TRANSFORMACIONES PÒR MEDIO DE MICROORGANISMOS

Dependiendo del estado de oxidación que se presente un metal y la especie que esté conformando, un microorganismo puede realizar dos transformaciones posibles.

• Movilización del metal, pasaje de un estado insoluble inicial en una fase sólida (metales de suelos, sulfuros u óxidos metálicos, por ejemplo), a un estado soluble final, en fase acuosa. Este proceso se conoce con el nombre de lixiviación microbiana.

• Inmovilización del metal, pasaje de un estado inicial soluble en fase acuosa a uno insoluble final en fase sólida.

Existen en la naturaleza diferentes mecanismos por los cuales la inmovilización del metal puede llegar a ocurrir.

SOLUBILIZACION DE METALES

Biolixiviación

• Mecanismo de solubilización por acción microbiana, los metales presentes en los minerales resultan extraídos en fase acuosa.

Ej. obtención de Cu por la oxidación de las menas de Cu2S (calcocita) a CuSO4 por intermedio de Thiobacillus ferroxidans y Thiobacillus thiooxidans (bacterias oxidadoras del hierro o sulfuros)

• Recuperación de Cu, Ni, Zn y Cd, tanto en condiciones aerobias como anaerobias, estos m.o pueden utilizar el catión Fe3+ como último aceptor de electrones en lugar del O2 .

• Las bacterias del género Thiobacillus son microorganismos acidófilos, es decir, requieren un pH = 2,5 para crecer en condiciones óptimas, lo cual resulta adecuado para mantener a los metales en solución, sobre todo al Fe3+. Con valores de pH mayores a 5,5, estos microorganismos no se desarrollan, por lo tanto la lixiviación no sería efectiva.

Drenaje Acido de Mina

• El Thiobacillus ferrooxidans oxida sulfitos y azufre a SO4 ²- produciendo ácido sullfúrico (pH ~2)

FeS2 + 3.5 O2 + H2O ---> Fe²+ + 2 SO4 ²- + 2 H+ (biológico)

2Fe²+ + 0.5 O2 + 2 H+ ---> 2Fe³+ + H2O (biológico)

FeS2 + 14 Fe³+ + 8 H2O ---> 15 Fe²+ + 2 SO4²- + 16 H+ (abiotic)

• el DAM tiene una alta concentración de metales y la naturaleza ácida del ambiente disuelve los minerales

• Una vez que el flujo del ácido alcanza el pH neutro al curso de agua, el pH aumenta y el Fe(III) precipita.

• La misma bacteria también se usa en biolixiviación: removiendo metales de minerales de baja ley, bajando el pH y disolviendo la mayoría de minerales.

• $2 a $3 billiones de oro se extraen por biolixiviación al año. El Cobre se estima en $8

Tratamiento del drenaje ácido de minas

• Humedales, Compost (anaeróbico) : gran laguna con una capa de sustrato orgánico.• La capa de “compost” se hace con yuyo, aserrín, residuos de madera o arboles mezclados con arcilla o barro.• Un humedal de compost típico tiene 12 a 24 pulgadas de sustrato orgánico y plantadas con rastrojos o vegetación emergente.• Humedal reducido donde el sustrato orgánico promueve los procesos químicos y microbianos que generan alcalinidad e incrementa el pH.• Anóxico de manera que el sulfato es reducido a sulfito metálico precipitado y el pH se incrementa• Puede sostener agua a un pH muy bajo.• Excelente, alternativa de bajo costo para tratar el DAM

AGENTES QUELANTES

Otros microorganismos logran una solubilización efectiva de metales como Mn, Fe, Zn, Cd y Pb a pH mayor a través de un mecanismo diferente.

• Liberación de sideróforos y ácidos carboxílicos y agentes quelantes, compuestos orgánicos capaces de formar complejos y así solubilizar metales.

• Ralstonia eutropha (Alcaligenes eutrophus) puede acumular metales pesados, por solubilización mediante sideróforos.

• Trichoderma harzianum (hongo) puede solubilizar MnO2, Fe2O3 y Zn metálico mediante la liberación de agentes quelantes.

Los sideróforos son péptidos con capacidad complejante que liberados al medio captan el Fe, que es utilizado como oligoelemento dentro del metabolismo celular.

La biosíntesis de sideróforos, si bien se induce en ausencia de Fe en el medio, también ocurre en presencia de otros metales, con el fin de desintoxicar el entorno celular .

Ralstonia sp. CH34 (Ralstonia metallidurans)

• Bacteria Gram negativa aislada en tanque de sedimentación de fábrica de zinc • Resistente a Zn2+ (20 mM), Co2+ (20 mM), Cd2+ (5 mM)• Resistente a Hg2+• 7 determinantes que codifican para la resistencia a metales pesados tóxicos• 2 megaplásmidos indígenas pMOL30 (238 kb) y pMOL28 (180 kb)

Bioremediación– Usa los pasos de reducción para inmovilizar los metales por precipitación de carbonatos– Usa Ralstonia in sitios con altas concentraciones de metales (sitios mineros) para degradar compuestos orgánicos– Cepas de Ralstonia modificadas genéticamente capaces de degradar compuestos orgánicos y reducir metales y radionúclidos para ser usados en tanques de desechos mezclados DOE

INMOVILIZACIÓN DE METALES PESADOS

Existen microorganismos resistentes y microorganismos tolerantes a metales.

• Los resistentes se caracterizan por poseer mecanismos de destoxificación codificados genéticamente, inducidos por la presencia del metal .

• Los tolerantes son indiferentes a la presencia o ausencia de metal.

• Ambos pueden captar metales en sitios contaminados y extraerlos

• La resistencia o tolerancia experimentada por microorganismos es posible gracias a la acción de diferentes mecanismos

Estos fenómenos son: biosorción, bioacumulación, biomineralización, biotransformación y quimiosorción mediante microorganismos.

BIOSORCIÓN

• Retención del metal mediante una interacción fisicoquímica del metal con ligandos presentes en la superficie celular.

• Interacción se produce con grupos funcionales expuestos hacia el exterior celular . Ej. carboxilo, amino, hidroxilo, fosfato y sulfhidrilo.

• Es un mecanismo de cinética rápida que no presenta una alta dependencia de la temperatura y en muchos casos puede estudiarse en detalle mediante la construcción de varios modelos de isotermas.

 • Se usa en biorremediación de diversos metales pesados como el Cd, Cr, Pb, Ni, Zn y Cu.

Localización potencial de centros de quelación de iones metálicos en proteínas de superficie de bacterias Gram-negativas :

1. En proteínas intracelulares. 2. En prot. periplásmicas. 3. Como proteínas de membrana externa (PME). 4. En sitios permisivos de PME orientados al exterior. 5. En dominios anclados en PME.

Biosorción

• Acumulación pasiva de los metales en la superficie del material biológico• Ventajas de la biosorción sobre tecnologías de intercambio de iones, carbón activado o membranas• Amplio rango de condiciones de operación (pH, temperatura, otros iones en solución)• Costo/efectivo

Aplicaciones:• Concentrar metales, mil veces mas• Etapa de refinado en tratamiento de aguas residuales para remover metales por debajo de 100 ppm de concentración metálica y obtener agua de bebida• Procesamiento de soluciones minerales• Obtención de metales preciosos del agua de mar

• A menudo es preferible trabajar con biomasa muerta:• Biomasa viva o muerta acumulan a menudo la misma cantidad de metal• Puede usar residuos de la fermentación• El costo de cultivar biomasa excede el costo de obtener biomasa muerta• Recuperación no destructiva de los metales

Biosorbentes: Tipos de materiales

Algas:- Disponible fácilmente, cerca del mar- Sorción acontece por los grupos carboxílicos de las algas marrones (ácido algínico)- Partículas lo suficientemente grandes, lo que elimina la necesidad de inmovilización

Bacterias- Barato. Procedente de industrias de fermentación (Bacillus, Citrobacter, Streptomyces)- Materia prima pueden contener residuos químicos- Se necesita immovilizar la biomasa- Gram positivas mas que Gram negativas

Hongos- Barato. De fuentes industriales (Aspergillus niger usado para producción de ácido cítrico)- Algunos hongos (A. niger) crecen como pellets; fácil separación sólido/líquido

HONGOS

• Disponible y barato, procedente de la industria de fermentación• La desventaja es que las impurezas adheridas a la biomasa durante la fermentación puede afectar la sorción del metal • La pared celular es el sitio principal de deposición del metal• Polisacáridos constituyen hasta el 90% de la pared celular del hongo• A veces polisacáridos estan fosfatados. Mucor tiene 20% de contenido de fosfato en la pared celular en peso seco

Biosorción de Cu2+, Pb2+, Cd2+ con el alga marina Ecklonia maxima

• Alta capacidad de sorción 85, 227, 84 mg/g para Cu2+, Pb2+, Cd2+• Sorción rápida: equilibrium alcanzado dentro de 60 min• Regeneración (recuperación de metales) con 2M NaCl. Lleva a 35x de concentración de metal desde 100 mg/L a 3,500 mg/L• El tamaño de partícula es importante:• Partículas mas pequeñas (75 µm) sorben mas rápido, pero tiene menos capacidad y menor regeneración• Las partículas mas grandes (1.2 mm) sorben mas despacio, tiene mas capacidad y se regeneran mejor

Condiciones de pH

• Biosorción funciona en un rango amplio de pH desde el drenaje ácido de mina hasta aguas residuales alcalinas tratadas por precipitación

• No obstante la efectividad de la biosorción a un pH dado depende de la naturaleza del sorbente

• Generalmente hay mejor sorción de cationes mientras el pH aumenta debido a que los grupos funcionales son desprotonados a pH mas alto

• Generalmente hay mejor sorción de aniones mientras el pH disminuye debido a que los grupos funcionales son protonados a pH mas bajo

• A pH muy alto, precipitación de hidróxidos. Si hay precipitación, puede obturar a la columna de cama fija.

• Algunos cationes que ocurren como complejos cargados negativamente (AgCl2 -) pueden mostrar un descenso de la toma con el pH aumentando.

Biosorción Bacteriana

• Se usan ambas bacterias, Gram positivas y Gram negativas

• El reto es la inmovilización de la biomasa: - Espuma, vidrio, carbón activado como soporte inerte - Atrapamiento en matriz polimérica : alginato de calcio, polisulfona y polietilenimina - Enlace cruzado: uso del formaldehido para enlace cruzado con las células

Tecnologías Existentes:

Proceso BIOCLAIM : bacteria del género Bacillus son: (i) tratado con solución cáustica fuerte para reforzar la

acumulación de metal; (i) lavado con agua para remover el cáustico residual; e (ii) inmovilizar en barritas extruidas usando

polietilenenimina (PEI) y glutaraldehido;

Proceso BIO-FIX : biomasa, incluyendo, algas, sphagnum peat moss, levaduras, bacterias y/o flora acuática immovilizadas en polisulfona;

Requisitos de las partículas biosorbentes

• Alta capacidad de sorción- conteniendo lo menos posible de material inerte• Cinética favorable - hidrofílico, alta porosidad, o estructura de gel y tamaño de partícula de 0.5-1.5 mm• Dinámica de flujo del reactor suave de manera que no use partículas muy pequeñas o muy absorbentes• Debe ser posible la regeneración de las partículas • Elución del metal posible con poco agente desorbente sin dañar el biosorbente• A veces pretratamiento con ácido o base u solventes orgánicos o detergentes

Técnica de inmovilización

Biomasa Metal

Alginato de calcio Chlorella vulgaris Au, Cu, Fe, Zn

Gel de poliacrilamida

Citrobacter

Rhizopus

U, Cd, Pb, Cu, Co

Sílica AlgaSORB Ca, Ni, U, Pb, Hg, Cd, As, Zn, Ag

Poliuretano Pseudomonas aeruginosa

U

polisulfona Citrobacter sp. Pb, Cd, Zn

INMOVILIZACION DE MATERIAL BIOLOGICO

Biosorbentes Comerciales

• AlgaSORB usa el alga de agua dulce Chlorella vulgaris para tratar soluciones diluidas (1-100mg/L), abajo de 1 mg/L o menos

• AMT-BIOCLAIM usa biomasa de Bacillus para manufacturar material granulado para tratamiento de aguas residuales y recuperación de metales. >99% de soluciones metálicas diluidas no selectivas pueden ser regeneradas muchas veces

• BioFix- biomasa de espirulina, levaduras, algas, plantas ricas en xantano y goma guar para darle consistencia al producto- remoción selectiva de metales en un amplio rango de pH- cinética de sorción y desorción rápidas

Biosorción BacterianaGram positiva

• PG (20-30 nm de grosor) tiene ácidos teicoico y teicurónico (40-90% de la pared celular• PG tiene grupos funcionales carboxílicos + en las cadenas de aminoácidos • Acido Teicoico : grupos funcionales fosfodiésteres• Acido teicurónico TUA: grupos funcionales carboxílicos

Bioacumulación

• Sistema de transporte de membrana que internaliza al metal pesado presente en el entorno celular, con gasto de energía.

• Este consumo energético se genera a través del sistema H+-ATPasa.

• Metalotioneínas secuestran o incorporan el metal pesado al citoplasma, son proteínas ricas en grupos sulfhidrilos.

• También puede ser compartimentalizado dentro de una vacuola, como ocurre en hongos.

• Ej. acumulación de uranio por la bacteria Pseudomonas aeruginosaal igual que en la levadura Saccharomyces cerevisiae

Biomineralización

• Los microorganismos son capaces de precipitar metales y radionúclidos como carbonatos e hidróxidos, mediante un mecanismo de resistencia codificado en plásmidos.

• Mecanismo de bomba que expulsa el metal tóxico presente en el citoplasma hacia el exterior celular en contracorriente a un flujo de H+ hacia el interior celular.

• Esto produce una alcalinización localizada sobre la superficie celular externa y por lo tanto la precipitación del metal

• Otra forma de precipitar los metales es a través de la formación de sulfuros o fosfatos, como resultado de alguna actividad enzimática celular.

• Ej. la precipitación de sulfuros metálicos en reactores con cultivos mixtos de bacterias reductoras de sulfato o la acumulación de CdS en la pared celular de las bacterias Klebsiella planticola y Pseudomonas aeruginosa

Biotransformación

• Proceso que involucra un cambio químico sobre el metal pesado, como por ejemplo en el estado de oxidación o metilación.

• Esta transformación biológica de los metales pesados tóxicos mediante enzimas microbianas puede dar como resultado compuestos poco solubles en agua o bien compuestos volátiles.

Ej. el ciclo del Hg en la naturaleza, donde la bacteria Pseudomonas aeruginosa puede reducir el catión Hg2+ a Hg0, y otros organismos pueden luego metilarlo dando como producto el CH3Hg+ y (CH3)2Hg, que son volátiles y aún más tóxicos que el propio Hg

• Las reducciones de V(V) a V(III), Au(III) a Au(0) y Cr(VI) a Cr(III), conducen a la precipitación del metal bajo condiciones fisiológicas..

• El Cr(VI) pasado a Cr(III) produce la inmovilización por precipitación de hidróxidos y la disminución en la mutagenicidad.

• La utilización de microorganismos resistentes a Cr con capacidad de bioconversión Cr(VI) en Cr(III) es de fundamental importancia en el tratamiento biológico de efluentes industriales

Quimiosorción mediante microorganismos

• Los microorganismos biomineralizan un metal, formando un depósito primario.

• Este depósito primario funciona como núcleo de cristalización, con la subsecuente deposición del metal de interés, promoviendo y acelerando así el mecanismo de mineralización

Ej. el agregado de Fe en un efluente a tratar, en presencia de bacterias reductoras del sulfato.

Estas bacterias producen sulfuros que precipitan en forma de FeS, sobre la superficie celular.

Los otros metales contaminantes utilizan el FeS formado como soporte y cristalizan sobre sus cristales.

Luego, aprovechando las propiedades magnéticas del Fe, pueden separarse fácilmente de la fase soluble, descontaminando así el material

MECANISMOS DE TOXICIDAD DE LOS METALES PESADOS PARA LAS BACTERIAS

• Algunos metales pesados (Zn2+, Cu2+, Ni2+, Co2+) juegan un rol importante como elementos traza (zinc superóxido dismutasa, citocromo c oxidasa, acetil-SCoA sintetasa, B12)

• En altas concentraciones, inclusive los metales traza son tóxicos• Toxicidad No-específica por unión a grupos -SH • Remplaza iones importantes fisiológicos

Asociación con grupos sulfidrilos

Cu2+ + HS- ==> CuS(s)

Sólidos logKHgS(s) 52.7AgS2(s) 50.1CuS(s) 36.1PbS(s) 27.5CdS(s) 27.0

Remplazo de iones significantes fisiológicamente

• Cd2+ with Ca2+• Ni2+ with Fe2+• Cromato con sulfato• Arsenato con fosfato

TRANSPORTE DE METALES DENTRO DE LAS CELULAS

• Mucho de la toxicidad ha sido asociado con la ingesta de metales (aunque la evidencia de toxicidad es por asociación con la membrana)• Rápido, sistema de ingesta inespecífica manejado por gradiente quimiosmótico, constitutivo• Ni2+, Co2+, Zn2+, Mn2+ es transportado por el sistema CorA (transporte inorgánico de metales, MIT), • el arsenato por PIT (trasporte inorgánico de fosfato)• Especificidad de sustrato alta, requiere ATP, inducible en situaciones metabólicas especiales (ej. Carencia de nutrientes), transportadores en cassette ligado al ATP- (ABC)

MECANISMOS DE DESINTOXICACION

• Bombeo de eflujos, complejo czc (para Co, Zn y Cd) ncc (Ni, Cd y Co) y cnr (Co, Ni resistente,)

• Reducción, Para metales sensibles al redox como el cromato (sistema Chr)

• Secuestro, Segregado en complejos con compuestos conteniendo azufre (metalotioneinas). Muy costoso. Solo eficiente a concentraciones de metal

bajas (16 ATP para formar complejo de un ion Cd2+ con S2-)

TRANSPORTE Y RESISTENCIA AL ARSENATO EN Escherichia coli. El Arsenato y fosfato entran al periplasma con la proteína Porin (PhoE). Luego al citoplasma por la proteina Pit o el sistema Pst (proteína unida al fosfato PstS. El complejo PstABC ATPasa para el ingreso por la membrana interna). Dentro de la célula, el arsenato es reducido a arsenito por la proteína ArsC (dependiente de glutaredoxina y glutation) y el arsenito es bombeado fuera de la célula por el ArsAB efflux ATPasa.

TRANSPORTE y RESISTENCIA AL ARSENATO EN STAPHYLOCOCCUS. Arsenato y fosfato se presume que se transportan al citoplasma por 2 transportadores de membrana. Dentro de la célula, el arsenato es reducido a arsenito por la proteína ArsC, acoplada a la tioredoxina y el arsenito es bombeado fuera de la célula por la proteína ArsB sola.

TRANSPORTE Y RESISTENCIA AL CADMIO Y CINC EN S. aureusEl Cadmio es transportado al citoplasma por el transportador de manganeso y el cinc probablemente por el transportador de magnesio. A concentraciones altas, ambos cationes son bombeados fuera por el único polipéptido tipo CadA P- ATPasa.

TRANSPORTE Y RESISTENCIA AL CROMATO EN A. eutrophus. El Cromato es transportado al citoplasma por los transportadores de sulfato. A concentraciones altas, el cromato es bombeado fuera por la proteína ChrA (asociada posiblemente con la ChrB ).

APLICACIONES EN SISTEMAS DE RESISTENCIA A LOS METALES

• Biosensores– Medición de la concentración de ión libre– Evaluación de la toxicidad del metal para un sistema biológico– Util para una evaluación rápida de la salud del ambiente natural