Upload
bryan-wall
View
86
Download
2
Embed Size (px)
Citation preview
Biosenzori Optici cu rezonant a plasmonica de suprafat a
Odata cu evoluia tehnologiei monitorizarea sistemelor natural si biolegice a
captat din ce n ce mai mult atenie. ntr-o societate care se afl ntr-o continu
schimbare n care trasformrile asupra mediului se petrec ntr-un mod rapid iar pe zi ce
trece apar noi virui i maladii iar detecia i monitorizarea acestora prezint o importan
ridicat.Un rspuns general la aceste probleme nu poate fi furnizat de ctre tiina din
ziua de astzi dar cu ajutorul nanotehnologiilor i a biosenzorilor se poate furniza un
rspuns ct mai precis la problemele ridicate de domeniul biologic din ziua de azi.
Termenul biosenzor reprezint o prescurtare de la senzor biologic. Acest
dispozitiv este constituit dintr-un traductor i un element biologic(ligand) care ar putea fi
o enzim, un anticorp sau un acid nucleic. Elementul biologic interacioneaz cu
substana testat iar apoi rspunsul biologic este convertit n semnal electric de ctre
traductor. Prile componente ale unui biosenzor sunt componenta biologic care
actioneaz ca i element senzitiv i componenta electronic care detecteaz i transmite
semnalul.
Biosenzori au devenit tot mai complexi n special datorit combinaiei a dou
domenii tehnologice foarte avansate i anume microelectronica i biotehnologia. Acetia
reprezint dispozitive foarte importante pentru analiza unui spectru larg de substane
printre care cele mai des utilizate ca i obiect de studiu sunt compuii organici, gazele, i
ioni.
Cea mai veche referire la biosenzori dateaz din anul 1960 atunci cnd Dr. Leland
C. Clark a lucrat la un biosenzor dezvoltnd o enzim electrod pentru msurarea
concentraiei de glucoz care prezint un rol foarte important n diagnosticarea i tratarea
pacienilor cu diabet. Din acel moment i pn acum un numr larg de biosenzori au fost
dezvoltai, fiecare combinnd un element biologic de recunoatere i un traductor.
Dezvoltarea unor domenii cum ar fi microelectronica sau mecanica au permis
miniaturizarea a multor biosenzori iar cele mai noi generaii de biosenzori pot include
pn la 1000 de biosenzori adresabili per cip.
O prim clasificare a senzorilor i mparte pe acetia n dou categorii: senzori cu
recunoatere direct caz n care interaciunea biologic este direct msurat i senzori cu
recunoatere indirect care se bazeaz pe elemente secundare pentru detecie. Figura 1
rezint o viziune schematic asupra celor dou categorii.
Figura 1. A) Senzori cu recunoatere direct(Label-free). B)Senzori cu recunoatere indirect
Senzorii cu detecie direct msoar direct interaciunea dintre substanele
biologice. Acest tip de senzori msoar o schimbare fizic(ex. Schimbri a proprietiile
optice, electrice sau mecanice) introdus de interaciunea biologic i care nu necesit
marcare pentru detecie. Senzorii cu detecie indirect se bazeaz pe elemente
secundare(labels) pentru detecie. Exemple de elemente secundare pot fi enzimele sau
anticorpii marcai fluorescent. Cei mai multi biosenzori optici cu msurare indirect se
bazeaz pe principiul msurrii fluorescenei.
Biosenzorii au cteva avantaje n comparaie cu alte metode de biodetecie cele
mai importante fiind cretere vitezei de realizare a testelor precum i o flexibilitate mai
ridicat a acestora. Aplicaiile biosenzorilor includ domeniul medical, al mediului,
securitatea public precum i sigurana alimentar. Aplicaiile medicale includ domeniul
farmaceutic, de ngrijire medical, producerea de echipamente i cel al cercetrii.
Senzori cu rezonan plasmonic de suprafa Rezonana plasmonic de suprafa (SPR) furnizeaz o analiz n timp real a
evenimentelor de suprafa i este o unealt valoroas n studiul interaciunii dintre
momecule. Metoda SPR este o metod sensibil care detecteaz schimbri a indicelui de
refracie n apropierea unui strat subire de metal(de obicei aur). n Figura 2.a este
prezentat un dispozitiv a crui funcionare se bazeaz pe principiul rezonaei plasmonice
de suprafa. Principiul de funcionare a acestui dispozitiv este prezentat n Figura 2.b.
Un fascicul de lumin polarizat vertical ilumineaz spatele unei foie subiri de aur pe
cnd partea frontal a foiei de aur se afl n contact cu soluia de interes. Atunci cnd
unghiul de inciden excede unghiul critic fenomenul de reflexie intern total se
produce. La un anumit unghi de inciden unda de lumin poate s se cupleze cu
electronii din folia de metal. Aceast excitaie cauzeaz pierderi de energie in metal iar
intesitatea luminii reflectate scade n intensitate.
Figura 2. A) Dispozitiv SPR cu configuraie Kretchmann. B) Reprezentare schematic
Unghiul de rezonan este o funcie dependent de indicele de refracie al suprafeei de
metal precum i de substana analizat. Aadar o deplasare a unghiului de rezonan
reflecteaz un eveniment la interfaa dintre folia de metal i substan. Acest eveniment
poate fi absorbia de proteine la suprafaa sau interaciunea dintre antigene i anticorpi.
SPR mai este folosit i n testele imunologice pentru detecia markerilor
biologici n sngele uman. Testele imunologice bazate pe SPR detecteaz interaciunea
dintre markerii biologici i anticorpii imobilizai pe suprafaa senzorului SPR, numii i
anticorpi primari. O monstr de snge este adus n contact cu senzorul iar markerii
biologici din sange se cupleaz cu anticorpii imobilizai pe suprafaa senzorului. Dac
concentraia biomarkerilor din snge este ridicat variaia unghiului de rezonan poate fi
detectat cu uurin.
Figura 3. A) Relaia dintre unghiul de inciden i lumina reflectat. B) Reprezentarea schematic a unui
imunotest
Deoarece n cele mai multe cazuri concentraia biomarkerilor din snge este
sczut se poate recurge la diferite metode biologice de mbuntire a deteciei. Acestea
sunt prezentate n Figura 4.
Figura 4. Metode pentru mbuntirea deteciei
Aceste metode folosesc markeri adiionali pentru a mrii sensibilitatea senzorului. Spre
exemplu n Figura 4 a) anticorpi secundari se folosesc pentru a marca markerii biologici.
mbuntirea deteciei prin utilizarea markerilor Metoda de detecie din Figura 4 d) se bazeaz tot pe principiul formrii unui
complex imun de tip sandwitch ntre un anticorp fixat pe suprafaa senzorului, un marker
biologic i un al doilea anticorp secundar. Diferena pe care o aduce aceast metod
const n faptul c anticorpul secundar este fluorescent. Aceast metod de detecie
poarte numele de Surface Plasmon Field-Enhanced Spectroscopy iar dispozitivul prin
care se analizeaz monstrele de substan are prescurtarea SPFS i are o structur aproape
identic cu SPR-ul cu diferena c n plus fa de cel din urm acesta are n componen
i o camer CCD n apropierea suprafeei senzorului(Figura 5). Avantajul SPFS const n
abilitatea de a monitoriza simultan schimbrile indicelui de refracie precum i semnalul
de fluorescen.
Figura 5. Structura schematic a SPFR
Radiaia luminoas incident stimuleaz suprafaa senzorului pe care s-au format
legturile de tip sandwitch dintre anticorpul primar, markerul biologic i anticorpul
secundar fluorescent. n acest caz pe lng radiaia luminoas reflectat se mai produce i
fenomenul de emisie de electroni n urma fluorescenei.
Figura 6. A) Reflectana(linie continu) i Intensitatea cmpului de emisie. B) Principiul de funcionare al senzorului
Astfel n loc de un singur semnal care s ne furnizeze informatii avem dou semnale cu
un comportament diferit rezultnd o analiz mai precis.Dezavantajul acestei metode de
analiz n comparaie cu prima este faptul c pentru a obine rezultatele dorite este nevoie
de introducerea de markeri adiionali ceea ce n unele cazuri ar fi o problem.
mbuntirea deteciei prin monitorizarea fazei Biosenzorul bazat pe rezonana plasmonic de suprafa este o unealt foarte puternic
atunci cnd vine vorba de analiza interaciunii dintre molecule, proteomic precum i
descoperirea de noi medicamente. De celel mai multe ori cei mai multe dispozitive
comercializate se bazeaz pe principiul msurrii intensitii radiaiei reflectate deoarece
principiul de construcie a celor din urm este mult mai simplu. Dar din cauza deviaiei
sursei de lumin, a fotoreceptorului i a circuitului de amplificare precizia de detecie este
degradat. Aceasta n cele mai multe cazuri nu este mai bun de uniti ale indicelui
de refracie(RIU).
n cercetarea proteomic i n descoperirea de noi medicamente este necesar studierea
interaciunii dntre moleculele cu dimensiuni devine din ce n ce mai important aa c
trebuie utilizat o modalitate pentru a putea msura interaciunea dintre molecule cu masa
mai mic de cteva sute de Daltoni. Atunci cnd aceste molecule interacioneaz cu alte
molecule este generat o variaie a indexului de reflexie foarte mic care este foarte greu
de detectat aa c mbuntirea sensibilitii sistemului de detecie trebuie mbuntit.
Pentru a obine sensibilitatea de care avem nevoie putem utiliza dou metode: una este
cea prin care se modific moleculele analizate iar cealalt este de a mrii posibilitiile de
detecie ale senzorului. Utiliznd prima metod, urmtoarele probleme pot s apar:
repetabilitatea testelor s fie sczut, durat mare a testelor, influen asupra activitii
moleculelor, etc. Aadar o alt abordare pentru a obine o sensibilitate mai bun este
indicat.
Detecia fazei este o posibil soluie deoarece acesta se schimb mult mai abrupt
dect intensitatea atunci cnd suprafaa senzorului este excitat. n acest sistem o und de
lumin monocromatic colimat este utilizat pentru excitaia suprafeei senzorului iar
radiaia reflectat este modulat spaial pentru a genera un ablon de interferen.
Procesnd acest ablon de interferen cu anumii algoritmi, distribuia fazei a ntregii
regiuni de detecie poate fi obinut. Monitoriznd continuu scimbarea fazei, ntregul
proces de interaciune al moleculelor poate fi observat iar n urma rezultatelor
esperimentale s-a demonstrat ca sensibilitatea acestei metode este mai mare dect cea n
care intensitatea radiaiei reflectate era monitorizat.
Analiza cu ajutorul elipsometriei
Printre tehnicile de detecie a fazei se numr interferometria i elipsometria care
aduc cu ele o configuraie simpl i o sensibilitate mare. Interferometria poate detecta
distribuia fazei pe ntreaga suprafa a senzorului iar petru detecie este recomandat
detecia distribuit.
Figura 7. Elipsometer
Elipsometria este cunoscut ca i o tehnic foarte sensibil la caracterizarea i
msurarea proprietilor optice a ambelor suprafee a unui film subire de metal. Acest
tehnic este bazat pe msurarea schimbrii strii de polarizare a radiaiei luminoase.
Elipsometria msoar doi parametri, i , definii ca i raportul amplitudinii relative i
diferena de faz dintre polarizarea veritcal i cea orizontal nainte i dup reflexia de
pe suprafaa sensibil. Dintre cele dou este foarte sensibil la schimbrile proprietailor
filmului de metal. Suprafaa plasmonic reprezint ocilaia colectiv a densitii de
electroni liberi de pe suprafaa metalului iar grosimea stratului de aur variaz odat cu
indicele de refracie a prismei dielectrice. Doar polarizarea orizontal poate excita
suprafaa plasmonic.
Mrimile msurate de ctre un elipsometru sunt i coeficienii complexi
Fresnel ai polarizatiei veriticale i orizontale. n cel mai simplu caz pentu dou medii
semi-infinite coeficienii de reflexie totala sunt nlocuii cu coeficienii de reflexie
Fresnel.
(1)
Elipsometrul presentat n exemplul urmtor este un echipament comercial, EP3 de la
Nanofilm, i conine un laser ca i surs de lumin care emite la o lungime de und de
532 nm precum i un polarizator i un compensator n partea de emisie care au rolul de a
furniza la ieirea celui din urm o radiaie luminoas polarizat eliptic.
Schema de principiu este prezentat n Figura 8.Atunci cnd radiaia luminoas
incident este polarizat n alt direcie dect cea orizontal sau vertical i este reflectat
de pe suprafaa senzorului acesta dobndete o polarizare eliptic. n alt oridine de idei,
aceeai radiaie cu polarizare eliptic reflectat de pe suprafaa senzorului va rezulta ntr-
o radiaie liniar(dac monstra nu este depolarizant). Acest fenomen are ca i conseci
faptul c putem detecta acest stare a polarizrii utiliznd un al doilea polarizator n
partea de ieire a senzorului, acesta mai fiind numit i analizor. Astfel un faciculul
polarizat linear poate fi anulat setnd analizorul la fa de axa pe care este polarizat.
Acest metod se numete Metoda anulrii iar n practic este echivalent cu gsirea
minimului n semnalul unui fotodetector. Senzorul CCD poate detecta aceste minime i
poate furniza datele unui sistem de calcul care le poate analiza i interpreta.
Figura 8. Schema de principiu a unui elipsometru folosit pentru analiza monstrelor biologice
n Figura 9 se poate observa diferena dintre variaia amplitudinii radiaiei reflectate
notat cu i variaia fazei radiaiei reflectate. Combinnd facilitiile furnizate de ctre
prelucrarea numeric a imaginilor se pot obine rezultate ca i cele prozentate n Figura
10.
Figura 9. Difernea ntre sensibilitatea celor doi parametri utilizai n elipsometrie
Figura 10. Rspunsul furnizat de ctre sistemul de analiz al monstrei a) nainte b) dup depunerea unui strat de proteine pe suprafaa placuei de aur.
Analiza cu ajutorul interferometriei
Interferometria se bazeaz pe acelai principiu ca i elipsometria i anume pe
detecia fazei. La rezonan plasmonic de suprafa faza luminii polarizate vertical
variaz abrupt n comparaie cu indicele de refracie al filmului de metal pe cnd faza
luminii polarizate orizontal rmne aproximativ constant. Variaia fazei n comparaie
cu indicele de refracie al filmului de metal este prezentat n Figura 11.
Figura 11. Dependena dintre faza luminii polarizate vertical, grosimea stratului de aur i indicele de refracie
Diferena de faz dintre dou componente nu poate fi msurat direct. Dar dup ce este
trecut printr-un polarizator diferna de faz este conectat cu intensitatea n concordan
cu ecuaia (2), unde I este intensitatea luminii de interferen iar este sunt
determinate de intensitatea luminii polarizate vertical respectiv a celei polarizate
orizontal.
(2)
Figura 12. Principiul de fucionare i imaginea rezultat n urma interferenei
Deoarece sunt necunoscute faza nu poate fi determinat doar detectnd pe I.
Lumina reflectat de pe suprafaa de detecie trece printr-o prism Wollaston care o
divide cu un unghi mic ntr-o component vertical i una orizontal. Dup ce trec printr-
un polarizator cele dou componente interfereaz una cu cealalt rezultnd o imagine
asemntoare cu cea din Figura 12. Sistemele de calcul pot determina cu ajutorul unor
algoritmi distribuia dungilor create de interferena celor dou unde i astfel pot furniza
informaii cu privire la interaciunea dintre moleculele urmrite.
Figura 13. NanoSPR 6
Figura 14. Specificaii tehnice NanoSPR 6
Concluzii Senzorii bazai pe principiul rezonanei plasmonice de suprafa provin din familia
senzorilor care msoar indicele de refracie produs de ctre interaciunea dintre molecule
la suprafaa senzorului. Principalul avantaj al acestor senzori este c pot s detecteze
interaciunea dintre molecule direct fr a fi nevoie de utilizarea unor markeri biologici
acest caracteristic fcnd posibil observarea monstrelor n timp real. Un alt avantaj al
acestor tip de senzori const n diversitatea metodelor de detecie precum i posibilitatea
de a analiza diferite tipuri de substane i interaciuni fr ca acestea s aib caracteristici
speciale ca i fluorescena sau absorbia.
Cea mai mare provocare pentru acesti senzori este categorisirea substanelor i proceselor
monitorizate. Cum abilitatea de detecie a acestor senzori se bazeaz pe schimbarea
indicelui de refracie la capturarea de noi molecule, orice schimbare a indicelui de
refracie datorat absorbiei unor molecule care nu fac parete din categoria celor urmrite
va rezulta ntr-o eroare.
Pe viitor se dorete mbuntire acestora astfel nct s poat detecta direct interaciunea
dintre molecule de dimensiuni ct mai mici sau n concentraii extrem de mici.
Bibliografie
[1] Avraham Rasooly, Keith E. Herold Biosensors and Biodetection Methods and
Protocols Volume 1 Optical-Based Detectors Methods in Molecular Biology 2008
[2] Frances S. Ligler, Chris Rowe Taitt Optical Biosensors, 2nd edition Today and
Tomorrow 2008
[3] A high-throughput surface plasmon resonance biosensor based on differential interferometric imaging, Daqian Wang1, Lili Ding1,Wei Zhang1, Zhaofeng Luo2,
HuichaoOu2, Enyao Zhang1 and Xinglong Yu1, 2012
[4] Imaging ellipsometry combined with surface plasmon resonance for real-time
biospecific interaction analysis, Won Chegal, Hyun Mo Choa, Yong Jai Choa, Young Pil
Kimb, Hak Sung Kimb, Division of Optical Metrology, Korea Research Institute of
Standards and Science
[5] Enhancement of biomolecular detection sensitivity by surface plasmon resonance ellipsometry,Hyun Mo Cho, Won Chegala, Yong Jai Choa, Young-pil Kimb,
and Hak-sung Kimb, Division of Optical Metrology, Korea Research Institute of
Standards and Science,