Biologia Molecolare CDLM in CTF 2010-2011 – La trascrizione negli eucarioti

  I meccanismi della trascrizione

  Organizzazione generale delle sequenze regolative

  Il macchinario generale della trascrizione

  Si stima che molti eucarioti abbiano un numero complessivo di geni compreso tra 20k e 25k geni

  Alcuni geni hanno una espressione pressoché costante (housekeeping genes)

  La regolazione genica negli eucarioti prevede diversi punti di controllo, il più importante dei quali è la trascrizione

  La definizione dei dettagli del meccanismo di traduzione ha richiesto lo studio delle interazioni proteina/DNA

L’espressione genica è controllata a diversi livelli. Questo permette di ottenere una modulazione più efficace, specifica nel tempo e nello spazio. La necessità di esprimere GENI DIVERSI in cellule e tessuti diversi nasce dalla diversità nella specializzazione funzionale di cellule che hanno comunque lo stesso genoma L’adattamento a condizioni ambientali in costante mutamento è strettamente correlato con la regolazione genica.

  Alcune delle proteine che intervengono nel processo di trascrizione hanno affinità per il DNA

  Il legame al DNA avviene in regioni specifiche

  Una molecola carica immersa in un campo elettrico si muove verso il polo di carica opposta.

  Il DNA, grazie ai numerosi gruppi fosfato, ha una carica netta negativa. Questa carica è costante per unità di lunghezza.

  Se inseriamo una molecola di dna in un campo elettrico questa migrerà verso il polo positivo.

  Se intrappoliamo il DNA in un gel poroso lo spostamento del DNA sarà ostacolato dall’attrito.

  Più grande è la molecola di DNA è maggiore sarà l’attrito: le molecole di DNA più grandi migreranno più lentamente, quelle più piccole migreranno più velocemente.

  Questa è l’elettroforesi su gel.

  Il DNA da analizzare presenta una estremità marcata.

  Si eseguono due esperimenti paralleli: in uno il DNA viene analizzato da solo, nell’altro il DNA viene prima fatto interagire con una proteina che lega il DNA.

  I due campioni vengono trattati con DNAsi I, un enzima che produce dei tagli random in diverse posizioni

  Viene così prodotta una popolazione di molecole di dna più piccole, di varia lunghezza sulla base della posizione di taglio.

  Nel campione con la proteina legata, la zona di legame è inaccessibile alla DNAsi I. In questa zona non si verificano tagli.

  Se facciamo correre i due campioni su un gel elettroforetico nel campione senza proteina avremo una popolazione ben distribuita di frammenti mentre nel campione trattato con la proteina ci sarà un intervallo nel quale non si riscontrano frammenti. Le estremità di questo intervallo determinano la zona coperta dalla proteina che lega il DNA

  Il DNA da analizzare presenta una estremità marcata.

  Si eseguono due o più esperimenti paralleli: in uno il DNA viene analizzato da solo, nell’altro il DNA viene prima fatto interagire con una proteina che lega il DNA. E possibile fare altri esperimenti in cui si utilizzano diverse DNA binding protein contemporaneamente

  I campioni vengono fatti correre su gel elettroforetico utilizzando concentrazioni saline particolari che consentano ai complessi DNA-proteine di rimanere attivi.

  Il primo esperimento produrrà una sola banda che corrisponde al DNA libero.

  Il secondo esperimento può produrre:   Una sola banda all’altezza della precedente significa che la proteina non si è legata al

DNA

  Una sola banda con migrazione inferiore significa che la proteina si è legata “ritardando” la migrazione del DNA.

  La presenza di due bande (una all’altezza del DNA libero ed una ritardata) significa che alla concentrazione di proteina utilizzata una parte del DNA è stato legato (banda in ritardo) ed una parte no.

  Il macchinario responsabile della trascrizione negli eucarioti è composto anche da proteine che NON si legano direttamente al DNA, ma che interagiscono con altre proteine del macchinario stesso

  La trascrizione prevede:   Macchinario generale della trascrizione   Fattori di trascrizione specifici

  I meccanismi della trascrizione

  Organizzazione generale delle sequenze regolative

  Il macchinario generale della trascrizione

  Elementi promotori   Nucleo del promotore

  Elementi prossimali

  Elementi regolatori a lungo raggio   Enhancher

  Silencer

  Isolatori

  LCRs

  MAR

  Lettera maiuscola > 50% dei promotori

  Lettera minuscola < 50% dei promotori

  TATA Box -> 32% potenziali nuclei

  Lega TFIID (in particolare TBP)

  Può agire senza Inr, BRE e DPE

  DPE -> identificato nei TATAless – richiede Inr

  Lega TFIID (TAF9 TAF6)

  Inr -> Simile a TATA (sinergico ma autonomo)

  Lega TFIID (TAF1 e TAF2)

  DPE -> lega TFIIB

CAAT Box ->CBF GC Box -> Sp1

I TF legati attivano o reprimono direttamente la trascrizione o interagiscono con Enhancer/Silencer

•  Gli Enhancer sono specifiche sequenze di DNA in grado di legare fattori proteici capaci di aumentare l'efficacia dei promotori nell'attivazione della trascrizione • Al contrario, i Silencer sono specifiche sequenze di DNA che legano inibitori proteici della trascrizione

Sono entrambi elementi distali e per interagire con la regione del promotore è

necessario che il DNA si ripieghi a formare un’ansa.

  Marcatori di confine della cromatina (eterocromatina/eucromatina)

  Attività di blocco di sequenze regolatrici distali