Biológiai diverzitásMetagenom analizis

Biodiverzitás• Bár a mikrobák központi szerepet játszanak a biotikus

folyamatokban, nagyon keveset tudunk valós sokféleségükről

• Mikrobiális diverzitás, katabolikus gének

• Szaporítható/nem szaporítható mikroorganizmusok

• Környezeti metagenom könyvtár

A Földön előforduló fajok becsült száma

• Jelenleg kb 5000 prokarióta fajt ismerünk, de a becsült számuk több, mint 1 000 000!

• A molekuláris technikák fejlődésével új lehetőségek

• A laborban nem szaporítható prokarióták genetikai és biotechnológiai jelentősége hatalmas

Ism

ert,

leír

t fa

jok

szám

a (x

1000

)

becs

ült

fajo

k sz

áma

(x10

00)

% is

mer

t faj

ok

A Földön előforduló fajok becsült száma

A mikroszkópikusan detektálható fajokból a szaporíthatók aránya

élőhely % szaporítható

Miért fontos, hogy megismerjük a lehető legtöbb mikróba fajt?

• Alapvető szerepet játszottak a bioszféra kialakulásában• Meglepően nagy fiziológiai, biokémiai változatosságot mutatnak• Képesek extrém körülmények között élni• Tanulmányok arra világítanak rá, hogy a prokarióták száma

jelentősen meghaladja az eukarióta sejtszámot, sőt egyes becslések szerint a prokarióta összbiomassza is meghaladja az eukarióta összbiomassza tömegét

• A fentiek ellenére kevés ismerettel rendelkezünk, mivel az össz prokarióta féleségnek csak kis %-át tudjuk laboratóriumi körülmények között szaporítani, így érthetően nem is lehet elegendő információt szerezni a fajok többségéről

• A különböző élőhelyek mikrobiális sokféleségét akkor tudjuk analizálni, ha a teljes genetikai anyagot kinyerjük a vizsgálandó élőhelyről gyűjtött mintából (metagenom)

Metagenomika

• A genomika egy szervezet teljes genetikai állományát határozza meg, a metagenomika pedig egy adott (mikro-) környezetben élő közösség teljes genetikai anyagát

• Hagyományosan laborban szaporított, tiszta kultúrákat vizsg, viszont sok mikroorganizmus nem szaporítható, ami gátat szab a megismerésnek. A metagenomika a közösség összetételén túl a funkcionális (metabolikus) potenciáljára is szolgáltat információt

• A legvizsgáltabb/legkedveltebb a tengeri környezet. Emellett a talaj metagenom a legfontosabb diverzitás szempontjából

Talaj metagenom

• A talaj nagyon összetett élőhely

• A mikrobiális heterogenitás a talajban felülmúl minden más környezetet: kimutatták, hogy 1 g talaj több ezer faj akár 10 milliárd egyedét is tartalmazhatja!

• A mikrokörnyezet jelentősen befolyásolja a sejtek szaporodását, aktivitását, így két egészen közeli mikrokörnyezet is nagyon eltérhet egymástól. Ez a heterogenitás eredményezi a mikrobiális élőhelyek nagy változatosságát és a mikrobák sokféleségét

• Jogos tehát a várakozás, hogy a talaj metagenom genetikai sokfélesége még tartogat meglepetéseket, és gazdag forrása lehet ipari jelentőségű enzimek, bioaktív anyagok felfedezésének

DNS kinyerése a környezeti mintából

• Molekuláris ökológiai tanulmányok szerint a standard kultivációs technikákkal a mikrobiális diverzitás max 1%-a nyerhető vissza, noha pl. talajban akár több, mint 10 000 különböző faj is jelen lehet (Komoly problémát jelent, hogy az in situ megfigyelhető mikróba sokféleség, és a szaporító tápon in vitro számolható telepszámok (számlálási anomáliák) között eltérés mutatkozik)

• Pace és mtsai úttörő szerepet játszottak a metagenom extrakciója környezeti mintából kifejlesztésében. (Az extrahált DNS egyveleget részlegesen emésztették, a fragmenteket vektorba ligálták, E. coli-ba klónozták, és az rRNS-ket kódoló géneket vizsg, mely segíts-vel nem–szaporítható egyedek létezéséről is nyerünk információt)

• A talaj a legjobb környezet a mikrobiális sokféleség vizsgálatára, de komoly hátránya, hogy a DNS kinyerése során huminsavak is extrahálódnak, melyek gátolják a molekuláris munkákat

• A DNS kinyerésére mátrix gazdag (talaj, üledék) környezeti mintából kétféle extrakciós módszert dolgoztak ki:

1. A sejtek direkt lizise, és ezáltal a DNS közvetlen kinyerése - a környezeti mintától nem választjuk el a sejteket. Sok DNS-t nyerünk, egyszerű extrakciós eljárás

2. Indirekt módszer: először elválasztjuk a környező anyagoktól a sejteket, és utána extaháljuk a DNS-t a tisztított (utána akár laborban felszaporított) sejteketből - tiszta, nagyon jó integritású DNS

• Attól függően, hogy mi a célunk használhatjuk a két módszer egyikét, pl. egy egyedi enzimet kódoló gén kinyeréséhez alkalmazható az első megoldás, míg multifunkciós enzimeket kódoló géncsoportok izolálásához célszerű a második módszert használni

DNS kinyerése a környezeti mintából

Mikrobiális diverzitás

bioszféra

izoláció

Metagenom izoláció

Transzformáció gazdasejtbe

Transzformáció gazdasejtbe

Vektorba ligálás

DNS izoláció

Vektorba ligálás

Rekombináns enzimek

Enzim karakterizáció

SzaporításKarakterizációfermentáció

DNS extrakciós módszerek összehasonlítása

Indirekt módszer (közvetett) • először elválasztjuk a környezeti

minta anyagaitól a sejteket (ezután gyakran felszaporítjuk), és utána extraháljuk a DNS-t

• a jelenlévő mikróbáknak csak egy részét lehet szelektálni és szaporítani tiszta kultúrában. A szaporítható mikroorg-k jellemezhetők, fermentálhatók

• Tiszta, nagyon jó integritású DNS nyerhető

• Olyan talajminták esetén előnyös, ahol nagy mennyiségű olyan anyagot találunk, amelyek zavarják a DNS izolációt (pl. huminsavak)

• Nagyobb DNS fragmentek,nagy-inszert könyvtár készítésére alkalmas

Közvetlen lizis• Az adott környezet összes mikroorg-

nak teljes genomját izoláljuk és klónozzuk egy gazdába (pl. E. coli) a további vizsgálatokhoz

• A sejteket nem választjuk el a környezeti mintából, lízisüket a DNS tisztítása követi

• A sejtek lizisére magas hőmér-sékletet, erős detergenseket, mechanikai törést vagy fagyasztás-olvasztás módszert alkalmazhatunk

• Jobban reprezentálja a minta valós mikrobiális sokféleségét

• Leggyakrabban ezt használják, mivel sokféle talajra alkalmaz-ható, kevésbé laborigényes, több DNS nyerhető

• Hátránya: kisebb DNS fragmentek keletkeznek

• A genetikai anyag önmagában nem elegendő a mikrobiális környezet megismeréséhez, minket elsősorban az érdekel, hogy

– mit tudnak

– milyen fontos tulajdonságot hordoznak számunkra és a környezet számára

– milyen funkcionális fehérjéik, egyéb molekuláik vannak

– ezen tulajdonságokhoz, fehérjékhez, egyéb sejt által termelt anyagokhoz hogyan juthatunk hozzá

DNS kinyerése a környezeti mintából

Metagenom analizis

• Az a felismerés, hogy a környezetben élő mikroorganizmusok többsége nem szaporítható standard módszerekkel, ösztönzőleg hatott a metagenomika fejlődésére, melyet úgy definiálhatunk, hogy a mikroorganizmusok szaporítása nélküli genom analizis

• Két típusa:– Funkció alapú analizis – a kifejeződő tulajdonságokat

keressük, vizsgáljuk– Szekvencia alapú analizis – a könyvtárat egyedi szekvenciák

keresésével hozzák létre

Genomi DNS extrakció környezeti mintából

Szekvencia alapú analízis

Vektorba ligált DNS transzformáció E. coli sejtekbe

Genomi DNS-ek

A DNS-t hordozó vektor a ligálás

után

Hasított vektor

Funkció-alapú analízis

Metagenom analízis

• Amikor egy környezeti mintából kifejezetten egy bizonyos funkciót szeretnénk megtalálni, egy bizonyos enzim aktivitását kimutatni, nyomon követni több megközelítés lehetséges:– Bróm jelölt uracil használata, mely a metabolikusan aktív sejtek

RNS-eibe épül be– Izotóp jelölt szubsztrátot alkalmazunk, mely a metabolikusan aktív

sejtek szervesanyagaiban jelenik meg– A környezeti mintából kinyert DNS szakaszokat vektorba építve,

pl. E. coli sejteket használva, azok a sejtek tudnak szaporodni, melyek a szubsztrát bontásáért felelős géneket/ tulajdonságokat hordozzák

– Számos egyéb lehetőség is létezik

Metagenom analizis

Specifikus (egy bizonyos funkcióért felelős!) DNS szakaszok dúsítása környezeti mintából

Transzkripció/transzláció(előző ábra a, és b, példájához)

Mikroorganizmusok és lebontási útvonalak

tervezése hatékonyabb biodegradáció elérése

céljából

Miért keresünk új megoldásokat?

• Mindamellett, hogy számos természetesen előforduló mikroorg-al találkozunk, melyek képesek a xenobiotikus komponenseket bontani, vannak korlátai is e folyamatoknak:– Nincs olyan egyedi mikroba, mely képes minden szerves hulladékot

bontani– Nagy konc-ban a szennyezőa gátolhatja a szaporodást és/vagy metabolikus

aktivitást– Összetett szennyezések esetén, noha több komponenst képes bontani egy

mikroba, van egy, mely gátolja aktivitását– Nem poláris komponensek szorbeálódnak a talaj-, üledék részecskéihez,

kevésbé hozzáférhetővé válnak– Gyakran lassú a biodegradáció

• Lehetőség pl plazmid transzfer, gén módosítás segítségével jobb metabolikus tulajdonságokkal bíró törzsek létrehozása

1. Kromoszóma2. plazmid

Plazmid transzfer

Description : This image is a line drawing of bacterial conjugation. The image shows, going from the top to the bottom, two bacteria before, during, and after conjugation. On the top then are two bacterium, before conjugation, each with their own chromosomal DNA. Only one bacterium shows a plasmid. In the middle, are the same two bacterium during conjugation. A pilius (connection) forms between the two bacteria and a linear copy of the plasmid is transported through the pilius to the other bacterium. On the bottom, are the same two bacterium after conjugation. The pilius is now gone and each bacterium has a plasmid.

Inkompatibilitás lehet a plazmidok között (azonos v hasonló replikációs origó gének), ekkor nem maradnak fenn egy sejtben együtt

Egy szénhidrogén bontó baktérium törzset (strain C) használtak fel (szabadalom)

1970-es évek – Chakrabarty és mtsai

Strain B’ Strain C’

Kompatibilis plazmidok

Nem kompatibilis plazmidok

Strain C’’

A ‘szuperbaci’ jól szaporodik nyersolaj szubsztráton

Manipuláció plazmid transzfer segítségével

• Eleinte mezofil mikroorganizmusokkal végezték csak

• Probléma: a környezetben sokkal általánosabb a 0-20°C (vizek, talaj)

• Pszikrofilekbe (hideg kedvelők) kell az információkat (plazmid) juttatni, melyek az adott környezeti feltételeket jól tűrik

Manipuláció plazmid transzfer segítségével

• Egyes folyamatokban a keletkező intermedierek gátolhatják a következő átalakítási lépéshez szükséges enzimek szintézisét, ezen lehet néha változtatni

• Kometabolizmus esetén a bontandó anyag nem szubsztrátja a sejtnek, így nem indítja el a bontáshoz szükséges enzimek szintézisét, ezen szintén lehet módosítani

Manipuláció génmódosítással

Manipuláció génmódosítással

Pm promoterxyl gének

P promoter és xylS gén

+

• Pseudomonas putida törzs pWWO plazmidja xilol és toluol bontásáért felelős enzimeket kódoló géneket hordozó plazmid

• xyl operon a Pm promoter szabályozása alatt áll, melyet a xylS gén terméke pozitívan szabályoz (ami önálló promoterrel rendelk) és a legtöbb szubsztrát (benzol szárm) aktiválja

• A pWWO-t hordozó bakt át tudja alakítani a 4-etilbenzoátot (4EB) 4-etilkatekollá (4EC), de tovább nem, mert az inaktiválja a xylE gén termékét a katekol 2,3-dioxigenázt.A 4EB pedig nem aktiválja axylS fehérje term-t

• Kérdés: hogyan lehet a 4EB-tinducerré (szubsztráttá) tenni, és elérni, hogy a 4EC negátolja a katekol 2,3-doxigenázt

példa

Tetr: tetracyclin rezisztencia génAmpr: ampicillin rezisztencia génKanr: kanamycin rezisztencia gén

Mutagenizálták etil-metánszulfonáttal

Mutagenizálás után 4EB jelenlétében átírodott a xylS gén terméke

A mutagenizált xylS gént egy széles gazdaspektrumú kanamycin rezisztens plazmidba építették, és a pWWO-t hordozó P. putida-ba juttatták

A sejteket nagy mennyiségben 4EB szénforráson, kanamycin és etil-metánszulfonát jelenlétében inkubálták

Csak azok a sejtek tudtak szaporodni, melyek esetében a keletk 4EC nem gátolta a katekol 2,3-dioxigenáz enzim aktivitását (ezekben a sejtekben az enzimet kódoló gén –xylE- mutálódott)

• TCE széles körben használt oldószer, gyakori talaj, talajvíz szennyező, perzisztens, potenciális karcinogén. Gyakran vinilkloriddá alakul anaerob talajbaktériumoknak köszönhetően

• Ennek környezetbarát eltávolítására is célszerű jó megoldást keresni• Lehetséges jelölt: aromásokat bontó P. putida, mely képes a TCE-t is

bontani. A felelős enzim a toluol dioxigenáz, melynek szintéziséért 4 gén felelős.

• A 4 gént E. coli-ba vitték, megfelelő promoter rendszerben ezek kifejeződtek, és nem káros anyaggá alakították a TCE-t. Kezdeti hatékonysága elmaradt a P. putida-étól, de sokkal hosszabb ideig aktív maradt. A TCE-re – ellentétben a P. putida-val - nem érzékeny az E. coli

• Ennek több verzióját is létrehozták P. putida-ban, bifenil dioxigenáz gént juttatak be, és az így létrehozott törzs ellenállóbb volt, sőt sokkal több szubsztrátot képes volt átalakítani

Manipuláció génmódosítással

összefoglalás

• Nagyon sokféle megoldás létezik, a plazmidok segítségével számtalan lehetőség áll rendelkezésünkre, hogy megváltoztassuk egy törzs képességeit

• De vigyázni kell, hogy az új tulajdonságok bevitelével ne borítsuk fel a mikroba alapvető funkcióit

• Két (esetleg több) alternatív lebontási útvonal is lehet aktív egy törzsben, de pl. egyszerre orto-hasítási és meta-hasítási (dioxigenázok) útvonal nem működőképes, hiszen összekutyulódik a folyamat, és használhatatlan köztitermékkel be is fejeződik a lebontás, és a sejtek elpusztulnak

• Rezisztenciát hordozó törzseket nem lehet kijuttatni a természetbe!

Általánosan használt technikák a molekuláris mikrobiális ökológiában