Biotoxinas Marinas en Moluscos:

Introducción de una nueva regulación

José Juan RiveroEspecialista de Producto

GC y GCMS

Agilent Technologies

Febrero 2011

Biotoxinas marinas: Por que analizarlas?

Las enfermedades relacionadas con la ingesta de Biotoxinas

van desde los simples dolores de cabeza, vómitos y diarreas

hasta problemas neurológicos y en casos extremos la

muerte.

La situación actual en cuanto a regulación

Las empresas de alimentación que suministran moluscos bivalvos vivos en

mercados para el consumo humano, deben asegurarse que no deben contener

biotoxinas marinas que excedan los siguientes limites:

• 800 microgramos por kilogramo para las paralizantes (PSP),

• 20 milligramos de ácido domoico por kilogramo para las anextesiantes (ASP)

• 160 microgramos de ácido okadoico por kilogramo equivalente para ácido

okadoico, dinofisistoxina y pectenotoxina combinado.

• 1 milligramo de yessotoxina equivalente por kilogramo,

• 160 microgramos of azaspiracida equivalente por kilogramo.

Dos alertas muy recientes (Agosto’10).

Clases de Toxinas (Reguladas)

Saxitoxina STX PSP

Acido Domóico DA ASP

Grupo del ácido Okadaico OA DSP Acido Okadaico

Toxinas Dinophysis

Pectenotoxina PTX DSP

Yesotoxina YTX DSP

Azaspirazida AZA AZP

Todas son analizadas actualmente por tecnicas MBA

dando resultados aprobados por la UE

Acidos Okadaicos

Azaspiracidas

Pectenotoxinas

Yesotoxinas y adriatoxina

Clases de toxinas (no reguladas)

brevetoxin BTX

cyclic imines CI SPX (12: eg 13-desmethyl SPX C) Spirolides

GYM (4: A-C) gymnodimines

PnTX (7: A-G) pinnatoxins

PtTXs (3 characterized: A-C) pteriatoxins

Not yet studied in Europe prorocentrolides

Not yet studied in Europe

spiroprorocentrimine

s

palytoxinas P1TX

ciguatoxinas CTX

¿Que tiene que ver todo esto con el LCMS?

MBA (Mouse Bioassay)Bioensayos con ratones es la forma

estandar hoy dia de analizar las

Biotoxinas

Desde los 80’s .....

Las toxinas son extraidas del tejido del

molusco usando acetona y despues

de una evaporación es inyectada

intraperitonealmente en ratones y

aquellos que sobrevivan dentro de las

24-48 horas. Una unidad raton (MU)

se defina como la minima cantidad de

toxina que es necesaria para matar a

un raton dentro de las primeras 24

horas.

Algunos compuestos no son muy sensibles a la

tecnica MBA

= Falsos positivos y negativos

Toxinas Lipofilicas:

Compound Tox factor

OA 1

DTX1 1

DTX2 0.6

AZA1: 1

AZA2: 1.8

AZA3: 1.4

Compound Tox factor

PTX1: 1

PTX2: 1

YTX: 1

Homo-YTX: 1

OH-YTX: 1

OH-homo-YTX: 1

¿Quien está trabajando con este analisis ya?

Dr. Ana Gago-Martinez

Prof. at the Department of Analytical and Food

Chemistry, University of Vigo, Spain

EURLMB Director

We have this system installed at my laboratory on the Faculty of Chemistry (University of

Vigo Spain). One of my priority field of research is the analysis of Marine toxins and in this

field I am also the Director of the European Reference Laboratory for Marine Biotoxins.

We have been using this equipment to participate on the interlaboratory validation for

Diarrhetic shellfish poisoning and the previous results have been pretty good, the system

have been working well for this particular analysis and in fact our results have allowed us to

participate on the main study which is being carried out at this precise moment.

We have been also using this system to analyse emergent toxins such as Brevetoxins and

Ciguatoxins and the performace and sensitivity of the equipment is very good.

Oliver Keuth

Chemisches und Veterinäruntersuchungsamt

Münsterland-Emscher-Lippe (CVUA-MEL) – AöR

Münster, Germany

For analyzing samples on lipophilic marine biotxins we mainly use the Agilent 6460 QQQ

with the ESI JetStream source as the mass spectrometer. The LC part is the Agilent Infinity

1290. Additionally we also use an Agilent 6410 QQQ with an Agilent Series 1200SL for the

LC part.

According to our experiences we are very satisfied with the stability and reproducibility of the

system (both parts, MS and LC part).

The sensitivity of the system is very good, refer to our calibration curve.

Also the software (we use Agilent MassHunter) is very easy to use and there are many

practical tools included in the software for data analysis. Based on our own experiences it

does not take many time to learn the MassHunter software, if you are know working with

another type of software.

¿Quien está trabajando con este analisis ya?

UE N-15/2011 ( En vigor desde el 1 de Julio de 2011)

Determinación de biotoxinas marinas lipofilicas en

moluscos usando Triple Cuadrupolo LC/MS/MS

Datos experimentales suministrados por:

Begoña Ben Gigirey, Prof. Dr. Ana Gago-MartinezDept. Química Analitica y Alimentación, Facultad de Químicas, Universidad de Vigo

Agenda:

1. Revisión del analisis de las Biotoxinas lipofílicas

2. Optimización del método

3. Metodología – desde la extracción hasta la cuantificación

Revisión del análisis de Biotoxinas lipofilicas:

• Existen dos métodos LC-MS/MS propuestos para el analisis de este tipo

de biotoxinas ambos métodos están siendo evaluados:

• Metodo Ácido (McNabb et al., 2005)

– Condiciones en fase reversa

– Fases móviles ácidas

– La ionización por ESI con polaridad +/-

– Monitorizacion de multiples condiciones (MRM)

• Metodo Alcalino (Gerssen et al., 2009)

– Condiciones en fase reversa

– Fases moniles básicas (pH 11)

– Ionización por ESI con segmentos en polaridad negativa y positiva

– Monitorizacion de multiples condiciones (MRM)

Influencia del valor del pH de la fase movil:

DTX-1:

O

O

OH

CH3OH

CH3OH

OH

H

CH3O

O

O

CH2

CH3

O

O

OHOH

CH3

H

H

H

H

O

O

OH

CH3OH

CH3O

-

OH

H

CH3O

O

O

CH2

CH3

O

O

OHOH

CH3

H

H

H

H+H+

Gerssen et al., J. Chromatogr. A, 1216 (2009) 1421-1430

Comportamiento cromatográfico de las toxinas:

45 O

H-Y

TX

/

45 O

H-h

om

o-Y

TX

YT

X/H

om

o-Y

TX

OA D

TX

-2

AZ

A-3

AZ

A-1

AZ

A-2

DT

X-1

PT

X-2

PT

X-2

sa

**

Método ácido:• Excelente forma de picos

para la mayoría de los

compuestos

• YTX muestran picos

ligeramente mas anchos

• Buena sensibilidad

• Requiere cambios de

polaridad rápidos

Negative ionization Positive ionization4

5 O

H-Y

TX

/

45 O

H-h

om

o-Y

TX

YT

X/H

om

o-Y

TX

OA DT

X-2

AZ

A-3

AZ

A-1

AZ

A-2

DT

X-1

PT

X-2

Método alcalino:• Excelente forma de los

picos de YTXs

• Separación cromatografica

delos compuestos

ionizados en pos y neg

• Incrementa la sensibilidad

para OA y DTXs

• Forma de picos para

azaspirazidas se ven

negativamente afectados

Ionización de las toxinas lipofilicas en la electrospray

Compound class Formula ESI mode Precursor ion

Okadaic acid group

OA

DTX-1

DTX-2

C44H68O13

C45H70O13

C44H68O13

negative

positive

negative

positive

negative

positive

[M-H]- = 803.5

[M+Na]+ = 827.5

[M-H]- = 817.6

[M+Na]+ = 841.5

[M-H]- = 803.5

[M+Na]+ = 827.5

Azaspiracids

AZA-1

AZA-2

AZA-3

C47H71NO12

C48H73NO12

C46H69NO12

positive

positive

positive

[M+H]+ = 842.6

[M+H]+ = 856.5

[M+H]+ = 828.5

Pectenotoxins

PTX-1

PTX-2

C47H70O15

C47H70O14

positive

positive

positive

positive

[M+NH4]+ = 892.5

[M+Na]+ = 897.5

[M+NH4]+ = 876.6

[M+Na]+ = 881.5

Yessotoxin group

YTX

homo-YTX

OH-YTX

OH-homo-YTX

C55H82O21S2

C56H84O21S2

C55H82O22S2

C56H84O22S2

negative

negative

negative

negative

negative

negative

[M-2H]2- = 570.3

[M-H]- = 1141.5

[M-2H]2- = 577.4

[M-2H]2- = 578.4

[M-H]- = 1157.4

[M-2H]2- = 585.4

PTX-2

AZA-1

YTX

CID para OA

CE 45 V

CE 60 V

positive

negative

0.00E+00

2.00E+05

4.00E+05

6.00E+05

8.00E+05

1.00E+06

1.20E+06

1.40E+06

200 210 220 230 240 250 260

Pe

ak a

rea

in c

ou

nts

Fragmentor voltage in V

SIM 842.6

Optimización del voltaje de fragmentación para AZA-1

• Azaspiracid-1

• SIM 842.6 @ FragV 150 to 350 V

(coarse, step 40V)

• SIM 842.6 @ FragV 205 to 250 V

(step 5V)

FragV 150 V

FragV 190 V

FragV 230 V

FragV 270 V

FragV 310 V

FragV 350 V

0

40000

80000

120000

160000

200000

25 35 45 55 65 75

Pe

ak h

eig

hts

in

co

un

ts

Collision energies in V

842.6 -> 824.6

842.6 -> 806.6

842.6 -> 362.3

842.6 -> 672.4

Optimización de las energías de colisión para AZA-1

• Azaspiracid-1

• Frag 1: 842.6 824.6

• Frag 2: 842.6 806.6

• Frag 3: 842.6 362.3

• Frag 4: 842.6 672.4

842.6 824.6 @ CE 29 V

842.6 806.6 @ CE 45 V

842.6 362.3 @ CE 61 V

842.6 672.4 @ CE 53 V

Metodología – Preparación de la muestra:

2 g tejido de molusco cocido y molido

LC-MS/MS

Extracción con disolvente acuoso

(80 % metanol)

Agitación para homogenizar

Centrifugar

Repetir la extracción,

El sobrenadante se decanta en un

matraz, rellenando hasta 50 ml

Se filtra el extracto, usando un filtro de

membrana de 0.45 µm

Injectar 10 µl

Metodología – condiciones del HPLC:

Columna: Phenomenex Luna C-18, 150 x 2 mm, 5 µm (modo positive)

Agilent ZORBAX Eclipse Plus C-8, 75 x 4.6 mm, 3.5 µm (modo negativo)

Flujo: 0.2 mL/min

Temp Columna: 30°C

Volumen de inyección: 10 μL (needle wash in flush port 5 seconds)

Disolvente Canal A: 0.1% formic acid (positive mode)

2 mM ammonium acetate (negative mode)

Disolvente Canal B: methanol

Gradiente: Time (min) A (%) B (%)

0.0 90 5

10.0 10 85

22.0 10 85

23.0 90 5

30.0 90 5

Tiempo total: 30.0 min

Metodología – Condiciones del Agilent Jet Stream:

Temp gas de secado: 300°C

Flujo de gas: 5 L/min

Presión del nebulizador: 45 psi

Temp del gas de Jet Stream: 250°C

Flujod de gas: 11 L/min

Voltaje de Aguja: +/- 500 V

delta EMV: 400 V

Voltaje de Capilar: +/- 3500 V

Nebulizer N2 gas

(near sonic

velocity)

Super-heated N2

sheath gas

LC flow

Thermal focusing

Electrospray

* Transitions based on literature information

Metodología – Condiciones de adquisición MRM:

Analyte Polarity Prec Ion

m/z

Prod Ion

m/z

Frag

[V]

CE

[eV]

Quantifier

OA and DTX-2 pos

pos

827.5

827.5

723.4

809.2

220

220

55

45

X

DTX-1 pos

pos

841.5

841.5

737.2

823.2

220

220

55

45

X

PTX-1 pos

pos

897.5

897.5

555.3

853.5

230

230

70

60

X

PTX-2 pos

pos

881.5

881.5

539.3

837.5

230

230

70

60

X

PTX-2sa * pos

pos

899.5

899.5

855.5

557.3

230

230

60

70

X

YTX neg

neg

1141.5

1141.5

1061.3

925.5

135

135

35

60

X

Homo-YTX * neg 1155.4 1075.5 135 35 X

OH-YTX neg 1157.4 1077.5 135 35 X

OH-Homo-YTX * neg 1171.4 1091.5 135 35 X

AZA-1 pos

pos

842.5

842.5

824.5

806.5

200

200

40

55

X

AZA-2 pos

pos

856.5

856.5

838.5

820.5

200

200

40

55

X

AZA-3 pos

pos

828.5

828.5

810.5

792.5

200

200

40

55

X

Cromatogramas de un extracto de mejillón y QC

Blue mussel extractAZA-1 to AZA-3: < 20 µg/kg

OA: 37 μg/kg

DTX-2: 120 μg/kg

DTX-1: 69 μg/kg

QC-sampleAZA-1: 15 µg/kg

OA: 15 μg/kg

PTX-2: 15 μg/kg

Curvas de calibración sobre matriz

Calibration curve (matrix matched)

AZA-1, OA, PTX-2, and YTX reference

standards spiked into blue mussel extract

Calibration range:

AZA-1: 2.5 to 25 ng/mL

OA : 1 to 38 ng/mL

Cuantificación de Biotoxinas

• Existen tan solo cuatro estandares disponibles (AZA-1, OA, PTX-2, YTX) the

National Research Council, Institute for Marine Biosciences (NRC-CNRC),

Halifax, Canada

• Todos los demas deben ser cuantificados basándose por la respuesta de la

calibración de compuestos relacionados.

OA reference standard

(10 ng/ml)

Blue mussel extract

containing OA and DTX-2

(isomeric compounds)

Uso de “CopyCalibrationLevel.quant.script”

• Este especial script sirve para copiar la respuesta de la calibración de un compuesto de referencia

a otro del que no existe material de referencia disponible:

– Copiar “CopyCalibrationLevel.quant.script” en la dirección D:\MassHunter\Scripts\Quant

– Definir el compuesto de referencia en el campo de „Compound group“

– Ejecutar el script en el „Edit method“

– Los niveles de calibración incluyen el nombre del nivel, concentración y la respuesta del

compuesto de referencia y serán copiados automáticamente a los compuestos targets

– Cuantificación de los compuestos targets usando el comando „Quantitate Batch“.

Cuantificación de DTX-2 basado en la calibración del OA

• DTX-2 en muestra es cuantificada basado en la calibración del OA

• La separación a linea base es obligatoria si el compuesto es isomero; Se necesita

una buena separación para obtenero optimos resultados de cuantificación.

Validación del método

• El método has sido validado dentro de un estudio colaborativo internacional.

• El estudio de intercomparación fue dirigido por el grupo de trabajo LFGB

“Phycotoxins”, el cual está dentro del la oficina federal de protección al consumidor

y seguridad alimentaria Europea (BVL).

• LODs y LOQs en moluscos cocinados y molidos fueron:

Compound LOD LOQ

1OA 6 μg/kg 20 μg/kg

1DTX-1 & 2 6 μg/kg 20 μg/kg

2AZA-1 to 3 6 μg/kg 20 μg/kg

1PTX-1 & 2 6 μg/kg 20 μg/kg

3YTX 10 μg/kg 35 μg/kg

1MRL in raw mussel material for sum of OA, DTX-1 & 2, PTX-1 & 2: 160 μg/kg OA equivalents2MRL in raw mussel material for sum of azaspiracids: 160 μg/kg AZA-1 equivalents3MRL in raw mussel material for sum of yessotoxins: 1000 μg/kg YTX equivalents

Gracias por su

atención

José Juan RiveroEspecialista de Producto

GC y GCMS

Agilent Technologies

Email: jose.rivero@agilent.com

Tlf: 609426811 o 901116890