Biotoxinas Marinas

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Ana M Camen / Manuel Repetto, 2012 Reservados todos los derechos No est permitida la reproduccin total o parcial de esta publicacin, ni su tratamiento informtico, ni la transmisin de ninguna forma o por cualquier medio, ya sea electrnico, mecnico por fotocopia, por registro u otros mtodos, sin el permiso y por escrito de los titulares del Copyright. Ediciones Daz de Santos Albasanz, 2 28037 Madrid www.diazdesantos.com.es [email protected] ISBN 978-84-9969-178-7

Esta monografa est formada por un captulo del libro:

TOXICOLOGA ALIMENTARIA de Ana M Camen y Manuel Repetto (Directores) (Obra completa publicada por Ediciones Daz de Santos). Puede ocurrir que en el texto de esta monografa se haga referencia o citen otras pginas que correspondan a otros captulos de la obra completa, esto sera normal al haberse respetado la paginacin original. Obra completa: ISBN 978-84-9969-208-1 (Libro electrnico) Obra completa: ISBN 978-84-7978-727-1 (Libro en papel)

Introduccin. Intoxicacin paralizante (PSP). Intoxicacin diarreica (DSP).Pectenotoxinas (PTX).Yessotoxinas (YTX). Intoxicacin amnsica (ASP). Toxinasemergentes. Conclusiones. Bibliografa.

BIOTOXINAS MARINAS8

Ana Isabel Gago-Martnez, Isabel Ruppn, James Hungerford

El fitoplancton marino se ve frecuentementeafectado por la presencia de algas microscpicasque sirven de alimento a especies tales comomoluscos bivalvos (mejillones, almejas, vieiras,ostras, etc.) as como larvas de crustceos yotras especies marinas. La proliferacin masivade algas es beneficiosa para la agricultura, sinembargo, dicha proliferacin puede tener tam-bin efectos negativos, y causan importantesdaos socioeconmicos.

La primera referencia a episodios txicos deeste tipo podra encontrarse en la Biblia: (xodo7:20-21) las aguas de los ros se convirtieronen sangre, los peces murieron, los egipcios nopodan beber el agua del ro.

Uno de los primeros casos fatales de envene-namiento tras la ingestin de mariscos contami-nados con toxinas de dinoflagelados fue infor-mado en 1793 (Poison Cove, British Columbia).En aquel entonces, a las tribus locales de la India

Introduccinno se les permita consumir mariscos cuando lasaguas del mar se volvan fosforescentes debido aproliferaciones de dinoflagelados, este hechofue entonces atribuido a la presencia de ciertastoxinas alcaloides, hoy en da denominadascomo toxinas paralizantes, paralytic shellfishpoisoning (PSP). Desde entonces se ha informa-do de al menos 2.000 casos de intoxicaciones deeste tipo a lo largo de la geografa mundial. Portodo ello se plante la necesidad de controlar loscompuestos responsables para asegurar la salu-bridad de los alimentos de origen marino.

La proliferacin masiva cada vez ms fre-cuente de organismos fitoplanctnicos (dinofla-gelados y diatomeas principalmente) que da ori-gen a episodios txicos est determinada por lascondiciones ambientales del medio en el queviven y la influencia de un gran nmero de fac-tores fsicos (salinidad, temperatura, luz delmedio...) y qumicos, como es la la presencia denutrientes (nitrgeno, fsforo, cidos hmicos,etc.) debido al aumento de la contaminacin enaguas costeras y al uso de fertilizantes en agri-cultura.

Francisco. El dinoflagelado txico fue asignadoal gnero Gonyaulax y denominado G. catenella.Posteriormente se encontraron ciertos dinoflage-lados de similar morfologa como responsablesde este mismo tipo de toxicidad; estos organis-mos se han asignado normalmente al gneroGonyaulax. Recientes revisiones taxonmicashan hecho que dichos dinoflagelados sean hoyda considerados como Alexandrium (Balech,1985). Especies de Pyrodinium bahamense fue-ron encontrados tambin como responsables deun episodio txico en Papua, Nueva Guinea.Recientemente se han detectado nuevos anlogosde saxitoxina (GC1, GC2 y GC3) en muestras deGymnodinium catenatum (Negri et al., 2003).

2. Propiedades qumicasLos componentes txicos del grupo PSP consti-tuyen un grupo de compuestos solubles en aguacon elevado carcter polar. Su estructura qumicase muestra en la Figura 8.1. A pesar de que lasaxitoxina fue considerada inicialmente como elnico compuesto responsable de esta intoxi-cacin, hoy en da se conocen ms de veinte an-logos de la misma de ocurrencia natural. Lamolcula de saxitoxina es una tetrahidropurinacompuesta por dos grupos funcionales guanidinioEn el C-11 la saxitoxina posee una funcin diol.Tradicionalmente las toxinas PSP, se dividieronen tres grupos: carbamatos, sulfocarbamatos ydecarbamatos (Oshima et al., 1989). Reciente-mente se han aadido a este grupo unos cuantoscompuestos deoxicarbamatos y nuevas formas desaxitoxina denominadas GC1, GC2 y GC3, en lasque un grupo p-hidroxibenzoato est unido al car-bn 17. Las relaciones estructurales entre estoscompuestos sugieren la posibilidad de mltiplesbioconversiones entre estos componentes PSP.

3. ToxicologaLos efectos in vitro de las saxitoxinas han sidocuidadosamente estudiados (Kao et al., 1971). Lasaxitoxina da lugar a una depresin en msculocardaco, as como a un bloqueo fisiolgico de loscanales de sodio entre las membranas nerviosas.

142 Toxicologa alimentaria

Entre las contaminaciones ms importantesde alimentos de origen marino por prolifera-ciones de algas txicas, y consecuentemente dehumanos consumidores de los mismos, seencuentran las intoxicaciones PSP (paraliticshellfish poisoning o envenenamiento por toxi-nas paralizantes), DSP (diarrhetic shellfish poi-soning o envenenamiento por toxinas diarreicas)y ASP (amnesic shellfish poisoning o envenena-miento por toxinas amnsicas).

La intoxicacin paralizante (PSP) es un sndro-me neurotxico que resulta del consumo huma-no de alimentos marinos contaminados. Lastoxinas asociadas con este sndrome fuerondenominadas saxitoxinas, ya que en un princi-pio se crea que la saxitoxina era la nica respon-sable de este tipo de intoxicacin. La incidenciade estos episodios se increment considera-blemente desde 1970 y en la actualidad esta con-taminacin est apareciendo en regiones delmundo donde no haba surgido con anterioridad.

1. Organismos productoresLos organismos considerados responsables deeste tipo de intoxicacin son mayoritariamentedinoflagelados de los gneros Gonyaulax, Ale-xandrium y Pyrodinium, as como ciertas espe-cies de cianobacterias, o algas verdeazuladaspresentes en aguas dulces, tales como Aphanizo-menon flos-aquae, las cuales se ha descubiertorecientemente que contienen saxitoxina o com-puestos derivados de la misma, y son ademsresponsables de envenenamientos de animalesterrestres y marinos que haban bebido en estan-ques contaminados con este tipo de algas. Elvnculo entre toxicidad de alimentos de origenmarino, fundamentalmente mariscos y dinofla-gelados, se estableci por vez primera en 1927,despus de un episodio txico en la Baha de San

Intoxicacin paralizante(PSP)

Los principales sntomas de este tipo de into-xicacin incluyen temblores y entumecimientoen la boca y los labios en un corto periodo detiempo tras la ingestin de especies contamina-das con PSP, extendindose al resto de la cara ycuello. Tambin se observa una sensacin dehormigueo en los dedos seguida de doloresde cabeza y mareos. En algunos casos se obser-van tambin nuseas y vmitos cuando se iniciala intoxicacin. En casos de intoxicacionesmoderadas o severas pueden darse parestesiasen brazos y piernas. Posteriormente los pacien-tes pueden presentar incoherencia en el habla ysensacin de debilidad, as como dificultadesrespiratorias en pacientes con intoxicacionesseveras, producindose parlisis en los mscu-los y finalmente la muerte como consecuenciadel incremento progresivo de las dificultadesrespiratorias (Prakash et al., 1971).

La principal fuente de la intoxicacin es elconsumo de bivalvos, incluyendo mejillones,almejas, ostras, etc.; sin embargo, algunos otrosalimentos marinos, tales como cangrejos y

otros peces, pueden ser responsables tambin deeste tipo de intoxicacin.

Estas toxinas son absorbidas rpidamentepor el tracto intestinal. La eliminacin de lastoxinas PSP dura aproximadamente 90 minutosy los estudios clnicos han mostrado que lospacientes que sobreviven las primeras 24 horas,normalmente se recuperan aparentemente sinefectos posteriores (Kao, 1993). En trminos detoxicidad los compuestos sulfocarbamilados sonconsiderados como los menos txicos, sinembargo, estos compuestos pueden convertirseen carbamatos, que son los compuestos PSP mstxicos en condiciones cidas (Hall et al., 1990).Los niveles de toxinas que pueden causar into-xicaciones varan considerablemente, probable-mente debido a diferencias sensibles entre indi-viduos as como a la precisin de los mtodosutilizados para la cuantificacin. Las intoxica-ciones suaves en adultos se pueden dar a dosisde toxinas PSP entre 304-4.128 g/persona,mientras que las intoxicaciones severas estncausados por dosis entre 576 y 8.272 g (Prakash

Biotoxinas marinas 143

Carbamato N-Sulfocarbamato Decarbamato p-hidroxibenzoato

R1 R2 R3 R4= -OONH2- -OONHSO3

- -OH

H H H STX GTX5 dcSTXH H OSO3- GTX2 C1 dcGTX2 GC1H OSO3- H GTX3 C2 dcGTX3 GC2OH H H NEO GTX6 dcNEO GC3OH H OSO3- GTX1 C3 dcGTX1OH OSO3- H GTX4 C4 dcGTX4

R1

R R

OH

OH

N

N

R4

H2N

HN

NH2

H

NH

+

+

Figura 8.1. Estructura de las toxinas PSP.

et al., 1971). Otras fuentes consideran que lossntomas suaves pueden aparecer entre 144 y1.660 g STX-equivalentes/persona, y las into-xicaciones fatales entre 456 y 12.400 g STX-equivalentes (Acres et al., 1978).

No hay un antdoto especfico para las toxi-nas PSP. El tratamiento clnico de los pacientesintoxicados con estas toxinas es de soporte, si elvmito no ocurre espontneamente, se inducirmediante emticos o lavado gstrico. Las toxi-nas pueden ser efectivamente absorbidas porcarbn activo.

En casos moderadamente severos la ventila-cin es una primera preocupacin, as como elcontrolar el pH de la sangre y los gases de lamisma para asegurar una oxigenacin adecuada.En caso de que la acidosis no sea compensadapor la hiperventilacin, la terapia con fluidos esesencial para corregirla y adicionalmente sedeber facilitar la excrecin renal de las toxinas.

El lmite de tolerancia para las toxinas PSPes de 80 g STX-equivalentes/100 g de carne demejilln (equivalente a 400 unidades ratn).

En cuanto a los anlogos de saxitoxina des-cubiertos recientemente (GC1, GC2 y GC3), seha demostrado, mediante experimentos de re-ceptor binding, que son ligeramente menos txi-cos que la saxitoxina (Negri et al., 2003).

4. Mtodos de anlisisEl mtodo ms comn utilizado para el controlde toxinas PSP es el bioensayo con ratones(Official Methods of Analysis, AOAC, 1990),este mtodo es todava el oficial en la mayorade los pases y mide la toxicidad global enextractos de mariscos y puede servir para con-trolar eficazmente la salubridad de las especiesanalizadas. Este mtodo presenta algunas caren-cias con respecto a su selectividad, sensibilidad,variabilidad de los resultados, as como por elhecho de tener que disponer de un constantesuministro e instalaciones para el mantenimien-to de ratones no disponibles en todos los labora-torios analticos. El mtodo ms ampliamenteutilizado para la determinacin sensible y selec-tiva de estos compuestos es la cromatografa de

lquido de alta eficacia (HPLC) con deteccinpor fluorescencia. Para llevar a cabo esta deter-minacin es preciso llevar a cabo una reaccinde derivatizacin sobre la base de la inicialmen-te propuesta por Bates y Rapoport (Bates et al.,1975) cuando desarrollaron el primer mtodopor va qumica para la determinacin de estoscompuestos, de modo que los componentes txi-cos paralizantes se conviertan en sus correspon-dientes homlogos de carcter fluorescente uti-lizando dos alternativas importantes, una de lascuales utiliza una reaccin de derivatizacinpostcolumna y fue propuesta por Oshima(Oshima et al., 1989) mientras que la otraopcin utiliza una derivatizacin precromato-grfica y fue propuesta por Lawrence (Lawrenceet al., 1995). Las toxinas PSP sern oxidadascon perxido o peryodato, teniendo en cuentaque, a pesar de que la oxidacin con perxidopermite incrementar la sensibilidad, los com-puestos hidroxilados, tales como los derivadosN-1 hidroxi, no son suficientemente oxidados enestas condiciones. La fluorescencia producidaser utilizada para estimar la concentracin delos compuestos PSP.

Ambas alternativas difieren adems en elmodo de elucin, mientras que para la alternati-va precromatogrfica se utiliza una elucin engradiente, el mtodo postcolumna utiliza tresisocrticos distintos para cada uno de los gru-pos de toxinas. La ventaja de utilizar un mtodoqumico es la capacidad para separar los dife-rentes anlogos y poder cuantificarlos indivi-dualmente. La opcin precromatogrfica surgiespecialmente para resolver problemas de tiem-po asociados con la utilizacin de los tres iso-crticos, as como para evitar la utilizacin deequipos especiales con mdulos para la deriva-tizacin postcolumna. La electroforesis capilar(CE) es una alternativa para la separacin yanlisis de los compuestos citados (Pieiro etal., 1999). Los acoplamientos con la espectro-metra de masas tanto de HPLC como de CEhan proporcionado datos muy tiles de una granvariedad de anlogos de PSP (Gago-Martnezet al., 1996). Dichas tcnicas no son particular-mente tiles para anlisis de rutina, sin embar-


go proporcionan una informacin muy tilacerca de las toxinas presentes en muestras con-taminadas.

Se han desarrollado tambin diversas alter-nativas bioqumicas. Entre ellas los mtodosELISA son los ms interesantes. El uso de mto-dos ELISA lleva asociado una prdida de sensi-bilidad frente a muchos compuestos PSP.Tambin se ha empleado un test rpido paradeteccin cualitativa de PSP empleando el ensa-yo inmunocromatogrfico MIST AlertTM enparalelo al oficial bioensayo (Jellet et al., 2002).

ltimamente se estn desarrollando tambinotro tipo de ensayos utilizados para screeningrpido, como es el caso del ensayo de neuro-blastomas. Tambin se han propuesto el ensayoelectrofisiolgico (Velez et al., 2001), ensayo decitotoxicidad (Manger et al., 2003), ensayoscitolgicos usando marcadores fluorescentessensibles a potenciales (Louzao et al., 2001;Louzao et al., 2003). El principal obstculo parael desarrollo de mtodos analticos est asociadocon la obtencin de estndares y materiales dereferencia.

La primera evidencia de la presencia de este tipode enfermedad gastrointestinal asociada con elconsumo de mejillones contaminados tras laingestin de dinoflagelados tuvo lugar enHolanda en la dcada de 1960 (Kat, 1979). Otroincidente txico de este tipo tuvo lugar en Japnen 1976-1977, cuando un elevado nmero depersonas sufrieron sntomas gastrointestinales.Dichos sntomas se asociaron entonces con elconsumo de vieiras contaminadas con cidookadaico (OA) y compuestos relacionados(Yasumoto et al., 1978). Episodios de este tipotuvieron lugar tambin en Escandinavia durantelos aos 60, no obstante, no se confirm ningnepisodio de este tipo hasta 1980 (Kumagai et al.,1986).

Intoxicacin diarreica (DSP)

El descubrimiento de este tipo de intoxica-cin se atribuye a Yasumoto y su grupo deinvestigacin, que encontraron una correlacinentre dinoflagelados del gnero Dinophysis for-tii y este tipo de contaminacin. As, las toxinasasociadas fueron denominadas DTX y comoconsecuencia de los sntomas diarreicos, el sn-drome fue denominado como Intoxicacin dia-rreica, DSP (diarrhetic shellfish soisoning)(Yasumoto et al., 1980).

Las toxinas diarreicas solan dividirse en tresgrupos: cido okadaico (OA) y derivados, dino-physistoxinas, pectenotoxinas (PTX) y yessoto-xinas (YTX). Estos dos ltimos grupos de toxi-nas fueron incluidos inicialmente en este grupoa pesar de presentar una sintomatologa y efec-tos txicos distintos; mientras las pectenotoxi-nas son claramente hepatotxicas, las yessotoxi-nas muestran una sintomatologa tpicamentecardiotxica. Hoy da se consideran gruposaparte y sern tratados en diferentes apartados.

Existan varias razones por las que incluir losYTX y PTX en el grupo DSP, ya que coexistenen muestras de moluscos bivalvos, son coextra-dos de las glndulas digestivas de estos debidoa su naturaleza lipoflica y provocan un efectotxico tras inyeccin intraperitoneal en ratones.Por tanto, generan resultados positivos en losbioensayos, ampliamente utilizados como mto-do de screening en los programas de monito-rizacin. Adems, y al igual que el OA y susanlogos, son producidos por organismos fito-planctnicos.

Sin embargo, debido principalmente a que noprovocan toxicidad diarreica, los grupos PTX yYTX hoy da son considerados como un grupoaparte del complejo DSP. As, en la Decisin dela Comisin de las comunidades europeas publi-cada el 15 de marzo de 2002 en el OfficialJournal of the European Communities (2002/225/EC), se establecen reglas detalladas deimplementacin del Consejo Directivo 91/492/ECC en lo que se refiere a niveles mximos ymtodos de anlisis de determinadas biotoxinasmarinas en moluscos bivalvos, equinodermos,tunicados y gasterpodos marinos y establece elbioensayo con ratones como mtodo oficial para


la deteccin de biotoxinas. Este documento con-sidera los grupos por separado, y establece unmximo permitido de 1 mg de equivalente deyessotoxina por kg de peso de ratn empleadoen el bioensayo, mientras que para el complejoDSP y PTX establece un mximo de 160 g/kg.

1. Organismos productoresLos dinoflagelados del gnero Dinophysis, hanestado implicados en episodios txicos de DSP.La confirmacin de su toxicidad fue difcil debi-do a la dificultad para cultivar ese tipo de dino-flagelados. Especies de dinoflagelados Proro-centrum lima fueron tambin responsables de laproduccin de cido okadaico y derivados.

La DTX-1 se encontr como la mxima res-ponsable de episodios txicos DSP en Japn en1976 y 1977; el organismo responsable fue laespecie Dinophysis fortii. Los acilderivadosDTX-3 fueron los mximos responsables decontaminaciones de vieiras en 1982, sin embar-go los compuestos DTX-3 no fueron encontra-dos en especies de Dinophysis spp. As pues, secree que su origen pueda estar en la acilacin dela DTX-1 en los hepatopncreas de dichas viei-ras (Murata et al., 1982).

En episodios de DSP en Francia, Espaa,Portugal, Italia y Suecia, se inform de la pre-sencia de cido okadaico como componenteDSP mayoritario, siendo las especies D. acumi-nata y acuta las responsables de dichas toxinas.Episodios de DSP en Holanda fueron debidosmayormente a elevadas concentraciones deProrocentrum spp. Importantes episodios de DSPen Noruega y Suecia en 1985 y 1986 fueron atri-buidos a la presencia de D. acuta (Aune et al.,1993).

Aunque el cido okadaico ha sido considera-do el mximo responsable de la toxicidad DSPen Irlanda, tambin se detect la presencia deDTX-2. Lo mismo ocurre con la toxicidad DSPen Galicia, donde la DTX-2 ha sido tambinidentificada como la mxima responsable de latoxicidad DSP, a pesar de considerarse en unprincipio que el OA era el nico componenteDSP en esta zona (Gago-Martnez et al., 1996).

Episodios txicos de DSP en Amrica estnasociados con la presencia de OA y DTX-1,siendo los dinoflagelados pertenecientes a lasespecies Prorocentrum spp. responsables dedicho perfil txico en Canad, mientras queDinophysis spp. fueron responsables de la toxi-cidad DSP en EE UU y Chile.

2. Propiedades qumicasEn un principio, este grupo estaba compuestopor el cido okadaico (OA) y la dinophysistoxi-na-1 (DTX-1). Ms tarde, una nueva dinophy-sistoxina (DTX-2) fue aislada en Irlanda (Hu etal., 1992) y posteriormente se encontr en dino-flagelados y mejillones de las ras gallegas(Gago-Martnez et al.,. 1996). Las estructurasqumicas de estos compuestos, que se muestranen la Figura 8.2, son complejas, pesadas y solu-bles en lpidos (Wright et al., 1995).Recientemente se han encontrado ms dinophy-sistoxinas tales como DTX-3, acilderivados delas anteriores, que an no han sido detectados enfitoplancton txico pero que han sido aisladas apartir de muestras de vieiras (Yasumoto et al.,1985). Dichos compuestos tambin poseen acti-vidad txica, pero solo fueron hallados en teji-dos de mariscos, sugiriendo su probable origenmetablico. Se identificaron adems otros an-logos de este grupo (DTX-2B, DTX-2C) enmariscos (James et al., 1997; James et al., 1998;Draisci et al., 1998a). La primera evidencia de laexistencia de diol steres del OA viene del aisla-miento de una mezcla de los mismos de especiesde Prorocentrum Lima (Yasumoto et al., 1989).Otros steres del OA tales como OA-DE1 se ais-laron tambin de diversos tipos deProrocentrum sp. tales como Prorocentrum limay Prorocentrum maculosum (Hu et al., 1992).Dichos diol steres se encontraron tambin enespecies de P. lima (Norte et al., 1994).

Un nuevo componente DSP denominadoDTX-4 ha sido descubierto recientemente (Huet al., 1995). Las toxinas DSP son compuestoslipdicos de cadena larga conteniendo anillospolieter cclicos. Son solubles en acetona, cloro-formo, cloruro de metileno y dimetilsulfxido.


3. Toxicologa

Los efectos txicos del OA y sus derivados, des-critos tras el episodio de Japn en 1978, inclu-yen vmitos y diarrea. En los resultados obteni-dos con el bioensayo con ratones se encontruna correlacin entre toxicidad de esos com-puestos en humanos y efectos en ratones. Elcontenido de toxina requerido para producirenfermedades en humanos fue definido median-te unidades ratn: 1 Unidad ratn (UR) se defi-ne como la cantidad de toxina requerida paracausarle la muerte a un ratn de 20 g durante unperiodo de 48 horas.

La cantidad de toxina necesaria para causarintoxicaciones suaves a adultos es de 12 UR. Delos estudios efectuados sobre este tipo de com-puestos se concluye que las toxinas DSP pre-sentan efectos crnicos, pudiendo inducir pro-mocin de tumores (Fujiki et al., 1999).Respecto al mecanismo de accin del cido oka-daico y la DTX-1, son potentes inhibidores delas proten-fosfatasas 1 y 2A (PP1 y PP2A, res-pectivamente) afectando al funcionamiento delas clulas eucariotas. Se han realizado tambinalgunos estudios acerca de los efectos mutag-nicos y genotxicos del OA y la DTX-1. Losdaos asociados con la exposicin a toxinas delgrupo DSP estn relacionados con los efectostxicos de los compuestos individuales. Los sn-

tomas de DSP comienzan despus de la inges-tin de OA o DTX por encima de 40-50 g porpersona (adulto). Los pacientes se recuperandespus de unos cuantos das. La toxicidad cr-nica (promocin de tumores, mutagnesis) nopuede ser estimada todava.

4. Mtodos de anlisisEl mtodo utilizado como rutinario para la detec-cin de toxinas DSP es el bioensayo con ratones(Yasumoto et al., 1978; Marcaillou-Lebaut et al.,1994). Este mtodo presenta muchas desven-tajas, y una de las mayores objeciones es el usode animales con fines de investigacin; tambinse observa una prdida de selectividad ya queotras toxinas o cidos grasos pueden entrar a for-mar parte de la fraccin lipdica dando lugar ainterferencias que pueden dificultar la identifica-cin de las toxinas estudiadas o causar falsospositivos. El bioensayo con ratones no distingueentre los diferentes tipos de toxinas pero propor-ciona informacin sobre la toxicidad total de lasmuestras estudiadas.

Los ensayos de citotoxicidad fueron desarro-llados despus del descubrimiento de que lastoxinas DSP eran responsables de cambios mor-folgicos en algunas clulas (Amzil et al., 1992;Croci et al., 1997). Se consideran ensayos rpi-dos y sensibles, y ticamente ms satisfactorios


O

O

O

O O

O

OH

HO

OR3

OH

R2

R1

O

OH

R1 R2 R3CH3 H H cido okadaico (OA)CH3 CH3 H Dinophysistoxina-1 (DTX1)H CH3 H Dinophysistoxina-2 (DTX2)H/CH3 H/CH3 Acyl Dinophysistoxina-3 (DTX3)

Figura 8.2. Estructura de las toxinas DSP.

que los ensayos con animales vivos. Se desarro-llaron tambin otros ensayos basados en la inhi-bicin de las proten fosfatasas que proporcio-nan una deteccin sensible de las toxinas DSP(Vieytes et al., 1997). Sin embargo la respuestano es especfica, y al igual que el bioensayo conratones da una informacin global acerca de latoxicidad. Los inmunoensayos pueden ser utili-zados tambin para detectar OA y algunos desus anlogos (Chin et al., 1995; Morton et al.,1996). Sin embargo, esos anlisis muestran unapobre reactividad, especialmente para los com-puestos DTX-3.

Se desarrollaron tambin alternativas fsico-qumicas para una determinacin sensible delas toxinas DSP. Las tcnicas cromatogrficasmediante HPLC son las utilizadas ms habitual-mente, acopladas con diversos sistemas dedeteccin.

La deteccin por fluorescencia (FLD) pro-porciona una repuesta muy sensible y esta alter-nativa ha sido ampliamente utilizada comoherramienta de control en rutina. Se han utiliza-do diversos reactivos para la derivatizacin delas toxinas DSP, convirtindolas en los corres-pondientes derivados fluorescentes, mediante laderivatizacin del cido carboxlico correspon-diente para formar los correspondientes steresde carcter fluorescente, los cuales son poste-riormente separados por cromatografa en faseinversa. El mtodo que se ha utilizado msampliamente hasta la fecha es el desarrolladopor Lee (Lee et al., 1987). Ese mtodo utiliza9-antracildiazometano (ADAM) como reactivode derivatizacin y ha sido sometido a un grannmero de modificaciones, especialmente en laetapa de cleanup. Por otra parte, dado que elADAM es un reactivo caro y de estabilidad limi-tada, se han planteado alternativas al mismo, uti-lizando otros reactivos de derivatizacin o inclu-so sintetizando el reactivo inmediatamente antesde ser utilizado (Quilliam et al., 1998). Tambinse han desarrollado mtodos de anlisis con CE(Boland et al., 1993; Bouaicha et al., 1997). Elacoplamiento de HPLC/MS ha sido la nica tc-nica que ha proporcionado una determinacindirecta del OA y las DTX (James et al., 1997;

Draisci et al., 1998; Quilliam, 1998). Dicha tc-nica permiti adems la confirmacin de lastoxinas DSP presentes en muestras contamina-das y result ser muy til cuando no se disponade estndares.

Al igual que el grupo anterior, las pectenotoxi-nas han sido objeto de una amplia investigacin.Se descubrieron en Japn en 1984, y su denomi-nacin viene de la especie de vieira en la que sedetectaron por vez primera, Patinopecten yesso-ensis.

1. Organismos productoresLa PTX-2 es el nico anlogo de las PTXdetectada hasta la fecha en fitoplancton, demanera que las especies fitoplanctnicas que sehan identificado como responsables de la pro-duccin de estas toxinas son Dinophysis fortiiy Dinophysis acuta (Draisci et al., 1996; Jameset al., 1999a; Draisci et al., 1999a).

Se cree que el resto de componentes delgrupo PTX encontradas en mariscos pudieratener su origen en diversos tipos de biotransfor-maciones.

2. Propiedades qumicasEstructuralmente este grupo de polieter lactonases muy diferente al OA y sus anlogos, ya queen vez de la tpica estructura abierta tienenun anillo caracterstico en el carbono 33 (Figu-ra 8.3a) (Murata et al., 1986).

En un principio se aislaron los anlogosPTX-5, aunque solo se determinaron las estruc-turas de PTX-1 y PTX-2 (Figura 8.3a). Poste-riormente, se determin la estructura de PTX-3(Murata et al., 1986), PTX-4 como 7-epi-PTX-1, y PTX-7 como 7-epi-PTX-6 (Yasumoto et al.,1995). La elucidacin de los anlogos PTX-8,PTX-9 y PTX-10 tambin ha sido publicada.Otras pectenotoxinas de reciente descubrimien-

Pectenotoxinas (PTX)


to fueron aisladas y denominadas pectenoto-xinas-2-secocidos (PTX-2SA) y 7-epi-PTX-2SA. Estas toxinas poseen un cido carboxlicode cadena abierta en vez del anillo lactona de losanlogos PTX (Figura 8.3b) (Daiguji et al.,1998).

3. ToxicologaLos efectos txicos difieren mucho a los provo-cados por el grupo del cido okadaico, ya que nogeneran problemas gastrointestinales en sereshumanos. Mediante el bioensayo con ratones seha comprobado que la PTX-1 no afecta al intes-tino delgado, sino al hgado (Terao et al., 1986)y en seres humanos la PTX-2 genera efectosnegativos sobre tejidos del colon, pulmn ypecho (Jung et al., 1995).

4. Mtodos de anlisisLos mtodos que se han desarrollado para elanlisis de pectenotoxinas incluyen el bioensayocon ratones (Hamano et al., 1985), los ensayos decitotoxicidad (Aune et al., 1989) y mtodos ins-trumentales como HPLC-UV (Yasumoto et al.,1989; Sasaki et al., 1998; Suzuki et al., 1998),HPLC-FLD (Sasaki et al., 1998; James et al.,1999a) y CL-EM (James et al., 1999b; Suzukiet al., 2000; Draisci et al., 1999a; Ito et al., 2002).

A lo largo de la ltima dcada, el grupo de lasyessotoxinas ha provocado la preocupacin delas autoridades en sanidad pblica e industriaproductora de moluscos y suponen un tema con-trovertido para los cientficos a medida que lainvestigacin en ficotoxinas progresa. El grupoYTX, que en el pasado estaba restringido aambientes acuticos especficos, se ha detectadoen numerosas reas ocenicas, junto a nuevastoxinas.

1. Organismos productoresLas especies de dinoflagelados P. reticulatum,(Satake et al., 1997c; Ciminiello et al., 2003), yGonyaulax polyedra, (Tubaro et al., 1997;Draisci et al., 1999b) han sido confirmadascomo fuentes de produccin de YTX. Estoimplica un riesgo global de contaminacin en

Yessotoxinas (YTX)


Nombre R1 C 7

PTX-1 CH2OH RPTX-2 CH3 RPTX-3 CHO RPTX-4 CH2OH SPTX-5 * *PTX-6 COOH RPTX-7 COOH SPTX-8 CH2OH SPTX-9 COOH SPTX-10 CH2OH R

no publicado

7

OO

CH3

CH3OOO

R1H3C

OHOH

O

O O

OOH

H3C

O

OCH3

CH3

Figura 8.3a. Estructura general de las pectenotoxinas.

O

OCH3 CH3

CH3OO

O

CH3H3C

OHOH

O O

OOH

H3C

O

OCH3

OHHO

7

Nombre Sitio 7

PTX-2SA R7-epiPTX-2SA S

Figura 8.3b. Estructura general de las pectenotoxinas.

moluscos de consumo, ya que estas especies sonmuy comunes en comunidades fitoplanctnicasde aguas costeras, y sus quistes de resistenciason ubicuos en los sedimentos marinos, ya quese pueden adaptar a diferentes condicionesmedioambientales, como temperatura, pH, sali-nidad, regmenes de luz y niveles de nutrientes.

2. Propiedades qumicasLa estructura qumica (Figuras 8.4a, 4b, 4c) dela yessotoxina y sus anlogos (YTX) posee 11grupos ter en forma de anillos contiguos, unacadena lateral insaturada de nueve carbonos, unesqueleto con 47 tomos de carbono, dos steres

de sulfato, y adems carece de carbonos carbo-nilo.

La yessotoxina fue aislada por vez primeraen 1987, (Murata et al., 1987), y mediante tc-nicas de Resonancia Magntica Nuclear (RMN)se configur su estructura planar y se le asignla frmula molecular C55H80O21S2Na2.

Posteriormente se confirm su estructuramediante el empleo de la tcnica de bombardeode tomo rpido (FAB) en experimentosMS/MS en modo negativo, como mtodo com-plementario a la RMN (Naoki et al., 1993). Seconfirm que la yessotoxina es un compuestolipoflico, con un esqueleto ter policclico yuna cadena lateral insaturada.

3. ToxicologaExiste una serie de datos en relacin a la expo-sicin de moluscos de consumo a niveles de yes-sotoxina en el medio, se han identificado losorganismos fitoplanctnicos responsables de suproduccin y se ha estudiado la distribucin delas toxinas en unas pocas reas de produccin debivalvos. Sin embargo, es necesario un mejorconocimiento del nivel de contaminacin enotras reas y una informacin detallada sobreorganismos txicos y proliferacin espacio-temporal de estos (especialmente profundidaden la columna de agua).

Debido a la falta de datos, los niveles de tole-rancia actualmente adoptados para estas toxinasno se han deducido a partir de estudios toxicol-gicos robustos, que debera determinar la rela-cin entre la magnitud de la exposicin, el nivel


R2

n

H

CH3

H H H H H

HH

HH

H

H

OO

OO

O

O

OO O

O

O

CH3CH3

CH3

OHCH3

H3C

NaO3SO

R2O HHHHHH

H

Nombre R1 R2 n

YTX SO3Na I 11-desulfoYTX H I 145-OH-YTX SO3Na II 145,46,47-trinorYTX SO3Na III 1HomoYTX SO3Na I 245-OH-homoYTX SO3Na II 2CarboxiYTX SO3Na IV 1CarboxihomoYTX SO3Na IV 2

Figura 8.4a. Estructura general de las yessotoxinas.

OH

H

COOH

Figura 8.4b. Estructura de los grupos R2 de las yesso-toxinas.

CH3

H

OSO3NaOH

H H H H HH

HH

H

H

HHHH

H

OO O

O

O

OO O

O

O

CH3CH3

CH3

OCH3

N

NaO3SO

Figura 8.4c. Estructura de los grupos R2 de las yesso-toxinas.

de efectos adversos no observables (NOAEL) yel nivel de mnimo efecto adverso observable(LOAEL).

Las YTX presentan una estructura qumicamuy singular y parecen ser nicas en su modode accin. Por ello son consideradas comoherramientas particularmente interesantes paraprobar fenmenos biolgicos y farmacolgicos(como en el caso del OA actuando como inhibi-dor de la protena fosfatasa) (Haystead et al.,1989).

Se ha demostrado que la yessotoxina es diezveces menos txica tras administracin oral quetras inyeccin intraperitoneal, e incluso a dosisde hasta 10 mg/kg (la ms alta jams empleada)la yessotoxina no provoc la muerte de los rato-nes (Aune et al., 2002).

Recientemente se estudiaron los niveles detoxicidad aguda tanto de YTX como de sus an-logos en comparacin con la del OA, que es laprincipal toxina diarreica. Estos estudios hanmostrado valores muy variables en cuanto aletalidad tras inyeccin intraperitoneal (i.p.),mientras que no se han presentado ningn tipode efectos letales tras la administracin oral. Seha demostrado que la yessotoxina y sus deriva-dos son menos txicos que el cido okadaicotras tratamientos tanto orales como tras inyec-cin intraperitoneal a dosis que representarancien veces la posible cantidad ingerida por unser humano diariamente (Tubaro et al., 2003).As, la potencia letal observada en este estudiose encuentra entre los valores observados porTerao (Terao et al., 1990), y Ogino (Ogino et al.,1997), con valores para la LD50, de entre 89 y286 g/kg, y los obtenidos por Aune (Aune etal., 2002), con LD50 comprendidos entre los 750y los 1.000 g/kg. Estas discrepancias se debenseguramente a la variabilidad de las condicionesexperimentales entre los distintos laboratorios olos diferentes tipos, edad o sexo de los ratonesde los que se dispona. Los sntomas que presen-tan los ratones tras ser infectados con YTX sonlos tpicos de las neurotoxinas, caracterizadospor supervivencia corta adems de convulsionesy movimientos bruscos antes de la muerte. Porotro lado, se ha observado que tratamientos

orales a ratones con YTX (1 y 2 mg/kg) y susderivados (1 mg/kg) no causan ninguna muerteo signos de toxicidad, a excepcin de algunasalteraciones estructurales en los miocardiocitosadyacentes a los capilares (Tubaro et al., 2003).

Se supone que la toxicidad de la yessotoxi-na tiene relacin con la presencia de los grupossulfato presentes en el extremo de su esqueletohidrofbico, que confieren a la molcula dife-rente afinidad por las membranas lipdicas.Adems, es posible que la elevada polaridad enlas cadenas laterales de los derivados 45-OH-YTX y 45, 46, 47-trinorYTX tenga relacincon su baja toxicidad, debido a una menorafinidad por las membranas lipdicas (Satakeet al., 1996). Por la misma razn la adriatoxinaes menos txica que la yessotoxina, debido a lapresencia de tres grupos sulfato en aquella(Ciminiello et al., 1998). En la Tabla 8.1 sepresenta un esquema del tema tratado en esteapartado.

En resumen, aunque existen razones paracreer que la presencia de las YTX es muchomenos daina que la del OA y la DTX-1, debe-ran considerarse otros datos toxicolgicos,como la degradacin celular, el efecto letal enratones juveniles tras la administracin oral ylesiones cardacas severas tras inyeccin intra-peritoneal.

En cuanto a las posibles aplicaciones farma-colgicas, debido a la similitud entre las toxinasproducidas por dinoflagelados y algunos anti-biticos de Actynomyces, se comprobaron laspropiedades inhibidoras del crecimiento de hon-gos, levaduras y bacterias de YTX y dsYTX. Latoxicidad de la yessotoxina (al igual que en elcaso de otras toxinas con mltiples grupos ter)resulta ser dbil. Por el contrario, la desulfata-cin de la yessotoxina potencia su actividadantibitica frente a los hongos y reduce la mor-talidad en ratones (Nagai et al., 1990).

Posteriormente se confirm la incapacidadde la YTX y dsYTX para inhibir el crecimientobacteriano, mientras que s mostraron ciertahabilidad ante levaduras y hongos, siendo layessotoxina menos potente que la dsYTX(Ogino et al., 1997).


Todos estos hallazgos hacen creer que deter-minadas modificaciones inducidas en molcu-las como la YTX y otros compuestos, puedenresultar en aplicaciones beneficiosas al mismotiempo que su toxicidad se ve reducida. Ademsconfirman a las toxinas producidas por dinofla-gelados como una fuente prometedora de nue-vos y potentes antibiticos (Nagai et al., 1990).

4. Mtodos de anlisisActualmente, el bioensayo con ratones es laherramienta bsica para la monitorizacin deYTX y sus anlogos, a pesar de los inconvenien-tes que presenta. Existen numerosas dificultadesa la hora de desarrollar, validar y difundir meto-dologas analticas alternativas a este bioensayodebido, por ejemplo, a la escasez de buenasfuentes naturales de estndares analticos, queha impedido la produccin y comercializacinde material de referencia para muchas toxinas,incluida YTX y sus anlogos.

Otras dificultades a la hora de desarrollarmtodos alternativos es la continua identifica-cin de nuevos anlogos, los cambios en lasestructuras originales de las toxinas debido abiotransformaciones en tejido animal, la com-plejidad y variabilidad del material biolgico

marino, la disponibilidad, en muchos casos, desolo una pequea cantidad de muestras para lasdeterminaciones analticas, y la frecuente coexis-tencia de distintas toxinas en la misma muestra.

Sin embargo, se han propuesto una serie demtodos qumicos y bioqumicos empleadoscomo herramientas analticas especficas y sen-sibles para la determinacin de las YTX enmoluscos y en muestras de fitoplancton. Estasson empleadas tanto en investigacin como enprogramas de monitorizacin.

En cuanto al bioensayo con ratones, aunqueel mtodo es capaz de detectar YTX, la posiblepresencia de toxinas PSP y la elevada concen-tracin de cidos grasos (que son inofensivospara los humanos por va oral pero letales paralos ratones por va intraperitoneal), puedeninterferir dando lugar a falsos positivos(Hamano et al., 1985). Para evitar esto se hanpropuesto varias modificaciones (Marcaillou-LeBaut, 1990; Draisci et al., 1998).

Sin embargo, y como ya se ha explicado, elbioensayo es mucho menos sensible, selectivo ypreciso que los mtodos analticos instrumenta-les, y presenta una gran variabilidad de resulta-dos. Por ello hay una necesidad de sustituirlopor tcnicas analticas, tanto por razones ticascomo de precisin.


Tabla 8.1. Efecto letal en ratones y principales efectos patolgicos de YTX.

Toxina Efecto letal en ratones Efecto patolgico y(g/kg b.w. i.p.) actividad biolgica

YTX

45-OH-YTX

45, 46, 47-trinorYTX

HomoYTX

45-OH-homoYTX

dsYTX

100 [Murata et al., 1987]286 [Terao et al., 1990a]80-100 [Ogino et al., 1997]512 [Tubaro et al., 2003]

500 [Satake et al., 1996]

220 [Satake et al., 1996]

100 [Satake et al., 1997b]444 [Tubaro et al., 2003]

500 [Satake et al., 1997b]

301 [Terao et al., 1990a]

Cardiotxica [Terao et al., 1990a]Inhibicin del crecimiento en hongos y levaduras [Ogino et al., 1997]Foco hemorrgico en el miocardio (caso aislado) [Tubaro et al., 2003]

Toxicidad en hgado y pncreas [Terao et al., 1990a]Fungicida [Nagai et al., 1990]Ictiotoxicidad e inhibicin de crecimiento de hongos y levaduras[Ogino et al., 1997]

En cuanto a ensayos bioqumicos, la YTX,ha mostrado una dbil inhibicin de la PP2A(Ogino et al., 1997). De hecho, la concentracinde YTX necesaria para reducir la actividad enzi-mtica en un 50% (IC50) result ser cuatrordenes de magnitud mayor que la hallada parael OA (Tubaro et al., 1996).

La deteccin inmunolgica mediante ensa-yos ELISA (Enzyme-linked inmunosorbentassays) es capaz de detectar todos los anlogosde la YTX que la UE actualmente regula enmuestras de moluscos (45-OH-YTX, homo-YTX, 45-OH-homoYTX), y los formatos mssensibles resultan tener un lmite de cuantifica-cin de entre 20 pg/mL (Briggs et al., 2002) y 70pg/mL (Samdal et al., 2002), que est por deba-jo del nivel mximo recomendado, que es 1mg/kg.

Sin embargo, los resultados obtenidosmediante ensayos ELISA y HPLC-EMS presen-tan muchas discrepancias (Miles et al., 2002).Adems, muchos laboratorios han concluidoque el mtodo ELISA no siempre proporcionaresultados cuantitativamente fiables, ya que,debido a las reacciones cruzadas, se subestimael contenido de toxina.

En lo que se refiere a ensayos de citotoxici-dad, en un experimento realizado por Aune(Aune et al., 1991), se observaron los efectos anivel morfolgico que una serie de biotoxinasmarinas (OA, DTX-1. PTX-1 y YTX) provoca-ron sobre hepatocitos de ratas. El ensayo fuepropuesto como mtodo para diferenciar entretoxinas diarreicas y no diarreicas. Sin embargoexisten muchas desventajas a la hora de trabajarcon este mtodo, ya que es lento y proporcionaresultados confusos en el caso de muestras mix-tas, por lo que es mejor complementarlo conalgn mtodo qumico.

Por otro lado, los mtodos qumicos instru-mentales son la alternativa y/o el complementoms prometedor a los ensayos biolgicos para elcontrol y monitorizacin de todos los grupos detoxinas acuticas. Esto podr suceder si combi-nados o solos pueden detectar al menos los an-logos regulados (en el caso de las YTX: YTX,45-OH-YTX, homoYTX, 45-OH-homoYTX en

la UE), no son menos efectivos que los mtodosbiolgicos y su implementacin supone un nivelequivalente de proteccin de la salud pblica.

Las yessotoxinas carecen de un cromforofuerte, muy til en la absorcin UV sensible. Sinembargo, la presencia de yessotoxina se puedemonitorizar empleando esta tcnica, con unalongitud de onda de absorcin mxima a 230 nm(Murata et al., 1987; Satake et al., 1997c).

La yessotoxina y sus anlogos no presentanuna fluorescencia natural, por lo que han de sermodificados qumicamente para su deteccin.As, se ha propuesto un mtodo de deteccinfluorimtrica en moluscos mediante HPLC, enel que la molcula de YTX es derivatizadaempleando el reactivo 4-[2-(6, 7-dimetoxi-4-metil-3-oxo-3, 4- dihidroquinoxalinil) etil]1, 2,4-triazolina-3, 5-dieno (DMEQ-TAD) (Yasumo-to y Takizawa, 1997; Tubaro et al., 1997;Ramstad et al., 2001). Este mtodo demuestralinealidad, carencia de interferencias y el lmitede deteccin se estima en 1 ng de yessotoxinainyectada, que supone una sensibilidad 2.000veces mayor a la conseguida con el bioensayo.As, el mtodo HPLC-FlD es recomendado parala deteccin de yessotoxina ya que provee mejorinformacin sobre la toxicidad en moluscos queel bioensayo con ratones.

En cuanto a la tcnica HPLC-(ESI) MS seemple para la determinacin del peso molecu-lar de diferentes anlogos de YTX: 45-OH-YTX, 45, 46, 47-trinorYTX (Satake et al.,1996), homoYTX y 45-OH-homoYTX (Satakeet al., 1997b) aislados a partir de muestras con-taminadas de moluscos. Tambin se emple estatcnica para la confirmacin de la presencia deYTX en muestras de fitoplancton (Satake et al.,1997c).

El primer mtodo para la identificacindirecta de YTX en muestras de moluscosempleando HPLC-MS y HPLC-MS-MS conSRM (selected reaction monitoring) (Draisci etal., 1998b) hace uso de una fuente de ionizacina presin atmosfrica (API) e interfase ionspray.El lmite de deteccin resulta ser 4.000 vecesmenor que en el bioensayo, y la sensibilidad essimilar a la obtenida en el mtodo fluorimtrico


(HPLC-FlD). El mtodo es especfico, sensibley rpido para la determinacin de YTX tanto enmoluscos como en fitoplancton, y acab con laambigedad de los falsos negativos tras el bio-ensayo con ratones (Draisci et al., 1998b;Draisci et al., 1999b).

Posteriormente se desarroll un mtodo quepermita el anlisis simultneo en muestras dediez toxinas relacionadas con eventos DSP (OA,DTX1, palAO, palDTX1, PTX1, PTX2,PTX2SA, PTX6, YTX y 45-OH-YTX) dePatinopecten yessoensis mediante HPLL-MScon fuente de ionizacin a presin atmosfrica(API) e interfase ionspray (ESI) y un analizadorde masas de triple cuadrupolo. La separacincromatogrfica de todas las toxinas se consiguimediante una combinacin de distintas colum-nas y fases mviles. El lmite de deteccin estu-vo entre 40 y 80 ng/g de tejido (Goto et al.,2001; Ciminiello et al., 2002).

Recientemente se ha propuesto un nuevomtodo de anlisis de YTX y 45-OH-YTX enmoluscos empleando HPLC-MS3, haciendo usode ESI como fuente de ionizacin en modonegativo y un analizador de masas de trampa deiones (Fernndez Amandi et al., 2002). El lmi-te de deteccin fue 30 pg de YTX en columna,equivalentes a 3 ng/g en tejido de molusco. Sepuede concluir que aunque una validacin totalde los mtodos HPLC-MS est todava dificul-tada por la carencia de estndares, representanuna alternativa prometedora y efectiva al bioen-sayo para el anlisis de YTX y DSP en muestrasbiolgicas tanto en programas de monitoriza-cin como de investigacin. Esta tcnica ha sidopropuesta como idnea para desarrollar unmtodo de determinacin universal de toxinaslipoflicas (Quilliam et al., 2001).

Fue descubierta por vez primera en PrinceEdward Island (Canad) en 1987, despus de unepisodio serio de intoxicaciones por mariscos

Intoxicacin amnsica (ASP)

(Quilliam et al., 1989). El mximo responsablede la intoxicacin amnsica es el cido domoico(AD), que fue inicialmente aislado de la micro-alga Chondria armata por investigadores japo-neses estudiando propiedades insecticidas deextractos de algas (Takemoto et al., 1958).

El cido domoico fue el responsable de laintoxicacin en el episodio canadiense (Wrightet al., 1989). La toxina estaba presente a nivelestan altos como 1.000 mg/g de tejido y es el pri-mer dato que existe sobre la presencia de cidodomoico como una toxina de mariscos (Wrightet al., 1995). Los sntomas, observados en lasvctimas durante 24 horas, fueron neurotxicos(prdida de memoria, confusin, desorienta-cin) y gastrointestinales (diarrea, vmitos),pero tambin se apreci una aguda prdida dememoria. De este tipo de sntomas surgi elnombre ASP (amnesic shellfish poisoning).

1. Organismos productoresLa fuente de AD en el incidente canadiense fuela diatomea Pseudonitzschia pungens f. multise-ries (Subba Rao et al., 1988). Hasta este inci-dente se crea que las ficotoxinas solo procedande dinoflagelados y las diatomeas no se conside-raban como posibles fuentes de dichas toxinas.Otras especies pertenecientes al gnero Pseudo-nitzschia son P. pseudodelicatissima y P. austra-lis. Este ltimo fue el organismo responsable delas muertes de pelcanos y cormoranes en laBaha de Monterrey, California (Fritz et al.,1992), despus de la ingestin de anchoas quecontenan cido domoico en concentraciones tanaltas como 100 mg/g. Adems, el AD se hadetectado en muestras de moluscos procedentesde Francia (Amzil et al., 2001), Portugal (Vale etal., 2001), Japn (Kawatzu et al., 2000), Irlanda(Furey et al., 2001) y Escocia (Hess et al., 2001).

2. Propiedades qumicas El cido domoico es un compuesto de origennatural, anlogo del cido glutmico, aislado delfitoplancton marino. La estructura qumicadel cido domoico y sus ismeros se muestra en


la Figura 8.5. El cido domoico parece ser elcompuesto predominante tanto en el planctoncomo en los mariscos contaminados. Algunos desus ismeros como el cido isodomoico A, C, D,o las domoilactonas A y B parecen no haber sidoencontradas todava en extractos del plancton oen tejidos de mariscos contaminados. El cidodomoico es un compuesto cristalino soluble enagua con propiedades tpicas de aminocido y suestructura es claramente dependiente del pH,pudiendo dar lugar a cinco formas protonadas.

3. Toxicologa

Los efectos txicos del cido domoico se estable-cieron tras estudios llevados a cabo utilizandoratas o monos. Tras la inyeccin intraperitonealen ratones, esta toxina induce una sintomatolo-ga peculiar conocida como scratching syndro-me. Los animales se rascan los hombros con lasextremidades posteriores, le siguen convulsio-nes y a menudo la muerte. Tambin se informde efectos sutiles tales como hipoactividad,


Figura 8.5. Estructura de las toxinas amnsicas.

COOH

CH3

N COOH

H

COOH

CH3

HCOOH

CH3

N COOH

H

COOH

H

H3C

CH3

N COOH

H

COOHH3C

COOHCOOH

H

COOHN

CH3

CH3HOOC

N

H

COOH

CH2

HOOC CH3

N

H

COOH

CH3COOH

H3C

N

H

COOH

H3C

COOH

CH3

N COOH

H

COOH

CH3H3C

COOH

COOH COOH

COOH

cido domoico Isodomoico G (8) (C5 diastereomer)

Isodomoico A (2) Isodomoico B (3)

Isodomoico C (4) Isodomoico D (5)

Isodomoico (6) Isodomoico F (7)

rigidez, temblores, etc. (Tasker et al., 1991).De los efectos txicos en humanos se tuvoconocimiento con posterioridad al incidentecanadiense, cuando 107 personas tuvieron queser hospitalizadas; 14 de ellas presentaron sn-tomas neurolgicos severos y cuatro de las per-sonas de edad avanzada intoxicadas murieronen un periodo de 11 a 24 das. En sus cerebrosse detectaron daos severos, fundamentalmen-te en la regin del hipocampo (Todd etal.,1993). Los sntomas humanos fueron rela-cionados fundamentalmente con trastornosgastrointestinales (diarrea, vmitos), pero tam-bin se observaron sntomas neurolgicos,siendo la prdida de memoria temporal uno delos sntomas ms caractersticos asociados coneste tipo de intoxicacin. La farmacocintica yel mecanismo de accin del cido domoicomuestran que tras la exposicin oral, y comoocurre con la mayora de las toxinas, se excre-tan en heces tanto de ratas como de ratones(Iverson et al., 1990). En el torrente sanguneoel cido domoico es purificado muy fcilmenteen los riones (Suzuki et al., 1993).

El AD es estructuralmente similar al cidoglutmico, cido kanico y cido asprtico,todos aminocidos conocidos por las lesionescerebrales que provocan debido a su excitotoxi-cidad (Hess et al., 2001). Sin embargo, se sabeque el cido domoico es un neuroexcitador dedos a tres veces ms potente que el cido kani-co y aproximadamente cien veces ms potenteque el glutamato.

Una serie de estudios iniciales sugirieron quela neurotoxicidad del cido domoico era resulta-do de su actuacin sobre receptores del cidokanico en el cerebro (Larm et al., 1997). Sinembargo, investigaciones ms recientes handemostrado que el cido domoico provoca sn-tomas neurotxicos debido a una sobrecarga einhibicin de los iones calcio (Nijjar et al.,2000), y se le ha relacionado con el incrementode liberacin de glutamato en el cerebro (Ross etal., 2000; Quintela et al., 2000).

Despus del incidente canadiense el nivel decido domoico estipulado como lmite de segu-ridad fue de 20 mg/g de tejido de marisco

(Iverson et al., 1994). Dicho nivel ha sido adop-tado por la mayora de los pases como lmitelegal. El lmite de accin legal del cido domoi-co en vsceras de cangrejos ha sido reciente-mente modificado y establecido en 80 mg/g. Delos datos obtenidos en el incidente canadiense seestima que la concentracin de cido domoicoen los mariscos estaba en el rango de 300-1.000mg/g y los individuos intoxicados podran haberingerido entre 1-2 mg/kg de la toxina.

As, el consumo de 250 g de carne de meji-lln con el mximo nivel de tolerancia corres-ponder a la ingestin de 0,1 mg AD /kg peso deadulto.

Los grados de acumulacin del cido domoi-co en los mariscos y su velocidad de eliminacinvaran entre las diferentes especies y entre rga-nos diferentes. En la mayora de los mariscos elAD se acumula en los rganos digestivos.

4. Mtodos de anlisisEl AD puede ser detectado mediante el bioensa-yo para PSP siempre y cuando el tiempo deobservacin sea de ms de cuatro horas. La toxi-na es detectada en los ratones por una sintoma-tologa caracterstica, el sndrome de scratchingya mencionado. El xito de dicho ensayo biol-gico en el incidente canadiense fue en partedebido a los niveles elevados de toxinas presen-tes en los mariscos contaminados (300-1.000mg/g tejido). Sin embargo la sensibilidad delbioensayo es inadecuada para el lmite de accinde 20 mg/g tejido establecido como lmite decontrol. Los sntomas en ratones, tales como elscratching fueron observados en extractos con-teniendo >40mg/g.

Se han desarrollado diversas alternativaspara el anlisis de toxinas ASP. El primer mto-do qumico desarrollado fue la cromatografa delquido en fase inversa con deteccin UV delcompuesto no derivatizado a un mximo deabsorcin de 242 nm (Quilliam et al., 1989a)

Desde entonces se desarrollaron numerosasalternativas utilizando diversos procedimientosde extraccin o de deteccin, incluyendo el uso dereactivos de derivatizacin distintos (Pocklington


et al., 1990; James et al., 2000) permitiendo obte-ner niveles de deteccin de 1 g/g o incluso msbajos.

La electroforesis capilar, una tcnica analticamuy prometedora, ha sido investigada tambin yaplicada al anlisis de cido domoico (Nguyen etal., 1990; Zhao et al., 1997; Pieiro et al., 1999).La tcnicas GC-MS y HPLC-MS (Furey et al.,2001; Pieiro et al., 2001) fueron propuestastambin para la determinacin de dichos com-puestos. As, la tcnica de GC-MS es aplicable aconcentraciones de cido domoico en mariscoscontaminados en el rango de 1-500 mg/g. Sinembargo, la reaccin de derivatizacin es nece-saria para convertir los componentes ASP en susderivados N-trifluoroacetyl-O-silyl requirindo-se un clean-up intensivo para facilitar la deriva-tizacin (Pleasance et al., 1990). La tcnicaHPLC combinada con in spray MS ha resultadomuy til para la confirmacin del cido domoicoen mariscos (Quilliam et al., 1989b).

Entre los ensayos bioqumicos, adems delradioinmunoensayo (Lawrence et al., 1994) sehan desarrollado diversos ensayos ELISA(Garthwaite et al., 1998; Kawatzu et al., 1999;Kawatzu et al., 2000) altamente sensibles, reco-mendables para ensayos de rutina.

Entre todas las alternativas analticas para elcontrol de ASP, la ms recomendable es la tc-nica de HPLC-UV, utilizada con fines de controlen la mayora de los organismos oficiales paraprevenir incidentes de ASP (Lawrence et al.,1989; Lawrence et al., 1991; Quilliam et al.,1989a; AOAC, 1991). Este mtodo es recomen-dable para detectar niveles de contaminacinsuperiores a 20 mg/g, sin embargo ciertas inter-ferencias comnmente presentes en matrices tancomplejas pueden causar falsos positivos enextractos crudos. Este es el caso del triptfano yalguno de sus derivados presentes a menudo entejidos de mariscos, eluyendo prximos al AD oa alguno de sus ismeros, siendo necesario unclean-up eficaz para eliminar las citadas interfe-rencias y consecuentemente obtener un controlseguro de los citados compuestos txicos. A talfin se han desarrollado mtodos de clean-upefectivos mediante extraccin en fase slida

(SPE) utilizando C18 o intercambio aninicocomo fases estacionarias. No obstante, dichosprocedimientos han mostrado una gran variabi-lidad, por lo que todava son necesarias estrate-gias de preparacin de muestra alternativas quepermitan paliar las citadas carencias. Por todoello, el uso de tcnicas confirmatorias, talescomo la espectrometra de masas, son muy reco-mendables para asegurar la presencia o ausenciade ASP en alimentos marinos.

Gracias al desarrollo de nuevas tcnicas analti-cas se han descubierto nuevos grupos de bioto-xinas marinas, incluyendo las espirolidas, pro-rocentrolidas, gymnodiminas, pinnatoxinas,azaspircidos (AZP).

1. EspirolidasEste grupo de toxinas se descubri tras demos-trarse la toxicidad que presentaban muestras demoluscos de consumo cultivados en NuevaEscocia (Canad). Ya en un principio se sospe-ch que las espirolidas eran de origen fitoplanc-tnico debido a su elevada concentracin en lasglndulas digestivas de estos moluscos y a suaparicin estacional. Ms tarde se demostr queel dinoflagelado Alexandrium ostenfeldii es laprincipal fuente de estas toxinas ya que, trasla recoleccin de muestras de plancton en laregin del sureste de Nueva Escocia, fuerondetectadas en el anlisis mediante HPLC-MS desus clulas una vez aisladas y cultivadas(Cembella et al., 2000).

Cuatro de estas toxinas, las espirolidas A, B,C y D, que se muestran en la Figura 8.6a hansido aisladas a partir de muestras de mejillones yvieiras (Placopectena magellanicus) y su estruc-tura ha sido elucidada (Hu et al., 1995). Sonmolculas macrocclicas polares que poseen unsistema con un grupo espiro unido a un ter tri-cclico. Adems, contienen un grupo con iminacclica de siete miembros. As, el nombre espi-

Toxinas emergentes


rolidas proviene de su estructura caracterstica.Durante los procedimientos de aislamiento delos cuatro anlogos de espirolida anteriormentecitados, se descubrieron dos nuevos compues-tos menores, las espirolidas E y F, que tambinfueron aisladas y elucidadas estructuralmente.Estos fueron caracterizados como derivados dela hidrlisis de las keto aminas de las toxinasprincipales y se demostr su inactividad en elbioensayo con ratones. Recientemente, las espi-rolidas A y C, y un anlogo de la espirolida C, la13-dimetil-C, fueron estructuralmente elucida-das tras su extraccin a partir de muestras devieiras y fitoplancton recogidas en una zonadedicada a la acuicultura en Nueva Escocia y apartir de cultivos del dinoflagelado Alexandriumostenfeldii (Hu et al., 2001).

Su actividad farmacolgica no est muy defi-nida todava, pero existen suficientes evidenciascomo para afirmar que afectan a los canales deCa en las clulas. Aunque el grupo imina cclicaes poco frecuente en biotoxinas marinas, se han

encontrado similares grupos en prorocentrolidas(Torigoe et al., 1988; Hu et al., 1996a), gymno-diminas (Seki et al., 1995) y pinnatoxinas(Uemura et al., 1995). Adems, las espirolidasinactivas E y F no poseen este grupo por lo quese ha sugerido que dicho grupo es el responsablede la actividad farmacolgica de estas toxinas(Hu et al., 1996b).

2. ProrocentrolidasEn 1984 se observ un hecho inusual: durante laextraccin de toxinas DSP de muestras del dino-flagelado Prorocentrum maculosum (formal-mente P. concavum), se inyectaron en ratones lasfracciones solubles en ter y butanol. Las toxinas(DSP) contenidas en la fraccin ter causaron lamuerte de los ratones en un espacio de horas,mientras que las toxinas solubles en butanol(polares) la causaron en cuestin de minutos.

Un ao ms tarde, las clulas de la especiefitoplanctnica Prorocentrum lima fueron aisla-das y cultivadas, y sometidas a un procedimien-to de extraccin de toxinas DSP. La fraccinbutanlica se aisl, de manera que la estructurade la prorocentrolida, que se muestra en laFigura 8.6b, fue determinada por primera vez(Torigoe et al., 1988).

En 1996, una nueva toxina, la prorocentro-lida B (Figura 8.6b), se aisl y elucid estruc-turalmente tambin a partir de clulas de Proro-centrum maculosum, provocando una toxicidadmuy rpida tras ser inyectada en ratones (Hu etal., 1996a).

Se ha comprobado que este grupo de toxinasno son inhibidores de la protena fosfatasa, perosus propiedades farmacolgicas y toxicolgicastodava an no han sido establecidas. Contienenuna imina cclica (al igual que las espirolidas,gymnodiminas y pinnatoxinas), y esta caracte-rstica comn determina su similar actividad far-macolgica, siendo todas ellas muy txicas enratones.

Sin embargo, no hay que olvidar que las pro-rocentrolidas no han sido detectadas todava enmuestras de moluscos, por lo que han de serconsideradas como una amenaza potencial.


O

N

O

OO

CH3

OH

R2

CH3

CH3

O

CH3

CH3

O

R1

1

23

Toxina Sitio 2 3 R1 R2Espirolida A Doble enlace H CH3Espirolida B Enlace sencillo H CH3Espirolida C Doble enlace CH3 CH3Espirolida D Enlace sencillo CH3 CH313-dimetil-espirolida C Doble enlace CH3 H

Figura 8.6a. Estructura general de las espirolidastxicas.

3. Gymnodiminas

En 1994 se detectaron signos de toxicidad enmuestras de ostras de la especie Tiostrea chilen-sis procedentes del Estrecho de Foveaux (NuevaZelanda), pero los anlisis no revelaron la pre-sencia de ninguna toxina conocida hasta esafecha (MacKenzie et al., 1995). Tras su extrac-cin, estas muestras se sometieron a distintas eta-pas de purificacin hasta el total aislamiento dela toxina que contenan, monitorizando las frac-ciones mediante cromatografa con detector conhaz de diodos y bioensayo con ratones. Duranteel mismo periodo que sucedi la intoxicacin, seprodujeron afloramientos del dinoflageladoGymnodinium cf. mikimotoi, por lo que se deci-

di cultivarlo, para finalmente descubrir que erael responsable de la produccin de la toxinadenominada gymnodimina (Seki et al., 1995).

Tras la elucidacin estructural de este com-puesto mediante RMN, se comprob que poseeun anillo de 16 tomos de carbono y una iminacclica (Seki et al., 1995), por lo que guarda cier-ta similitud con las pinnatoxinas y prorocentroli-das. Posteriormente, la configuracin absoluta dela toxina (Figura 8.6c) se estableci mediante an-lisis estructural con rayos X (Stewart et al., 1997).

Recientemente, se ha descubierto un nuevoanlogo, la gymnodimina B, aislada a partir deun cultivo de Gymnodinium spp., y cuya estruc-tura ya ha sido elucidada (Figura 8.6c) (Mileset al., 2000).


Figura 8.6b. Estructura de prorocentrolida (a) y prorocentrolida (b).

N

O

O

O

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

N

O

O

O

O

OH

OH

OH

OH

O

OH

OHOH

OH

OSO3H

a b

Figura 8.6c. Estructura de gymnodimina (a) y gymnodimina (b).

N

O

O

HO

O

HCH3CH3 CH3

N

O

O

HO

O

HCH3CH3 CH3

CH3

a b

En cuanto a su toxicidad, las gymnodiminaspueden resultar ictiotxicas a bajas concentra-ciones (250-500 ppb), y la dosis letal mnimatras la inyeccin en ratones ha sido establecidaen 450 g/kg.

4. PinnatoxinasEn Japn se han producido numerosos fenme-nos de intoxicacin tras el consumo de moluscosdel gnero Pinna; el primero de ellos se dio en1975, cuando cerca de 1.500 personas consumie-ron ejemplos del bivalvo Pinna pectinata en malestado. En China se dieron casos similares enlos aos 1980 y 1989 tras el consumo de la espe-cie Pinna attenuata, pero la toxina responsablede estos fenmenos no se aisl hasta 1995 a par-tir de muestras de Pinna muricata (Chou et al.,1996a). La estructura de la pinnatoxina A poseeun macrociclo con mltiples grupos ter y unaimina cclica (Figura 8.6d), por lo que es similara las prorocentrolidas, gymnodiminas y espiroli-das. Se han descubierto los anlogos pinnatoxi-na B, C y D, pero solamente la estructura de lapinnatoxina D ha sido elucidada (Figura 8.6d)(Chou et al., 1996b, Suthers et al., 1998).

En cuanto a su toxicidad, se ha comprobadoque extractos de la glndula digestiva de ejem-plares de P. muricata, P. attenuata, P. atropu-prea y P. pectinata contaminadas causan la

muerte durante el bioensayo con ratones, herra-mienta principal en la monitorizacin de estatoxina, en cuestin de minutos, aunque su origenbiolgico an no ha sido determinado. Adems,estudios preliminares demostraron que la pinna-toxina activa el canal del in calcio y que lossntomas que provoca en seres humanos sontpicamente neurotxicos, induciendo diarrea,parlisis y convulsiones.

5. Azaspircidos (AZP)En 1995 varias personas sufrieron problemasgastrointestinales en los Pases Bajos tras el con-sumo de mejillones (Mytilus edulis) cultivadosen Killary Harbour (Irlanda). A pesar de que elprograma de monitorizacin de toxinas DSP nodetect niveles altos de estas, los sntomas quelos intoxicados presentaban son los tpicos pro-vocados por las toxinas DSP: nuseas, diarrea,vmitos y calambres en el estmago. Anlisisrealizados posteriormente a las muestras debivalvos mostraron niveles muy bajos de AO yDTX-2 (Satake et al., 1998a).

Posteriormente se procedi al aislamiento yelucidacin estructural de la toxina responsablede este episodio, que en aquel momento fuedenominada killarytoxin-3 (KTX-3) (Ito et al.,1998). La investigacin sobre su estructuradetermin que este compuesto posee un anillo


Figura 8.6d. Estructura de pinnatoxina A (a) y pinnatoxina D (b).

HN+

H

O

O

O

O O

OH

OHCH3

CH3 CH3

CH3CH3

O

O

O

HN+

H

O

O

O

OO

O

OH

OHCH3

CH3CH3

CH3CH3

O

a b

espiro triple, un anillo azospiro nico a un 2,9-dioxabiciclo (3.3.1) nonano y un cido carbox-lico terminal (Figura 8.6e), por lo que el nombrede esta toxina se cambi por azaspircido-1(AZA-1) (Satake et al., 1998b).

Un segundo incidente txico se dio en 1997en la Isla de Arranmore (Irlanda), cuando docepersonas se intoxicaron tras el consumo demejillones cultivados en la zona. La toxicidadpersisti en las muestras de moluscos duranteunos ocho meses, lo que permiti aislar e iden-tificar dos nuevos anlogos de azaspircidos:AZA-2 y AZA-3 (Figura 8.6e), ambos presen-tes en concentraciones superiores a AZA-1.Tras la determinacin estructural de estos dosnuevos anlogos, se comprob que AZA-2 esun 8-metilazaspircido, y que AZA-3 es un 22-dimetilazaspircido (Ofuji et al., 1999).

Recientemente se han identificado nuevosanlogos: AZA-4 y AZA-5 son los 3-hidroxi y23-hidroxi anlogos respectivamente de AZA-3(Ofuji et al., 2001). Adems, AZA-6 es ismerode AZA-1 (Furey et al., 2002; James et al.,2003) y AZA-7, AZA-8, AZA-9 y AZA-10 sonderivados hidroxilados de AZA-1 (Moroney etal., 2002). Se cree que los anlogos hidroxiladosson productos de la bioconversin de los bival-vos, ya que no se han detectado en muestras defitoplancton.

Este sndrome txico se ha identificado ade-ms en moluscos cultivados en otros pases delnorte de Europa, como Inglaterra y Noruega(James et al., 2002a) as como en Espaa yFrancia (Braa Magdalena et al., 2003).

En cuanto a la toxicidad de estos compues-tos, se ha comprobado que la dosis letal mnimapara AZA-1 es 0,2 g/g tras administracinintraperitoneal (i.p.) en ratones, mientras quepara AZA-2 y AZA-3 es menor: 0,14 g/g (Ito etal., 2000). Tambin se observ que los ratonesmuestran sntomas tpicamente neurotxicos,diferentes a los provocados por las toxinas dia-rreicas, como son parlisis progresiva, respira-cin dificultosa, lentitud de movimientos yespasmos (Satake et al., 1998a). En otro estudiose analizaron los cambios morfolgicos sufridosen distintos rganos de ratones y se detectaronmltiples daos en la lmina propia del intestinodelgado, glndula del timo y bazo, adems degenerar depsitos grasos en el hgado (Ito et al.,2000). Recientemente se han estudiado los efec-tos crnicos de la administracin no letal deazaspircidos a ratones (Ito et al., 2002), dondela recuperacin de rganos daados fue muylenta y los cambios morfolgicos en el intestinodelgado y el estmago no haban sanado tras unperiodo de tres meses.

Sin embargo, es necesario que la toxicidadde los azaspircidos se estudie con mayor pro-fundidad tanto para confirmar la accin deAZA-1 como promotor de tumores como paradeterminar los efectos patolgicos provocadospor los otros anlogos.

El bioensayo con ratones es el mtodo deanlisis tpico para la monitorizacin de toxinas


Figura 8.6e. Estructura de los diez anlogos de azas-pircidos descubiertos hasta la fecha.

O

OOOH

HHO

CH3

H

H

O

NH

O

O

O

O

H

H

CH3 CH3

CH3

H

HO

CH3

OH

R1R2

R4

R3

Nombre R1 R2 R3 R4AZA1 H H CH3 HAZA2 H CH3 CH3 HAZA3 H H H HAZA4 OH H H HAZA5 H H H OHAZA6 CH3 H H HAZA7 H CH3 OH HAZA8 H CH3 H OHAZA9 CH3 H OH HAZA10 CH3 H H OH

DSP en la mayora de pases europeos, pero enel caso de los azaspircidos los resultados noson satisfactorios; se han obtenido resultadospositivos en muestras con un elevado contenidotxico, pero en otros casos se han dado por bue-nas mercancas que luego han causado intoxica-ciones humanas en diferentes pases europeos(James et al., 2000a). Este fracaso del bioensayocon ratones se debe principalmente al inusualpatrn de distribucin de estas toxinas en lostejidos del mejilln (James et al., 2002b), ya quelos azaspircidos se distribuyen por todos losrganos, mientras que en el bioensayo se tomasolamente el hepatopncreas, donde se acumu-lan las toxinas diarreicas.

En cuanto al origen biolgico de los azaspi-rcidos, se supuso desde un principio que erande origen dinoflagelado por su estructura oxige-nada (Ofuji et al., 1999; Yasumoto et al., 2000).Finalmente, se ha demostrado que el productorde los azaspircidos es la especie Protoperidi-nium crassipes (James et al., 2003) muy comnen las comunidades fitoplanctnicas de aguastempladas.

En cuanto a los mtodos de anlisis desarro-llados para la deteccin y cuantificacin de losazaspircidos, cabe decir que el primero en serpropuesto empleaba la tcnica HPLC-MS/MS(Draisci et al., 2000) para la determinacin deAZA-1. Otros mtodos propuestos empleanHPLC-MS para la determinacin de AZA-1,AZA-2 y AZA-3 (Ofuji et al., 2000; Furey etal., 2002). Posteriormente se han desarrolladomtodos para el anlisis simultneo de AZA-1,AZA-2, AZA-3, AZA-4 y AZA-5 empleandoHPLC-MS/MS (Lehane et al., 2002) y reciente-mente se ha propuesto un mtodo HPLC-MS3para la determinacin de los diez azaspircidos,incluyendo los anlogos hidroxilados en molus-cos (Lehane et al., 2004).

Tambin se ha desarrollado un ensayo decitotoxicidad para la deteccin y diferenciacinentre toxinas DSP y AZP (Flanagan et al., 2000;Flanagan et al., 2001). Sin embargo, el mtodoparece no ser tan selectivo como en un principiose pens, por lo que el ensayo de citotoxicidadno es sustituto, por el momento y hasta que no

se realice una investigacin ms completa, delanlisis mediante HPLC-MS, adems de sermucho ms lento (Flanagan et al., 2001).

En conclusin, podemos decir que gracias aldesarrollo de nuevas tcnicas y mtodos anal-ticos, se ha descubierto un buen nmero de bio-toxinas marinas. La mayora de estas toxinasestn presentes en el medio marino de una mane-ra natural, pudiendo provocar problemas de cali-dad y seguridad en los alimentos de origen mari-no, y, en consecuencia y a bajos niveles, a lasalud de las personas consumidoras de stos.

La bsqueda de tcnicas analticas sensibleses necesaria para un control de riesgos adecua-do. Adems es importante la realizacin de estu-dios toxicolgicos para un mejor entendimientode los mecanismos de accin de estos compues-tos. Sin embargo, la carencia de estndares ymateriales de referencia dificulta obviamenteavanzar en esta rea. Por otro lado, el inters enel estudio de estas sustancias est aumentandoconsiderablemente debido a su enorme impactosocioeconmico. En la actualidad diferentesequipos de investigacin en todo el mundo estntrabajando en el desarrollo de nuevos mtodosanalticos para su deteccin y cuantificacin,que poco a poco resultar en un mayor conoci-miento de los compuestos txicos involucradosen diferentes episodios nocivos, y por tanto enuna reduccin de los riesgos para la salud de losconsumidores.

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