hierarchical ClusteringHierarchical Clustering
g5 is most like g7
{g5,g7} is most like {g1, g4, g8}
(HCL-3)
g6g1 g8 g4 g5 g7 g2 g3
Hierarchical TreeHierarchical Tree
(HCL-4)
Hierarchical ClusteringHierarchical Clustering
Durante la decisione della gerarchia devono essere prese delle decisioni in merito ai clusters da collegare tra di loro.Calcolare la distanza tra due punti è facile (ad esempio usando la distanza euclidea), ma come calcolo la distanza tra due clusters? O tra un punto ed un cluster?Le regole che governano questi problemi sono i metodi di linkage.
(HCL-5)
Agglomerative Linkage MethodsAgglomerative Linkage Methods
Linkage methods are rules or metrics that return a value that can be used to determine which elements (clusters) should be linked.
Three linkage methods that are commonly used are:
• Single Linkage• Average Linkage• Complete Linkage
(HCL-6)
Cluster-to-cluster distance is defined as the minimum distance between members of one cluster and members of the another cluster. Single linkage tends to create ‘elongated’ clusters with individual genes chained onto clusters.
DAB = min ( d(ui, vj) )
where u A and v Bfor all i = 1 to NA and j = 1 to NB
Single LinkageSingle Linkage
(HCL-7)
DAB
Cluster-to-cluster distance is defined as the average distance between all members of one cluster and all members of another cluster. Average linkage has a slight tendency to produce clusters of similar variance.
DAB = 1/(NANB) ( d(ui, vj) )
where u A and v Bfor all i = 1 to NA and j = 1 to NB
Average LinkageAverage Linkage
(HCL-8)
DAB
Cluster-to-cluster distance is defined as the maximum distance between members of one cluster and members of the another cluster. Complete linkage tends to create clusters of similar size and variability.
DAB = max ( d(ui, vj) )
where u A and v Bfor all i = 1 to NA and j = 1 to NB
Complete LinkageComplete Linkage
(HCL-9)
DAB
Comparison of Linkage MethodsComparison of Linkage Methods
Single Ave. Complete(HCL-10)
Il K-means è un algoritmo non gerarchico di clustering.Raggruppa gli elementi in clusters omogenei ma non genera delle relazioni di parentela tra gli elementi o tra i clusters.
Questo algoritmo ha bisogno di avere una conosceza a-priori del numero di clusters da produrre.
K-Means / K-Medians Clustering (KMC)– 1K-Means / K-Medians Clustering (KMC)– 1
1. Specificare il numero dei clusters, ad esempio 5.
2. Assegnare, in maniera casuale, ogni punto ad un cluster.
G1 G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 G9 G10 G11 G12 G13
K-Means / K-Medians Clustering (KMC)– 1K-Means / K-Medians Clustering (KMC)– 1
K-Means Clustering – 2K-Means Clustering – 2
3. Calcolare media o mediana degli elementi in ogni cluster.
4. Riassegnare gli elementi a cluster in modo tale che ogni elemento venga assegnato al cluster il cui valore medio o mediano è il più vicino al valore di quel elemento.
G1 G2G3 G4 G5G6
G7
G8 G9G10
G11
G12
G13
5. Ripetere i passi 3 e 4 finche i geni si stabilizzano (non cambiano più cluster da una iterazione ad un’altra) o finchè si raggiunge un numero massimo di iterazioni stabilito dall’utente.
K-Means / K-Medians is most useful when the user has an a-priori hypothesis about the number of clusters the genes should group into.