BIOQUÍMICA – LCB 208

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO ESCOLA SUPERIOR DE AGRICULTURA “LUIZ DE QUEIROZ”

Departamento de Ciências Biológicas

BIOQUÍMICA – LCB 208 ROTEIRO DE AULAS PRÁTICAS

DOCENTES: Prof. Dr. Daniel Sherer de Moura Profa. Dra. Helaine Carrer Prof. Dr. Luiz Antônio Gallo Prof. Dr. Luiz Carlos Basso

Técnica Responsável: Aline Borges

Piracicaba - SP

2014

2

SUMÁRIO

AULAS pg

1. Colorimetria e Espectrofotometria 03

2. Determinação de Lactose no leite 07

3. Cromatografia em Papel de Filtro 11

4. Determinação do Teor de Caseína no leite (Reação do Biureto) 16

5. Determinação da Constante de Michaelis (Km) e da Velocidade máxima (Vm) para a Invertase de Levedura 19

6. Reação de Hill (Fotólise da água) 23

3

COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA 1. OBJETIVOS

Dosagens de espécies químicas mediante a absorção de luz. 2. FUNDAMENTOS DO MÉTODO

A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento

analítico através do qual se determina a concentração de espécies químicas mediante a

absorção de energia radiante (luz).

A luz pode ser entendida como uma forma de energia, de natureza ondulatória,

caracterizada pelos diversos comprimentos de onda (, expressos em m ou nm) (Figura 1) e

que apresenta a propriedade de interagir com a matéria, sendo que parte de sua energia é

absorvida por elétrons da eletrosfera dos átomos constituintes das moléculas.

Figura 1. Espectro de absorção de luz em diversos comprimentos de onda ().

Uma solução quando iluminada por luz branca, apresenta uma cor que é resultante da

absorção relativa dos vários comprimentos de onda que a compõem, que pode ser analisados

por um espectrofotômetro (Figura 2). Esta absorção, em cada comprimento de onda, depende

da natureza da substância, de sua concentração e da espessura da mesma que é atravessada pela

luz.

Figura 2. Componentes e funcionamento de um espectrofotômetro para análise da absorção de um determinado

comprimento de onda específico de uma solução.

4

A Lei de Lambert-Beer: a absorbância é proporcional à concentração da espécie

química absorvente, sendo constante o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo

feixe luminoso e demais fatores. Verifica-se uma relação linear entre absorbância ou densidade

ótica e concentração, e de uma relação logarítmica entre transmitância e concentração.

c = concentração da espécie química absorvente b = espessura atravessada pelo feixe luminoso Io= intensidade de luz incidente I = intensidade de luz emergente (transmitida)

I < Io Io

Ab = D.O. = K.b.c = log (absorbância ou densidade ótica)

I A Transmitância ou Transmissão (T%) corresponde a: I Io I T = 100 x

100 T Io I T Io 100

como, = , temos que : =

Io 100 I T Io 100

portanto, log = log

I T logo, Ab = log 100 - log T

Ab = 2 – log T

5

3. MATERIAL

Espectrofotômetro com cubetas

Micropipetas de 1 mL

Estante com tubos de ensaio

Alaranjado de Metila (10µg/mL)

Azul de Bromofenol (10µg/mL)

4. PRÁTICA

A. Coleta de dados para a construção do espectro de absorção:

Alaranjado de Metila ou do Azul de Bromofenol (um composto para cada grupo).

Usando água destilada como referência, efetuar as leituras de Absorbância (ou D.O.) do

Alaranjado de Metila (nos seguintes comprimentos de onda: 400, 420, 440, 460, 480, 500,

520, 550, 600, 650 e 700 nm) e o Azul de Bromofenol (nos seguintes comprimentos de onda:

400, 440, 490, 520, 540, 565, 580, 590, 620, 660 e 700 nm)

Preencher os dados da tabela abaixo, de acordo com o corante escolhido pelo grupo:

Alaranjado de Metila (10 µg/mL) Azul de Bromofenol (10 µg/mL) λ (nM) T (%) Ab (2-logT) λ (nM) T (%) Ab (2-logT)

400 400 420 440 440 490 460 520 480 540 500 560 520 580 550 590 600 620 650 660 700 700

Utilizando os dados da tabela acima preparar um gráfico (x = comprimento de onda

nm) e (y = leitura em absorbância), encontrando qual o comprimento de onde se refere ao pico

de absorção do corante usado em aula.

6

B. Demonstração da Lei de Lambert-Beer:

Preparar 6 tubos de ensaio (enumerados de 0 a 5) conforme o quadro que se segue. o

tubo no 6 estará contendo solução do corante com concentração desconhecida, a qual deverá ser

determinada através da Lei de Lambert-Beer.

Tubo (No)

Água (mL)

Corante* (mL)

Concentração Obtida (g/mL)

Transmitância (T%)**

Absorbância (Abs Ou D.O.)

0 5 0 1 4 1 2 3 2 3 2 3 4 1 4 5 0 5

6 5 mL Encontrar no gráfico

(Equação da Reta)

* Alaranjado de Metila ou Azul de Bromofenol na concentração de 10 µg/mL. ** Leituras efetuadas no comprimento de onda que corresponde ao pico de absorção do composto ( máximo).

5. QUESTIONÁRIO:

1) Qual o comprimento de onda correspondente ao Pico de absorção da luz para cada

corante? ________________________

2) Utilizando um programa de planilha eletrônica (p.ex.: excel), obter a equação da reta a partir da reta padrão.

A) Eq. Reta: ____________________

B) Concentração da solução do corante (solução problema): ____________

7

DETERMINAÇÃO DE LACTOSE NO LEITE

(MÉTODO DE SOMOGY & NELSON) 1. OBJETIVO

Determinar a concentração de lactose (açúcar redutor) no leite conservado em geladeira e

mantido à temperatura ambiente empregando o método de Somogyi &Nelson.

2. FUNDAMENTOS DO MÉTODO

Carboidratos que apresentam em sua estrutura molecular os grupos aldeído ou cetona

livres (no carbono 1), possuem poder redutor e são por isso denominados açucares redutores.

Geralmente, estes açúcares são monossacarídeos ou dissacarídeos que podem ser oxidados por

agentes oxidantes relativamente suaves, tais como os íons férricos (Fe3+) e cúprico (Cu2+).

Estes íons, por sua vez, são reduzidos pela ação dos açúcares redutores (agentes redutores). No

açúcar, o carbono do grupo carbonila é oxidado a carboxila. É possível determinar a

concentração de um açúcar redutor pela medida da quantidade de agente oxidante que é

reduzido pela solução desse mesmo açúcar.

A lactose (Figura 1A) é o principal carboidrato do leite, produzida pela glândula

mamária, sendo ainda a principal fonte de energia dos recém nascidos. Além disso, a lactose é

um dissacarídeo redutor, que reduz o íon cúprico do Reativo de Somogyi a óxido cuproso, em

meio alcalino e a quente. Em seguida, o óxido cuproso reage com o ânion arseno-molibdato do

Reativo de Nelson produzindo um composto de coloração azul - óxido de molibdênio, Mo2O3,

com λ máx.= 540 nm (Figura 1B).

Dentro de certos limites, a intensidade da coloração azul é diretamente proporcional à

quantidade de lactose no leite. Essa intensidade de coloração pode ser medida utilizando-se um

espectrofotômetro, que detecta a absorção de luz pelo óxido de molibdênio.

Figura 1. (A) Estrutura molecular do dissacarídeo lactose (β-galactose 1,4 α-glicose), evidenciando o

carbono 1 contendo o grupo aldeído da glicose, envolvido em ligação hemiacetal (região redutora). (B) Reações envolvidas no método de Somogyi & Nelson, mostrando a formação do óxido de molibdênio, Mo2O3, um composto de coloração azul, com máx.= 540 nm.

Antes da reação quantitativa, a amostra de leite deve ser desproteinizada e clarificada, mediante precipitação de interferentes com Ba(OH)2 e ZnSO4.

8

3. MATERIAL

Espectrofotômetro

Centrífuga de mesa

Banho-maria (ebulição)

Balão volumétrico de 100 mL

Estante com 8 tubos de ensaio e 2 tubos de centrífuga

Micropipetas de 1mL

Hidróxido de bário 0,3N

Sulfato de zinco 5%

Reativo de Somogyi: dissolver 28 gramas de fosfato de sódio dibásico ou monoácido e

40 gramas de tartarato duplo de sódio e potássio em 700 ml de água. Adicionar 100 ml de

NaOH 1N. Gotejar, sob agitação constante, 80 ml de CuSO4.5H2O a 10%. Adicionar

180 gramas de sulfato de sódio anidro e completar a 1 litro. Deixar em repouso por 2 dias

e filtrar. Guardar em frasco escuro a cerca de 37ºC. Filtrar antes do uso.

Reativo de Nelson: dissolver 50 gramas de molibdato de amônio em 900 ml de água

destilada. Cuidadosamente, adicionar 52 ml de ácido sulfúrico concentrado. Adicionar 3

gramas de arseniato dibásico de sódio dissolvido em 50 ml de água. Completar para 1

litro e manter em repouso em frasco escuro durante 2 dias antes de uso e filtrar.

Padrão de lactose: dissolver 0,1 gramas de lactose pura em um litro de água. Esta solução

conterá 100 g/mL.

4. PRÁTICA

a) Tomar 6 tubos de ensaio e numerá-los de 0 a 5. Adicionar 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 e 1 mL da

solução padrão de lactose (100 g/mL) e completar o volume a 1 mL com água destilada.

b) Acrescentar em cada tubo 1 mL do Reativo de Somogyi e agitar. Deixar em banho-maria

fervente por 10 minutos. Esfriar em água corrente.

c) Adicionar 1 ml do Reativo de Nelson e agitar. Completar o volume a 10 mL,

adicionando 7 ml de água destilada.

d) Fazer leitura em espectrofotômetro em 540 nm. Preencher a tabela abaixo:

TUBO (No)

ÁGUA (ml)

Lactose (mL)

Conc. Obtida

(g/mL)

Reat. Somogy

(mL)

Banho Maria (min)

Reat. Nelson (mL)

Compl. Vol. (10

mL)

Transmit. (T%)

Absorb.

Absorb.

0 1.0 0 1.0 10 1.0 7 mL 0 1 0.8 0.2 1.0 10 1.0 7 mL 2 0.6 0.4 1.0 10 1.0 7 mL 3 0.4 0.6 1.0 10 1.0 7 mL 4 0.2 0.8 1.0 10 1.0 7 mL

5 0 1.0 1.0 10 1.0 7 mL

9

A. Preparo das Amostras de Leite

Cada grupo receberá 2 amostras de leite: uma armazenada em geladeira e outra mantida

à temperatura ambiente.

a) Transferir 2 mL da amostra de leite para balão volumétrico de 100 mL e completar o

volume com água destilada. Agitar bem.

b) Transferir 1 mL (com pipeta volumétrica) da solução diluída de leite para tubo de

centrífuga. Efetuar a remoção dos interferentes pela adição de 1,0 mL de ZnS04 a 5% (agitar) e

acrescentar 1,0 mL de hidróxido de bário 0,3N. Agitar. Completar a 10 mL adicionado 7 mL de

água destilada. Agitar. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos (3.000 rpm).

B. Determinação do Teor de Lactose no Leite Determinar os teores de lactose nas duas amostras de leite, preparando as amostras como

segue na tabela abaixo:

Tubo

Volume

(mL) Reat.

Somogy (mL)

Banho Maria (min.)

Reat. Nelson (mL)

Água destilada

(mL)

Transmit. (T%)

Absorb.

Absorb.

[lactose] (µg/mL)

Leite Ambiente

1,0 1,0 10 1,0 7 mL

Leite Geladeira

1,0 1,0 10 1,0 7 mL

Teor de lactose no leite ambiente: ..........%

Teor de lactose no leite geladeira: ..........%

5. QUESTIONÁRIO – CARBOIDRATOS E LIPÍDEOS

1) Em relação à Aula Prática, responder:

a) Qual a Equação da Reta através da análise de correlação linear entre os resultados da primeira tabela (Δ Abs X [lactose])?

b) Quais as concentrações das amostras desconhecidas (Geladeira e Ambiente) em cada tubo de ensaio?

c) Qual a concentração das amostras desconhecidas (Geladeira e Ambiente) em g/100 mL de leite (%), observar que a amostra de leite analisada foi diluída 1:500?

d) Explique os resultados obtidos nas concentrações de lactose no leite Ambiente e Geladeira.

10

2) Defina ligação hemicetal demonstrando um exemplo através de uma cetose e uma aldose (ciclo hexose).

3) Escreva a fórmula cíclica (projeção) dos principais monossacarídeos (hexoses). Considere as posições D, L, e .

4) A molécula de D-- glicose difere em que de uma molécula de D- -glucose?

5) Explique resumidamente: (1) Como se faz a numeração da cadeia de um monossacarídeo; (2) Diferencie posição D, L, (+) e (-).

6) Escreva as fórmulas de: sacarose, maltose, lactose e celobiose.

7) O que são ligações glicosídicas dos tipos a ( 1,4) e a ( 1,4)?

8) Quais as diferenças entre os polissacarídeos amido, glicogênio e celulose quanto às ligações glicosídicas? Comente sobre suas funções destas três moléculas.

9) Como se dividem os polissacarídeos? Dê exemplos.

10) O que são dextranas, frutanas e hemicelulose?

11) O que são n-glicosídeos, o-metílicos, açúcares-alcoóis e amino-açúcares?

12) Citar as funções dos lipídeos nos seres vivos.

13) Qual a importância do índice de saponificação e índice de iodo (em relação ao peso molecular e grau de insaturação) nos ácidos graxos, gorduras e óleos.

14) Escreva a relação entre ponto de fusão e solubilidade quanto ao peso molecular, estrutura e grau de insaturação de lipídeos.

15) O que ocorre na rancificação oxidativa? Qual o papel dos antioxidantes? Cite exemplos.

16) Citar as características necessárias para que uma molécula funcione como sabão ou detergente.

17) Quais os componentes estruturais de uma cera e o tipo de ligação entre elas?

18) O que são ácidos graxos saturados, insaturados e poliinsaturados? Dê exemplos.

19) Quais as funções dos triglicerídeos? Que tipo de ligação existe?

20) Qual a função dos fosfolipídeos? Escreva um exemplo, dando sua importância.

21) A Testosterona e a Progesterona pertencem a qual classe de lipídeos? Por quê?

11

CROMATOGRAFIA EM PAPEL DE FILTRO

1. OBJETIVO

Identificação de aminoácidos numa solução desconhecida por cromatografia em papel

filtro.


Nesta aula prática a técnica de cromatografía em papel filtro será utilizada para análise

de aminoácidos em solução. De um modo geral, o termo cromatografía pode ser definido como

um procedimento bioquímico em que uma mistura de substâncias é separada pela carga,

tamanho, solubilidade ou outra propriedade de seus componentes, através de sua partição entre

uma fase móvel e uma fase estacionária.

O método de cromatografia em papel filtro será utilizado nesta aula para separação e

identificação de aminoácidos. Para entendermos tais fundamentos devemos considerar a

solubilidade dos aminoácidos num determinado solvente (variando em função da temperatura)

e a propriedade dos aminoácidos de se tornarem coloridos após reagirem com substâncias

específicas. Dependendo da estrutura molecular da cadeia lateral dos aminoácidos, estes

apresentarão diferentes solubilidades no solvente empregado, mantida a temperatura constante.

A capacidade de um determinado solvente (contido num recipiente) subir contra a força da

gravidade através de um papel absorvente é muito importante nesta técnica de cromatografia

em papel filtro, como mostrado na Figura 1. Conforme o solvente sobe pelo papel absorvente,

ele pode levar consigo diferentes aminoácidos a diferentes distâncias separando-os a partir de

uma mistura inicial de aminoácidos.

Figura 1. A migração da fase móvel (solvente) pelo papel filtro (fase estacionária) de modo ascendente

(representado por setas vermelhas) é importante na técnica cromatográfica. Soluções de aminoácidos colocadas sobre a linha básica através de micropipetas serão transportadas pelo solvente a diferentes alturas. Após pulverização com ninhidrina, o papel filtro apresentará manchas coloridas em diferentes alturas, que representam os aminoácidos separados.

A partir da distância percorrida pelos aminoácidos desde a linha básica até o centro da

mancha formada após a pulverização com ninhidrina, podemos calcular o chamado fator de

retenção (Rf). Este pode ser definido como a relação existente entre a distância percorrida pelo

soluto – aminoácido (até o centro da mancha), pela distância total percorrida pelo solvente

(Figura 2). O valor de Rf revela a solubilidade de cada aminoácido no solvente empregado.

12

Figura 2. Soluções de aminoácidos a, b e c foram colocadas sobre a linha básica e percorreram as distâncias a’, b’

e c’, respectivamente. A distância d refere-se à distância percorrida pelo solvente. Assim, os fatores de retenção para cada solução de aminoácido são: Rfa=a’/d; Rfb=b’/d; Rfc=c’/d.

A. Teoria sobre Rf (Equação de Martin e Synge) Chama-se de Rf a relação:

onde: a = coeficiente de partição

As = área ocupada pelo soluto na fase estacionária Al = área ocupada pelo soluto na fase móvel

B. Solventes usados em cromatografia:

De acordo com as substâncias a serem cromatografadas, utilizamos os mais solventes

diversos: Fenol - Água (80: 20)

Usado para cromatografia de aminoácidos. Pode-se inclusive adicionar 40 mg de 8-

hidroxiquinolina de 1 ml de NH4OH concentrado por 100 ml de solvente. Butanol: HaO (4: 1: 1)

Também empregado na cromatografia de aminoácidos, açúcares etc. Benzol: butanol: Piridina: H2O (5: 3: 3: 1)

Existem basicamente dois modos de revelação

Pelo uso da luz Ultravioleta: empregado quando os compostos possuem núcleo que revelam o comprimento de onda ao nível do U.V.;

13

Uso de reagentes: comumente utiliza-se para açúcares e imersão na seguinte solução: 1 mL de anilina + 1g de difenilamina + 100 mL de acetona + 10 mL de H2PO4 a 85%.

Para aminoácidos pulveriza-se o papel com solução de ninhidrina a 0,3% em álcool

(usado na aula)

Para ácidos orgânicos pulveriza-se o papel com a seguinte solução: 1g de xilose + 3 mL

de água + 1 mL de anilina + 100 mL de álcool metílico;

3. MATERIAL

- Papel Filtro (Whatmann);

- Câmara cromatográfica;

- Solvente (butanol, ácido acético e água na proporção de 4:1:1);

- Solução de aminoácidos padrão (arginina, leucina e prolina);

- Solução desconhecida (problema);

- Secador de cabelo;

- Lápis;

- Solução alcoólica de ninhidrina a 0,3%;

- Estufa.

4. PRÁTICA

1) Montar o cromatograma, ou seja, papel filtro (Whatmann) devidamente tratado

(adaptado ao tamanho da câmara cromatográfica) constituindo a fase estacionária.

2) Traçar uma linha horizontal a dois centímetros do bordo inferior do papel (linha básica)

sobre a qual, posteriormente, serão distribuídas “manchas” de solutos (aminoácidos).

3) Manter os cromatogramas dentro de recipientes hermeticamente fechados, denominados

câmaras cromatográficas (Figura 3).

4) Adicionar o solvente específico para cromatografia de aminoácidos (butanol, ácido

acético e água na proporção de 4:1:1), a uma altura menor do que dois centímetros.

5) Pipetar sobre a linha básica do cromatograma as soluções de aminoácidos padrão

(arginina, leucina e prolina) e a solução problema (contendo uma mistura de

aminoácidos desconhecidos) (Figura 3).

14

Figura 3. Distribuição das soluções de aminoácidos no cromatograma sobre a linha básica (dois centímetros

acima do bordo inferior do papel). Notar que o solvente colocado na câmara cromatográfica atinge uma altura menor do que dois centímetros (considerando o cromatograma dentro da câmara). A solução problema contém uma mistura de aminoácidos desconhecida. Os aminoácidos 1, 2 e 3 são a arginina, leucina e prolina, respectivamente.

6) Secar o cromatograma através da utilização de um secador de cabelo antes de ser

colocado na câmara cromatográfica. Este processo permite que o excesso das soluções

de aminoácidos colocadas no papel seja removido.

7) Manter o cromatograma por 35 minutos dentro da câmara cromatográfica, para que o

solvente suba contra a ação da gravidade.

8) Retirar o cromatograma da câmara e marcar com um lápis a altura que o solvente

atingiu;

9) Secar o cromatograma com um secador de cabelo por 5 min para a remoção do

solvente;

10) Pulverizar o papel com o reagente revelador ninhidrina a 0,3% em solução alcoólica;

11) Levar o cromatograma a uma estufa (temperatura de 60-65ºC) por 5 minutos, até o

aparecimento das manchas coloridas, que representam os aminoácidos separados.

12) Calcular os fatores de retenção (Rf) para cada aminoácido separado no papel filtro.

Cada aminoácido apresenta um Rf específico para um determinado solvente numa dada

temperatura. Como, cada aminoácido se desloca a uma determinada distância no

cromatograma, baseado em sua solubilidade no solvente. A determinação da

solubilidade de um determinado aminoácido depende diretamente da estrutura química

de sua cadeia lateral (R).

15

5. QUESTIONÁRIO - AMINOÁCIDO


A) Quais os aminoácidos estudados em classe e a coloração deles na reação com ninhidrina?

B) Qual Rf dos aminoácidos utilizados no experimento?

C) Qual aminoácido apresentou maior Rf e por quê?

D) Qual aminoácido apresentou menor Rf e por quê?

E) Os aminoácidos apresentaram coloração diferente? Por quê?

F) Quais aminoácidos estão presentes na mistura?

2) Escreva as classificações dos aminoácidos de acordo com a cadeia lateral. Cite dois exemplos de cada classe.

3) Escrever a reação entre dois aminoácidos, identificando a ligação peptídica.

4) Explicar o que significa ponto isoelétrico de um aminoácido.

5) Citar a carga de um aminoácido abaixo e acima de seu ponto isoelétrico.

16

DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CASEÍNA NO LEITE (PELA REAÇÃO DO BIURETO)

1. OBJETIVO

Quantificar a concentração da proteína do leite utilizando Reativo de Biureto.


A importância em se estudar a proteína caseína presente no leite, se relaciona com o fato

desta ser uma proteína bastante completa (alto valor biológico), pois ela possui todos os

aminoácidos essenciais (aqueles que sua síntese no organismo é inadequada para satisfazer as

necessidades metabólicas e que devem ser fornecidos como parte da dieta). Os aminoácidos

essenciais para os seres humanos são: treonina, triptofano, histidina, lisina, leucina, isoleucina,

metionina, valina e fenilalanina. Ausência ou inadequada ingestão de alguns desses

aminoácidos resulta em balanço nitrogenado negativo, perda de peso, crescimento menor em

crianças e pré-escolares e sintomatologia clínica.

A metodologia da Reação do Biureto, que é utilizada para a caracterização de proteínas,

pode ser empregada para a quantificação das mesmas mediante a colorimetria. O método se

baseia no fato de que as proteínas (nesse caso, a caseína) formam um complexo violeta com o

íon cúprico (Cu2+) em meio alcalino, e tal complexo apresenta um pico de absorção a 540 nm.

A coloração violeta apresentada pelo complexo é proporcional à concentração das proteínas na

amostra (leite). Essa reação é positiva para peptídeos constituídos de no mínimo três

aminoácidos; assim, a Reação do Biureto será negativa para dipeptídeos e aminoácidos livres.

Tal complexação também ocorre com o Biureto (H2N-CO-NH-CO-NH2), daí o nome da

reação. A Figura 1 apresenta a formação do complexo violeta, pela interação do íon cúprico

com duas cadeias polipeptídicas.

Figura 1. Formação do complexo violeta, pela interação do íon cúprico com duas cadeias polipeptídicas.

17

3. MATERIAL

Espectrofotômetro (540 nm)

Balão volumétrico com leite diluído (1 mL de leite desnatado e 9 mL de água

destilada 1:10)

Estante com 6 tubos de ensaio (Reta Padrão) e 1 tubo de ensaio para amostra de leite

diluído (1:10)

1 erlenmeyer com água destilada

1 micropipeta de 1 mL

1 Tubo de centrífuga de 15 mL (Tipo Falcon)

Reagente do Biureto: Pesar 1.5 g de CuSO4.5H2O e 6g de tartarato duplo de sódio e

potássio, dissolvê-los em água destilada completando o volume a aproximadamente 500

ml. Juntar, sob agitação, 300 mL de NaOH 10% e completar a 1 litro.

Padrão de Caseína (5 mg/mL) - dissolver 2,5g de caseína em 500 mL de NaOH 0,1 N.

4. PRÁTICA

1. Com a micropipeta transferir 1 ml do leite (1:10) para um tubo de centrífuga (Tipo

Falcon)

2. Em 7 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 6, pipetar os componentes conforme o quadro

abaixo.

3. Após a adição do Reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30

minutos. A coloração púrpura formada á indicativo da presença de proteínas.

4. Fazer leitura de Transmitância a 540 nm em espectrotofômetro e converter em

Absorbância com auxílio de tabela (Ab = 2 - log T).

5. Com os dados obtidos dos tubos 0 a 5, obter função da Reta na análise de correlação em

planilha eletrônica (Excel), utilizando os valores de Absorbância (Y) e concentrações

de caseína expressas em mg/tubo (X).

6. Calcular a concentração de caseína no leite diluído (1:10) e concentração de caseína no

leite desnatado longa vida em g/100 mL de leite ( % ).

Tubo (No)

Água Destilada

Caseína (10 mg/mL)

Caseína (mg/tubo)

Reativo Biureto

Transmitância (%)

Absorb. 540 nm

Absorb. 540 nm

0 1,0 0 5 0 1 0,8 0,2 5

2 0,6 0,4 5

3 0,4 0,6 5

4 0,2 0,8 5

5 0 1,0 5

6 1 mL leite diluído (1:10) x 5

18

5. QUESTIONÁRIO - PROTEÍNA 1) Em relação à Aula Prática, responder:

a) Determinar o valor da concentração de caseína no leite através da equação da função Reta Padrão em planilha eletrônica, dando o resultado em g/100 mL (m/v) (%) de leite.

b) Discutir o valor encontrado em relação ao valor nutricional do leite.

c) O que ocorre com a caseína do leite quando o valor de pH fica abaixo de 6,5?

2) Representar a ligação peptídica.

3) O que vem a ser a estrutura primária, secundária, terciária e quaternária de uma proteína?

4) Citar os tipos de ligação responsáveis pelas estruturas secundária e terciária de uma proteína?

5) O que vem a ser desnaturação de uma proteína, e que agentes causam esta desnaturação?

6) Definir proteína simples e conjugada. Dê exemplos.

19

DETERMINAÇÃO DA CONSTANTE DE MICHAELIS (Km) E DA VELOCIDADE MÁXIMA (Vm) PARA A INVERTASE DE

LEVEDURA 1. OBJETIVO

Determinar os parâmetros Km e Vm da enzima invertase utilizando a sacarose como

substrato, mediante o estudo cinético da reação.


As reações químicas conduzidas pelos organismos vivos são, na sua grande maioria,

catalisadas enzimaticamente, tornando a velocidade das mesmas compatíveis com as

exigências metabólicas.

Assim a levedura (Saccharomyces cerevisiae), por intermédio da "invertase" hidrolisa a

sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose (Figura 1), açúcares esses

que são absorvidos pela célula. A membrana plasmática é impermeável à sacarose, e a levedura

acaba excretando a invertase (sendo, pois, uma exoenzima) para a hidrólise ocorrer fora da

célula de levedura.

Figura 1. A molécula de sacarose hidrolisada pela enzima invertase da levedura produzindo açúcares

redutores (Glicose e Frutose).

No presente experimento a invertase será obtida de levedura de panificação (fermento

Fleischmann) e adicionada à sacarose (açúcar não redutor), cuja hidrólise resulta na formação

de açúcares redutores (glicose e frutose) que serão estimados pela Reação de Somogyi-

Nelson.

Para tal se colocará a enzima frente à diferentes concentrações de substrato (sacarose),

resultando em diferentes velocidades de reação enzimática, permitindo, mediante um

tratamento matemático adequado, determinar graficamente os valores de Km e Vm.

20

3. MATERIAL

Espectrofotômetro Estante com 8 tubos de ensaio (por grupo) 2 pipetas graduadas de 2 mL (por grupo) 1 pipeta graduada de 1 mL (por grupo) 1 pipeta volumétrica de 1 mL (por grupo) Centrífuga e banho-maria para dosagem de açúcares redutores 4 g de fermento prensado tipo Fleischmann Reagente de Somogyi Reagente de Nelson Padrão de açúcar redutor (100 ug de glicose por 2,5 mL) Substrato (sacarose 12,5 mM = 4,27 g/L)

4. PRÁTICA

A. Extração da enzima

Transferir 4 g de fermento de panificação para tubo de centrífuga, adicionar 20 mL de

água destilada e deixar em estufa a 37ºC por 30 minutos agitando casualmente. Centrifugar a 1.000 x g por 15 minutos recolhendo o sobrenadante que contém a enzima invertase. Fazer uma diluição de 1:50.

B. Ensaio enzimático

Em 7 tubos de ensaio, enumerados de 0 a 6, pipetar os volumes (em mL) das soluções conforme indica o quadro que se segue:

Tubo (NO)

Sacarose (12,5 mM)

Água Destilada (mL)

Invertase 1:50 (mL)

0 0,0 2,0 0,5 1 0,4 1,6 0,5 2 0,8 1,2 0,5 3 1,2 0,8 0,5 4 1,6 0,4 0,5 5 2,0 0,0 0,5

6 2,5 mL de padrão contendo 100 ug de glicose

Incubar os tubos (exceto o tubo no7) a 37ºC, por 15 minutos, para que a invertase catalise a hidrólise da sacarose, resultando na formação de glicose e frutose (açúcares redutores), os quais podem ser determinados pela Reação de Somogyi-Nelson.

C. Reação para dosagem de açúcares redutores. Tão logo termine o período de incubação acrescentar 1 mL do Reativo de Somogy (a

reação enzimática é paralisada pela desnaturação da invertase, quer pela ação do Cu++ ou pela

alcalinidade do reagente).

21

Ferver os tubos em banho-maria por 10 minutos, resfriá-los e juntar 1 mL do Reativo

de Nelson. AGITAR BEM OS TUBOS.

Em seguida, completar o volume a 10 mL (adicionando 5,5 mL de água destilada),

agitar novamente a fazer leitura a 530 nm.

D. Coletar os dados, organizando-os conforme o quadro que se segue. TUBO (NO)

T% 530 nm

Abs. (2-logT) 530 nm

Abs. 530 nm

[S]*

V** 1 [S]

1 V

0 0 mM

1 2 mM

2 4 mM

3 6 mM

4 8 mM

5 10 mM

6 - - - -

* [S] = concentração de substrato (sacarose) no meio de reação enzimática expressa em milimolaridade mM. ** V = velocidade de reação enzimática expressa em g (micrograma) de glicose (açúcar redutor) formado por

hora.

5. QUESTIONÁRIO - ENZIMAS


a) Completar a Tabela acima e utilizar os valores de Abs. para calcular a velocidade da reação enzimática em ug de açúcar redutor (AR) por hora, completando a Tabela abaixo:

Tubo (No)

[S] mM

Abs. 530 nm

V (ug AR/15min)

V (ug AR/h)

1 [S]

mM

1 V

(ug AR/h)

0 0

1 2

2 4

3 6

4 8

5 10

7 100 ug de glicose

- - -

b) Calcular as velocidades de reação (V) para cada tubo, utilizando os dados de 1/V (eixo

Y) em função de 1/[S] (eixo X), obtendo a equação da Reta Padrão em planilha eletrônica.

c) Com base na equação inversa da equação de Michaelis-Mentes, determinar analiticamente os valores de Km e Vmax e discutir os seus significados bioquímicos.

2) Qual o conceito de “sitio ativo”?

3) O que vem a ser velocidade de uma reação enzimática?

22

4) Qual a explicação de Michaelis Mentem para o modo de ação de uma enzima?

5) Escreva graficamente a comparação entre as energias de ativação de uma reação catalisada e de uma reação não catalisada.

6) A aldolase apresenta K-equilibrio 9 x 104. Porém na célula a reação se desloca no sentido da degradação da frutose. Por quê?

7) Que vem a ser inibidor competitivo e não competitivo?

8) O que é uma enzima alostérica?

9) Qual o efeito da temperatura e do pH em uma reação enzimática?

10) O que é cofator enzimático?

11) O que são coenzimas? Dê exemplos.

23

REAÇÃO DE HILL (FOTÓLISE DA ÁGUA)

1. OBJETIVO

Avaliar a habilidade metabólica do cloroplasto de promover a fotólise da água, o

primeiro passo na sequência de reações da fotossíntese.


O processo fotossintético, que ocorre no interior do cloroplasto, compreende 2 etapas:

a) Fase luminosa: dependente de luz, ocorrendo a fotólise da água acoplada com as

produções de NADPH + H+ (fotorredução) e de ATP (fotofosforilação), conforme a equação

abaixo.

luz

NADP+ + ADP + Pi + H20 NADPH + H+ + ATP +½O2

cloroplastos

b) Fase escura: não depende de luz e corresponde à redução do CO2 ao nível de

carboidrato utilizando NADPH + H+ e ATP.

escuro

NADPH + H+ + ATP + CO2 NADP+ + ADP + Pi + C(H20)

cloroplastos Hill, em 1937, tentando desvendar o processo fotossintético empregando cloroplastos

isolados de espinafre pretendia a redução do CO2 ao nível de carboidrato. Por dificuldades

técnicas, limitadas pela época, não conseguiu o seu intento, mas chegou a demonstrar a

habilidade de cloroplastos isolados de reduzir outros compostos em um processo acoplado à

fotólise da água com evolução de O2:

luz 2Fe+3 + H2O 2Fe+2 +H+ +1/2O2 cloroplastos

Assim a produção fotoquímica de oxigênio exige a presença de um aceptor de H+ e/ou

elétrons, que necessariamente não precisa ser o CO2.

No presente experimento será utilizado como aceptor de elétrons (reagente de Hill) um

indicador de óxido-redução, o 2,6-diclorofenolindofenol, que na forma oxidada é azul (com

max. ao redor de 540 nm) e na forma reduzida é incolor (Figura 1), o que permite o

acompanhamento da reação fotoquímica mediada por cloroplastos isolados de espinafre.

24

Figura 1. Redução do 2,6 diclorofenolindofenol na Reação de Hill.

3. MATERIAL

Espectrofotômetro Tubos de ensaio (4 por grupo) Centrífuga de mesa para tubos de centrífuga (15 ml) Almofariz com pistilo (1 para cada grupo) Lâmpada de 100 W (2 por aula) Micropipeta de 1mL Tubos de centrífuga tipo Falcon Algodão Funil pequeno de plástico Pipeta volumétrica (Pasteur) Folha de alumínio

Banho maria (100oC) Folhas de espinafre Sacarose 0,35M Tampão fosfato 0,05 M (pH = 6,5) contendo sacarose 0,35 M 2,6-diclorofenollindofenol (16 mg/100 ml) Ácido ascórbico (cristais)

4. PRÁTICA

A. Extração dos Cloroplastos

a) Picar 5 g de folhas de espinafre e homogeneizar em almofariz usando areia lavada

como abrasivo e 10 ml de sacarose 0,35 M (adicionados aos poucos) como extrator.

b) Filtrar o homogeneizado em algodão.

c) Centrifugar por 2 minutos a 200 x g, (1300 rpm) desprezar o precipitado e

centrifugar novamente o sobrenadante por 7 minutos a 1000 x g. (3000 rpm)

d) Ressuspender os cloroplastos lavados em 10 ml de tampão fosfato 0,05 M (pH= 6,5)

contendo sacarose 0,35 M.

25

B. Ensaio Preparar 4 tubos de colorímetro conforme o quadro que se segue:

TUBOS

SUSPENSÃO CLOROPLASTO

(mL)

TAMPÃO FOSFATO

(mL)

2,6-DCF

(mL)

OBSERVAÇÕES

1 1,5

(+ ác.ascórbico) 3 0,5

ajustar o “zero”do aparelho

2

1,5 3 0,5 ler imediatamente

3 1,5 3 0,5 ler imediatamente e cobrir com folha de

Alumínio

4 1,5

(ferver 3’) 3 0,5

Os tubos 2, 3 e 4 são expostos à luz de lâmpada (100 W) durante 1 minuto (o tubo no 3

protegido da luz) e faz-se a leitura de absorbância (Abs.) repetindo a operação 3 vezes.

5. QUESTIONÁRIO – FOTOSSÍNTESE

1) Em relação à Aula Prática, anotar as leituras obtidas e fazer um gráfico:

TUBOS

SUSPENSÃO CLOROPLASTO

(mL)

ABS. (λ=540 nm)

1ª LEITURA

ABS. (λ=540 nm)

2ª LEITURA

ABS. (λ=540 nm)

3ª LEITURA

1 1,5

(+ ácido ascórbico)

2

1,5

3 1,5

4 1,5

(ferver 3’)

Discutir os resultados: a) Qual a função do ácido ascórbico? b) Qual a função do 2,6 DCF? c) Descreva o observado nos tubos 2, 3 e 4 durante as leituras. d) Em quais tubos ocorrem fotossíntese? Por quê? e) Em quais tubos não ocorre a fotossíntese? Por quê?

LEITURAS

ABS. λ=540 nm

26

2) Quais os eventos que dependem e quais os que não dependem da luz quanto à formação

de glicose por uma planta fotossintetizadora?

3) Por que os comprimentos de onda na faixa de 450 e 650 nm são mais eficientes para a realização de fotossíntese pelas plantas superiores?

4) Quais as funções dos carotenóides no processo fotossintético conduzido pelas plantas?

5) Como se explicam a essencialidade do Cl, Mn e Mg para o processo fotossintético?

6) Como são estruturados os sistemas de pigmentos para a captação da energia radiante para a condução da fotossíntese?

7) Qual a função da água no processo fotossíntético?

8) O que fica demonstrado quando se observa a redução do 2,6-diclorofenolindofenol por cloroplastos iluminados (reação de Hill)?

9) Como os herbicidas que bloqueiam o transporte de elétrons no processo fotossintético matam a planta?

10) Como que os herbicidas que bloqueiam o transporte de elétrons na fase luminosa da fotossíntese (2,4-DNP e DCMU) matam a planta?

11) O que vem a ser “foto-redução do NADP+” e “fotofosforilação do ADP”?

12) Qual o primeiro composto formado pela assimilação do CO2 mediante a via C3 de fixação? Idem para a via C4. Quais as enzimas envolvidas nesta etapa e suas afinidades para com o CO2?

13) Que adaptações ocorreram nas crassuláceas que lhes permitem a melhor sobrevivência em ambientes quentes e áridos?

14) O que vem a ser “fotorrespiração”? Qual o seu substrato e porque é pouco intensa nas plantas C4? Qual a importância da luz e do O2 neste processo?

15) Cite quatro diferenças entre plantas C3 e C4 (exceto foto-respiração).

16) Porque as plantas C4 fazem fotossíntese com boa eficiência mesmo em temperaturas mais elevadas?

17) Porque a fotossíntese nas plantas C4 não atinge a saturação mesmo com grande intensidade luminosa?

18) O que vem a ser “ponto de compensação” e por que é menor para as plantas C4?

27

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

AVRON, M. "Mechanism of photoinduced electron transport in isolated chloroplasts", in D.R.

Sanadi (ed.), Current Topics of Bioenergetics, 12, Academic Press, New York, 1967, p.1.

JACOBS, M.B. The Chemical Analysis of Foods and Food Products. Van Nostrand, New York, 1958, 970p.

LITWACK, G. Experimental Biochemistry - A Laboratory Manual. John Wiley & Sons,

Inc., New York, 1960, 313p. MARTELLI, H.L.; PANEK, A.D. Bioquímica Experimental. Ao Livro Técnico, Rio de

Janeiro, 1968, 112p. NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger Princípios de Bioquímica. 3a. Ed., Sarvier, São

Paulo, 2002, 975p. VILLELA, G.G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e Experimentos de Bioquímica.

Editora Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1972, 522p. VILLELA, G.G.; BACILA, M.; TASTALDI, H. Técnicas e Experimentos de Bioquímica.

Koogan, Rio de Janeiro, 1973, 552p. WHARTON, D.C.; MC CARTY, R.E. Experiments and Methods in Biochemistry.

McMillan Publishing Co, Inc., New York, 1972, 350p.

28

Tabela de Conversão

T em A x 1.000 00 01 02 ~ 04 05 06 07 08 09 0 3.000 2699 2.523 2.398 2.301 2.222 2.155 2.097 2.046 1 2.000 1.959 1.921 1.886 1.854 1.824 1.796 1.770 1.745 1.721 2 1.699 1.678 1.658 1.638 1.620 1.602 1.585 1.569 1.553 1.538 3 1.523 1.509 1.495 1.481 1.469 1.458 1.444 1.432 1.420 1.409 4 1.398 1.387 1.377 1.387 1.357 1.347 1.337 1.328 1.319 1.310 5 1.301 1.292 1.284 1.276 1.268 1.260 1.252 1.244 1.237 1.229 6 1.222 1.215 1.208 1.201 1.194 1.187 1.180 1.174 1.167 1.161 7 1.155 1.149 1.143 1.137 1.131 1.125 1.119 1.114 1.108 1.102 8 1.097 1.092 1.086 1.081 1.076 1.071 1.066 1.060 1.056 1.051 9 1.048 1.041 1.036 1.032 1.027 1.022 1.018 1.013 1.009 1.004 10 1.000 0.996 0.991 0.987 0.983 0.979 0.975 0.971 0.967 0.963 11 959 955 951 947 943 939 938 932 928 924 12 921 917 914 910 907 903 900 896 893 889 13 886 883 879 876 873 870 866 863 860 857 14 854 851 848 845 842 839 836 833 830 827 15 824 821 818 815 812 810 807 804 801 799 16 796 793 790 788 785 783 780 777 775 772 17 770 767 764 762 759 757 764 752 750 747 18 745 745 742 738 735 733 730 728 726 724 19 721 719 717 714 712 710 708 706 703 701 20 699 697 695 693 690 688 686 684 682 680 21 678 676 674 672 670 688 666 664 662 660 22 658 656 654 652 650 648 646 644 642 640 23 638 636 635 633 631 629 627 625 623 622 24 620 618 616 614 613 611 609 607 606 604 25 602 600 599 597 595 503 592 590 588 587 26 585 583 582 580 578 577 575 573 572 570 27 569 567 565 564 562 561 559 558 556 554 28 553 551 550 548 547 545 544 542 541 539 29 538 536 535 533 532 530 529 527 528 524 30 523 521 520 519 517 516 514 513 511 510 31 509 507 506 504 503 502 500 499 498 495 32 495 493 492 491 489 488 487 485 484 483 33 481 480 479 478 476 475 474 472 471 470 34 469 467 468 465 463 462 461 460 458 457 35 456 455 453 452 451 450 449 447 446 445 36 444 442 441 440 439 438 437 435 334 433 37 432 431 429 428 427 426 425 424 423 421 38 420 419 418 417 416 415 413 412 411 410 39 409 408 407 406 405 403 402 401 400 399 40 398 397 396 395 394 393 391 390 389 388 41 387 386 385 384 383 382 381 380 379 378 42 377 376 375 374 373 372 371 370 369 368 43 367 366 365 364 363 362 361 360 359 358 44 357 356 355 354 353 352 351 350 349 348 45 347 346 345 344 343 342 341 340 339 338 46 337 336 335 334 333 333 332 331 330 329 47 328 327 328 326 325 324 323 322 321 320 48 319 318 317 316 315 314 313 312 312 311 49 310 309 308 307 306 305 305 304 303 302 00 01 02 03 04 05 06 07 08 09 50 301 300 299 298 298 297 296 295 294 293 51 292 292 291 290 289 288 287 287 286 285 52 284 283 282 281 281 280 279 278 277 277 53 278 275 274 273 272 272 271 270 289 268 54 268 267 266 265 264 264 263 262 261 260 55 250 259 258 257 257 256 255 254 253 253 56 252 251 250 249 249 248 247 246 246 245 57 244 243 243 242 241 240 240 239 238 237 58 237 236 235 234 234 233 232 231 231 230 59 229 228 228 227 226 225 225 224 223 223 60 222 221 220 220 219 218 218 217 216 215 61 215 214 213 213 212 211 210 210 209 208 62 208 207 206 206 205 204 203 203 202 202 63 201 200 199 199 198 197 197 196 195 194 64 194 193 192 192 191 190 190 189 188 188 65 187 186 186 185 184 184 183 182 182 181 66 180 180 179 178 178 177 177 176 175 175 67 174 173 173 172 171 171 170 169 169 168 68 167 167 166 166 165 164 164 163 162 162 69 161 161 160 159 159 158 157 157 156 156 70 155 154 154 153 152 152 151 151 150 149 71 149 148 148 147 146 146 145 144 144 143 72 143 142 141 141 140 140 139 138 138 137 73 137 136 135 135 134 134 133 133 132 132 74 131 130 130 129 128 128 127 127 126 126 75 125 124 124 123 123 122 121 121 120 120 76 119 119 118 117 117 116 116 115 115 114 77 114 113 112 112 111 111 110 110 109 109 78 108 107 107 106 106 105 105 104 103 103 79 102 102 101 101 100 100 099 099 098 097 80 097 096 096 095 095 094 094 093 093 092 81 092 091 090 090 089 089 088 088 087 087

29

82 086 086 085 085 084 084 083 083 082 081 83 081 080 080 079 079 078 078 077 077 076 84 076 075 075 074 074 073 073 072 072 071 85 071 070 070 069 069 068 068 067 067 066 86 066 065 064 064 063 063 062 062 061 061 87 060 060 059 059 058 058 057 057 057 056 88 056 055 055 054 054 053 053 052 052 051 89 051 050 050 049 049 048 048 047 047 046 90 046 045 045 044 044 043 043 042 042 041 91 041 040 040 040 039 039 038 038 037 037 92 036 036 035 035 034 034 033 033 032 032 93 032 031 031 030 030 029 029 028 028 027 94 027 026 026 025 025 025 024 024 023 023 95 022 022 021 021 020 020 020 019 019 018 96 018 017 017 016’ 016 015 015 015 014 014 97 013 013 012 012 011 011 011 010 010 009 98 009 008 007 007 007 007 006 006 005 005 99 004 004 003 003 003 002 002 001 001 000

Documents

BIOQUÍMICA – LCB 208