42dansk kemi, 84, nr. 5, 2003

BIOTEKNOLOGI

Cellemetode til toksikologiskscreening af rene stoffer og støvPå indeklimaområdet mangler der gode modeller til måling af godt og dårligt indeklima. Herpræsenteres en epitelcellemodel, der har givet lovende resultater mhp. at forudsigeindeklimagener ud fra det inflammatoriske potentiale af støv

Af Leila Allermann og Otto Melchior Poulsen, Indeklimaafdelingen, Arbejdsmiljøinstituttet

berettigelse, dels ved test af store serier af prøver, dels ved testaf stoffer med ukendt, men potentiel stor skadevirkning.

Luftvejenes epitelceller og makrofager er en del af kroppensførste forsvarssystem mod fremmedstoffer og indtrængendeorganismer. Hvis f.eks. endotoxin - en komponent i cellevæg-gen af Gram-negative bakterier - indåndes vil epitelceller ogmakrofager udskille en kaskade af signalstoffer, der igangsæt-ter den inflammatoriske proces.

På Arbejdsmiljøinstituttet er der derfor udviklet en cellemo-del, hvor den humane lungeepitelcellelinje A549 kan bruges ien hurtig og billig screening af et stort antal prøver - enten renestoffer eller komplekse partikler. Modellen afspejler - megetsimplificeret - kroppens primære inflammatoriske forsvar modet indtrængende fremmedstof. Ved at stimulere A549-cellermed prøver, der ønskes undersøgt, og måle udskillelsen afsignalstoffet interleukin IL-8, kan vi opnå et mål for prøvensevne til at starte en betændelsesreaktion.

Cellemodeller

Fordele• Simple at udføre• Billig og hurtig• Biologisk variation kan negligeres

ved brug af rene cellelinier• Ingen etiske begrænsninger

Ulemper• Modellen afspejler ikke alle rele-

vante processer i kroppens immun-system. Det kan derfor være sværtat fortolke resultater

Forsøgsdyrsmodeller

Fordele• Omfatter hele kroppens

immunsystem• Biologisk variation er lille ved

brug af indavlede dyr• Relativt simpelt at fortolke

resultater

Ulemper• Teknisk vanskelige at udføre• Kostbare og langsomme• Ekstrapolation fra dyr til

mennesker kan være usikker• Etiske begrænsninger

Human eksponeringsforsøg

Fordele• Omfatter hele menneskets

immunsystem• Relativt simpelt at fortolke resultater

Ulemper• Teknisk vanskeligt at udføre• Kostbare• Stor biologisk variation kan vanske-

liggøre fortolkning af resultater• Store etiske begrænsninger

Betændelsesreaktionen, også kaldet inflammation, er et grund-læggende karaktertræk ved luftvejssygdomme som f.eks. astma[1]. Disse sygdomme er ofte knyttet til en kompleks udsættelsefor partikler, organisk støv og/eller biologisk aktive komponen-ter fra mikroorganismer [2]. Det kan derfor i praksis væresvært at udrede årsagerne til sygdommene. Også bygnings-relaterede symptomer (BRS) i indeklimaet, som f.eks.uspecifikke klager over irritation af slimhinder i øjne, næse oghals, hovedpine, svimmelhed, unormal træthed, koncentrations-besvær, hoste og tør hud, kan omfatte en underliggendebetændelsesreaktion. Bygningsrelaterede symptomer menes athave en multifaktoriel årsagssammenhæng, hvor både kemiske,biologiske, fysiske og psykosociale faktorer kan være involve-ret.

Mange forskergrupper tager i dag afsæt i inflammation somet centralt mål, når kemiske og mikrobiologiske påvirkningerskal farevurderes (tabel 1).

Tabel 1 summerer fordele og ulemper ved de tre principieltforskellige typer af modeller, der kan bruges i toksikologisketest af, om stoffer eller blandinger af stoffer kan være årsag tilinflammation:1. Cellemodeller2. Forsøgsdyrsmodeller3. Humane eksponeringsforsøg.Resultater fra forsøgsdyrsmodeller eller humane eksponerings-forsøg er ofte lettere at fortolke mht. farevurdering end resulta-ter fra cellemodeller. Imidlertid er forsøgsdyrsmodeller oghumane eksponeringsforsøg kostbare at udføre, og dissemodeller har etiske begrænsninger ift. hvilke stoffer, der kantestes, og hvordan. Cellemodellerne har derfor en særlig

Tabel 1. Cellemodeller, forsøgsdyrsmodeller og humane eksponeringsforsøg til farevurdering af rene kemiske stoffer og komplekse partikulære prøver.

A549-cellemetodenA549 er en udødelig lungeepitelcellelinje, der i 1972 blevisoleret fra en 58-årig mand med lungekræft. Cellelinjen harbevaret de fleste fundamentale karakteristika ved lungeepitel-celler, herunder evnen til at producere og udskille signal-stofferne IL-6 og IL-8, der sammen med IL-1 og TumorNecrosis Factor (TNF) fra makrofager hører til gruppen afproinflammatoriske signalstoffer (cytokiner). Det akutteinflammatoriske respons, som initieres af de pro-inflammatoriske cytokiner, efterfølges generelt af et systemiskrespons - et akut-fase-respons, som bl.a. er karakteriseret vedfeber og en hurtig ændring i niveauet af proteiner i blodetsplasma.

INDEKLIMA

43 dansk kemi, 84, nr. 5, 2003

BIOTEKNOLOGIIL-8 er et signalstof, der tiltrækker og aktiverer neutrofile

celler. Det kan sammen med IL-1, IL-6 og TNF spores, før enegentlig betændelsesreaktion kan ses.

Til analyse af teststoffernes inflammatoriske potentiale blevder med forskellige biologiske og kemiske stoffer udviklet ogkarakteriseret et bioassay på den humane lungeepitelcellelinjeA549.

Cellerne inkuberes med teststoffet (eks. endotoxin, kendteallergener, irritanter eller støv) ved 36,6°C og 5% CO2 i 24timer. Teststoffet tilsættes cellerne i fem doser. Samtidig testesen negativ og en positiv kontrol hhv. rent celledyrkningsmedieog TNF- (TNF- ). Cellernes udskillelse af IL-8 måles medELISA. Teststoffets potens (PF), altså dets evne til at fåcellerne til at udskille IL-8, udtrykkes som den initiale hæld-ning af dosis-responskurverne, dvs. det frigivne IL-8 versusden tilsatte koncentration af teststoffet (figur 1). For at reduce-re metodens dag til dag-variation korrigeres PF ift. værdien afden positive kontrol. Dosis-responskurverne har typisk etklokkeformet forløb. Det kan skyldes, at stoffernes celleska-dende effekter ved større doser får betydning for IL-8-udskil-lelsen, så den falder.

Anvendelse af cellemetodenRene kemiske stoffer:Endotoxiner (LPS, lipopolysaccharider) fra forskellige Gram-negative bakterier blev testet på cellemodellen (figur 2).

Ved beregning af PF fra de fire bakterier gav LPS fraK. pneumoniae den højeste potens af de testede LPS’er (figur3) [3]. Derefter kom LPS fra P. aeruginosa, E. coli ogS. enteritidis. Detoksificeret LPS gav ingen respons i A549-cellelinjen. Det viser, at selv små forskelle i LPS, som

Figur 1. Typisk dosis-responskurve for A549-lungeepitelceller stimuleretmed et teststof. Potensen afteststoffet udregnes hereftersom PFcorr = /(¯X/T), hvor er den initiale lineærehældning af dosis-responskur-ven, ¯X er middelværdien afden positive kontrol måltsamme dag som teststoffet, ogT er middelværdien af fleremålinger af den positive kon-trol målt på forskellige dage.

Figur 2. Dosis-responskurver fra A549 lungeepitelceller stimuleret med LPSfra fire forskellige Gram-negative bakterier og en detoksificeret LPS fra E.coli, hvor Lipid A-delen, som er ansvarlig for LPS’ toksiske egenskaber, erfjernet. Hvert punkt på grafen er middelværdien af en trippelbestemmelse vistsammen med standardafvigelsen.

INDEKLIMA

Bredt måleområde

Utallige anvendelser

Høj opløsning

Med et Avantes fiberoptisk spektrometer system kandu løse et væld af måleopgaver som rækker længereend en typisk spektrometer. Hjertet i løsningen er etmini spektrometer, der kombineret med forskelligefiberprober, prøveholder og lyskilder kan løse et utal afmåleopgaver som farvemålinger, traditionel spektrosko-pi, flowmåling, inspektion af materialer og væsker mm.

Bredt måleområde

UV-NIR, 200-1100 nm eller IR, 900-2200 nm.

Høj opløsning

Op til 1Å (0,1nm)

Utallige anvendelser

Refleksion/farvemålingAbsorption/transmission/koncentrations bestemmelseFlouracensRamanOn-line/In-line proceskontrolBillige udbygningsmuligheder

Avantes vil altid være enrentabel løsning

Rekvirer et fuldt katalog:

BBT Benny Larsen ApS · Kongevejen 67 · 2840 HolteTlf: 45412040 · Fax 45412070

Email: sales@bbt-bl.com · www.bbt-bl.com

44dansk kemi, 84, nr. 5, 2003

BIOTEKNOLOGIstammer fra forskellige bakteriestammer, kan give udslag imetoden.

Lungecellerne reagerede også på forskellige rene kemiskestoffer med allergene og irritative effekter [3]. Nikkelsulfat,methylmethacrylat og formaldehyd er alle kendte kontakt-allergener. Formaldehyd gav den højeste PF (figur 3), menogså mange døde celler ved lave koncentrationer. Nikkelsulfatgav endvidere tydelige celleforandringer (figur 4). Der blevikke fundet en klar korrelation mellem stoffernes allergiskepotentiale og det inflammatoriske potentiale.

Af irritative stoffer blev fire overfladeaktive stoffer (sæbe-stoffer) testet i modellen [3]. Den nonioniske detergent Gena-pol X-80 gav den højeste potens i modellen (figur 3) efterfulgtaf natriumdodecylsulfat (SDS), kokosolie og dodecylbenzen-sulfonsyre (SDBS). Selv meget lave koncentrationer af sæbe-stofferne havde celleskadende effekter, som gav sig udslag idøde celler.

MikroorganismerVed test af forskellige partikler og fragmenter fra forskelligesvampe afskrabet fra gulvpap gav Trichoderma den højeste PF(figur 3). Derefter kom Aspergillus versicolor og Stachybotryschartarum, mens Chaetomium gav den laveste PF. Der er altsåforskel på de forskellige svampearters potens, hvilket også ervist på makrofag cellelinjer [4]. Her har svampesporer fraStreptomyces californicus et højere inflammatorisk potentialeend sporer fra andre svampearter.

Komplekse støvprøverVed test af mere komplekse prøver som støv fra affalds-sorteringsanlæg og fra skoler blev lungecellemodellen brugt tilat differentiere mellem forskellige anlæg og mellem skoler medog uden indeklimaproblemer.

Støv opsamlet fra gulvet i 19 affaldssorteringsanlæg gav i

gennemsnit en PF=2 ng IL-8/mg støv (0,3-14). Anlæg, somhåndterede blandet affald, havde støv med signifikant højerePF-værdier end støv fra anlæg som håndterede renere affalds-typer som papir og flasker [5]. Der var ikke nogen sammen-hæng mellem PF og indholdet af endotoxin, men der blevfundet en indikation af, at bakterier og svampe spiller en rolle.

Støv fra indeklimaet blev opsamlet fra 20 skoler i Køben-havn [3]. PF af støv fra gulve var 2,8 ng IL-8/mg støv (0,1-11,8), og fra vandrette højereliggende overflader var PF=11 ngIL-8/mg støv (1,1-28,6). PF for indeklimastøv er altså på højdemed PF for støv fra affaldssorteringsanlæg, hvor man ved, atder kan være mavetarmproblemer og luftvejssymptomer, somhovedsagelig skyldes udsættelse for mikroorganismer. Iskolerne blev der fundet en positiv korrelation mellem PF afstøv fra gulve og PF af støv fra højereliggende overflader,hvilket tyder på, at prøverne afspejler hinanden (figur 5). PFfor gulvstøvprøverne fra skoler med få indeklimagener varsignifikant lavere end PF for gulvstøv fra skoler med mangeindeklimagener (Mann-Whitney-test p<0,0001).

Potensen af støvet fra skolerne korrelerede med indholdet aforganisk stof, og der fandtes en svag korrelation mellem PF ogkoncentrationen af endotoxin i støvet. Da mængden afendotoxin i støvprøverne lå under cellemetodensdetektionsgrænse, kan det betyde, at endotoxin er en markørfor andre biologiske eksponeringer. Korrelationerne af støvetsPF, indholdet af levende bakterier i gulvstøvet, PF og indholdetaf mide-, katte- og hundeallergen var generelt svage, hvilkettyder på, at ingen af de testede parametre er dominerendefaktorer i støvet. Potensen af støvet målt i celleassayet kanderfor betragtes som multifaktorielt [3].

Skolebygninger med flade tage, havde signifikant højere PFend bygninger med tage, der havde hældning. Mindre volumenpr. person gav et højere PF fra støvet. Der blev fundet positiveassociationer mellem PF for gulvstøv og symptomer somøjenkløe, stoppet næse, træthed, et indeks for mindst to tilste-deværende symptomer ud af fem fra slimhinderne og huden oget indeks for mindst et symptom fra centralnervesystemet(p<0,05). Prikkende følelse i huden og hovedpine var næstensignifikante (p<0,1) [3].

DiskussionA549-cellemodellen kan klart differentiere mellem skoler medgodt og dårligt indeklima. Endvidere kan den differentieremellem anlæg, der håndterer affald med stort indhold aforganisk materiale fra planter, dyr og mikroorganismer oganlæg, der håndterer renere materialer som flasker og papir.Bioassayet kan derfor bruges som screeningsredskab i evalu-eringen af, om faktorer i støvet kan give gener for slimhinder iøjne, næse og hals og fra luftvejene.

Modellen med A549-celler kan bruges til en toksikologiskvurdering af forskellige stoffers evne til at fremkalde et

Figur 3. Potensen af forskellige rene kemiske stoffer. LPS fra K. pneumoniae,P. aeruginosa, E. coli og S. enteritidis. Kontaktallergener som nikkelsulfat,methylmethacrylat og formaldehyd. Irritanter som sæbestofferne GenapolX-80, SDS, kokosolie og SDBS. Svampe skrabet af gulvpap.

Figur 4.A) Normale A549-lungeepitelceller forstørret 400 gange. Pilen peger på encelle, som er ved at dele sig til to.B) A549-celler efter 24 timers stimulering med 0.1% nikkelsulfat, forstørret400 gange. Pilene peger på pseudopodia som er det sidste cellen trækker tilsig, når den runder pga. toksisk effekt af stoffet.

Figur 5. Potensen af støv fra gulve og højereliggende vandrette overflader vistfor skoler med få og mange indeklimasymptomer.

INDEKLIMA

45 dansk kemi, 84, nr. 5, 2003

BIOTEKNOLOGIinflammatorisk respons via måling af signalstoffet IL-8.

Cellemodeller tager ikke i så høj grad som dyremodellerhøjde for det komplekse system af organer og væv i menneskerog dyr, men afspejler nogle af de underliggende processer ibetændelsesreaktionen. Andre forskergrupper bruger andrecelletyper og andre markører for betændelse. Nogle anvenderf.eks. makrofager, der er en meget central celletype i immun-responset [4]. Epitelcellen, der bruges i denne model, er denførste celletype, som får kontakt med de fremmedstoffer, viudsættes for i vores hverdag. Epitelcellen er derfor også med tilat stimulere f.eks. makrofagerne, hvorefter en kaskade afsignalstoffer udskilles, og betændelsesreaktionen sættes i gang.

Fugt har vist sig at være en god prædiktor for indeklima-symptomer [6]. Denne epitelcellemodel er derfor også etlovende bud på, hvordan man kan forudsige indeklimagener udfra støvs inflammatoriske potentiale.

E-mail-adresser:Leila Allermann: LAM@ami.dkOtto Melchior Poulsen: OMP@ami.dk

Referencer1. Horwitz RJ, Busse WW. 1995. Inflammation and Asthma. Clinics in

Chest Medicine,16, 583-602.2. Rylander R. 1986. Lung Diseases Caused by Organic Dusts in the Farm

Environment. Am J Ind Med, 10, 221-227.3. Allermann, L. 2001. Development of in vitro models for hazard

evaluation of dust from the indoor environment. Correlation to organicparameters and building related symptoms. 1-126. Copenhagen,National Institute of Occupational Health, Lersoe Parkalle 105, DK-2100 Copenhagen Ø. (Ph.D-afhandling).

4. Murtoniemi T, Nevalainen A, Suutari M, Toivola M, Komulainen H,Hirvonen MR. 2001. Induction of cytotoxicity and production ofinflammatory mediators in raw264.7 macrophages by spores grown onsix different plasterboards. Inhal Toxicol, 13, 233-247.

5. Allermann L, Poulsen OM. 2000. Inflammatory potential of dustsamples from waste handling facilities measured as IL-8 secretion fromlung epithelial cells in vitro. Ann Occup Hyg, 44, 259-269.

6. Bornehag, C. G. and Sundell, J. 2002. Dampness in buildings an a riskfactor for heslth effests. European multidisiplinary review of the entirelitterature (EUROEXPO). Levin, H. VI, 13-18. Santa Cruz, CA, IndoorAir 2002. 9th International Conference on indoor air quality andclimate. 30-6-0002 (Konference Proceeding).

Kvinder, kom i gang!– nye kvindelige iværksættere springer ud

Kvinder, kom i gang! har som formål at stimulereakademikerkvinder til at starte egen virksomhed. Projektetforegår i et samarbejde mellem Den Europæiske Social-fond og Competencehouse A/S.

Den 19. januar 2003 mødte 250 entreprenante kvindeligeakademikere fra Københavnsområdet op til en forrygendedag i Symbion på inspirationskonferencen om iværksætte-ri.

Ved afslutningen af projektet står mellem 28 og 77 nyevirksomheder og venter på at blive til noget - alle medkvindelige akademikere ved roret.

Et af de fem vinderprojekter er MicroKrable af PernilleIngildsen og Rikke Nikolajsen. Forretningsplanen handlerom vandrensning – om udvikling af sensorer til online-detektion af mikrobakterier i vand.

Overvågningen af drikkevandskvaliteten har i dag har tobegrænsninger:- den er baseret på stikprøver, som medfører stor tids-forsinkelse mellem udbrud af bakterier og til der er slåetalarm (nogle udbrud kan totalt overses).- nuværende analysemetoder ser på indikatororganismer istedet for de sygdomsfremkaldende bakterier.

Nye metoder under udvikling er baseret på analyse afcellers genetiske materiale, og de kan detektere de speci-fikke mikroorganismer, der er årsag til sygdomme. Det ervirksomhedens første mål ud fra en af disse teknologier atudvikle en online sensor til detektion af sygdomsfremkal-dende bakterier.

Udviklingen af MicroKrables produkter kræver, at flereteknologier kombineres. Det er filosofien at købe viden ogforskning fra specialiserede universitetsinstitutter. Selveintegrationen af denne viden til et produkt foretages afMicroKrable.

Pernille Ingildsen er miljøingeniør og har erfaring indenfor automation og Rikke Nikolajsen er kemiingeniør mederfaring inden for mikroteknik.

KORT NYT

45 dansk kemi, 84, nr. 5, 2003

Toppost til kemikerfra Københavns UniversitetProdekan ved Det Naturvidenskabelige Fakultet på Køben-havns Universitet, professor Sine Larsen, tiltræder den 1.juni stillingen som forskningsdirektør ved en af de størstefælleseuropæiske forskningsfaciliteter ESRF (EuropeanSynchrotron Radiation Facility), der ligger i Grenoble,Frankrig.

Som forskningsdirektør får Sine Larsen direkte indfly-delse på brugen og driften af Europas kraftigste røntgen-synkrotronstrålingsanlæg, der har et budget på ca. 64millioner euro. Et synkrotronstrålingsanlæg kan populærtsagt sammenlignes med et »supermikroskop«. Det kanbruges i stort set alle naturvidenskabelige grene og giverforskerne mulighed for undersøge strukturer helt ned i deenkelte atomer. Tusindvis af forskere fra de i alt 17 euro-pæiske lande, der støtter og driver anlægget, besøger hvertår ESRF.

Sine Larsen er professor i strukturkemi og er en yderstaktiv forsker. Hun har ledet Center for KrystallografiskeUndersøgelser på Københavns Universitet, siden det i 1994blev oprettet med støtte fra Danmarks GrundforskningsFond. Centeret undersøger sammenhænge mellem protei-ners struktur og funktion og opnåede på kort tid internatio-nal anerkendelse inden for strukturel biologi. Hendesgruppe er en af de få i verden med ekspertise både indenfor strukturel kemi og biologi.

Ud over sin egen forskning har Sine Larsen lagt kræfter iadskillige kollegiale hverv lokalt og internationalt. Hun harværet formand for udvalget vedrørende Bioteknologiskforskning på Københavns Universitet, General Secretaryand Treasurer i International Union of Crystallography, ogstår for den danske indsats i det fælles dansk-svenske 40millioner kroners projekt Cassiopeia ved MAX-lab i Lund.MAX-lab er den svenske synkrotronstrålingsfacilitet ogCassiopeia-projektet har indvielse den 21. maj. Siden 2002har Sine Larsen som prodekan desuden lagt kræfter iadministrationen af Det Naturvidenskabelige Fakultet.

INDEKLIMA