biologie génique

Universit Pierre et Marie Curie

Biologie gniqueObjectifs au cours de Formation de base IFTAB (2me anne) Diplme dUniversit P. et M. Curie Formation continue 2006 - 2007

Pr. A. Raisonnier ([email protected]) Avec lautorisation des Professeurs J. Etienne et G. Lucotte

Mise jour : 14 juin 2006 Relecture : Pr. A. Raisonnier

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Biologie gnique - Pr A. Raisonnier

2006 - 2007

Plan du cours

Plan du cours3 9 11 13 14 15 16 17 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 39 40

Plan du cours Objectifs Partie I : Chapitre 1 :1.1 1.2 1.3 1.4

Enzymes agissant sur les acides nucliques Phosphorylation - dphosphorylation

Polynuclotide-kinase Polynuclotide kinase T4 Terminal transferase Phosphatase alcaline

Chapitre 2 :2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13

Les polymrases

DNA polymrase (raction) DNA polymrase (exonuclase 35) DNA polymrase (fonction ddition) DNA-polymrases (tableau) DNA pol I (E. Coli) Fragment de Klenow T4 DNA polymrase Sequenase Taq polymrase Reverse transcriptase RNA polymrase II (raction) RNA polymrases (phages) Poly(A) polymrase

Chapitre 3 :3.1 3.2 3.3 3.4

Les ligases

DNA ligase (raction) DNA ligase (E. Coli) DNA ligase (phage T4) RNA ligase (phage T4)

Chapitre 4 :4.1

Les isomrases

Topoisomrase

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Plan du cours 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 73 74 75 77 79 80 81

Chapitre 5 :5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 5.16 5.17 5.18 5.19 5.20 5.21 5.22 5.23 5.24 5.25 5.26 5.27 5.28 5.29 5.30

Les nuclases

Fragment de restriction (dfinition) Systme de restriction-modification Nomenclature des enzymes de restriction Restriction (raction gnrale) Tampons dincubation (restriction) EcoR I EcoR V Pvu II Hae III Pvu I Pst I Kpn I Alphabet dgnr Ava II Hind II Hga I Mbo II Hha I Hpa I Digestion dune squence (Hae III) Digestion dune squence (Mbo II) Ribonuclase A Ribonuclase T1 Ribonuclase H Dsoxyribonuclase I Nuclase BAL 31 Nuclase S1 Nuclease de mung-bean Exonuclase de phage Exonuclase III

Chapitre 6 :6.1 6.2

Autres enzymes

-galactosidase Protinase K

Partie II : Chapitre 7 :7.1 7.2

Prparation des acides nucliques Extraction et purification

Purification des lymphocytes Homognisation des tissus, dprotinisation

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Plan du cours 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 120 121 122 123

7.3 7.4 7.5 7.6 7.7

Extraction de lADN Isolation de lARN Techniques de purification (tableau) Purification par lthanol Purification du RNA-poly(A)

Chapitre 8 :8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 8.10 8.11 8.12 8.13 8.14 8.15 8.16 8.17 8.18 8.19 8.20 8.21

Synthse des polynuclotides

Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR (I-1) PCR (I-2) PCR (I-3) PCR (II-1) PCR (II-2) PCR (II-3) PCR (III-1) PCR (III-2) PCR (III-3) Nested-PCR Phosphoramidites : dA-3-support protge Phosphoramidites : dtritylation Phosphoramidites : addition dun nuclotide Phosphoramidites : blocage des supports Phosphoramidites : oxydation Phosphoramidites : dprotection Synthse dun cDNA Sondes de cDNA amplifi Structures secondaires Synthse des queues poly(dN)

Chapitre 9 :9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 9.10 9.11 9.12 9.13

Caractrisation des acides nucliques

Principaux oligonuclotides Spectres UV des bases nucliques Spectre UV des acides amins Dosage des acides nucliques Electrophorse des acides nucliques Sonde nuclique (dfinition) Hybridation dune sonde Calcul de la Tm Southern blot Drpanocytose (anmie falciforme) Marquage : nick translation Marquage : random priming Marquage : terminal transferase

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Plan du cours 124 125 126 127 128 130 131 132 133 134 135 136 137 139 141 142 143 144 145 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160

9.14 9.15 9.16 9.17 9.18 9.19 9.20 9.21 9.22 9.23 9.24 9.25 9.26

Marquage : polynuclotide kinase Didsoxyadnosine triphosphate Raction de squence Squenage de lADN Squenage : dye primers Squenage : dye terminators Gel de squence Squenage : image du gel Squenage : analyse de limage Squenage : analyse de limage Promoteur : foot printing Dosage dARN : PCR quantitative Dosage dARN : protection la RNase

Partie III :

Caractrisation des vnements gntiques

Chapitre 10 : Mutations10.1 10.2 10.3 10.4 Polymorphismes de restriction Polymorphisme Msp I de lapoA-II Haplotypes Cartes de restriction

Chapitre 11 : Expression11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 11.7 11.8 11.9 11.10 11.11 11.12 11.13 Vecteur (dfinition) Cellules-htes Cycle du phage Phage Clonage (I) Clonage (II) EMBL Polylinker Clonage directionnel Carte du plasmide pBR322 Carte des plasmides pUC18/19 Cycle de M13 Carte du M13

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Plan du cours 161 163 164 165 167 168 169 170 171 172 173 175 176 177 179 181 182 183

Partie IV :

Le gnie gntique

Chapitre 12 : Mutagnse12.1 12.2 Cration dun site de restriction Mutagnse par PCR

Chapitre 13 : Transposition - recombinaison13.1 13.2 13.3 13.4 13.5 13.6 Transposition (dfinition) Protine rec-A Transposition (mcanisme) Recombinaison simple (mitose) Modle Holliday Crossing-over

Chapitre 14 : Construction de vecteurs14.1 14.2 14.3 Carte du virus SV40 Construction dun vecteur Vecteurs hybrides

Chapitre 15 : Transgnse15.1 15.2 Vecteurs de thrapie Souris knock out

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Plan du cours

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Objectifs

ObjectifsDes connaissances de base en enzymologie, en virologie et en biochimie des acides nucliques sont indispensables pour suivre cet enseignement. (Objectifs pr-requis). 1. Enzymes agissant sur les acides nucliques Pour chacune des enzymes suivantes, utilises au laboratoire de biologie molculaire, connatre1 les facteurs en prsence utiles la raction (substrat, modles, produits, cofacteurs, effecteurs, conditions physiques), la spcificit de lactivit enzymatique et donner des exemples de lusage quon peut en faire : polynuclotide kinase, terminal transferase, phosphatase alcaline, DNA polymrases, reverse transcriptase, RNA polymrases, poly(A) polymrase, DNA ligases, RNA ligase, topoisomrase, enzymes de restriction, ribonuclases (A, T1, H), dsoxyribonuclases, protinase K, -galactosidase. Dfinir2 les termes suivants : oligonuclotide, sonde, ADN complmentaire. Dcrire les gestes3 qui permettent de faire lextraction et la purification dADN gnomique partir dun prlvement de sang. Expliquer le principe de lextraction de lARN messager dun tissu et de la ralisation pratique dune banque de cDNA. Dcrire les gestes qui permettent de faire lamplification par PCR dun fragment dADN dont on possde les amorces. Expliquer le principe de la synthse dun oligonuclotide au moyen dun synthtiseur et de la technique des phosphoramidites. Dcrire les gestes qui permettent de faire la synthse dune queue de nuclotides lextrmit dun fragment dADN. Expliquer le principe du dosage des acides nucliques. Faire le calcul de la quantit dacides nucliques partir des donnes brutes fournies par un spectrophotomtre, en tenant compte des dilutions et du volume du milieu considr. Expliquer le principe de lhybridation dune sonde. Faire le calcul de la Tm de cette son-

2.

Prparation des acides nucliques

1. Connatre corps chimique : crire sa formule dveloppe, numrer les molcules simples dans une structure complexe et nommer les liaisons qui les unissent, expliquer une exprience mettant en vidence une proprit chimique ou physique ; image : dessiner un objet ou une structure ; raction : crire lquation chimique ; voie mtabolique : tablir son bilan chimique partir des ractions de chaque enzyme. 2. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern. 3. Expliquer le principe, dcrire ou mimer les gestes ou faire un schma explicatif : prciser le motif de chacun de ces gestes. Etre capable de dceler une erreur qualitative dans la description dun protocole. Au niveau des travaux pratiques, les connaissances techniques thoriques tant acquises, on devra tre capable de passer la manipulation sans avoir apprendre que la partie proprement manuelle.

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Objectifs

3.

de partir de sa squence et dune formule de calcul. Etablir les conditions des phases dun programme de PCR utilisant deux amorces de Tm voisines. Expliquer les tapes des techniques dhybridation molculaire qui auront t pratiques ou expliques en cours titre dexemples : hybridation sur filtre, hybridation in situ, hybridation en solution. Dcrire le principe technique et les gestes qui permettent de faire le marquage dune sonde par un atome de 32P ou par un nuclotide marqu. Expliquer le principe du squenage dun fragment dADN au moyen dun squenceur et de la technique des dye primers ou des dye terminators ; dcrire et interprter les rsultats1 apparaissant sur lcran de lordinateur aprs un squenage automatique. Expliquer les principes de la recherche des lments cis-rgulateurs sur la squence dun promoteur (foot printing). Expliquer le principe des ractions permettant le dosage des ARN transcrits : PCR quantitative, protection la Rnase. Dcrire et interprter les rsultats danalyse (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P. ou votre exprience personnelle) dune lsion molculaire conduisant une expression anormale du gne considr : mutation faux-sens, non-sens, dcalage du cadre de lecture, protine tronque, Expliquer les tapes (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P. ou votre exprience personnelle) des techniques ayant permis : un diagnostic gnotypique, une analyse gnique ou une empreinte gntique : RFLP, carte de restriction, haplotypes, squenage. Dfinir les termes suivants : vecteur, clonage, polylinker, plasmide. Dcrire les tapes de linsertion dun fragment dADN dans un plasmide. Expliquer les tapes (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P. ou votre exprience personnelle) des techniques ayant permis : une mutagnse, la transposition dun gne dans une bactrie, la cration dun animal ou dune plante transgnique. Expliquer le principe de la construction dun vecteur : cet objectif servira tester la facult pour ltudiant(e) de faire une synthse des connaissances de lensemble des chapitres prcedents.

Exemples dapplications

4.

Gnie gntique

1. Interpreter les rsultats : partir des donnes affiches par la machine, aprs la validation technique de la squence, savoir dcrire la structure de lacide nuclique squen et reconnatre sur cette squence des lsions molculaires dont linterprtation ne ncessite la leve daucune ambigut.

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Enzymes agissant sur les acides nucliques

Partie I Enzymes agissant sur les acides nucliquesRappel des objectifs Pour chacune des enzymes suivantes, utilises au laboratoire de biologie molculaire, connatre1 les facteurs en prsence utiles la raction (substrat, modles, produits, cofacteurs, effecteurs, conditions physiques), la spcificit de lactivit enzymatique et donner des exemples de lusage quon peut en faire : polynuclotide kinase, terminal transferase, phosphatase alcaline, DNA polymrases, reverse transcriptase, RNA polymrases, poly(A) polymrase, DNA ligases, RNA ligase, topoisomrase, enzymes de restriction, ribonuclases (A, T1, H), dsoxyribonuclases, protinase K, -galactosidase.

1. Connatre corps chimique : crire sa formule dveloppe, numrer les molcules simples dans une structure complexe et nommer les liaisons qui les unissent, expliquer une exprience mettant en vidence une proprit chimique ou physique ; image : dessiner un objet ou une structure ; raction : crire lquation chimique ; voie mtabolique : tablir son bilan chimique partir des ractions de chaque enzyme.

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Enzymes agissant sur les acides nucliques

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Phosphorylation - dphosphorylation

Chapitre 1 Phosphorylation dphosphorylation

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1.1 Polynuclotide-kinase

BG 01 La polynuclotide kinase catalyse le transfert du phosphate de lATP sur une fonction alcool du carbone 5 dun ADN ou dun ARN. Le substrat requiert une dphosphorylation pralable si la fonction est estrifie. Lenzyme catalyse aussi lchange du phosphate 5 terminal dun ADN ou dun ARN avec le phosphate de lATP, en prsence dADP comme accepteur de phosphate. La polynuclotide kinase du commerce est extraite dune bactrie (E. coli) infecte par le phage T4. Une unit denzyme catalyse le transfert de 33 picomoles de phosphate par minute 37 C. La polynuclotide kinase est utilise au laboratoire pour incorporer du phosphate radioactif (32P) sur lextrmit 5 dun acide nuclique, soit par transfert, soit par change.

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1.2 Polynuclotide kinase T4

BG 02 La polynuclotide kinase catalyse le transfert du phosphate de lATP sur une fonction alcool du carbone 5 dun ADN ou dun ARN. Le substrat requiert une dphosphorylation pralable si la fonction est estrifie. Lenzyme catalyse aussi lchange du phosphate 5 terminal dun ADN ou dun ARN avec le phosphate de lATP, en prsence dADP comme accepteur de phosphate. La polynuclotide kinase du commerce est extraite dune bactrie (E. coli) infecte par le bactriophage T4. Une unit denzyme catalyse le transfert de 33 picomoles de phosphate par minute 37 C. La polynuclotide kinase est utilise au laboratoire pour incorporer du phosphate radioactif (32P) sur lextrmit 5 dun acide nuclique, soit par transfert, soit par change.

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1.3 Terminal transferase

BG 03 La transfrase terminale catalyse laddition de dsoxynuclotides sur une fonction alcool 3OH terminale de lADN. Lenzyme prfre les molcules dADN dont lextrmit 3OH est sortante, mais il existe des conditions qui favorisent la catalyse sur lADN bouts francs, voire sur les extrmits 3OH rentrantes. Elle incorpore plus spcifiquement les purines ou les pyrimidines en fonction du cation divalent quon lui donne comme cofacteur : Mg++ pour les purines, Co++ pour les pyrimidines ou encore Mn++. La transfrase terminale du commerce est extraite du thymus de veau. Une unit denzyme catalyse le transfert de 17 picomoles de dsoxyribonuclotide par minute 37 C. La transfrase terminale est utilise au laboratoire pour : construire des squences polymrises de nuclotides (queues) lextrmit 3OH de lADN (en vue du clonage des fragments dADN) ; marquer les extrmits 3 de lADN avec un nuclotide marqu sur le phosphate ; ajouter un nuclotide la fin dune squence pour induire une mutation (mutagnse dirige).

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1.4 Phosphatase alcaline

BG 04 Les phosphatases sont des enzymes trs large spcificit, hydrolysant le radical phosphoryle port par une liaison ester ou anhydride... On les divise en plusieurs classes en fonction de leur pH optimum daction : phosphatases acides, phosphatases alcalines. Certaines phosphatases ont une spcificit de substrat plus troite : 5 nuclotidase. La raction catalyse par les phosphatases est irrversible, mais certaines sont capables dchanger le radical phosphate partir de molcules plus riches en nergie comme le pyrophosphate. La phosphatase alcaline du commerce est celle extraite de lintestin de veau. Une unit denzyme catalyse lhydrolyse dune micromole de paranitrophnylphosphate par minute 37 C. La phosphatase alcaline est utilise au laboratoire pour dphosphoryler les extrmits 5 des acides nucliques, soit pour prparer un marquage en 5 par une polynuclotide kinase, soit pour empcher la rannalisation dun ADN circulaire linaris (vecteurs de clonage).

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Les polymrases

Chapitre 2 Les polymrases

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Les polymrases

2.1 DNA polymrase (raction)

BG 05 Les DNA-polymrases sont des enzymes du noyau cellulaire qui agissent en phase S du cycle pour doubler systmatiquement lensemble du gnome diplode. Dautres DNA polymrases interviennent dans la synthse des amorces RNA/DNA, dans la rplication du gnome mitochondrial ou dans la rparation du DNA. Elles ne peuvent dmarrer la condensation des nuclotides que sur la fonction alcool en 3 du ribose du dernier nuclotide dune amorce, nuclotide qui doit tre hybrid avec le nuclotide complmentaire qui sert de modle. Elles utilisent comme substrats des dsoxyribonuclotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) et des amorces de RNA et de DNA synthtises par une primase (RNA polymrase capable de synthtiser un brin de RNA complmentaire dun brin de DNA sur 10 nuclotides) suivie dune DNA polymrase (qui prolonge lamorce de RNA de 20 dsoxyribonuclotides environ). Elles synthtisent lADN nouveau par fragments qui, aprs excision des amorces, sont lis entre eux par une DNA-ligase. Elles ont aussi une activit exonuclasique, qui leur permet en particulier dhydrolyser le dernier nuclotide en 3 du brin synthtis si celui-ci ne sapparie pas correctement avec le nuclotide complmentaire du brin modle.

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Les polymrases

2.2 DNA polymrase (exonuclase 35)

BG 05/1 Les DNA-polymrases sont des enzymes du noyau cellulaire qui agissent en phase S du cycle pour doubler systmatiquement lensemble du gnme diplode. Dautres DNA polymrases interviennent dans la synthse des amorces RNA/DNA, dans la rplication du gnome mitochondrial ou dans la rparation du DNA. Elles ne peuvent dmarrer la condensation des nuclotides que sur la fonction alcool en 3 du ribose du dernier nuclotide dune amorce, nuclotide qui doit tre hybrid avec le nuclotide complmentaire qui sert de modle. Elles utilisent comme substrats des dsoxyribonuclotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) et des amorces de RNA et de DNA synthtises par une primase (RNA polymrase capable de synthtiser un brin de RNA complmentaire dun brin de DNA sur 10 nuclotides) suivie dune DNA polymrase (qui prolonge lamorce de RNA de 20 dsoxyribonuclotides environ). Elles synthtisent lADN nouveau par fragments qui, aprs excision des amorces, sont lis entre eux par une DNA-ligase. Elles ont aussi une activit exonuclasique, qui leur permet en particulier dhydrolyser le dernier nuclotide en 3 du brin synthtis si celui-ci ne sapparie pas correctement avec le nuclotide complmentaire du brin modle.

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Les polymrases

2.3 DNA polymrase (fonction ddition)

BG 05/2 Les DNA polymrases ont la fois une activit de polymrase pour ajouter des nuclotides au nouveau brin de DNA, et une activit de 35 exonuclase pour hydrolyser le dernier nuclotide incorpor. Si le nuclotide incorpor est complmentaire du nuclotide du brin modle et donc que lhybridation des bases se fait normalement, lactivit de polymrase est plus rapide que celle dexonuclase et le nuclotide suivant va tre incorpor. Si le nuclotide incorpor nest pas complmentaire du nuclotide du brin modle et donc quil y a msappariement, lactivit dexonuclase est plus rapide que celle de polymrase et ce nuclotide sera hydrolys.

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Les polymrases

2.4 DNA-polymrases (tableau)

BG 06 Les DNA polymrases sont des enzymes qui catalysent la synthse de lADN partir des dsoxyribonuclosides triphosphates en recopiant la squence dune matrice dADN. Certaines dentre elles ont aussi des activits dexonuclase qui peuvent sexercer de 5 vers 3 ou dans lautre sens, afin de corriger les erreurs dincorporation (fonction ddition). Les DNA polymrases sont spcifiques de lADN double brin et incorporent les nuclotides pour faire la synthse dun deuxime brin en utilisant le premier comme matrice. Les DNA polymrases ont besoin dune amorce (extrmit 3OH rentrante dun deuxime brin) pour initier la raction. Tous les tres vivants ont besoin dune DNA polymrase pour la rplication de leur ADN. Ce sont en gnral des protines denviron 100000 daltons. Celles des tres vivants les plus simples (virus, archobactries) sont souvent dpourvues de fonctions ddition. Toutes les DNA polymrases exigent la prsence de lion magnsium. Beaucoup dentre elles fonctionnent en milieu alcalin. Leur temprature optimale daction se situe habituellement dans une fourchette de 20 40 C.

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Les polymrases

2.5 DNA pol I (E. Coli)

BG 07 La DNA polymrase I dEscherichia coli (DNA pol I) est une protine qui assure la fonction de rplication de lADN bactrien. Elle initie la raction lextrmit 3 rentrante dune amorce dADN ou dARN. Elle incorpore des nuclotides partir des quatre dsoxyribonuclosides triphosphates, en hydrolysant un pyrophosphate et en incorporant le nucloside et le phosphate . Lorsque cet atome de phosphore est radioactif, le brin dADN produit est aussi marqu. DNA pol I est doue dune double fonction ddition : exonuclase 53 pour digrer le deuxime brin partir de son extrmit 5 (nick translation) exonuclase 35 pour digrer lextrmit 3 dun brin (correction immdiate des misappariements)

Les activits dexonuclase sexercent aussi sur les brins dARN hybrids (amorces). DNA pol I est utilise pour la synthse de brins dADN marqus sur toute la longueur de la chane par la technique de translation de brche avec des dNTP marqus.

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Les polymrases

2.6 Fragment de Klenow

BG 07/1 La digestion de la DNA polymrase I par une protase (subtilisine) donne deux fragments : celui de 76 kD (fragment de Klenow) possde encore deux des activits catalytiques de la polymrase : 53 polymrase et 35 exonuclase. Ce fragment peut-tre utilis pour synthtiser le deuxime brin partir dun ADN simple brin et dune amorce. La raction est la mme que celle de la DNA polymrase I. Les conditions de milieu et la vitesse de raction sont les mmes que celles de lenzyme entire. Le fragment de Klenow est utilis pour : la synthse du deuxime brin, complmentaire dun cDNA ; le marquage des extrmits 5 sortantes du DNA double brin ; le marquage du DNA par la technique des amorces alatoires ; le squenage du DNA par la technique des didsoxynuclotides ; la mutagnse dirige partir doligonuclotides synthtiques.

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Les polymrases

2.7 T4 DNA polymrase

BG 08 Dans une culture dE. coli infecte par le bactriophage T4, on peut purifier la DNA polymrase de ce phage. Comme le fragment de Klenow elle est dpourvue dactivit 53 exonuclase, mais elle possde une activit 35 exonuclase 200 fois plus grande. En labsence de dsoxynuclosides triphosphates, seule lactivit 35 exonuclase se manifeste, aboutissant un DNA avec de longues extrmits 5 sortantes. Lorsque les substrats sont ajouts au milieu, la resynthse se fait rapidement, permettant lincorporation de nuclotides marqus. Lactivit de la T4 polymrase est aussi rapide que celle de la DNA polymrase I. La DNA polymrase du phage T4 est utilise pour le marquage du DNA.

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Les polymrases

2.8 Sequenase

BG 09 Les squenases sont une famille denzymes issues de la DNA polymrase du bactriophage T7. Elles sont constitues dune protine du phage (gne 5) et dune protine de la cellule-hte (thioredoxine). Elles sont dpourvues par une modification du gne de toute activit ddition (53 exonuclase et 35 exonuclase). Les squenases sont les plus rapides de toutes les DNA polymrases. Les squenases sont utilises dans les techniques de squenage avec des didsoxyribonuclotides (Sanger). Elles sont responsables de quelques erreurs dfaut dactivit ddition : de lordre de 1 misappariement pour 1000 paires de bases.

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Les polymrases

2.9 Taq polymrase

BG 10 Thermus aquaticus est une bactrie thermophile des sources chaudes du parc de Yellowstone (Californie). Elle possde des enzymes thermorsistantes, dont une DNA polymrase (Taq polymrase) rsistante lbullition et active 75-80 C. La Taq polymrase est dpourvue dactivits ddition (53 exonuclase et 3 5 exonuclase). La Taq polymrase est inhibe par les ions phosphates. La Taq polymrase est utilise pour la raction de polymrisation en chane (Polymerase Chain Reaction = PCR), technique courante damplification des fragments de DNA. Parce quelle est dpourvue dactivits ddition la Taq polymrase est responsable de nombreux misappariements : de lordre de 1 pour 100 paires de bases.

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Les polymrases

2.10 Reverse transcriptase

BG 11 Les transcriptases rverses sont des DNA polymrases qui peuvent synthtiser un brin dADN complmentaire (ADNc ou cDNA) en prenant un ARN comme matrice, pour former un hybride ADN:ARN. Elles catalysent donc la raction inverse de la transcription, do le nom de transcriptases rverses. Les transcriptases rverses sont produites par des cellules infectes par des rtrovirus, virus ARN qui font synthtiser un ADNc par la cellule-hte afin de permettre leur rplication. La transcriptase rverse est utilise pour ltude des ARN. Aprs la synthse de lADN complmentaire, on dtruit lARN matrice, puis on soumet lADNc lamplification par la PCR, qui fournit une grande quantit dADNc hybrid avec une copie ADN de la squence de lARN de dpart.

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Les polymrases

2.11 RNA polymrase II (raction)

BG 12 La RNA polymrase II est lenzyme de la transcription des gnes exprims sous forme de protines. Elle est inhibe spcifiquement par un poison extrait de lAmanite phallode, l-amanitine. Elle est prsente dans tous les noyaux cellulaires. Sa masse molculaire est de 500000 daltons pour 10 sous-units. La transcription quelle catalyse ncessite des ribonuclosides triphosphates comme substrats (ATP, CTP, GTP et UTP), plusieurs cofacteurs protiniques (transcription factors TFIIA TFIIJ). Lnergie de la raction est fournie par lhydrolyse des liaisons riches en nergie des nuclosides triphosphates (42 kJ/mol).

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Les polymrases

2.12 RNA polymrases (phages)

BG 13 Les RNA polymrases sont les enzymes de la transcription. Elles sont essentielles au cycle des bactriophages ADN comme le SP6 de Salmonella typhimurium ou le phage T7 dEscherichia coli. Elles sont trs spcifiques des promoteurs correspondants. Lorsque ces promoteurs sont rguls par un inducteur spcifique, la prsence de cet inducteur est indispensable la raction. Les RNA polymrases des phages sont capables dincorporer 17 picomoles de nuclotides la minute 37 C. Les RNA polymrases des phages sont utilises pour la transcription in vitro, pour la synthse des sondes dARN et pour lanalyse des messagers (protection la RNase).

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Les polymrases

2.13 Poly(A) polymrase

BG 14 Lextrmit 3OH terminale du dernier exon du transcrit est dabord coupe par une nuclase environ 15 nuclotides aprs la bote de polyadnylation. Ensuite, une polymrase additionne des nuclotides adnine (plusieurs centaines) pour constituer une queue polyA. La raction se fait sans matrice, partir de lATP et en prsence de Magnsium. Le pyrophosphate produit est hydrolys. La queue polyA est indispensable la sortie du mRNA du noyau vers le cytoplasme. Elle protge le mRNA au cours de la traduction. Les mRNA dsadnyls ne sont plus traduits et seront rapidement digrs par la ribonuclase. Ces deux activits (nuclase et polymrase) seraient catalyses par un mme complexe multienzymatique : polyA polymrase ou polyadnylyl synthtase.

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Les ligases

Chapitre 3 Les ligases

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Les ligases

3.1 DNA ligase (raction)

BG 15 Les DNA ligases sont des enzymes qui sont capables de reconstituer la liaison phosphoester entre le carbone 3-OH et le phosphate-5 de deux nuclotides voisins sur un brin de DNA.

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Les ligases

3.2 DNA ligase (E. Coli)

BG 16 Les DNA ligases catalysent la liaison de lextrmit 5-phosphate terminale dun brin dADN avec lextrmit 3-OH terminale dun autre brin. La DNA ligase de E. coli ne lie les bouts francs de lADN quen prsence de ractifs dexclusion (polythylne glycol ou Ficoll), mais elle est toujours active pour souder les fragments dADN double brin extrmits collantes, ou pour fermer une brche dans un brin dADN dont la resynthse est acheve. La DNA ligase de E. coli utilise le NAD+ comme coenzyme donneur dnergie selon la raction : NAD+ NMN+ + AMP Elle na pas dactivit sur les RNA. Les DNA ligases sont utilises dans le clonage des fragments dADN et dans la construction des vecteurs.

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Les ligases

3.3 DNA ligase (phage T4)

BG 17 La DNA ligase du bactriophage T4 est moins spcifique que celle de E. coli : elle lie bien les fragments de DNA bouts francs et fonctionne dans la plupart des tampons utiliss par les enzymes de restriction. La T4 DNA ligase agit aussi mais moins rapidement sur les ARN. La DNA ligase du phage T4 utilise lATP comme donneur dnergie.

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Les ligases

3.4 RNA ligase (phage T4)

BG 18 La RNA ligase du bactriophage T4 catalyse la liaison des fonctions 5-phosphate des ADN ou ARN simple brin la fonction 3-OH dautres fragments simple brin dARN ou dADN. Lenzyme est capable de lier un fragment dun seul nuclotide. La RNA ligase du bactriophage T4 est utilise pour le marquage des ARN sur leur extrmit 3 et pour la synthse doligonuclotides.

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Les ligases

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Les isomrases

Chapitre 4 Les isomrases

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Les isomrases

4.1 Topoisomrase

BG 19 La rplication ou la transcription de lADN ncessite une fusion partielle de la double hlice et modifie lenroulement des deux brins. Afin de permettre ces ractions, la topoisomrase est capable de modifier lenroulement en hydrolysant un brin de lADN et en le reconstituant aprs avoir fait le tour de lautre brin. Aprs cette opration, la torsion de la double hlice tend se rapprocher de la valeur normale : pas de lhlice = 10 paires de nuclotides par tour. Au cours de la rplication et de la traduction le pas de lhlice diminue en avant des polymrases et lhlicase (une des topoisomrases) travaille alors pour augmenter le pas. Au contraire en arrire des polymrases les topoisomrases ajoutent des tours pour reconstituer la double hlice.

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Les nuclases

Chapitre 5 Les nuclases

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Les nuclases

5.1 Fragment de restriction (dfinition)

BG 20 Les endonuclases de restriction sont des enzymes bactriennes participant un mcanisme de dfense des bactries vis--vis des virus : systme de restriction-mthylation. Elles catalysent la coupure de lADN non mthyl en des endroits caractriss par une squence spcifique de nuclotides (site de restriction). Les produits de cette digestion sont les fragments de restriction, dont la longueur, toujours la mme pour un ADN donn, ne dpend que de la squence primaire de cet ADN. Lanalyse de la longueur des fragments de restriction, la recherche de variations individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des techniques danalyse de la squence primaire de lADN la recherche de substitutions, dinsertions ou de dltions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur des fragments de restriction. Les extrmits des fragments de restriction peuvent tre formes de deux brins dgale longueur (bouts francs) ou bien prsenter un brin plus long que lautre de quelques nuclotides (bouts collants).

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Les nuclases

5.2 Systme de restriction-modification

BG 20/1 Les Bactries sont lyses sous leffet de virus bactriophages dont lADN est rpliqu par la Bactrie elle-mme avant sa destruction. Pour dtruire lADN du parasite la Bactrie exprime des gnes de restriction et de mthylation. Les gnes de restriction permettent la synthse dendonuclases coupant lADN en des sites trs spcifiques. Afin de protger lADN bactrien de lhydrolyse par lenzyme, une mthylase, code par le gne de mthylation, va modifier les nuclotides de lADN bactrien en les mthylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction. Lensemble du gne de restriction et du gne de mthylation constitue un systme de dfense de la Bactrie vis--vis des phages.

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Les nuclases

5.3 Nomenclature des enzymes de restriction

BG 21 Les enzymes de restriction sont des hydrolases (classe 3 de la E.C.) agissant sur des liaisons esters (sous-classe 3.1), cest--dire des estrases. Parmi les estrases on distingue celles qui hydrolysent un acide nuclique en fragments polynuclotidiques (endonuclases) et en particulier celles dont les produits gardent leur phosphate 5 initial (sous-sous-classe 3.1.21). Enfin en fonction des cofacteurs, les enzymes de restriction ne ncessitent que la prsence de lion Mg++ dans le milieu (3.1.21.4) Le nom de chaque enzyme est driv du nom despce ou de varit de la Bactrie qui la produit. On crit linitiale du nom du genre, les deux initiales du nom de lespce, 1 lettre ou 1 nombre pour dsigner la varit (ou souche) et aprs un espace un chiffre romain pour dsigner successivement les diffrentes enzymes de restriction obtenues partir de la mme souche.

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Les nuclases

5.4 Restriction (raction gnrale)

BG 22 La raction gnrale catalyse par les enzymes de restriction implique la prsence dans le milieu ractionnel des facteurs suivants : Enzyme (3.1.21.n) Substrat : ADN double brin non digr Produit : ADN double brin digr Cofacteurs

En gnral, seul le Mg++ est indispensable. Quelques endonuclases font appel dautres cofacteurs. Les enzymes de mthylation ont pour coenzyme la S-Adnosyl-Mthionine (S-AdoMet). Des facteurs physiques contrlent aussi ces ractions : pH, potentiel doxydorduction, force ionique. Lnergie libre dgage par lhydrolyse est suffisamment importante pour que la raction ne soit pratiquement pas rversible dans les conditions habituelles.

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Les nuclases

5.5 Tampons dincubation (restriction)

BG 22/1 Diffrents tampons sont utiliss pour les enzymes de restriction permettant loptimisation des ractions de multiples enzymes avec le mme tampon. Toutes les enzymes de restriction ncessitent la prsence de lion Mg++ Le pH (7,0 - 7,9), le potentiel doxydo-rduction (dithiothritol 1 mM), la force ionique (NaCl ou CH3COOK de 0 100 mM) varient dun tampon lautre. De rares enzymes ncessitent des conditions spciales prcises par leur mode demploi.

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Les nuclases

5.6 EcoR I

BG 23 EcoR I est une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation des adnines ou de la cytosine du site dhydrolyse inhibent la reconnaissance du site par EcoR I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.7 EcoR V

BG 24 EcoR V est une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 GATATC 3 3 CTATAG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs . La mthylation des adnines du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par EcoR V. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.8 Pvu II

BG 24/1 Pvu II est une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 CAGCTG 3 3 GTCGAC 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs . La mthylation des cytosines au niveau du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Pvu II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.9 Hae III

BG 25 Hae III est une enzyme de restriction produite par Haemophilus aegypticus. Le site de liaison lADN est form de quatre paires de nuclotides : 5 GGCC 3 3 CCGG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs . La mthylation de la cytosine immdiatement en aval du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Hae III. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.10 Pvu I

BG 26 Pvu I est une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 CGATCG 3 3 GCTAGC 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation de la deuxime cytosine proche du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Pvu I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.11 Pst I

BG 26/1 Pst I est une enzyme de restriction produite par Providencia stuartii. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 CTGCAG 3 3 GACGTC 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation de la premire cytosine ou de ladnine du site dhydrolyse inhibent la reconnaissance du site par Pst I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.12 Kpn I

BG 26/2 Kpn I est une enzyme de restriction produite par Klebsiella pneumoniae. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 CTGCAG 3 3 GACGTC 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation de ladnine ou des cytosines du site dhydrolyse inhibent la reconnaissance du site par Kpn I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.13 Alphabet dgnr

BG 27 La spcificit large de certaines enzymes ou encore la dgnrescence du code gntique implique quon doit indiquer quelquefois dans les squences des lettres correspondant plusieurs bases azotes diffrentes pour le mme nuclotide prsent une position. Le choix peut porter sur deux des 4 nuclotides : A ou G, C ou T, G ou T, A ou C, C ou G, A ou T ; ou bien sur 3 nuclotides : C, G ou T, A, G ou T, A, C ou T, A, C ou G ; ou enfin sur les 4 nuclotides : A, C, G ou T. Les rgles de complmentarit impliquent videmment une dgnrescence de la squence de lautre brin en regard dune position dgnre.

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Les nuclases

5.14 Ava II

BG 28 Ava II est une enzyme de restriction produite par Anabaena variabilis. Le site de liaison lADN est form de cinq paires de nuclotides : 5 GGWCC 3 3 CCWGG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation des cytosines du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Ava II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.15 Hind II

BG 29 Hind II est une enzyme de restriction produite par Haemophilus influenzae, souche Rd. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 GTYRAC 3 3 CARYTG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs . La mthylation de ladnine du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Hind II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.16 Hga I

BG 30 Hga I est une enzyme de restriction produite par Haemophilus gallinarum. Le site de liaison lADN est form de cinq paires de nuclotides : 5 GACGC 3 3 CTGCG 5 Les sites de restriction ne sont quelquefois pas des palindromes, cest dire quils sont diffrents sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait en dehors du site de liaison et le site hydrolys nest pas dans le site de restriction. Pour indiquer le site de coupure on ajoute la squence du site de restriction une fraction indiquant le nombre de nuclotides en aval de la squence qui sparent lextrmit 3 de la squence du site de coupure sur le brin de la squence et sur le brin complmentaire : ici, 5 nuclotides en aval de la squence sur le brin de la squence et 10 nuclotides sur le brin complmentaire. Ici, il va rester des nuclotides non apparis : les fragments de restriction sont donc bouts collants . La mthylation de la deuxime cytosine du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Hga I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.17 Mbo II

BG 31 Mbo II est une enzyme de restriction produite par Moraxella bovis. Le site de liaison lADN est form de cinq paires de nuclotides : 5 GAAGA 3 3 CTTCT 5 Les sites de restriction ne sont quelquefois pas des palindromes, cest dire quils sont diffrents sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait en dehors du site de liaison et le site hydrolys nest pas dans le site de restriction. Pour indiquer le site de coupure on ajoute la squence du site de restriction une fraction indiquant le nombre de nuclotides en aval de la squence qui sparent lextrmit 3 de la squence du site de coupure sur le brin de la squence et sur le brin complmentaire : ici, 8 nuclotides en aval de la squence sur le brin de la squence et 7 nuclotides sur le brin complmentaire. La mthylation de la dernire adnine du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Mbo II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.18 Hha I

BG 32 Hha I est une enzyme de restriction produite par Haemophilus haemolyticus. Le site de liaison lADN est form de quatre paires de nuclotides : 5 GCGC 3 3 CGCG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait en dehors du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation des cytosines au niveau du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Hha I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.19 Hpa I

BG 33 Hpa I est une enzyme de restriction produite par Haemophilus parainfluenzae. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 GTTAAC 3 3 CAATTG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs . La mthylation de la deuxime adnine de la squence inhibe la reconnaissance du site par Hpa I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.20 Digestion dune squence (Hae III)

BG 34 Voici le rsultat de la digestion du gne de lapoA-II (brin codant) par Hae III. Chacune des squences GGCC engendre une coupure de lADN, ce qui produit des fragments de restriction dont le longueur dpend de la frquence de cette squence sur lADN. On peut tablir des cartes des emplacements de ces sites sur lADN (cartes de restriction). La recherche de ces sites sur lADN extrait dun sujet permet de dtecter des squences diffrentes qui ajoutent ou suppriment des sites de restriction. Il en rsulte que les fragments de restriction chez ces individus nont pas la mme longueur que les mmes fragments chez les autres individus : il y a un polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism).

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Les nuclases

5.21 Digestion dune squence (Mbo II)

BG 34/1 Voici le rsultat de la digestion du gne de lapoA-II (brin codant) par Mbo II. Mbo II est spcifique dun site non palindromique donc dissymtrique : GAAGA (N)8/7. Chacune des squences GAAGA engendre une coupure de lADN, huit nuclotides cot 3 du site. La squence doit tre recherche sur les deux brins, ou bien on peut rechercher la squence complmentaire TCTTC qui engendre une coupure sept nuclotides cot 5. On peut tablir des cartes des emplacements de ces sites sur lADN (cartes de restriction). La recherche de ces sites sur lADN extrait dun sujet permet de dtecter des squences diffrentes qui ajoutent ou suppriment des sites de restriction. Il en rsulte que les fragments de restriction chez ces individus nont pas la mme longueur que les mmes fragments chez les autres individus : il y a un polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism).

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Les nuclases

5.22 Ribonuclase A

BG 35 La ribonuclase A est lenzyme de la digestion des ARN chez les animaux. Elle agit comme une endonuclase, prfrentiellement aprs les nuclotides pyrimidine, en hydrolysant la liaison entre le phosphate et le carbone 5 du nuclotide suivant. Elle hydrolyse les ARN jusqu un mlange doligonuclotides se terminant tous par un nuclotide pyrimidine estrifi par un phosphate en 3. La ribonuclase pancratique est une des plus petites et des mieux connues des enzymes. Elle est thermorsistante et extrmement active. Il existe des inhibiteurs de la RNase : soit des dtergents comme le SDS (laurylsulfate de sodium), soit des protines comme celle extraite du placenta qui est souvent utilise pour protger les ARN dans les ractions enzymatiques.

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Les nuclases

5.23 Ribonuclase T1

BG 36 La ribonuclase T1 hydrolyse spcifiquement les ARN en rompant les liaisons 3-5 phosphodiester en aval des GMP, de telle manire que le produit soit une guanosine 3-phosphate ou un oligonuclotide se terminant par une guanosine 3-phosphate. Elle est utilise pour hydrolyser les ARN non-hybrids lors des expriences dhybridation ARN:ADN.

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Les nuclases

5.24 Ribonuclase H

BG 37 La ribonuclase H est une ribonuclase bactrienne qui intervient dans la maturation des RNA amorces qui servent initier la rplication des plasmides. Elle est utilise lors de la synthse du deuxime brin dun cDNA issu de la reverse transcription, afin de limiter les brins synthtiss en dehors de lamorce spcifique (self-primed strands).

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Les nuclases

5.25 Dsoxyribonuclase I

BG 38 La dsoxyribonuclase I est lenzyme de la digestion des ADN chez les animaux. Elle hydrolyse les ADN double ou simple brin jusqu un mlange de nuclotides et doligonuclotides. Elle agit comme une endonuclase, prfrentiellement sur les liaisons adjacentes aux nuclosides pyrimidiques. En prsence de Mg++ elle hydrolyse les liaisons au hasard indpendamment de la squence ; en prsence de Mn++ elle devient plus dpendante de la squence. La DNase pancratique est utilise pour introduire des brches au hasard dans lADN double brin en vue dun marquage par la DNA polymrase. Elle est galement lenzyme danalyse des sites de liaisons protine-DNA par la technique de foot-printing.

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Les nuclases

5.26 Nuclase BAL 31

BG 39 La nuclase BAL 31 est tout dabord une exonuclase 35 qui rsorbe progressivement les extrmits 3 des ADN double brin. Sur les brins 5 sortants quelle isole elle agit ensuite comme une endonuclase pour dtruire les fragments dADN simple brin. Elle est absolument dpendante de la prsence de Ca++ comme cofacteur. Elle a peu dactivit sur les ARN. La nuclase BAL 31 est surtout utilise pour le caractre progressif de son activit exonuclasique : on peut ainsi faire disparatre un un les sites de restriction dun ADN pour connatre lordre dans lequel ils sont prsents dans la squence de cet ADN.

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Les nuclases

5.27 Nuclase S1

BG 40 La nuclase S1 est une nuclase spcifique des ADN (ou ARN) simple brin, bien qu des concentrations leves elle agisse aussi sur les hybrides. Elle agit en milieu acide, en prsence dions Zinc. La nuclase S1 est utilise : pour faire des bouts francs aux extrmits des fragments dADN double brin ; pour hydrolyser les fragments dADN simple brin au niveau des brches (mme sil ne manque quune seule liaison) ; pour isoler les hybrides ADN:ARN lors de lhybridation entre un gne et le cDNA correspondant ; pour ouvrir les pingles cheveux formes lors de la synthse des cDNA.

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Les nuclases

5.28 Nuclease de mung-bean

BG 41 La nuclase des germes de haricot dor est aussi une nuclase spcifique des ADN (ou ARN) simple brin, bien qu des concentrations leves elle agisse galement sur les hybrides. Encore plus douce que la nuclase S1, elle respecte les brins dADN prsentant des brches dune seule liaison (nicks).

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Les nuclases

5.29 Exonuclase de phage

BG 42 Les exonuclases sont des enzymes qui hydrolysent le premier ou le dernier nuclotide au bout dun brin dacide nuclique. Lexodsoxyribonuclase du bactriophage , quon rencontre aussi chez les bactriophages T4 ou T7, ainsi que chez les Mammifres (DNase IV), hydrolyse de prfrence les extrmits 5-phosphate des DNA double-brin en continuant vers le ct 3. (53 exonuclase). Elle produit des nuclosides 5-phosphate. Elle est exprime dans les cultures bactriennes infectes par ces phages.

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Les nuclases

5.30 Exonuclase III

BG 43 Les exonuclases sont des enzymes qui hydrolysent le premier ou le dernier nuclotide au bout dun brin dacide nuclique. Lexodsoxyribonuclase III dEscherichia coli, quon rencontre aussi chez Haemophilus influenzae, hydrolyse de prfrence les extrmits 3OH des DNA double-brin en remontant vers le ct 5. (35 exonuclase). Elle produit des nuclosides 5-phosphate. Cette enzyme est aussi capable dhydrolyser un radical phosphoryl li la fonction 3 alcool du ribose du dernier nuclotide (3-phosphate terminal).

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Les nuclases

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Autres enzymes

Chapitre 6 Autres enzymes

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Autres enzymes

6.1 -galactosidase

BG 44 La -galactosidase est une enzyme dEscherichia coli. Lorsque cette bactrie pousse sur un milieu riche en lactose, elle exprime la -galactosidase qui est un des gnes de lopron lactose. La -galactosidase hydrolyse spcifiquement les liaisons osides dans lesquelles lanomre du galactose engage son carbone rducteur. La -galactosidase est utilise comme gne reporter dans beaucoup de constructions de vecteurs. On introduit le promoteur de lopron lactose et le gne de la -galactosidase dans un vecteur puis on transfecte des bactries avec. Les bactries utilises sont dpourvues de lopron lactose (lac-). En faisant pousser les bactries transfectes en prsence dun inducteur de lopron lactose (IPTG = isopropyl-thio-galactoside) on induit la synthse de lenzyme dans les colonies. En faisant pousser ces colonies en prsence dun substrat artificiel (X-Gal, compos incolore) on permet lhydrolyse de ce substrat par lenzyme qui libre le produit X (5Br,4Cl-indol, color en bleu). La prsence de ce colorant donne la preuve de lactivit de la -galactosidase, donc de son expression partir du gne et par consquent de la viabilit du vecteur transfect dans les bactries.

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Autres enzymes

6.2 Protinase K

BG 45 La protinase K est une protase vgtale trs active, mme en prsence de laurylsulfate (SDS) ou dEDTA, et qui na aucun effet dhydrolyse sur les acides nucliques. Elle hydrolyse les protines de toutes origines en quelques heures avec une prfrence pour les liaisons peptidiques situes aprs les acides amins hydrophobes (leucine, par exemple). La protinase K est utilise dans les techniques de prparation et de purification des acides nucliques.

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Partie II Prparation des acides nucliquesRappel des objectifs Dfinir1 les termes suivants : oligonuclotide, sonde, ADN complmentaire. Dcrire les gestes2 qui permettent de faire lextraction et la purification dADN gnomique partir dun prlvement de sang. Expliquer le principe de lextraction de lARN messager dun tissu et de la ralisation pratique dune banque de cDNA. Dcrire les gestes qui permettent de faire lamplification par PCR dun fragment dADN dont on possde les amorces. Expliquer le principe de la synthse dun oligonuclotide au moyen dun synthtiseur et de la technique des phosphoramidites. Dcrire les gestes qui permettent de faire la synthse dune queue de nuclotides lextrmit dun fragment dADN. Expliquer le principe du dosage des acides nucliques. Faire le calcul de la quantit dacides nucliques partir des donnes brutes fournies par un spectrophotomtre, en tenant compte des dilutions et du volume du milieu considr. Expliquer le principe de lhybridation dune sonde. Faire le calcul de la Tm de cette sonde partir de sa squence et dune formule de calcul. Etablir les conditions des phases dun programme de PCR utilisant deux amorces de Tm voisines. Expliquer les tapes des techniques dhybridation molculaire qui auront t pratiques ou expliques en cours titre dexemples : hybridation sur filtre, hybridation in situ, hybridation en solution. Dcrire le principe technique et les gestes qui permettent de faire le marquage dune sonde par un atome de 32P ou par un nuclotide marqu. Expliquer le principe du squenage dun fragment dADN au moyen dun squenceur et de la technique des dye primers ou des dye terminators ; dcrire et interprter les rsultats3 apparaissant sur lcran de lordinateur aprs un squenage automatique.1. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern. 2. Expliquer le principe, dcrire ou mimer les gestes ou faire un schma explicatif : prciser le motif de chacun de ces gestes. Etre capable de dceler une erreur qualitative dans la description dun protocole. Au niveau des travaux pratiques, les connaissances techniques thoriques tant acquises, on devra tre capable de passer la manipulation sans avoir apprendre que la partie proprement manuelle. 3. Interpreter les rsultats : partir des donnes affiches par la machine, aprs la validation technique de la squence, savoir dcrire la structure de lacide nuclique squen et reconnatre sur cette squence des lsions molculaires dont linterprtation ne ncessite la leve daucune ambigut.

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Expliquer les principe de la recherche des lments cis-rgulateurs sur la squence dun promoteur (foot printing). Expliquer le principe des ractions permettant le dosage des ARN transcrits : PCR quantitative, protection la Rnase.

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Extraction et purification

Chapitre 7 Extraction et purification

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7.1 Purification des lymphocytes

BG 46 Le prlvement de sang veineux au pli du coude est la technique la plus employe pour obtenir de lADN gnomique. Le sang est recueilli sur EDTA, chlateur des ions divalents, cofacteurs des nuclases. Pour faciliter lextraction de lADN on isole du sang total un culot de cellules nucles, les lymphocytes. Le sang est dabord dpos en gradient de densit dans un tube centrifuger, au-dessus dune couche de polyfluorocarbone liquide (Ficoll ) de densit 1,077. Le plasma flotte au dessus de ce produit car sa densit est de 1,006. Puis on centrifuge ce gradient pendant 25 min 700 g la temprature ambiante. Les lymphocytes et dautres cellules blanches sont recueillies la limite suprieure de la couche de Ficoll, tandis que les autres cellules plus denses ont sdiment au fond du tube. Les lymphocytes sont enfin lavs dans du NaCl 0,15 M et recentrifugs 10 min dans les mmes conditions. Ils forment aprs cette deuxime centrifugation un culot blanc au fond du tube.

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7.2 Homognisation des tissus, dprotinisation

BG 47 Lextraction de lADN partir des tissus se fait par broyage dans une presse tissus, suivie dune homognisation dans un tube de Potter. Lhomognat quon obtient est un mlange de dbris de membranes (microsomes), de nombreuses particules subcellulaires (noyaux, mitochondries) et de molcules en solution (cytoplasme). On dissous cet homognat avec une solution de lyse (tampon sans pression osmotique, faisant clater les membranes fermes) en prsence dEDTA et de laurylsulfate de Sodium (SDS) qui inhibent les nuclases. On incube enfin le milieu avec la protinase K, pour dtruire les protines en prsence du dtergent (SDS), la temprature ambiante et pendant toute la nuit.

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7.3 Extraction de lADN

BG 48 Les solutions dacides nucliques et de protines issues des prparations prcdentes sont purifies par addition de phnol satur de tampon Tris-EDTA. Aprs agitation douce du mlange, on spare les phases par une centrifugation de 10 min sous 10000 g la temprature de 4C. A la sortie, on distingue une phase aqueuse surnageante contenant les acides nucliques en solution, une phase organique au fond du tube : phnol + lipides et linterface un gateau de protines prcipites. On recueille la phase aqueuse avant de la laver par un mlange de chloroforme (CHCl3) et dalcool isoamylique dans un rapport 24:1 (volume:volume). On recueille nouveau une phase aqueuse contenant lADN en solution et une phase organique (24:1) contenant des restes de phnol, de protines et de lipides.

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7.4 Isolation de lARN

BG 49 Pour extraire lARN dun tissu ou dune suspension de cellules, il faut imprativement inhiber toute trace de RNase. Lhomognisation dans le tube de Potter se fait dans un tampon Tris-EDTA en prsence de thiocyanate de guanidinium 4 M et de SDS. Les dbris cellulaires sont sdiments en 10 min 10 C. Le surnageant contenant les acides nucliques est dpos sur un gradient de densit comprenant au fond du tube une solution trs dense de CsCl 5,7 M surmonte dune couche intermdiaire de CsCl 2,4 M. Ce gradient est ultracentrifug durant 24 heures 30000 tours/min la temprature ambiante. On peut alors recueillir un culot dARN de masses molculaires leves qui seront soumis lextraction par le phnol et le chloroforme.

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7.5 Techniques de purification (tableau)

BG 50 Il existe de nombreuses techniques de purification des acides nucliques. On peut purifier les ADN par chromatographie dans une colonne de gel en prsence dun dnaturant ou bien par chromatographie dadsorption. Le plus souvent on se contente de multiples prcipitations par lthanol qui suffisent dbarrasser lADN des protines contaminantes et des enzymes.

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7.6 Purification par lthanol

BG 51 La purification dune solution dADN se fait le plus souvent par prcipitations rptes dans lalcool. Une solution dADN, porte haute force ionique par addition de NaCl 3 M (1/10 du volume), est additionne dun large excs dthanol absolu -20C. Au bout de quelques minutes au maximum, on voit apparatre un prcipit blanchtre, translucide et filamenteux (la mduse ) constitu de longs filaments dADN prcipit. On recueille ce prcipit par centrifugation 10000 g pendant un quart dheure environ. Pour laver lADN on resuspend le prcipit dans de lthanol 75 % toujours -20C. puis on centrifuge nouveau. Le culot de cette dernire centrifugation est goutt, puis sch sous vide. On peut conserver lADN sec ou le redissoudre immdiatement soit dans de leau pure strile, soit dans un tampon Tris-EDTA.

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7.7 Purification du RNA-poly(A)

BG 52 Parmi les acides ribonucliques extraits des cellules, la classe la plus tudie est celle des ARN messagers. Ils se caractrisent par la prsence du ct 3-terminal dune longue queue poly(A) synthtise la phase post-transcriptionnelle. On utilisera une chromatographie daffinit entre cette queue poly(A) et une colonne dont la phase fixe est pourvue de fragments doligo(dT) de quelques dizaines de nuclotides qui peuvent shybrider avec les RNA poly(A). Aprs avoir lav la colonne en milieu alcalin (potasse), on charge les RNA totaux haute force ionique (KCl 0,5 M) puis on rince la colonne avec du KCl 0,1 M en surveillant labsorbance de lluat 260 nm pour sassurer de llimination des RNA non retenus par la colonne (rRNA, tRNA,... ). Enfin, on lue la fraction retenue par la colonne en abaissant la concentration de KCl 0,01 M et en levant la temprature. Un micro essai avec la reverse transcriptase permet de sassurer de la qualit de ce RNA poly(A) comme matrice pour la synthse de cDNA.

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Chapitre 8 Synthse des polynuclotides

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8.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

BG 53 La PCR (polymerase chain reaction) permet damplifier spcifiquement une rgion de DNA double brin de quelques centaines de paires de bases. Ce DNA doit dabord tre spar en simples brins (dnaturation 95C). On ajoute au DNA de dpart une large quantit damorces (oligonuclotides synthtiques complmentaires des deux extrmits de la rgion amplifier) qui vont shybrider 50-60C environ avec la squence complmentaire sur chacun des brins de DNA, et les quatre dNTP qui serviront de substrats. On soumet le tout lactivit dune DNA polymrase (Taq polymerase) qui synthtise 72C un brin complmentaire partir du 3OH de lamorce hybride. On obtient quatre brins de DNA. On recommence dnaturer ces 4 brins, puis on les laisse shybrider avec les amorces (toujours en excs) et la polymrase entre en action pour aboutir 8 brins de DNA. On recommence dnaturer ces 8 brins, puis on les laisse shybrider avec les amorces (toujours en excs) et la polymrase entre en action pour aboutir 16 brins de DNA. Et ainsi de suite 30 40 fois, ce qui aboutit 34359738368 brins de DNA (34 milliards), ce qui reprsente une quantit suffisante pour tudier le fragment de DNA amplifi.

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8.2 PCR (I-1)

BG 53/1 La PCR (polymerase chain reaction) est destine synthtiser un grand nombre de fragments dADN identiques un fragment dintrt afin de pouvoir le caractriser. Ce fragment multiplier est situ dans un ADN gnomique ou dans un cDNA. Il est indispensable que soient connues les squences aussi exactes que possible de deux petits oligonuclotides (20 30 nt) situs aux deux extrmits du fragment dintrt (ct 5 ou amont ; ct 3 ou aval). On synthtise ces oligonuclotides pour servir damorces la raction. Lamorce ct 5 est identique la squence connue en amont. Lamorce ct 3 est antiparallle et complmentaire de la squence connue en aval, cest dire identique celle de lautre brin ce niveau. Pour commencer la raction on dnature lADN en le chauffant 95 plusieurs minutes, pour sparer les deux brins.

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8.3 PCR (I-2)

BG 53/2 Chacune des amorces amont et aval est complmentaire dune squence connue et on peut dterminer la Tm de leur hybridation : ici, 52C pour la squence amont et 54C pour la squence aval. En refroidissant la temprature vers 50C (un peu en-dessous des Tm des deux amorces) les fragments dADN dnatur vont pouvoir shybrider avec des squences complmentaires. La concentration des amorces tant beaucoup plus leve que celle des brins dADN, chaque brin dADN shybridera avec une amorce qui lui est complmentaire. Ainsi le brin du bas, orient 53 de droite gauche, shybridera avec lamorce amont, oriente 53 de gauche droite et le brin du haut, orient 53 de gauche droite, shybridera avec lamorce aval, oriente 53 de droite gauche.

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8.4 PCR (I-3)

BG 53/3 A 95C durant la phase de dnaturation, puis 50 C durant la phase dhybridation, la Taq polymrase tait inactive parce que trop loigne de sa temprature optimale dactivit (75 80C). En remontant la temprature 72C, lenzyme commence son activit. Comme toutes les DNA polymrases elle ncessite un ADN double brin avec une extrmit 3OH rentrante pour initier la polycondensation des dsoxyribonuclotides, elle lit le brin modle de 3 vers 5 et elle construit le nouveau brin de 5 vers 3 qui se prolonge autant quil existe un brin complmentaire pour servir de modle. Le nouveau brin dADN est form partir de lamorce amont (ct 5) et se prolonge vers la droite (ct 3). Lautre brin dADN est form partir de lamorce aval (ct 5) et se prolonge vers la gauche (ct 3). La synthse nest limite que par le temps dincubation (environ 1000 nuclotides par minute).

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8.5 PCR (II-1)

BG 53/4 Au cours de la phase dlongation chacun des brins du fragment dintrt a t rpliqu une fois, la nombre de copies a donc doubl. Le deuxime cycle commence par la phase de dnaturation pendant laquelle on dnature nouveau lADN en le chauffant 95 plusieurs minutes, pour sparer les deux brins dorigine des brins nouvellement synthtiss.

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8.6 PCR (II-2)

BG 53/5 Les brins dADN nouvellement synthtiss ont rpliqu le fragment dintrt et aussi la squence complmentaire de lamorce qui le suit. En refroidissant la temprature vers 50C (un peu en-dessous des Tm des deux amorces) les fragments dADN dnatur et les fragments dADN nouvellement synthtiss vont pouvoir shybrider nouveau avec les amorces. Ainsi les brins orients 53 de droite gauche shybrideront avec lamorce amont, oriente 53 de gauche droite et les brins orients 53 de gauche droite shybrideront avec lamorce aval, oriente 53 de droite gauche.

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8.7 PCR (II-3)

BG 53/6 La Taq polymrase, thermorsistante, a t inactive mais pas dnature durant la phase de dnaturation de lADN. En remontant la temprature 72C, lenzyme recommence donc son activit. Elle catalyse la polycondensation des dsoxyribonuclotides, qui se prolonge autant quil existe un brin complmentaire pour servir de modle. Le nouveau brin dADN form partir de lamorce amont (ct 5) et se prolonge vers la droite (ct 3). Lautre brin dADN form partir de lamorce aval (ct 5) et se prolonge vers la droite (ct 3). Sur les brins dADN (en jaune) synthtiss partir des amorces au cycle prcdent, la synthse sera limite au ct 5 de lamorce oppose, faute de modle pour poursuivre. Seul le fragment dintrt sera rpliqu sur ces nouveaux fragments.

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8.8 PCR (III-1)

BG 53/7 Au cours de la prcdente phase dlongation chacun des brins dADN contenant la squence du fragment dintrt a t rpliqu une fois, la nombre de copies a donc encore doubl. A chaque cycle ce nombre doublera nouveau et lamplification se poursuit comme la suite des puissances de 2 : 22, 23, 24, 25, 26, 27,... la fin du 35me cycle, il y aura 235 copies soit plus de 34 milliards de copies ! Le cycle suivant commence par la phase de dnaturation pendant laquelle on dnature nouveau lADN en le chauffant 95 plusieurs minutes. A ce stade, il reste encore les deux ADN de dpart, quelques ADN limits par une seule des squences amorces et les squences, de plus en plus nombreuses, limites par les squences des deux amorces.

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8.9 PCR (III-2)

BG 53/8 En refroidissant la temprature vers 50C (un peu en-dessous des Tm des deux amorces) les fragments dADN dnatur et les fragments dADN nouvellement synthtiss vont pouvoir shybrider nouveau avec les amorces. Ainsi les brins orients 53 de droite gauche shybrideront avec lamorce amont, oriente 53 de gauche droite et les brins orients 53 de gauche droite shybrideront avec lamorce aval, oriente 53 de droite gauche.

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8.10 PCR (III-3)

BG 53/9 En remontant la temprature 72C, lenzyme recommence encore son activit. Elle catalyse la polycondensation des dsoxyribonuclotides, qui se prolonge autant quil existe un brin complmentaire pour servir de modle. Le nouveau brin dADN form partir de lamorce amont (ct 5) et se prolonge vers la droite (ct 3). Lautre brin dADN form partir de lamorce aval (ct 5) et se prolonge vers la gauche (ct 3). Sur les brins dADN (en jaune) synthtiss partir des amorces au cycle prcdent, la synthse sera limite au ct 5 de lamorce oppose, faute de modle pour poursuivre. Seul le fragment dintrt sera rpliqu sur ces nouveaux fragments. Le nombre de copies de lADN dorigine avec une seule amorce-limite va continuer crotre arithmtiquement et le nombre de copies avec deux amorces-limites continuera crotre exponentiellement, jusqu ce que ces dernires, soient pratiquement pures dans lADN amplifi final.

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8.11 Nested-PCR

BG 54 Les amorces spcifiques sont essentielles dans les techniques de PCR car elles seules vont dterminer le fragment amplifier. Lorsquil existe des squences homologues cette spcificit nexiste plus et la technique doit tre modifie pour mieux cibler le fragment amplifier. On utilise deux couples damorces. Des amorces externes dont la spcificit peut permettre damplifier la fois un petit nombre de squences homologues et des amorces internes permettant damplifier spcifiquement une des squences rvles par le couple damorces externes. Cette technique dite de nested-PCR (PCR niche) se pratique comme la PCR avec le couple damorces externes pour dix cycles damplification. A cette tape on ajoute un excs dune ou de deux amorces internes avant de prolonger lamplification pour encore 25 cycles environ. Cette procdure permet le plus souvent dobtenir lamplification spcifique dun seul fragment.

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8.12 Phosphoramidites : dA-3-support protge

BG 55 La synthse des oligonuclotides se fait sur la phase fixe dune colonne parcourue par un flux de liquide contenant successivement les ractifs ncessaires. Contrairement ce qui se passe dans la nature, la synthse chimique des oligonuclotides se fait de 3 vers 5. Sur les particules solides de la colonne est fix au dpart un nuclotide qui sera le dernier de la squence synthtiser (extrmit 3OH terminale). Ce nuclotide est li par sa fonction alcool secondaire en 3 une fonction amine du support, par lintermdiaire dun acide succinique pour permettre la libre rotation de lensemble par rapport au support. Pour permettre de diriger la synthse le nuclotide terminal a toutes ses fonctions bloques par des radicaux empchant les ractions prmatures ou parasites : radical dimthoxytrityl (DMTr), pour lalcool primaire en 5 du dsoxyribose acide benzoque, pour les fonctions amines de ladnine ou de la cytosine acide isobutyrique pour la fonction amine de la guanine.

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8.13 Phosphoramidites : dtritylation

BG 55/1 Avant de faire la liaison du deuxime nuclotide (qui sera lavant-dernier de loligonuclotide final) on enlve le radical DMTr qui protge lextrmit 5OH du nuclotide de dpart. Cette dtritylation est obtenue en faisant passer sur la colonne une solution dacide trichloractique (TCA) qui hydrolyse la liaison ther entre le DMTr et la fonction 5OH du dsoxyribose.

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8.14 Phosphoramidites : addition dun nuclotide

BG 55/2 Laddition dun nouveau nuclotide est faite en chargeant la colonne dune solution contenant le nouveau nuclotide avec des fonctions protges : par le DMTr pour la fonction 5OH par les ractifs (benzoate, isobutyrate) protgeant les fonctions des bases azotes le phosphore li la fonction alcool en 3 est un phosphoramidite dont la fonction amine est substitue par deux radicaux isopropyl et la fonction acide par un radical mthyl. En prsence de ttrazole, le nouveau nuclotide charg voit sa liaison phosphoamide hydrolyse et la fonction acide ainsi apparue va estrifier la fonction alcool dprotge du dernier nuclotide prcdemment fix la colonne. La liaison phosphodiester 35 est cre mais le phosphore est encore rduit (trivalent).

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8.15 Phosphoramidites : blocage des supports

BG 55/3 Toutes les fonctions alcool primaires de la colonne peuvent ragir avec les fonctions acides libres par le ttrazole. En principe, seules les fonctions 5OH terminales du dernier nuclotide li la colonne ont t dprotges et peuvent ragir de la sorte. Le rendement de cette raction est presque total (> 99 %). Afin quaucune erreur de squence ne soit possible par la suite, on passe de lanhydride actique sur la colonne pour bloquer nouveau les fonctions alcool estrifiables qui par accident nauraient pas t lies au phosphoramidite ltape prcdente. Les oligonuclotides qui nauraient pas ragi avec le nouveau nuclotide sont ainsi carts dfinitivement de la suite du cycle de synthse.

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8.16 Phosphoramidites : oxydation

BG 55/4 Le phosphore trivalent de la liaison phosphodiester est ensuite oxyd par liode en phosphore pentavalent (phosphate). La seule fonction acide de ce phosphate non lie aux dsoxyriboses reste bloque par le radical mthyl. La colonne porte maintenant un nuclotide de plus dont les fonctions sont bloques. Lintroduction du nuclotide suivant sera prcde de la dprotection de la fonction alcool primaire en 5, prsentement bloque par un DMTr, et le cycle recommence : addition dun nuclotide, blocage des supports, oxydation, dprotection, etc, autant de fois quil faudra de nuclotides pour complter la squence demande.

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8.17 Phosphoramidites : dprotection

BG 55/6 Lorsque le dernier cycle de synthse a eu lieu, loligonuclotide est encore li la colonne par son extrmit 3 et toutes ses fonctions ractives sont protges. Afin de donner au produit la structure dun ADN normal, on dprotegera progressivement : acide trichloractique pour dprotger la fonction 5OH initiale, thiophnol pour transformer les phosphotriesters en phosphodiesters en enlevant les groupes mthyl, ammoniaque concentre 25 C pour dtacher loligonuclotide de son support et enlever une partie des radicaux actyl de protection, le reste des radicaux actyl et les radicaux benzoyl sont dtachs par lammoniaque concentre 55 C.

Le produit final est habituellement purifi sur colonne ou dans un gel pour liminer les produits de synthses incompltes.

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8.18 Synthse dun cDNA

BG 56 La manipulation et ltude des RNA est difficile cause de leur grande sensibilit aux ribonuclases qui les dtruisent. Il est ncessaire de recopier la squence en DNA pour quelle soit plus stable et quon puisse lamplifier en fonction des besoins. Le mRNA purifi (chromatographie daffinit sur une colonne doligo-d(T)) est li dans un premier temps avec des oligonuclotides poly(T) qui sattachent la queue poly(A). A partir de lextrmit 3 de cette amorce poly(T) la transcriptase rverse, qui est une DNA polymrase, synthtise un brin de DNA complmentaire du messager de dpart. Une fois cette synthse acheve on dgrade le RNA par une base forte ou par une ribonuclase spcifique. Le brin de DNA fabriqu forme spontanment son extrmit 3 une boucle en pingle cheveux en shybridant sur lui-mme. Lextrmit 3 de cette boucle va servir de site de dmarrage pour la DNA polymrase qui va synthtiser un brin de DNA complmentaire du premier. Une nuclase spcifique du DNA simple brin supprimera la boucle de lextrmit. Le cDNA double brin est prt. On peut ainsi constituer autant de cDNA quil existe de messagers dans une cellule : lensemble de ces cDNA forme une banque de cDNA .

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8.19 Sondes de cDNA amplifi

BG 56/1 On peut effectuer directement la synthse biologique dune sonde partir dun ARN messager, isol dans la fraction des RNA-poly(A). Dans une premire tape, une amorce oligo d(T) est hybride avec les squences poly(A) des ARN messagers et la transcriptase rverse permet la synthse dun cDNA. Dans la seconde tape, une amorce spcifique permet de synthtiser le second brin dun cDNA correspondant lamorce choisie. Enfin, la PCR permettra damplifier les deux brins dADN jusqu lobtention dune quantit suffisante de la sonde. Au cours de cette PCR on peut marquer la sonde avec un nuclotide radioactif ou biotinyl. Si la spcificit de lamorce nest pas suffisante, une seconde paire damorces spcifiques permettra dobtenir la squence recherche (nested-PCR).

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8.20 Structures secondaires

BG 56/2 Les amorces synthtises prsentent parfois dans leur structure primaire des zones complmentaires qui shybrident en formant des boucles ou pingles cheveux (hair pin loops). Lorsque ces structures sachvent par une extrmit 3OH rentrante elles forment des sites de dmarrage pour la polymrase. Lenzyme synthtise alors des fragments parasites partir des amorces qui peuvent aller jusqu une taille double de celle des amorces hybrides. Des logiciels permettent de prvoir ces structures pour les viter.

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8.21 Synthse des queues poly(dN)

BG 57 La synthse dune queue poly(dN) est catalyse par la transfrase terminale en prsence de cations divalents : Mg++, Mn++, Co++ LADN allonger doit prsenter une extrmit 3 sortante ou dfaut un bout franc. Cest pourquoi il est utile de le digrer dabord avec une enzyme de restriction comme Kpn I ou Pst I (bouts 3 sortants) ou dfaut comme Pvu II (bouts francs). Lion Co++ permet la condensation prfrentielle du dCTP, donc la synthse de queues poly(dC).

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Chapitre 9 Caractrisation des acides nucliques

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9.1 Principaux oligonuclotides

BG 58 On synthtise des oligonuclotides pour de multiples techniques : des petits oligonuclotides de 6 nt pour le random priming ; des amorces de 20 30 nt pour la PCR ; des amorces modifies pour la cration des sites de restriction ou pour la mutagnse dirige ; des sondes enfin de 30 nt quelques kilobases pour servir de sondes dans les Southern blots.

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9.2 Spectres UV des bases nucliques

BG 59 La plupart des molcules biologiques contenant des noyaux aromatiques absorbent les rayons ultraviolets diffrentes longueurs donde. Dans lultraviolet de trs courte longueur donde presque toutes les solutions de molcules biologiques sont opaques. Dans la rgion dmission des lampes vapeur de mercure (254 nm) les bases puriques et pyrimidiques ont des pics dabsorption spcifiques quon utilise pour comparer avec les spectres dabsorption des acides amins aromatiques dans la mme rgion. Sur ce graphe les ordonnes reprsentent labsorption de la lumire transmise en fonction des longueurs donde reprsentes en abscisse. Les zones dabsorption des quatre bases stalent de 240 280 nm de sorte que les acides nucliques forms de ces quatre types de nuclotides ont un maximum dabsorption 260 nm.

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9.3 Spectre UV des acides amins

BG 60 Les radicaux aromatiques de certains acides amins (Phe, Tyr, et surtout Trp) ont la proprit dabsorber la lumire ultraviolette. Sur ce graphe les ordonnes reprsentent labsorption de la lumire transmise en fonction des longueurs donde reprsentes en abscisse. Labsorption 280 nm est due principalement aux noyaux phnols des tyrosines, parce que cet acide amin est plus frquent que le tryptophane, qui est pourtant beaucoup plus opaque cette longueur donde. Labsorption de la lumire UV 280 nm est caractristique des protines et sert doser ces protines lorsquelles sont en solution dans leau et quil nexiste pas dautres molcules absorbant la lumire UV cette longueur donde (acides nucliques par exemple).

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2006 - 2007


9.4 Dosage des acides nucliques

BG 61 Pour effectuer par spectrophotomtrie directe le dosage dune solution pure dacides nucliques, on utilise labsorbance des rayons ultraviolets 260 nm. On considre dans les calculs quune mole de nuclotides polycondenss reprsente 309 grammes. Il faut se placer autant que possible dans des condi

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biologie génique