Upload
christen-conley
View
79
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
ELEKTROHEMIJSKI BIOSENZORI OSNOVE I PRIMENA. D. Manojlovi ć , Hemijski fakultet Beograd. DEFINICIJA. Biosenzor se mo že definisati kao uređaj koji ima ugrađenu biološki aktivnu komponentu u bliskom kontaktu sa fizičko-hemijskim pretvaračem i procesorom elektronskog signala. - PowerPoint PPT Presentation
Citation preview
ELEKTROHEMIJSKI BIOSENZORI OSNOVE I PRIMENA
D. Manojlović, Hemijski fakultet Beograd
DEFINICIJADEFINICIJA
Biosenzor se može definisati kao uređaj koji ima ugrađenu biološki aktivnu komponentu u bliskom kontaktu sa fizičko-hemijskim pretvaračem i procesorom elektronskog signala
Shema biosenzora
Analit odinteresa Smetajućavrsta
Biokomponenta
Pretvarač
ProcesorSignal
Pretvarača (transducer) - pretvara uočenu promenu (fizičku ili hemijsku) u mereni signal
Prepoznavajućeg agensa – koji omogućava merenje samo one vrste koja nam je od interesa a koja se nalazi u smeši sa drugim vrstama
Svaki senzor i biosenzor se sastoji od:
Enzim
Antitelo
Mikro-org.
Ćelija
Molekul prepoznavajućimaterijal
Princip biosenzora
Pretvarač signala
Električni signal
Elektroaktivna supstanca
Elektrode
pH promenaPoluprovodničke pH elektrode
Toplota Termistori
Svetlost
Brojač fotona
Promena mase
Piezoelektrični uređaj
BIOKOMPONENETEBIOKOMPONENETE
EnzimiAntitelaMembraneOrganeleĆelijeTkivaReceptori
PRETVARAČIPRETVARAČI
Elektrohemijski OptičkiPiezo-električniKalorimetrijskiAkustični
Enzimi
Biološki elementi koji se najčešće koriste
Mogu biti korišćeni u čistom obliku ili prisutni u mikroorganizmima ili biljnom materijalu bez prethodnog izolovanja
Aktivnost mnogih enzima uključuje oksidaciju i redukciju koje mogu biti detektovane elektrohemijski
Postoji pet glavnih klasa enzima.
Oksidoreduktaze
Transferaza
Hidrolaze
Liaze
Izomeraze
OksidoreduktaOksidoreduktazeze
Dehidrogenaze
Oksidaze
Peroksidaze
Oksigenaze
Prednosti enzima:
1. lako se vežu za odgovarajući supstrat
2. visoko su selektivni
3. imaju katalitičku aktivnost
4. brzo se aktiviraju
Enzimi su najčešće korišćene biološke komponente
Mane enzima:
1. skupi su
2. često gube aktivnost dok se imobilizuju na pretvaraču
3. gube aktivnost posle relativno kratkog vremenskog perioda
Antitela
Vezuju se specifično za odgovarajući antigen
Prednosti:
1. veoma su selektivni2. ultra osetljivi3. veoma se snažno vezuju
Jedina mana im je što nemaju katalitički efekat
Nukleinske kiseline
slične antitelima
koriste se za detekciju genetskih bolesti, kancera i virusnih infekcija
DNK istraživanja često uključuju dodatak označene DNK u sistem dodatkom nekog radioaktivnog elementa ili elektrofore
Metode imobilizacije
Povezivanje selektivnih elemenata
adsorpcijom selektivnog elementa na površinu
kovalentnim vezivanjem
mikrokapsulacijom
cross-linking – koristi se bifunkcionalni agens da hemijski poveže pretvarač i selektivnu komponentu
‘zarobljavanjem’ - selektivni element se nalazi uhvaćen unutar gela, paste, ili polimera
TIPOVI BIOSENZORATIPOVI BIOSENZORA
Enzim/metabolički biosenzori– Enzimske elektrode i ćelijske elektrode
Bioafinitetni senzori
– Antitela– Nukleinske kiseline– Lektin
Enzim/metabolički senzoriEnzim/metabolički senzori
Supstrat + Enzim
Supstrat-enzmski kompleks
Proizvod + Enzim
Meri se odnos potrošnje supstrata premaoslobađanju proizvoda i pretvara u kvantifikovani signal
Bioafinitetni senzoriBioafinitetni senzori
Ovi senzori se baziraju na interakcijama povezivanja između imobilizovanih biomolekula i analita od interesa.
Ove interakcije su visoko selektivne.
Pimeri obuhvataju antitelo-antigen interakcije, nukleinske kiseline za komplementarne sekvence i lektin za šećer
Bioafinitetni senzori
AntiteloAnalitodinteresa(antigen)
Ometajućevrste
Antitelo-antigen kompleks
PretvaračiPretvarači
– Potenciometrijski
– Amperometrijski
– Konduktometrijski
POTENCIOMETRIJSKI POTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORI BIOSENZORI
Kod potenciometrijskih senzora izmereni potencijal na selektivnoj memembrani ili elektrodnoj površini, koja je u kontaktu sa rastvorom, povezan je sa koncentracijom analita
Potencijal se meri pri nultoj struji i prema referentnoj elektrodi (relativni)
pH elektroda je osnovni potencionetrijski pretvarač u biosenzorima.
POTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORIPOTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORI
E = Eo + RT/nF ln[analit]
– Eo konstanta za sistem
– R univerzalna gasna konstanta
– T apsulutna temperatura
– n broj izmenjenih elektrona
– F Faradejeva konstanta
– ln[analit] prirodni logaritam od aktiviteta analita.
Najpoznatiji potenciometrijski senzor je jon-selektivna elektroda (ISE)
Tečne polimerne membranske elektorde su komercijalno raspoložive i rutinski se koriste selektivnu detekciju nekoliko jona (K+, Na+, Ca2+, NH4
+, H+, CO32-) u složenim biološkim
osnovama
Antibiotici nonactin i valinomicin služe kao neutralni nosači za određivanje NH4
+ i K+
Ag/AgCl referentna elektroda
Unutrašnji vodeni rastvor za punjenje
Membrana/soni most
Porozna membrana koja sadrži jonoforu
Tečni jonoizmenjivač
Enzim može biti imobilizovan na pH elektrodi korišćenjem želatina i glutaraldehida
Glukoza
glukoza + O2 → glukonska kiselina + H2O2 enzim:GOD
dolazi do promene pH zbog nastanka glukonske kiseline
merenjem promene potencijala (pH) možemo odrediti koncentraciju glukonske kiseline (a samim tim i glukoze)
Penicinpencilinaza
Penicilinska Kiselina
U kontaktu sa pH elektrodom.
ISE koje se koriste u kombinaciji sa imobilizovanim enzimoma mogu da služe kao osnova elektroda koje su selektivne za specifične enzimske supstrate
Od njih su dva glavna: za ureu i za kreatinin.
Ove potenciometrijske enzimske elektrode se prave ubacivanjem enzima ureaze i kreatinaze na površinu katjon osetljive (NH4
+) ISE
Urea
CO(NH2)2 + 2 H2O → (NH4)2CO3
koncentraciju uree možemo određivati primenom katjonske amonijum selektivne elektrode
ili možemo napraviti alkalni rastvor i određivati slobodni amonijak koristeći amonijum selektivnu gasnu elektrodu
Osetljivost odnosno granica detekcije iznosi (10-6 M )
Oksalati
C2O42- → 2 CO2 + H2O oksalat oksidaza
Određivanje oksalata u urinu je značajno prilikom dijagnostike hiperokslurije
Potenciometrijski pretvarač kod biosenzora koji se koristi za određivanje koncentracije CO2 (odnosno oksalata u mokraći) je CO2 gasna elektroda
Primeri potenciometrijskih senzora
Glukoza
Koristimo jodid selektivnu elektrodu
glukoza + O2 → glukonska kiselina + H2O2
enzim:GOD
H2O2 + 2 I- + 2 H+ → I2 + 2 H2O enzim:PO
Jodid-selektivna elektroda prati smanjenje koncentracije jodida što je prouzrokovano dejstvom vodonik-peroksida
AMPEROMETRIJSKI BIOSENZORIAMPEROMETRIJSKI BIOSENZORI
Kod amperometrijskih biosenzora elektrodni potencijal se drži na konstantnoj vrednosti dovoljnoj za oksidaciju ili redukciju vrste od interesa (ili supstance elektrohemijski vezane za nju)
Jačina struje koja protiče je proporcijonalna koncentraciji analita
Id = nFADsC/d
e tok
Radna elektroda
Pomoćna elektroda
Referentna Elektroda(Ag/AgCl, SCE)
( Pt žica)
( Pt, Au, C)
Mešalica
Puferski rastvor (Tris, DPBS, Citrat)Koji sadrži elektrolit( KCl, NaCl)
Primer
Glukoza + O2GlukozaOksidaza
Glukonska kiselina + H2O2
Proizvod, H2O2, se oksidovuje na +650mV u odnosu na Ag/AgCl referentnu electrodu.
Zbog toga se primenjue potencijal od +650mV i meri oksidacija H2O2 .
Struja je direktno proporcionalna koncentraciji glukoze.
0
50
100
150
5 10 15 20
I (nA)
[Glukoza], mM
Amperometrijske enzimske elektrode koje se baziraju na oksidazama u kombinaciji sa vodonik proksid indikatorskim elektrodama postale su najuobičajeniji biosenzori
Kod ovih reakcija prati se, potrošnja kiseonika ili proizvodnja vodonik peroksida
Prvi razvijeni biosenzor bazirao se na korišćenju kiseonične elektrode
Enzim glukooksidaza (GOD) imobilisan je u poliakrilamidnom gelu na gas-propusnoj membrani koja pokriva elektrodu
Kroz razvoj biosensora se susrećemo hronološki sa tri generacije na osnovu mehanizma dejstva:
1. prva generacija – senzori bazirani na kiseoničnim elektrodama
2. druga generacija – senzori bazirani na medijatorima i
3. treća generacija – elektrode sa ugrađenim enzimima
Klarkovakiseoničnaelektroda-+
Platinska katoda
Srebrna anoda
Telo elektrode
KCl rastvor
Mana kiseoničnih senzora je što su veoma skloni smetnjama od strane spoljašnjeg kiseonika
Zbog toga pratimo koncentraciju proizvedenog vodonik peroksida, a ne kiseonika koji se troši u reakciji
H2O2 → 2H+ + 2e- + O2
Na primenjenom potencijalu anodne oksidacije vodonik peroksida različita organska jedinjenja se oksiduju (vitamin C, mokraćna kiselina, glutation itd.)
flavin-adenin-dinukleotida (FAD)
Preduzeti su različiti pristupi za povećanje selektivnosti detektujuće elektrode, njenim hemijskim modifikacijama, korišćenjem:
1. membrana2. medijatora3. metalizovanjem elektroda4. polimera
1.Membrane.
Razvijene su različite permiselektivne membrane, koje kontrolišu vrste koje stižu do elektrode, na bazi naelektrisanja i veličine
Primeri obuhvataju
celuloza acetat (naelektrisanje i veličina),nafion (naelektrisanje) i polikarbonat (veličina).
Nedostatak korišćenja membrana je njihov uticaj na difuziju.
2. Medijatori druga generacija biosenzora
Mnogi oksidaza enzimi mogu da koriste veštačkeelektron akceptorske molekule, koji se nazivaju medijatori
Medijator je niskomolekulski redoks par koji može da prenese elektrone sa aktivnog mesta enzima na površinu elektrode, i na taj način uspostavlja električni kontakt izmađu njih
Ovi medijatori imaju širok opseg struktura, a samim tim i osobina, uključujući i opsege redoks potencijala
Kao medijatori se koriste katjoni prelaznih metala i njihovi kompleksi
Jedan od boljih medijatora je ferocen(Fc) – sendvič kompleks gvožđa i dva ciklopentadienil(Cp) anjona
Princip dejstva medijatora na bazi ferocena
glukoza + GODOx → glukonolakton + GODR + 2H+
GODR + 2Fc+ → GODOx + 2Fc
2Fc – 2e- → 2Fc+
Oksidacija glukoze se ostvaruje preko flavin-adenin-dinukleotida (FAD), komponente enzima GOD, koji se pretvara u redukovani oblik FADH2, koji se kasnije reoksiduje do FAD pomoću Fc+ (medijatora), dok se Fc reoksiduje direktno na elektrodi strujom koja će kasnije biti merena pri određivanju koncentracije glukoze
Dobri medijatori bi trebalo da:
1. brzo reaguju sa enzimima2. reverzibilno izvode transfer elektrona3. imaju mali nadpotencijal pri
regeneraciji4. nezavisni su od pH vrednosti5. stabilni su i u oksidovanom i u
redukovanom obliku6. ne reaguju s kiseonikom7. nisu otrovni
Ferocen zadovoljava sve uslove
Primeri medijatora koji se obično koriste:
– Ferocen (nerastvoran)– Ferocen dikarbonska kiselina (rastvoren)– Dihloro-indofenol (DCIP)– Tetrametil-fenilenediamin (TMPD)– Fericijanid – Rutenium hlorid– Metilen Plavo (MB)
3. Metalizovne elektrode
Svrha korišćenja metalizovanih elektroda je u tome da se steknu uslovi pri kojima se oksidacija enzimski generisanog H2O2 može postići na nižem primenjenom potencijalu, stvarajući jako osetljivu katalitičku površinu
Pored toga smanjujući efekat smetnji, zbog nižeg primenjenog potencijala, odnos signal/šum raste zabog povećanja elektrohemijski aktivne površine
Metalizacija se postiže taloženjem odgovarajućegplemenitog metala na glas karbon elektrodu (GC), korišćenjem ciklične voltametrije
Uspešni rezultati su postignuti sa nekoliko plemenitih metala-platina, paladijum, rodijum i rubidijum od kojih se najviše može očkivati
Odg
ovor
Potencial
Odg
ovor
PotencialPotencial
Odg
ovor
Potencial
Odg
ovor
GC elektroda Metalizovana GC
GC elektroda ne katalizuje oksidaciju H2O2
GC metalizovana elektroda sa ruteniumom, rodiumom, paladijuom ili platinom katalizuju oksidaciju H2O2
Primeri uobičajeno upotrebljavanih polimera:
– polipirol– politiofen– polianilin– diaminobenzen– polifenol
Kao i membrane polimeri imaju ulogu da sperče ometajuće vrste da stignu do površinu elektrode i izvode diferencijaciju na osnovu veličine i naelektrisanja
4. Polimeri
Treća generacija – elektrode sa ugrađenim enzimima
Neophodan je da medijator bude ugrađen zajedno sa enzimom u elektrodu
Nema redukcije ili oksidacije enzima direktno na elektrodi da bi se sprečila denaturacija na površini elektrode i gubitak enzimsku aktivnost
NANOSENZOR
Vrh nanosenzora
Nanosenzor u ćeliji
eSensor TM Motorola
Senzor je razvijen ispitivanjem sendvič hibridizacija ima tri osnovne komponente koje sadrže svi današnji uređaji (sonda za hvatanje, ciljna proba i signalna proba).
Signalna sonda je obeležena ferocenom i služi kao cilj za hibridizaciju
Tok elektrona prema elektrodi se javlja samo ako se specifično hibridizuju sonda za hvatanje, ciljna proba i obeležena proba
eSensor TM Motorola
eSensor TM Motorola
Sonda za hvatanje
Ciljna DNA
Hibridizacija sa ciljnom DNA
Hibridizacija sa feracen označenom probom
Merenje ferocen označenog signala
Senzor za odrđivanje nitrata
SEM makroporozne mikroelektrode SEM mreže
Ultramikro makroporozna elektroda za određivanje teških metala u životnoj srediniu