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BiotecnologBiotecnologíía y Alimentacia y Alimentacióónn

II. AlimentaciII. Alimentacióón y Saludn y Salud

CURSO DE BIOTECNOLOGCURSO DE BIOTECNOLOGÍÍA EN LA EMPRESAA EN LA EMPRESAV EDICIV EDICIÓÓNN

David TomDavid Tomáás s FornFornééssdtomas@ainia.esdtomas@ainia.es

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Biotecnología en la Industria Alimentaria.

Desarrollo de alimentos funcionales

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Contenido

• Definición de alimento funcional

• Características de un alimento funcional

• Tipos de alimentos funcionales

• Desarrollo de alimentos funcionales basados en probióticos

Definición

Características

Evaluación y caracterización funcional y tecnológica

Aspectos tecnológicos

• Conclusiones

• Anexo (ingredientes funcionales y aplicaciones)

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¿Qué son los alimentos funcionales?

El termino alimento funcional aparece por primera vez en Japón, en los años 80.

Alto coste de la atención sanitaria debido a:

Envejecimiento poblacional

Dieta carentes nutrientes

SOLUCIÓN frente al

Hoy en día, se conoce la relación entre:

Dieta Estado de salud

saludable Estado salud óptimo

Desarrollo nuevos productos funcionales

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Son productos con probados efectos beneficios fisiológicos y/o reducción en el riesgo de enfermedades crónicas

¿Qué términos podemos utilizar?

8 Alimento funcional8 Nutracéuticos8 Farmaalimentación8 Alimento diseñado8 Vitafood8 Fitoquímicos

8 Alimentos medicinales8 Suplementos dietéticos8 Productos herbales8 Sustancias botánicas8 Nutracosméticos

Goldberg, I. (1994). Functional foods, designer foods, pharmafoods, nutraceuticals. Champman and Hall, New York

Mazza, G. (1998). Functional foods. Biochemical and processing aspects. Technomic Publishing Company, Inc, Lancaster, Pennsylvania

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En Europa, aunque no existe un acuerdo general sobre que son los alimentos funcionales, se acepta la definición propuesta por el profesor M. Robertfroid (Am. J. Clin. Nutr. 2000; 71:1660s-1664s)

“ Un alimento funcional es aquel que contiene un componente alimenticio (sea un nutriente o no) con efecto selectivo sobre una o varias funciones del organismo, cuyos efectos positivos justifican que pueda reivindicarse que es funcional o incluso saludable”

Alimentos funcionales

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Características alimentos funcionales

Efecto beneficiososobre la salud

Base científica.Estudios epidemiológicos.

Necesario conocer interaccionesentre el ingrediente y la matriz del alimento.

Administrado demanera convencional.

No deben reducir valor nutritivo del alimento que los contiene

Dosis establecida por expertos

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Beneficios de los alimentos funcionales

Fomento de la salud intestinal

Reducción del nivel de colesterol

Descenso en la presión arterial

Mejora de la respuesta inmunológica

Protección frente a problemas cardiovasculares y algunos cánceres

Hasler, C.M. (1998). Functional foods: Their role in disease prevention and healthpromotion. Scientific Status Summary. Food Technology, 52(11), 63-70

Ventajas que aporta al consumidor

Consumiendo un PRODUCTO con las mismas características que el

TRADICIONAL

GARANTIAS DE SALUD: PREVENCIÓN DE ENFERMEDADES

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Problemas de los alimentos funcionales

Médicos: no los consideran una medicina y normalmente prescriben un fármaco en lugar de recomendar su ingesta

Consumidores: necesitan más información

- ¿Qué son exactamente?

- ¿Son adecuados para todo el mundo?

- ¿Son verdaderamente efectivos?

- ¿Pueden utilizarse como un tratamiento médico?

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Suplementación, añadiendo alguna sustancia que el propio alimento ya contiene hasta niveles adecuados que tengan efecto beneficioso como alimento funcional

Clasificación de alimentos funcionales

Enriquecimiento, mediante introducción de un ingrediente funcional normalmente no presente en el alimento

Substitución de alguna sustancia por otra similar, pero más saludable.

Eliminación, mediante la separación de algún componente no saludable de un alimento

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Ingredientes funcionales y aplicaciones (1/4)

Ingredientes funcionales

Flavonoides:anthocianidinas, catequinas, flavononas, flavonas

Pre/Probióticos: fructo-oligosaáridos (FOS), lactobacilus

Proteínas de soja (fitoestrógenos): isoflavonas

Aplicaciones

Bebidas, zumos, suplementos alimenticios, cosméticos,

Yoghurt, golosinas, mantequilla

Confitería, bebidas, suplemento dietético, leche, salsas

Beneficio potencial

- Neutraliza radicales libres

- Reduce riesgo de cáncer y enfermedades y cardiovasculares

- Mejora de la calidad de la microflora intestinal

- Mejora los síntomas de la menopausia - Descenso en el riesgo de osteoporosis

Esteroles vegetales: estanol ester

- Menos colesterol en sangre

Confitería, margarina, chocolate, leche

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Ingredientes funcionales

Carotenoides: alfa-caroteno, beta-caroteno, luteina, licopeno

Fibra dietética: fibra insoluble, beta-glucano, fibra soluble

Ácidos grasos: omega-3 -DHA/EPA, ácido linoleico conjugado (CLA)

Aplicaciones

Cosméticos, industrias alimentarias, aceite vegetal (expuesto a luz)

Zumo, bebidas, cereales de desayuno, confitería

Beneficio potencial

- Neutraliza radicales libres - Reduce riesgo de cáncer de próstata

- Menor riesgo de cáncer de colon - Reduce el riesgo de enfermedad cardiovascular

-Descenso en los niveles de triglicéridos y colesterol en sangre

- Mejora de las funciones visual y mental - Descenso en el riesgo de algunos cánceres

huevos, pastas, dulces, pasteles, panadería, bollería, leche infantil

Zumos, bebidas

Ingredientes funcionales y aplicaciones (2/4)

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Minerales: calcio, hierro y zinc

Vitaminas liposoluble: vitamina A, D, E and K

-Mejora de la función visual

-Mejora de la absorción del calcio

-Neutralización de radicales libres, actividad antioxidante necesarias para la coagulación normal de la sangre

Leche, zumo, galletas, mantequilla, dulces, biscuits, aceite vegetal (A,E)

Vitaminas hidrosoluble : vitamina C, complejo B

-Protección del sistema vascular

-Mejora de las funciones nerviosas

zumos, bebidas, biscuits

Leche, yogur, comidas preparadas, dulces, galletas, biscuits

- Descenso en el riesgo de osteoporosis - Tratamiento de anemia, - Mejora del sistema inmunológico, digestión

Ingredientes funcionales AplicacionesBeneficio potencial

Ingredientes funcionales y aplicaciones (3/4)

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Taninos: proantocianidinasPan, confitería, chocolate, vino

- Mejora en el tracto urinario - Reducción del riesgo de enfermedades cardiovasculares

Proteínas y aminoácidos:triptófano, glutamina, arginina, cisteína,...

- Mejora del sistema nervioso - Mejora del sistema inmunológico

Cosméticos, leche infantil, complementos dietéticos, alimentos para deportistas

Alcoholes azucarados (polioles): sorbitol, manitol, xilitol, lactitol, maltitol

-Utilizados en dietas bajas en carbohidratos para diabéticos

- No favorece la caída de dientes

Cosméticos, complementos dietéticos

Excitantes y tranquilizantes: - cafeína, ginseng,…- valeriana, melisa,...

- Estimulación del sistema nervioso y mejora de las funciones psicológicas - Favorece la relajación del sistema nervioso e inducción al sueño

Bebidas energéticas, suplementos herbales

Ingredientes funcionales AplicacionesBeneficio potencial

Ingredientes funcionales y aplicaciones (4/4)

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Desarrollo de nuevos alimentos (2007)

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Ventas de alimentos funcionales

Europa17%

Estados Unidos42%

Japón40%

Australia1%

Facturación Total Mercado de alimentos funcionales: 33.000 mlls US$

AÑO 2000. FUENTE: Leatherhead Food R.A.

Mercado Japonés

Probióticos82,1%

Anticaries 0,2%Anticolesterol 0,2%

Antidiabéticos 0,2%Minerales 2,0%

Grasas saludables 3,1%

Fibras 5,1%

Antihipertensión 3,2%

Oligosacáridos 4,0%

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Desarrollo de alimentos funcionales mediante empleo de microorganismos probióticos

¿Qué es un probiótico?

• “Un suplemento dietético a base de microbios vivos que afecta beneficiosamente al animal huésped mejorando su equilibrio intestinal” (Fuller 1989)

• “Un monocultivo o cultivo mixto viable de bacterias que cuando se aplican a animales o seres humanos afecta beneficiosamente al huésped mejorando las propiedades de la flora autóctona” (Havenaar y Huis in’t Veld 1992)

• Microorganismos vivos que, cuando se consumen en cantidades apropiadas, confieren al huésped efectos saludables” (Guarner y Schaafsma, 1998)

18

Desarrollo de alimentos funcionales mediante empleo de microorganismos probióticos

Qué es un probiótico

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Características de los probióticos

• Se trata siempre de microorganismos vivos que deben ser capaces de sobrevivir el paso por el aparato digestivo y proliferar en el intestino.

Muestran resistencia a jugos gástricos y crecer en presencia de bilis

Disponen de un “vehículo” que les protege durante el paso por el estomago y de la bilis

• Deben encontrarse en una dosis adecuada para obtener los efectos deseados.

• Generalmente (aunque no exclusivamente) son bacterias Gram + que pertenecen a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium. Los fermentos lácteos habitualmente empleados (L. delbrueckii ssp. bulgaricus y S. thermophilus) pueden tener efectos similares pero no suelen proliferar en el intestino.

• Su mecanismo de acción puede ser mediante:

Producción sustancias antimicrobianas

Exclusión de la fijación de patógenos

Competencia por nutrientes

Modulación del sistema inmunitario

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Efectos beneficiosos

Trastornos aparato digestivo

• Prevención de diarreas causadas por bacterias patógenas y/o virus

• Infección por Helicobacter pylori

• Enfermedades inflamatorias.

• Cáncer

• Estreñimiento.

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Efectos beneficiosos

Inmunidad mucosa

Alergias

Enfermedades cardiovasculares

Otros (no alimentarios) como trastornos del aparato urogenital (vaginosis, vaginitis o infecciones)

22

Desarrollo de alimentos funcionales mediante empleo de microorganismos probióticos

Guias para su evaluación

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Evaluación de probióticos de uso alimentario

•Identificación de la cepa por métodos fenotípicos y genotípicosGénero, especie, cepa

Depósito en una Colección de Cultivos (CECT)

•Caracterización funcionalEstudios “in vitro”

Estudios en animales

•Evaluación de la inocuidadEstudios “in vitro”

FASE 1-Estudio en humanos

•Ensayos clínicos con placeboFASE 2- Estudio en humanos

Tamaño de muestra y resultado primario

Segundo estudio independiente para confirmar resultados

•FASE 3-Estudio en humanosComparar probióticos con tratamiento

estándar para una condición específica

•MICROORGANISMO PROBIÓTICODenominación (género, especie, cepa)

Nº bacterias viables durante su vida útilCondiciones de almacenamiento

Aptitud tecnológica

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Caracterización funcional de un microorganismo

Ensayos “in vitro” para caracterizar propiedades funcionales

• Resistencia a la acidez gástrica

• Resistencia a ácidos biliares

• Adherencia a mucosas y/o células hepiteliales humanas y líneas celulares

• Capacidad de reducir adhesión de agentes patógenos

• Actividad hidrolasa de sales biliares

• Capacidad antimicrobiana frente a patógenos

25

Caracterización funcional de un microorganismo

Ensayos “in vitro” para caracterizar su inocuidad

• Perfiles de resistencia antimicrobiana

• Inocuidad en seres humanos

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Desarrollo de alimentos funcionales. Aspectos tecnológicos

Concepto de alimento funcional e identificación nutracéutico (p.ej. producto cárnico bajo en grasa)

Desarrollo de nuevas formulaciones (p.ej. prototipos con diferentes sustitutos de grasa) evaluando los siguientes aspectos tecnológicos:

de formulación: presentación y dosis del nutracéutico, forma de incorporación, homogeneidad en el producto, reformulación otros ingredientes,…

de procesado: forma de incorporación, solubilidad, influencia sobre parámetros termodinámicos (transferencia de calor), tasa de degradación del nutracéutico, variables del proceso (temperatura vs tiempo), …

organolépticos: el sabor, la sensación en boca, la palatabilidad, la textura, …

Estudio de la función fisiológica (p.ej. grasa: aporte calórico, ácidos grasos esenciales, vit. liposolubles A, D, E y K, sensación de saciedad y atributos sensoriales…)

Evaluación ventajas salud (p.ej. relación consumo grasas con patologías: obesidad, hipercolesterolemia, ECV, cáncer, …)

Estrategias tecnológicas a implementar (p.ej. sustitución grasas)

reducción del nivel de grasa de materias primas

adición de sustitutos o imitadores de la materia grasa (glucídica, proteica o lipídica)

adecuación de las tecnologías de elaboración y/o preparación del producto

Estudio de vida útil (microbiológica y organoléptica) y estudio de aceptación consumidores

27

EVALUACIÓN DE LA

ACEPTACIÓN SENSORIAL

DESARROLLO DE PROTOTIPOS

Selección de la matrizIdentificación de

ingredientes funcionales

Caracterizaciónquímica

Caracterización tecnológica

ESTUDIOS PRELIMINARES: IDENTIFICACIÓN DE LAS CARATERISTICAS BENEFICIOSAS

Estudio cualitativo

Recomendaciones nutricionales

Caracterización sensorial

SELECCIÓN DEL PROTOTIPO

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Los métodos in vitro presentan inconvenientes que se pretenden solucionar

mediante el desarrollo de reactores o digestores in vitro

No existen técnicas o modelos perfectos para estudiar el grado de

biodisponibilidad de los nutrientes en el hombre, y es necesario

la acción conjunta de diversos sistemas in vitro e in vivo

para obtener una información completa de

la biodisponiblidad de

nutrientes

Evaluación de la biodisponibilidad de compuestos bioactivos cardiosaludables

Ventajas del Digestor Dinámico in vitro:

- son métodos más rápidos, de menor coste y de fácil manipulación- con posibilidad de toma de muestra en cualquier parte del tracto gastrointestinal

- con mejor reproducibilidad que los estudios in vivo- no supone limitaciones éticas

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El digestor dinámico in vitro diseñado y desarrollado por ainia reproduce las condiciones naturales del tracto gastrointestinal humano (estómago e intestino delgado) y sus características principales

- El digestor reproduce el proceso de digestión gastrointestinal.

- En el estómago se lleva a cabo la digestión gástrica de los alimentos, consistente en la transformación del bolo alimenticio en una masa fluida llamada quimo (digerido gástrico).

- Posteriormente continúa la digestión intestinal, donde se siguen descomponiendo los nutrientes y/o compuestos bioactivos, dando lugar al quilo (digerido intestinal).

- Tras alcanzar un adecuado tamaño, dichos compuestos se absorben a través del equipo de diálisis

Evaluación de la biodisponibilidad de compuestos bioactivos cardiosaludables

30

Todos los estudios aportan información sobre el producto, pero:

Para poder afirmar o declarar un posible efecto del producto sobre el organismo humano relacionado con la salud

Estudios clínicos en humanos

La eficacia o efectividad de un alimento/ingrediente cardiosaludable se puede determinar:

- Experimentos in vitro con cultivos celulares

- Estudios con animales de experimentación

- Estudios clínicos con personas

Evaluación de la funcionalidad de compuestos bioactivos cardiosaludables

Evaluación de la funcionalidad

Exigencias de la EFSA

•Caracterización funcional

•Mecanismo de acción

•Establecer el efecto dosis-respuesta

31

-Se basan en el uso de modelos experimentales que reproducen a escala de laboratorio la funcionalidad objeto de estudio. El efecto biológico se determina analizando los biomarcadores adecuados.

-Se utilizan como

•Sistema de diagnóstico para identificar y seleccionar nuevos compuestos bioactivos (“high-throughput screening”).

•Sistema de diagnóstico para evaluar y/o validar la funcionalidad.

•Sistema para determinar el mecanismo de acción.

-Se dispone de modelos basados en microorganimos y basados en cultivos celulares.

Estudios “in vitro” del efecto biológicoEstudios “in vitro” del efecto biológico

32

MODULACIÓN DEL SISTEMA INMUNITARIO (Líneas celulares sanguíneas: monocitos humanos THP1, células T de ratón CTLL2 y D10.G4.1, macrófagos de ratón Raw 264.7).

REGULACIÓN DE LA OBESIDAD (Línea celular de ratón 3T3-L1).

NEUROPROTECCIÓN (Línea celular humana de neuroblastoma SH-SY5Y).

MODULACION DEL METABOLISMO DEL COLESTEROL (Línea celular humana de hepatomaHepG2, microorganismos probióticos).

BIOACCESIBILIDAD (Línea celular humana Caco-2, digestor in vitro).

REDUCCIÓN RIESGOS MICROBIOLÓGICOS (actividad antimicrobiana frente Listeria, Salmonella, E.coli OH157…).

BIOENSAYOS CELULARES

EVALUACION DE BIOMARCADORES

BIOMARCADORES de: estrés/inflamación (p.e: el metabolito de NFkb), muerte celular (relación de los genes BAX, BCL2), regulación tejido adiposo (gen de la Leptina, formación de cuerpos grasos), proliferación celular, absorción de colesterol (diferencia colesterol presencial y absorbido)….

TÉCNICAS: moleculares: (expresión génica, PCR a tiempo real) espectrofluorimetria, citometría de flujo, microbiología clásica

33

Sistema integrado Digestor Dinámico in vitro/cultivos celulares

Digestor Dinámico in vitro

Monocapa celular Caco-2

Estudio absorción/transporte intestinal

Estudio funcionalidad órgano diana

Bioensayo celular en cultivos celulares

Determinación en la monocapa celular y en la parte basal de compuestos bioactivos biodisponibles

Determinación la capacidad cardiosaludablemediante análisis de biomarcadores específicos

Evaluación de la funcionalidad de compuestos bioactivos cardiosaludables

34

Patrón habitual para demostrar una relación causa-efecto relevante para el ser humano:

Ensayos de intervención nutricional randomizados y controlados

Se tendrán en cuenta las características que debe reunir un ensayo clínico “idóneo”:

- Randomizado: consiste en asignar de manera aleatoria a los pacientes a cada grupo de tratamiento, para que los diferentes grupos sean comparables u homogéneos

- Controlado con placebo: consiste en administrar placebo en lugar de tratamiento

- Doble ciego: ni el individuo participante ni el técnico responsable del ensayo clínico conocen en qué grupo está el participante

Evaluación de la funcionalidad de compuestos bioactivos cardiosaludables

Estudios de intervención nutricional

35

•Existen datos científicos suficientes que indican que el consumo de alimentos funcionales(probíóticos) pueden derivar en beneficios para la salud, tanto para personas inmunodeprimidas como para personas sanas.

•Es necesario considerar los alimentos funcionales como un complemento a una dieta equilibrada y a un estilo de vida saludable.

•La biotecnología moderna permite el desarrollo de alimentos funcionales mediante el uso de microorganismos beneficiosos, así como aporta las bases de los métodos moleculares y celulares que permiten una adecuada evaluación de los mismos.

•Es necesario aplicar Buenas Prácticas de Fabricación (BPF) en el desarrollo y producción de alimentos funcionales.

•Deben desarrollarse y normalizarse nuevos métodos (in vitro e in vivo) para evaluar la funcionalidad e inocuidad de los alimentos funcionales, así como un marco reglamentarioque regule el uso de los mismos.

Conclusiones

36

EVALUACIÓN DE COMPUESTOS BIOACTIVOS

373/X

Las propiedades bioactivas de interés se analizan

mediante la realización de ensayos específicos en

función del efecto biológico de interés

Niveles de experimentación

• in vitro

• in vivo

• Ensayos clínicos

EVALUACION DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS

MODULO TEÓRICO. Introducción

38

EVALUACION DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS

La evaluación in vitro e in vivo de compuestos bioactivos se basan

en modelos experimentales

Un modelo experimental debe cumplir al menos tres requisitos

esenciales:

deber reproducir el proceso biológico de interés

el sistema debe ser sensible a factores externos

las fluctuaciones del sistema deben ser medibles

MODULO TEÓRICO. Introducción

393/X

EVALUACION DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS

Un herramienta esencial para el diagnóstico de

bioactividad es la selección del biomarcador adecuado

Un biomarcador es un indicador del estado el modelo

experimental utilizado, es un parámetro medible y que

responde a los cambios producidos en el sistema.

Los biomarcadores pueden ser:

-proteínas

-metabolitos

-genes

-estado fisiológico

MODULO TEÓRICO. Introducción

40

EVALUACION DE LOS COMPUESTOS BIOACTIVOS

Según la naturaleza del biomarcador se utilizan distintas tecnologías:

TRANSCRIPTOMICA

METABOLOMICAPROTEOMICAGENÓMICA

ADN

ARN

Expresión génica

PROTEÍNAS METABOLITOS

WESTERN-BLOT CROMATOGRAFIA

-Técnicas inmunológicas: técnicas Elisa-Métodos enzimáticos (método indirecto)-Técnicas Fluoro-colorimétricas

MODULO TEÓRICO. Introducción

qPCR

-Técnicas de imagen-citometría de flujo

RMN

41

INTRODUCCIÓN A LA TÉCNICA DE CULTVO CELULAR

42

MODULO TEÓRICO. El cultivo celular como alternativa a la experimentación con animales

3/12

Origen del cultivo celular

¿Qué es el cultivo celular?

• Un cultivo celular es la propagación de células fuera del organismo de origen en condiciones controladas, por ello se denomina cultivo in vitro.

•También se entiende como cultivo celular “al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento de las células in vitro, manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y genéticas”.

9

43

MODULO TEÓRICO. El cultivo celular como alternativa a la experimentación con animales

•El origen del cultivo celular

•Animal: de distintos tejidos de vertebrados o invertebrados

•vegetal

Aspectos generales de los cultivos celulares

in vivo in vitro

órgano

Cultivo celular

hepatocitos

animales Planta del tabaco

Células planta tabaco

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MODULO TEÓRICO. El cultivo celular como alternativa a la experimentación con animales

Ventajas

Colecciones internacionales destacadas

Sigla Nombre u organismo Ciudad, país Nº de cultivos

ATCC American Type Culture Collectionhttp://www.lgcstandards-atcc.org/

Human and Animal Cell Cultureshttp://www.dsmz.de/

European Collection of CellCultureshttp://www.hpacultures.org.uk/collections/ecacc.jsp

Istituto Giannina Gaslinihttp://dppm.gaslini.org/biobank/

Minassas, USA

DSMZ Braunschweig, Alemania

≈500

ECACC Salisbury, Wiltshire, UK

≈1000

GEIMM

≈800

Genova, Italia ≈2300

Fuente: www.biotech.ist.unige.it/cldb/indexes.html

•Establecimiento de líneas internacionales de fácil acceso

45

MODULO TEÓRICO. El cultivo celular como alternativa a la experimentación con animales

A pesar de las ventajas se ha de considerar que ….

•Validez del modelo “in vitro”, no son animales enteros

Las conclusiones de los ensayos deben ser debidamente acotadas. Cada vez se están realizando más estudios de validación de modelos “in vitro” como por ejemplo: ECVAM (European Center ofValidation of Alternative Methods), INVITOX (colección de protocolos “in vitro”)http://ecvam.jrc.ec.europa.eu/

Skin irritation (March 2010)

In vitro test methods based on Reconstructed Human Epidermis (theEpiSkinTM, the modified EpiDermTM and the SkinEthic TM RhE) included in the new OECD Test Guidelines (No. to be defined and published) were pre-validated and validated by ECVAM and endorsed by its Scientific AdvisoryCommittee (ESAC).

46

MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares

1. 3 Aplicaciones

Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran número de disciplinas:

•Investigación del cáncer

•Inmunología: producción de anticuerpos monoclonales

•Ingeniería de proteínas: producción de proteínas en

líneas celulares como por ejemplo, insulina, hormona de

crecimiento,…

•Estudios de interacción y señalización celular, en la

diferenciación y en el desarrollo. Estudio de los

receptores y de las vías de traslocación de la señal.

47

MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares

1. 3 Aplicaciones

•Aplicaciones médicas: mantenimiento y producción de

tejidos para el trasplante

•Aplicaciones industriales y agronómicas: producción por

reproducción in vitro de clones de plantas de interés

comercial.

•Virología: producción de vacunas, establecimiento de

condiciones de cultivo animales

•Aplicaciones diagnósticas: por ejemplo en medicina y

farmacología destacan el análisis cromosómico de células

crecidas a partir de muestras de amniocentesis, detección

de infecciones virales, ….

48

CONTENIDOS DE UN BIOENSAYO: CASOS PRÁCTICOS

49

CASO PRACTICO:

EVALUACIÓN DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD ANTI-INFLAMATORIA

Respuesta del sistema inmunitario

InflamaciónInfección

Daño celular

•La inflamación es una respuesta inespecífica frente a agresiones del

medio

•Muchas enfermedades llevan asociado un proceso inflamatorio: artitis,

enfermedad de Crohn…

•En un proceso complejo que desencadena cambios a nivel celular y

molecular

MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares

50

Modelo experimental in vitro basado en líneas celulares

Sistema celular: células de macrófago de ratón

Evaluación de la capacidad anti-inflamatoria mediante

biomarcadores génicos Estimuloinflamatorio

transducción de la señal

Activación genesPro-inflamatoriosNFkB, iNOS, TNFa, COX2,

CASO PRACTICO :

EVALUACIÓN DE COMPUESTOS CON ACTIVIDAD ANTI-INFLAMATORIA

MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares

51

> Evaluación de la capacidad de modular el sistema inmunitario

Bioensayo celular (líneas celulares Raw 264.7, D.10G4, CTLL2) analizandobiomarcadores génicos específicos, proliferación celular..

Bioensayo celular de cribado analizando un biomarcador general mediante un sistema de alto rendimiento

1385,4 404,1 117,9 34,4 10,0 2,9

C

010000200003000040000500006000070000

PROLIFERACION CTLL2

Sistema inmune : células sanguíneas

52

Aplicaciones del cultivo celular: Determinación de la capacidad antiinflamatoria

Línea celular Raw 264.7 macrófago de ratón

FASE 1. Preparación de las células

•Descongelación de las células

•reactivación , producción de cantidad

•Preparación de medio de cultivo y reactivos

MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares

53

Línea celular Raw 264.7 macrófago de ratón

FASE 2.Ensayo de bioactividad

•Inducir inflamación mediante el tratamiento con LPS

•Tratar las células con los extactos objeto de estudio:

cultivos microbianos y/o extractos de macroorganismos

Importante controles: blanco, negativo y/o positivo

•Fin del bioensayo: toma de muestra a analizaR

•recoger medio de cultivo celular

•Recoger células

Adicionar compuestos Incubación 37ºC, 5% CO2

MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares

Aplicaciones del cultivo celular: Determinación de la capacidad antiinflamatoria

54

Aplicaciones del cultivo celular: Determinación de la actividad antiinflamatoria

FASE 3 . Resultados: Análisis de biomarcadores

• Medida de metabolitos en el medio de cultivo:

•producción de óxido nitrico (Greiss)

•A partir de las células recogidas: análisis de la expresión génica

•Extracción de ARN

•Transcripción reversa a ADN

•PCR in real time (primers del gen diana, controles internos)

82

MODULO TEÓRICO. Aplicaciones de los cultivos celulares

55

FUNDAMENTO DE UN SISTEMA DE CRIBADOFUNDAMENTO DE UN SISTEMA DE CRIBADO

MODULO I. TECNICAS DE CULTIVO CELULAR COMO SISTEMA DE ANALISIS MASIVO

Generalmente los sistema de cribado al actuar como primer filtro en la búsqueda de compuesto hacen uso de biomarcadores generales asociados al proceso biológico (Moléculas clave).

Posteriormente, en la validación y caracterización del efecto biológico se hace uso de biomarcadores específicos.

7

56

Sistema de Cribado de

compuestos con potencial efecto neuroprotector

EVALUACION EFECTO NEUROPROTECTOR

Neuroglia alterada

Neuroglia Estado normal

Mediadores InflamatoriosNeurotóxicosLisis celularExceso de especies reactivasDaño celularApoptosis…

NeurodegeneraciNeurodegeneracióónnParkinsonAlzheimer…

Estrés oxidativoplaca b-amiloide….

8

57

cribado basado en la actividad anti-inflamatoria

EVALUACION EFECTO NEUROPROTECTOR

Biomarcador molécula central en el proceso inflamatorio NF-kb

Sistema artificial: Línea celular modificada, THP1-XBlue-CD14

(NF-kb -SEAP)

Sistema de Cribado de

compuestos con potencial efecto neuroprotector

Efecto extrapolable

Lectura del biomarcador: reacción colorimétrica

Rápido

Manipulación sencilla

Alto procesado de muestra

9

58

Sistema de Cribado de

compuestos con potencial efecto neuroprotector

EVALUACION EFECTO NEUROPROTECTOR

Biomarcador molécula central en la inflamación NFkb

Neuroglia Activa

NFkb activo

Estímulo inflamatorio NeurodegeneraciNeurodegeneracióónn

Compuestos

NeuroprotecciNeuroproteccióónn

NFkb inactivoInhibe

mediadores inflamatorios

NFkb activo

10

59

> Evaluación de la capacidad neuroprotectora

2. Bioensayo celular de validación con neuronas (línea celular SH-SY5Y) biomarcadores génicos específicos mediante técnicas moleculares (RT-PCR a tiempo real) o analizando la muerte celular mediante citometría de flujo.

1.Bioensayo de cribado analizando la actividad antiinflamatoria

Cultivo de neurona SH-SY5Y0

200

400

600800

1000

1 2 3 4 5 6

Tipo de muestra

Cantidad normalizada expresada del gen iNOS/Β -actina respecto a las células sin tratar

60

Metabolismo del tejido adiposo

-órgano en el que se almacena las grasas

-órgano endocrino: metabólicamente activo

Sistema de cribado para compuestos

que regulen el metabolismo del tejido adiposo

EVALUACION EFECTO REGULACION TEJIDO ADIPOSO

Type 2 Diabetes and obesity: A review 11

61

cribado basado en la capacidad inhibir la acumulacion de

lípidos durante la adipogénesis

12

EVALUACION EFECTO SOBRE TEJIDO ADIPOSO

Biomarcador: formación de cuerpos grasos

Sistema no artificial: Línea celular 3T3-L1 fibroblastos de ratón

Capacidad de diferenciarse a adipocito

Sistema de cribado para compuestos

que regulen el metabolismo del tejido adiposo

Efecto extrapolable

Lectura del biomarcador: reacción colorimétrica

Alto procesado de muestra

62

Sistema de cribado para compuestos

que regulen el metabolismo del tejido adiposo

13

Biomarcador molécula central en la inflamación NFkb

Maduración del adipocitoCon los compuestos

No Efecto moduladorNo Efecto modulador

Efecto moduladorEfecto modulador

Adipocito maduroCúmulos de grasa

Adipocitoinhibición de

los cuerpos grasos

EVALUACION EFECTO SOBRE TEJIDO ADIPOSO

Pre-adipocito

63

> Evaluación del efecto anti-obesidad

Bioensayos celulares con la línea celular de tejido adiposo 3T3-L1

Cribado evaluando la capacidad de inhibir cúmulos grasa

Preadipocito Adipocito maduro

64

> Evaluación del efecto anti-obesidad

Bioensayos celulares con la línea celular de tejido adiposo 3T3-L1

Bioensayo de validación de analizando biomarcadores génicos

Adipocito maduro línea 3T3-L1

65

UN MECANISMO DE ACCION BACTERIANO PARA REDUCIR EL COLESTEROL:

DESCONJUGACION DE LAS SALES BILIARES

> Reducción del colesterol mediante microorganismos

“SCREENING” DE BACTERIAS

L. acidophilusMRS

L. acidophilusMRS+ TDCA+ CaCl2

L. acidophilusMRS+ GDCA

A B C

EVALUACION DE LA CAPACIDAD ASIMILADORA DE COLESTEROL

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Estudios “in vitro”.

Estudios “in vivo”.

Ensayo clínicos.

> Estudio de las funcionalidades

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Casos prácticos

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Estrategia Innovadora

FUNCIONALIDAD

EFECTO SOBRE LA SALUD

-Bioaccesibilidad.

-Diana funcional de interés.

-Estudio mecanismo de acción (EFSA).

TECNOLÓGICA

-Reducción de riesgos microbiológicos.

-Optimizar formato aplicación.

-Identificación de cultivos iniciadores.

-Mejorar de las propiedades sensoriales.

Identificar

Evaluar

Demostrar

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> Evaluación y caracterización de funcionalidades

DIANA FUNCIONAL

METABOLISMO DEL COLESTEROL

OBESIDAD

SISTEMA INMUNITARIO

NEUROPROTECCIÓN

BIOACCESIBILIDAD

RIESGO MICROBIOLÓGICO

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desarrollo de alimentos funcionales para la prevención del síndrome metabólico

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FLASH TECNOLOGICO: NUTRIGENOMICA ainia

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NutriciónAvances tecnológicos

en Biología Molecular

+

GENOMICA NUTRICIONAL

NUTRIGENOMICA NUTRIGENETICA

Gen

Nutriente

Nutriente

Gen

PROYECTO GENOMA HUMANO

CONCEPTOInnova_t-NUTRIGENOMICA

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73

Nutrición personalizada para prevenir o tratar enfermedades

OBJETIVO GENOMICA NUTRICIONAL

Innova_t-NUTRIGENOMICA

Enfermedades de gran impacto social estudiadas con base

nutrigenómica:

• Diabetes

• Enfermedades cardiovasculares

• Obesidad

• Cáncer

• Enfermedad de Crohn

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NUTRIGENOMICA Y TECNOLOGIAS “OMICAS”

TRANSCRIPTOMICAMETABOLOMICA

PROTEOMICA

GENÓMICA

DIETA GENES ADN

ARNExpresión génica

PROTEÍNAS

METABOLITOS

Innova_t-NUTRIGENOMICA

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EJEMPLO ESTUDIO BASE NUTRIGENOMICA

Innova_t-NUTRIGENOMICA

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Consorcios País Objetivo Web

NutrigenomicsConsortium

Holanda Regulación génica de los ácidos grasos en el síndormemetabólico

http://www.nutrigenomicsconortium.nl

Network of Excellence in Nutrigenomics(NUGO)

Europa (EC) Estlecimiento de una red europea de investigación nutrigenómica (investigación, aprendizaje, estanadraización…)

www.nugo.org

NCMHD Center ofExcellence forNutritional Genomics

USA Dieta personalizadaInteracciones gen dieta

nutrigenomics.ucdavis.edu

Centre of Excellence in Nutrigenomics

Nueva Zelanda Enfermedad de CrohnNuevos compuestos bioactivos

www.nutrigenomics.org.nz

Functional Food Genomics

Japón Biomarcadores y ingredientes bioactivos

Nutrigenomics Network Alemania Enfermedades complejasInteracciones gen—dieta

www.nutrigenomik.de

REDES DE NUTRIGENÓMICA

Innova_t-NUTRIGENOMICA

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Innova_t-NUTRIGENOMICA

NUTRIGENOMICA

Identificar y valorar tendencias

tecnológicas en Nutrigenómica,

Alimentación y Salud, para conocer el

futuro y poder establecer medidas para

su óptimo progreso

Factores sociales, legales y ambientales

Estilo de vida

Tecnologías de procesado de alimentos

Ingredientes con actividad específica

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