BIOTECHNOLOGIE ET SUBSTANCES NATURELLES VEGETALESF. BERNIER, Institut de Botanique

Thèmes abordés

1- Généralités – Facteurs à considérer2- Biotechnologie et alimentation3- Polymères – agro-carburants4- Bioréacteurs – protéines à usage médical5- Bioréacteurs – pour aller plus loin

- Le contrôle de l’expression des transgènes- Systèmes alternatifs- Systèmes alternatifs

6- Autres applications- Poils et tissus sécréteurs- Augmentation de la tolérance au stress

REFERENCES GENERALES

• Biochemistry & Molecular Biology of Plants, Buchanan, Gruissem, Jones, American Society of Plant Physiologists, 2000.

• Journaux• Journaux

– Current opinion in biotechnology

– Journal of agricultural and food chemistry

– Journal of biotechnology

– Metabolic engineering

– Nature bio-technology

– Plant Biotechnology journal– Plant Biotechnology journal

– Trends in Biotechnology…

QU’EST-CE QUE L’INGENIERIE METABOLIQUE ("metabolic e ngineering") ?

Manipulation de voies métaboliques (généralement par transgenèse) pour :

1- augmenter la quantité de substances naturellement présentes dans la plante

2- produire de nouvelles molécules (d’origine végétale ou non)2- produire de nouvelles molécules (d’origine végétale ou non)

1 et 2 (bioréacteurs ): pour nutrition, médecine, industrie…

Notion de: PMP (« Plant Made Pharmaceuticals »)

PMIP (« Plant Made Industrial Products »)

3- diminuer la quantité de substances naturellement présentes dans la planteplante

p.e. élimination de toxines ou allergènes

4- introduire de nouveaux caractères chez les plantesp.e. augmentation du rendement, de la résistance au stress…

Quelques exemples de PMP et PMIP (protéines)

Commercialization of whole-plant systems for biomanufacturing of protein products: evolution and prospects. H. Maelor Davies. Plant Biotechnology Journal (2010) 8, pp. 845–861

Approches 1 et 2 (Bioréacteurs): Avantages p/r aux autres systèmesIngénierie métabolique: Approches classique vs mode rne (« omiques »)

Genome Wide Approaches in Natural Product Research. Jürgen Ehlting, Björn Hamberger, Jean-François Ginglinger, and Danièle Werck-Reichhart. In A.E. Osbourn and V. Lanzotti (eds.), Plant-derived Natural Products, Springer Science + Business Media, pp 475-503, 2009

La manipulation du métabolisme des plantes nécessit e des connaissances à tous les niveaux (de la métabolomiq ue jusqu’à la génomique)

NB plantes: ≈ 200 000 métabolites, p.e. Arabidopsis: 5000 métaboliteshumain: 3000 métabolites

Integrating genomics and metabolomics for engineering plant metabolic pathwaysKM Oksman-Caldentey and K Saito, Curr Op Biotech, 16: 174-179 (2005)

Quels sont les facteurs à considérer?

• Choix des gènes

• Choix de l’espèce

• Choix de l’organe

• Transformation stable vs expression transitoire

• Site d’intégration du gène

• Expression du(des) transgène(s)

• Localisation subcellulaire des voies métaboliques

• Contraintes liées aux voies métaboliques

• Stabilité des protéines et métabolites• Stabilité des protéines et métabolites

• Problèmes/risques

1- Choix des gènes

• Origine

– Gènes de la même espèce

(plantes « intra-géniques » ou « cis-géniques » )

Avantage: la plante ne possède pas de protéine nouvelleAvantage: la plante ne possède pas de protéine nouvelle

– Gènes d'autres sources (autres espèces végétales, bactéries...)

(plantes transgéniques )

• Type de gènes*

– gènes structuraux (enzymes)

– gènes pour des régulateurs de transcription:– gènes pour des régulateurs de transcription:

• contrôlant des gènes structuraux

• contrôlant des gènes de développement

*addition, modification (expression ou produit), suppression de l’expression

Université Louis Pasteur janvier 2008 Faculté des Sciences de la Vie

Master Sciences du Végétal

UE : Ingénierie métabolique des substances naturelles végétales

Cours de M. François BERNIER

Durée: 2 heures

Des plantes intra-géniques

Crop genetic engineering relies on the introduction of foreign DNA into plant genomes.

Although genetically engineered traits provide valuable alternatives to those available through conventional breeding, there is public concern about the consumption of foods derived from transgenic plants. This concern raises the question of whether crops can be improved by inserting only native DNA into their genomes. Here, we discuss how rapid advances in molecular biology make it possible to use plants themselves as DNA sources. Native genes and regulatory elements can be reintroduced into plants without the need to use selectable markers. By also using transfer DNAs that are derived from within the targeted compatibility group, genetically engineered plants can now be produced that lack any foreign DNA.

Gènesstructuraux

Types de gènes

Gènes régulateurs

2- Choix de l’espèce : plantes faciles à transformer et déjà cultivées à grande échelle

• Espèces comestibles :

– avantage : absence de toxine; consommation directe de la plante (vaccins, éléments nutritifs…)plante (vaccins, éléments nutritifs…)

– inconvénient : sécurité (risque de « contamination »)

p.e. tomate, pomme de terre, laitue, soja, pois, banane, colza, riz, blé, maïs…

N.B. avantages des Légumineuses (pois, soja, luzerne…) : culture sans apport d’engrais azoté

• Espèces non comestibles : p.e. tabac (attention : alcaloïdes et substances phénoliques…)

3- Choix de l’organe (bioréacteurs)

Feuilles Graines

Productivité Possibilité plusieurs récoltes/année, p.e. tabac

Généralement 1 seule récolte/année

p.e. tabac

Toxines Souvent Peu (espèces domestiquées)

Stabilité des protéines exogènes

Souvent instables Généralement stables

Purification -Immédiatement après la récolte

-Stockage possible-purification plus facile: récolte

-Plusieurs contaminants-purification plus facile: mélange moins complexe

Risques -Perturbation développement-consommation par herbivores

Peu

Exemples

Riz ou maïs :

• synthèse partout (promoteur 35S) : rendement très faible (<0,02% TSP « Total Soluble Proteins »)(<0,02% TSP « Total Soluble Proteins »)

• synthèse dans les graines : 1-5% TSP

NB %TSP minimal requis pour production rentable à grande échelle : 0,1 à 1% (idéalement 1%)

4- Transformation stable vs expression transitoire

• Plantes transformées de façon stable :

Approches: Agrobacterium, canon à particules, trempage dans solution d’ADN…solution d’ADN…

Avantages: expression constitutive ou régulée du transgène

facilité de propagation/ multiplication

Inconvénients: effet possible sur le développement de la plante

(forte expression, toxicité: protéine ou métabolite)(forte expression, toxicité: protéine ou métabolite)

plante génétiquement modifiée (PGM)…

insertion du transgène: aléatoire*

The myth of plant transformation. Abdul Qayyum Rao, Allah Bakhsh, Sarfraz Kiani, Kamran Shahzad, Ahmad Ali Shahid,Tayyab Husnain, S. Riazuddin. Biotechnology Advances 27 (2009) 753–763

Remarque: il est maintenant possible de choisir le site d’intégration

- Zinc fingers on target, Matthew H. Porteus. Nature 21 May 2009, 337-338

- High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases. Feng Zhanga et al. PNAS 107, 12028-12033 (2010)- Site-directed mutagenesis in Arabidopsis using custom-designed zinc finger nucleases.Keishi Osakabe, Yuriko Osakabe, and Seiichi Tokia. PNAS 107, 12034-12039 (2010)

• Expression transitoire :plantes non transformées, ne produisant la protéine qu’au moment voulu

Construction: gène d’intérêt sous le contrôle d’un promoteur de plantes

Avantages : - rapide (permet de tester rapidement des constructions)

- peu d’effet sur le développement de la plante

- plantes non transgéniques

Inconvénient : difficulté de produire à grande échelleInconvénient : difficulté de produire à grande échelle

Expression transitoire: approches

– Electroporation (cellules ou tissus intacts), canon à particules

Avantage : pas de limitation d’hôteN.B. permet transformation des chloroplastes

Inconvénient : techniquement difficile, pas possible à grande échelle

– Agroinfiltration : infiltration de bactéries (Agrobacterium) recombinantes

→ expression du gène avant intégration à l’ADN de la plante

→ technique: - feuilles → pression (seringue) ou infiltration sous vide

- racines → simple trempage

Avantage : facilité de produire de grandes quantités de bactéries

Inconvénient : dispersion de bactéries

- Infiltration d’ADN seul dans des tissus intacts

Transient expression of a foreign gene by direct incorporation of DNA into intact plant tissue through vacuum infiltration. Bo Zhou, Xia Zhao, Saneyuki Kawabata, Yuhua Li. Biotechnol Lett (2009) 31:1811–1815

Expression transitoire: vecteurs

– PlasmideAvantages: simple, grande variété Inconvénient: expression limitée à un site

– Virus recombinant :• protéine soluble

OU• protéine chimérique intégrée à la particule virale (pour vaccins, p.e.)

Avantages : très bon rendementAvantages : très bon rendementexpression dans toute la plante

Inconvénients : dispersion de virus dans l’environnementinstabilité des transgènes dans vecteur viral

Utilisation de vecteurs viraux

Plant virus expression systems for transient productionof recombinant allergens in Nicotiana benthamianaBirgit Wagner, Heidemarie Fuchs, Farzaneh Adhami, Methods32 (2004) 227–234

Foreign protein production using plant cell and organ cultures: Advantages and limitations. Sharon M.-H. Shih, Pauline M. Doran. Biotechnology Advances 27 (2009) 1036–1042

– Exemple : Agro-infiltration dans les racines

vecteur basé sur le TMV

GFP: jusqu’à 8% des TSP (détection dès 24h après absorption)

A simple and effective system for foreign gene expression in plants via root absorption of agrobacterial suspension.Liping Yang, Hongwei Wang, Jingying Liu, Liang Li, Yajun Fan, Xiufeng Wang, Yehua Song, Shaoguang Sun, Lei Wang, Xiaojuan Zhua, Xingzhi Wang. Journal of Biotechnology 134 (2008) 320–324

Les problèmes liés aux virus peuvent être résolus par l’emploi de virus « déconstruits », i.e. ne codant pas eux-mêmes toutes leurs fonctions

Inconvénient: propagation dans des plantes transgéniques…

5- Choix du site d’intégration du gène

Vecteur pour transformation des chloroplastes

Agrobacterium: noyau

Nuclear and plastid genetic engineering of plants: Comparison of opportunities and challenges . Benjamin Meyers, Adi Zaltsman, Benoît Lacroix, Stanislav V. Kozlovsky, Alexander Krichevsky. Biotechnology Advances 28 (2010) 747–756

Transformation nucléaire vs chloroplastiques: avant ages et inconvénients

Nuclear and plastid genetic engineering of plants: Comparison of opportunities and challenges . Benjamin Meyers, Adi Zaltsman, Benoît Lacroix, Stanislav V. Kozlovsky, Alexander Krichevsky. Biotechnology Advances 28 (2010) 747–756

Avantages et inconvénients: résumé…

NOYAU CHLOROPLASTE

Rendement variable généralement +++ *Rendement variable généralement +++ *

Recombinaison homologue non oui

« Gene silencing » possible non

Dissémination du transgène oui : pollen non**

Modifications post-traductionnelles toutes assemblage, ponts S-S

(glycosylation : non)

Localisation de la protéine toutes possibles chloroplaste

* jusqu’à 47% TSP

** << 0,01% (vs taux autorisé de 0,9%)

Introduction dans génome chloroplastique: plantes transplastomiques

- Avantages : intégration par recombinaison homologuepas de dispersion des transgènes par le pollentrès haut niveau d’expressiontrès haut niveau d’expression

- Inconvénients : protéine dans le chloroplastetransformation « difficile »s’assurer de l’homoplasmie: homogénéité

(plusieurs ADN/chloroplaste; plusieurs chloroplastes/cellule)

HSA Bt toxin

CHLOROPLASTES: avantages de la recombinaison homolo gue

Plastid biotechnology: prospects for herbicide and insect resistance, metabolic engineering and molecularfarming. Ralph Bock. Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:100–106

La transformation de chloroplastes a été réalisée c hez peu d’espèces

The chloroplast transformation toolbox: selectable markers and marker removal. Anil Day and Michel Goldschmidt-Clermont. Plant Biotechnology Journal (2011) 9, pp. 540–553

Le problème de l’homogénéité

Exemples

Transgene containment by maternal inheritance: Effective or elusive? Henry Daniell. PNAS 104, 6879-6880 (2007).

6- Expression des transgènes

• expression régulée vs constitutive des transgènes

• transformation avec plusieurs gènes

• gènes de sélection : choix / élimination

• suppression de l’expression de certains gènes

• Utilisation de « master regulators »: régulation simultanée de l’expression de plusieurs gènes

Rappel: REGULATION DE L’EXPRESSION GENETIQUE

L'expression d'un gène est régulée par:

• développement• environnement: lumière, stress...• environnement: lumière, stress...• hormones• combinaison de facteurs (le plus souvent)

Biotechnologie/Ingénierie métabolique :

• manipulation de l'expression de gènes déjà présents dans la plante• introduction de gènes d'autres sources, avec une expression • introduction de gènes d'autres sources, avec une expression

appropriée→ niveau d’expression, lieu et moment (développement)→ principaux niveaux de régulation: - transcription

- stabilité des ARNm

Structure modulaire des promoteurs: plusieurs types d'éléments agissant en cis (enhancers et silencers)

sens strict

promoteur: sens largepromoteur: sens large

Biochemistry & Molecular Biology of Plants, Buchanan, Gruissem, Jones, American Society of Plant Physiologists, 2000.

Protéines pour l'expression des gènes: facteurs de transcription

4 classes:

• FT généraux : RNA pol II (complexe de >10 protéines)

+ protéines associées: TFIIA, TFIIB...

→ complexe d’initiation de la transcription (sur promoteur, sens strict)→ complexe d’initiation de la transcription (sur promoteur, sens strict)

→ nécessaires mais pas suffisants pour avoir transcription:

interactions avec les autres FT

• activateurs et répresseurs : se fixent aux enhancers ou silencers

(reconnaissance spécifique de courtes séquences d'ADN)

• coactivateurs et corépresseurs :

– ne se lient pas directement à l'ADN

– interactions protéine-protéine avec activateurs ou répresseurs

• FT "architecturaux": structure de l'ADN

p.e. repliement pour favoriser interaction activateurs-polymérase II

Assemblage de la machinerie transcriptionnelle

Biochemistry & Molecular Biology of Plants, Buchanan, Gruissem, Jones, American Society of Plant Physiologists, 2000.

Protéines activatrices de la transcription

structure modulaire; au moins 2 domaines :

• reconnaissance et fixation à l'ADN (définit les ≠ types d'activateurs)

• activation de la transcription (interaction avec complexe d'initiation)• activation de la transcription (interaction avec complexe d'initiation)

+ (souvent)

• interaction avec autres protéines (coactivateurs)

• interactions avec molécules qui vont moduler leur activité (kinases, phosphatases...)

Remarques:Remarques:

• familles de gènes: plusieurs protéines similaires, spécificités ≠

• se fixent généralement à l'ADN sous forme d’oligomères (homo- ou hétéro-)

EXEMPLE: G-Box :

• Eléments agissant en cis, souvent dans les gènes de réponse au stress

• G-Box est nécessaire mais pas suffisante pour activer transcription:

ABRE: ABA Responsive Element UVRE: UV Responsive Ele mentCo: co-activateur

Conclusion

• Fonctionnement combinatoire : 1 facteur de transcription → plusieurs rôles1 facteur de transcription → plusieurs rôles(1 élément agissant en cis) → plusieurs gènes ≠

→ plusieurs signaux

• pas de différence fondamentale entre: activation et répression

i.e. enhancer vs silencer, activateur vs répresseur, co-activateur vs co-répresseur

7- Localisation des substances et des voies métaboli ques

• Cellule compartimentée

• Chaque compartiment: sous-ensemble spécifique sous-ensemble spécifique de molécules

• Phénomènes de transport entre les compartiments

Parmi les substances naturelles végétales d'intérêt économique, il n'y a pas que les: essences, parfums, médicaments... (métabolisme IIaire, p.e. alcaloïdes…):

• plusieurs substances sont des composants de la paroi cellulaire:cellulose, pectines, gommes,mucilages, oligosaccharides...cellulose, pectines, gommes,mucilages, oligosaccharides...

• stockage dans les vacuoles : substances utiles (protéines de réserve , p.e.) ou nuisibles (oxalate , p.e.)

• molécules des plastes : amidon et autres polysaccharides, pigments

En ingénierie métabolique, il faut donc tenir compt e:

• Des phénomènes de transport (dans la cellule et entre les cellules):• Des phénomènes de transport (dans la cellule et entre les cellules):exocytose, endocytose, plasmodesmes , système vasculaire

• Développement et différenciation des cellules et tissus sécréteurs : poils, glandes...

8- Contraintes liées aux voies métaboliques

• connaissance préalable de :– localisation cellulaire et sub-cellulaire (parfois multiple)– tous les intermédiaires et activités enzymatiques – points de régulation (transcriptionnelle et post-transcriptionnelle)– mécanismes de transport des intermédiaires et produits finaux

Voie du glycolate, d’après Biochemistry & Molecular Biology of Plants, Buchanan, Gruissem, Jones, American Society of Plant Physiologists, 2000.

• par rapport au précurseur nécessaire à la voie métabolique à modifier, s'assurer:

– qu'il est disponible et présent en quantité suffisante

– que son "détournement" n'aura pas de conséquence néfaste (dans les cas où l'on cherche à synthétiser un nouveau produit ou à augmenter la synthèse d'un produit existant)ou à augmenter la synthèse d'un produit existant)

9. Stabilité des protéines et métabolites

• s'assurer que le produit recherché n'entre pas immédiatement dans des voies cataboliques

(N.B. pour augmenter la quantité d'un produit, il est parfois aussi efficace de réduire le catabolisme que d'augmenter la synthèse)efficace de réduire le catabolisme que d'augmenter la synthèse)

ou, combinaison des 2 approches…

• Stabilité des protéines hétérologues: variable, difficile à prévoir…

10. Problèmes/risques

• Pour la santé :

allergies (protéines: glycosylation) ou toxicité (métabolites)*

* métabolomique (« metabolic profiling »):

principe du « compositional assesment »…principe du « compositional assesment »…

• Pour l’environnement:

dissémination des transgènes

(solutions: choix des espèces, chloroplastes, stérilité mâle…)

• Pour la plante elle-même:

– possibilité d'effet pléïotropique : effet sur la croissance ou le développement de la plante

– difficulté de transposer en champ les résultats obtenus en serre: effets de l'environnement

Evaluation du danger pour la consommation (protéine s)

Evaluation of protein safety in the context of agricultural biotechnology. Bryan Delaney et al. Food and Chemical Toxicology 46 (2008) S71–S97

EXPLOITATION INDUSTRIELLE

Safe and acceptable strategies for producing foreign molecules in plants. PN Mascia,RB Flavell. Curr Op Plant Biol 7, 189-195 (2004)

Optimisation des résultats…Exemples d’approches pour l’optimisation des résultats

Commercialization of whole-plant systems for biomanufacturing of protein products: evolution and prospects. H. Maelor Davies. Plant Biotechnology Journal (2010) 8, pp. 845–861

En résumé

Pour bien savoir ce que sont toutes les substances végétales d'intérêt économique, et éventuellement les utiliser (purification et approches biotechnologiques), il faut d’abord savoir:

• où elles sont (au niveau cellulaire et dans la plante)

• comment elles s'y sont rendues

• sous quelle forme elles sont (libres ou conjuguées)

• à quoi elles servent pour la plante

• quelles autres substances les accompagnent

→ bonnes connaissances fondamentales de biologie cellulaire, physiologie, métabolisme…

DES LIENS ET SITES UTILES

Moodle: - cours- sujets des années précédentes- publications

http://www.cera-gmc.org/?action=gm_crop_database

Exemple:

Maïs MON810