Upload
matobik93
View
60
Download
18
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Opis zagadnień z kursu biotransformacje mikrobiologiczne
Citation preview
Kolokwium zaliczeniowe Biotransformacje- zagadnienia:
1. Wyjaśnić pojęcia, zielona chemia (XII przykazań- przykłady), biotechnologia, kolory biotechnologii
Zielona chemia to dział chemii zajmujący się optymalizacją procesów technologii chemicznej w celu zmniejszenia ryzyka związanego z zanieczyszczeniem (zmianą stanu) środowiska.
XII przykazań zielonej chemii
I. Zapobieganie. Lepiej zapobiegać powstawaniu odpadów niż je utylizować
II. Ekonomiczna gospodarka odpadami. Metody syntetyczne powinny być tak zaprojektowane by jak największa
liczba atomów (oprócz atomów wodoru) substratu znalazła się produktach.
III. Bezpieczniejsze syntezy chemiczne. Gdzie tylko jest to możliwe należy stosować procedury syntetyczne
zaprojektowane tak, by używane i otrzymywane substancje chemiczne były bezpieczne dla zdrowia i
przyjazne dla środowiska
IV. Projektowanie bezpieczniejszych chemikaliów. Spośród produktów powinno się wybierać te, które są
najmniej toksyczne przy zachowaniu wymaganej funkcji.
V. Dbałość o oszczędność energii. Powinno się dbać o oszczędność energii i unikanie gazowych produktów
ubocznych. Najlepiej jak reakcje zachodzą pod ciśnieniem atmosferycznym i w temperaturze atmosferycznej.
VI. Bezpieczniejsze rozpuszczalniki i pomocniki. Użycie substancji pomocniczych (np. rozpuszczalniki, media
separacyjne, itp.) powinno być ograniczone lub unikane, a jeśli już to powinny to być czynniki jak najmniej
szkodliwe.
VII. Stosowanie materiałów odnawialnych. Należy dążyć do odzysku i ponownego stosowania rozpuszczalników,
katalizatorów i nieprzereagowanych substratów
VIII. Ograniczenie procesów derywatyzacji. Związane jest to z ograniczeniem liczby dodatkowych procesów
chemicznych w ciągu technologicznym.
IX. Stosowanie katalizy, gdzie tylko to możliwe. Jest to związane z dbałością o stechiometryczny przebieg i
eliminowanie nadmiarów substaratów.
X. Projektowanie biodegradowalnych produktów
XI. Ciągły monitoring procesów i zanieczyszczeń środowiska.
XII. Dbałość o bezpieczeństwo techniczne. Np. przez eliminację substancji wybuchowych i toksycznych
stosowanych w procesach technologicznych, minimalizację zagrożeń (wypadek wybuch poża
Biotechnologia multidyscyplinarna dziedzina naukowa. Biotechnologia to:
- zastosowanie metod naukowych i inżynieryjnych do obróbki materiałów czynników biologicznych w celu pozyskania dóbr i usług. [ wg. OECD]
-integracja nauk przyrodniczych i inżynieryjnych w celu zastosowania organizmów, komórek i ich części oraz molekularnych analogów do pozyskiwania dóbr i usług [wg. EFB]
Kolory biotechnologii:
„kolorowy” podział biotechnologii wprowadziła Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju przy udziale UE. Kolory te ulegają ciągłym modyfikacjom.
o Zielona: produkcja i przygotowywanie żywnościʚ Uważana za kolejny etap „zielonej rewolucji”ʚ Hodowla in vitro komórek roślinnych pozwalająca na reprodukcję całych roślin lub ich organelliʚ Zastosowanie inżynierii genetycznej w celu otrzymania roślin (w mniejszym zakresie zwierząt)
posiadających pożądane cechy GMOʚ Hodowla z wykorzystaniem markerów molekularnych- połączenie tradycyjnej hodowli selekcyjnej z
inżynierią genetycznąʚ Zastosowanie markerów selekcyjnych dla przesiania wielkich populacji zmutowanych organizmów
celem wyboru najlepszegoo Czerwona: potrzeby służby zdrowia
ʚ Obejmuje ponad 85% firm biotechnologicznychʚ Preparaty biotechnologiczne stanowią około 20% sprzedawanych lekarstw i około 50% będących na
etapie badań klinicznychʚ Większość biofarmaceutyków jest wytwarzana za pomocą rekombinowanych bakterii (głownie E.
coli) czy drożdży (drożdże piekarnicze- Saccharomyces cerevisiae)ʚ Również linie komórek organizmów wyższych i tworzenie hybrydowych kultur międzygatunkowych,
jak to ma miejsce w przypadku przeciwciał monoklonarnych, które są hybrydą limfocytów B i komórek szpiczaka gwarantującego hybrydzie nieśmiertelność
ʚ Terapia genowao Biała: przemysłowa
ʚ Wykorzystanie komórki jako fabryki (np. do produkcji etanolu)ʚ Każda biotechnologia może przekształcić się w biała -> rozwój= więcej miejsc pracyʚ Zastąpienie starych procesów nowymi
o Szara: ochrona środowiskaʚ Kontrola mikroorganizmówʚ Oczyszczanie gleb i lasówʚ Ulepszenie wegetacji
o Niebieska: biotechnologia morzaʚ Palauamina- związek izolowany z gąbek, właściwości przeciwzapalne i przeciwbóloweʚ Źródło biowodoruʚ Nanotechnologiaʚ Pozyskiwanie etanolu
o Fiolet: patenty, prawo etyka i filozofiaʚ Przepisy prawne, aspekty społeczne i prawneʚ Własność intelektualna
o Żółta: żywienie i paszao Brązowa: pustynie i obszary suszyo Złota: komputery i biochipyo Ciemna: bioterroryzm, broń biolgiczna
2. Przykłady zamiany starych procesów nowymi w myśl ekonomii atomowej.
Ekonomia atomowa- zastępowanie starych procesów nowymi.
Produkcja fenolu
Aceton można łatwo wykorzystać do innych celów lub odparować z mieszaniny reakcyjnej
Fenol stosowany jest do produkcji tworzyw sztucznych, farb materiałów wybuchowych, wodny roztwór fenolu- karbon do dezynfekcji pomieszczeń
Produkcja ibuprofenu
1. NIE: AlCl3 -> nie można odzyskać, Al(OH)3- generowany jako cząsteczka ciała stałego, zanieczyszczenie= dodatkowe etapy oczyszczania, ekonomia procesowa: 40%
2. TAK: brak AlCl3; kwas hydrofluorowy stosujemy w małej ilości jako związek katalityczny; nie ma generowanych dużych substancji odpadowych, zysk energii, niższy koszt, wyższa ekonomia atomowa
Produkcja witaminy B3
1. NIE: 2-metano-5-etopiryna nie jest przyjaznym związkiem, powstaje wiele produktów ubocznych -> krystalizacja, większe: koszty, dłuższy czas produkcji
2. TAK: wykorzystanie bakterii -> Enzym: hydrataza nitrylowa; biokatalizator; produkt w postaci białego osadu, ekonomia atomowa= 100%. Cyjanopirydyna wymieszana z immobilizowanym biokatalizatorem w buforze po dekoloryzacji bimasa jest usuwana a biały osad to nikotynamid
3. Zdefiniuj pojęcia biodegradacja, biotransformacja
Biodegradacja (gr. bios - życie, łac. degradatio - obniżenie) to biochemiczny rozkład związków organicznych na związki proste, dokonywany za pośrednictwem organizmów żywych, m.in. bakterii, pierwotniaków, promieniowców, grzybów i glonów. Mechanizm tego procesu jest bardzo złożony i obejmuje wiele reakcji o charakterze chemiczno-biologicznym. Jest to fermentacja w warunkach tlenowych. Wykorzystuje się całe komórki, w procesie bierze udział wiele enzymów. W wyniku czego otrzymuje się różne produkty w różnych ilościach.
Czynniki wpływające na szybkość biodegradacji:
Biotransformacja- optymalizacja procesu, aby powstawało jak najwięcej produktów, przy jak najmniejszym powstawaniu produktów ubocznych. Wykorzystywane są pojedyncze enzymy. Cały proces przebiega z większą wydajnością. Po przez kierowanie procesem (wykorzystanie konkretnego enzymu, wcześniej wyizolowanego) otrzymujemy pożądane produkty.
4. Detoksykacja ksenobiotyków: przemiany I fazy (typy reakcji, enzymy), reakcje II fazy (typy przemian).
Procesy metabolizmu ksenobiotyków (biotransformacji) przebiegają w trzech etapach. Jedną z głównych funkcji tych procesów jest tworzenie bardziej polarnych i dzięki temu łatwiej rozpuszczalnych w wodzie pochodnych, które szybciej mogą ulec wydaleniu z organizmu. Procesy pierwszej fazy są to głównie przemiany oksydacyjne, mające na celu wprowadzenie lub odsłonięcie grupy polarnej – głównie hydroksylowej. W fazie drugiej, zwaną również fazą biosyntezy lub sprzęgania - następuje dołączenie do metabolitu pierwotnego zaktywowanej metabolicznie cząsteczki związku endogennego (np. kwasu glukuronowego lub aminokwasu), dzięki czemu powstaje łatwo rozpuszczalny w wodzie koniugat.
Główne enzymy I fazy biotransformacji:
Cytochrom P450 Monoksygenazy flawinowe Oksydazy monoaminowe Esterazy Amidazy Hydrolazy Reduktazy, hydrolazy, oksydazy
Reakcje sprzęgania zachodzące w II fazie biotransformacji katalizują głównie enzymy klasy transferaz, a metabolitami, które biorą udział w tych reakcjach są aminokwasy, glutation, oraz aktywowane kwasy tj: octowy, siarkowy i przede wszystkim glukuronowy. Produkty sprzęgania są zazwyczaj kwasami organicznymi, które w warunkach fizjologicznych występują w formie zjonizowanej i łatwo ulegają wydaleniu z moczem lub żółcią.
5. Cytochrom P-450, mechanizm działania, funkcja,
Cytochromy P450 katalizują przede wszystkim reakcje hydroksylacji, epoksydacji, dealkilacji, oksydacyjnej deaminacji i aromatyzacji. Są one zdolne do utleniania ogromnej liczby związków chemicznych o bardzo zróżnicowanej budowie, zarówno endo i egzogennych, biorąc udział w ich metabolizmie. Podstawowa funkcja cytochromów to detoksykacja licznych ksenobiotyków, w tym również wielu leków oraz hydroksylacja hormonów sterydowych, kwasów tłuszczowych i eikozanoidów. Ponadto cytochromy P450 biorą udział w aktywacji metabolicznej ksenobiotyków (enzym z układem hemowym), czego skutkiem może być powstawanie związków toksycznych lub mutagennych. Wyróżniamy system mikrosomalny, i pozamikrosomalny.
6. Przemiany paracetamolu w organizmie ssaków
Podany doustnie dobrze, szybko i prawie całkowicie wchłania się z przewodu pokarmowego. Maksymalne stężenie we krwi osiąga po około 30–60 minutach. Dawka toksyczna wynosi 150 mg/kg masy ciała. Jako odtrutkę stosuje się n-acetylocysteina. W około 25% wiąże się z białkami osocza, przy czym zwiększa się ono w miarę zwiększania dawki. Przenika do płynów ustrojowych i narządów wewnętrznych. Jest metabolizowany w wątrobie, wywołuje tam indukcję enzymów mikrosomalnych. Wydalany jest z moczem głównie w postaci glukuronianów i siarczanów oraz po sprzężeniu z cysteiną i kwasem merkapturowym, a także produktów utleniania. Mniej niż 5% opuszcza organizm w postaci niezmienionej. W przypadku zaburzonej funkcji nerek dochodzi do kumulowania się sprzężonych metabolitów. W literaturze pojawiają się doniesienia o genetycznie uwarunkowanych indywidualnych różnicach w szybkości metabolizowania paracetamolu u ludzi, które
związane są z indywidualnymi różnicami w aktywności cytochromu P450, szybkości sprzęgania do glukuronianów i siarczanów, dostępności glutationu oraz zdolnościach regeneracyjnych. Najgorszą ścieżką przemiany paracetamolu zachodzi z użyciem enzymów z grupy cytochromów, czego skutkiem jest śmierć komórek wątroby
7. Monooksygenazy flawinowe, mechanizm działania, metabolizm toluenu i nikotyny
Monooksyreduktazy flawinowe (FMO). Dinukleotyd flawinoadeninowy (FAD – forma utleniona, FADH2 – forma zredukowana) – organiczny związek chemiczny złożony z mononukleotydu flawinowego (FMN) (pochodnej ryboflawiny) i adenozynomonofosforanu (AMP). Koenzym oksydoreduktaz pełniący funkcję przenośnika elektronów i protonów (kationów wodorowych). Przenosi dwa protony i dwa elektrony, w efekcie czego utleniona forma FAD przechodzi odwracalnie w formę zredukowaną FADH2.
FADH 2O2→
(flawinhydroperoxide )→substrate−OH
→→H2O
→
Enzymy używające NADH2 jako koenzym wykorzystują go do aktywacji cząsteczki tlenu. Rakcja zachodzi w wodzie, powstaje w pełni aktywowany enzym.
Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH – forma zredukowana, NAD+ – forma utleniona) – organiczny związek chemiczny, nukleotyd pełniący istotną rolę w procesach oddychania komórkowego. Różne pochodne tego związku są akceptorami elektronów i protonów w procesach utleniania komórkowego. Pełnią też rolę koenzymów oksydoreduktaz.
Dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy występuje w organizmach żywych w postaci jonów (NAD+ i NADP+) oraz w formie zredukowanej (NADH i NADPH).
Metabolizm toulenu. Toluen w niskich stężeniach jest stymulantem procesów w wysokich neurotoksyną.
Metabolizm nikotyny. Jest to hydrotoksyna wydalana wraz z moczem, usuwana przez błony jelita grubego. W niskim stężeniu jest stymulantem metabolizmu w wysokich stężeniach neurotoksyna. Nie ulega dalszym przemianom, możliwa ponowna transformacja do nikotyny.
8. II faza biotransformacji- przykłady
Główne enzymy II fazy biotransformacji:
Transferaza glukurynowa Sulfotransferaza S-transferaza glutationowa Metylaza
Przykłady:
Glukuronylacja- sprzęganie z resztą kwasu α-D-glukoronowym. Przenośnikiem jest UTP. Warunkiem koniecznym do zajścia reakcji jest obecność grupy aminowej lub hydrokrylowej, żeby cząsteczka miała się gdzie dołączyć. Np. Transformacja nikotyny z użyciem cytochromu P450 i dołączenie kwasu α-D-glukoronowego
Sprzęganie z glutationem. Grupą aktywną jest grupa tiolowa. Związkie te mogą potem ulegać dalszym przekształceniom (zawracanie i wydalanie z organizmu lub dalsze przekształcanie). Przekształcenie ma na celu wydajniejsze usunięcie z organizmu.
Sprzęganie z aminokwasami. Aktywacja związku w celu związania z aminokwasami. Następnie usunięcie związku z organizmu.
Sprzęganie z kwasem siarkowym. Mogą powstawać substancje rakotwórcze lub mutagenne. Powstające związki sulfonowe są bardzo reaktywne.
Hydroliza hydantoiny (8 dni) Karbanimian (24h) tert-Leucyna
Metylacja. Obniża rozpuszczalność w wodzie i opużnia wydalanie z organizmu. Ochrona grup funkcyjnych przed koniugacją. Typy: O-metylacja, N-metylacja, S-metylacja
9. Produkcja aminokwasów- enancjomery tert-leucyny,
Metody otrzymywania: ekstrakcja z hydrolizatów białkowych, synteza chemiczna. Fermentacja- kwas glutaminowy, kataliza enzymatyczna. Otrzymywanie aminokwasów metodami biotechnologicznymi: produktywna animacja ketonu (enzym dehydrogenaza), transaminacja (aminotransferaza); 2 substraty biorca( Asp, Glu) i dawca, droga rozdziałów mieszanin racemicznych (hydrolaza jednego z enancjomerów), zazstosowanie liaz- dodanie NH3
Tert-leucyna nie jest aminokwasem biogennym, ma szerokie zastosowanie (leki). Wyróżniamy enancjomery S i R, każdy z nich ma szerokie zastosowanie.
10. Zastosowania hydantoinaz
Produkcja czystych optycznie aminokwasów. Cały proces zachodzi z wykorzystaniem mikroorganizmów np. E. coli. Metoda hydantoinazowa jest syntezą enzymatyczną polegającą na rozkładzie racemicznej substancji wyjściowej metodą enzymatycznej hydrolizy. Substratami do reakcji są D,L-5-monopodstawione pochodne hydantoiny. Synteza aminokwasów przebiega w dwóch etapach. W pierwszym etapie następuje enzymatyczne rozszczepienie pierścienia jednego z enancjomerów 5-monopodstawionej pochodnej hydantoiny w wyniku działania hydantoinazy (3.5.2.2. EC). Otrzymany związek pośredni to L lub D-N-karbamyloaminokwas, który w kolejnym etapie w procesie dekarbamylacji zostaje przekształcony w odpowiedni L- lub D-aminokwas
11. Reduktywna aminacja (Degussa)- metoda otrzymywania czystych optycznie aminokwasów
Metodą tą uzyskuje się leki przeciwwirusowe, przeciwzapalne. Zapewnia wysoką czystość chemiczną powstałych aminokwasów. W procesie wymagane są koenzymy, które z powodu swojej wysokiej ceny są regenerowane. Jest to standardowa reakcja dla dehydrogenaz. Wykorzystujemy immobilizacje enzymów. Glikol polietylenowy zapewnia zwiększenie masy koenzymów (NAD+NADH+ H+). Reakcja jest prowadzona w reaktorze membranowym.
12. Synteza L-cysteiny
Aminokwas endogenny. Bierze udział w syntezie związków siarkowych, metabolizmie metabolitów II rzędu, odpowiada za detoksykacje. Grupy tiolowe biorą udział w tworzeniu prawidłowej konformacji białek. Zastosowanie: składnik ACC (acetylocysteina), kosmetologia (kręcenie włosów), przemysł spożywczy ( usuwanie glutenu).
Synteza L- cysteiny metodą Ajinomoto. Izolowana z białek keratynowych- duża ilość używanego HCl- dodatkowe produkty, duża ilość odpadów- metoda często nie akceptowana przez społeczeństwa ATC syntezowany w postaci racemicznej, wykorzystywane są zmutowane komórki Pseudomonas.
Synteza L- cysteiny metodą Wackera- metoda farmaceutyczna. Redukcja używanego HCl z 27 kg do 1kg/kg cysteiny. Wydajność metody 90%. Wyłączenie białka regulatorowego w komórkach E. coli- nadprodukcja krystalicznej cystyny. Następnie redukcja cystyny do cysteiny. Wykorzystujemy tu bioinżynierie nie GMO.
13. Metody otrzymywania L-karnityny
Karnityna (β-hydroksy-γ-trimetyloaminomaślan). Metabolizm lipidów- transporter długołańcuchowych kwasów tłuszczowych do mitochondriów komórkowych. Zapewnienie odpowiedniej relacji acetylo-CoA do CoA w cytosylu oraz aktywność antyoksydacyjną. Acetylo- karnityna jest donorem grup acetylowych niezbędnych do syntezy acetylocholiny ważnego neuroprzekaźnika- regeneracja mięśni po intensywnym treningu
Metody otrzymywania:
Asymetryczna synteza chemiczna ( tanie substraty: epichlorydyna, trimetyloamina)- powstaje racemat Ekstrakcja z naturalnych źródeł (mięso)- możliwe skażenia Biotransformacja achiralnych prekursorów Fermentacja
Wybór mikroorganizmów:
Produkcja po przez szlak β-oksydacji kwasów tłuszczowych, wyłączenie dehydrogenazy karnityny. Agrobacterium Rhizobium- izolat glebowy: produkt około 80g/l, wydajność 99%, produktywność 5g/l/h
L- karnityna produkowana przez Lonza. Cały proces prosty w wykonaniu, wykrzystuje 4 enzymy.
Etapy procesu:
Stymulacja komórek Separacja komórek Elektrodializa Wykorzystanie węgla
aktywnego suszenie klarowanego płynu rekrystalizacja powstanie L-karnityny
14. Otrzymywanie aspartamu
Aspartam (E 951): słodzik (200x słodszy od sacharozy), trawiony do Asp, Phe i metalonu ( trucizna dla organizmu, skutki uboczne nadużycia aspartamu). Produkowany w ilości około 14-15tyś ton (2013 rok). Inne izomery mają bardzo gorzki smak. Słodką formą jest forma L.
Synteza chemiczna- skomplikowana, trudna, żmudna, wykorzystuje szkodliwe związki. Proces mało wydajny 50%
Proces chemoenzymatyczny
Prosty proces przebiegający w miarę szybko. Wykorzystujemy racemiczną postać alaniny. Użycie enzymu termoaktywnego (termolizyny) zapewnia regioselektywnośc i stereoselektywność reakcji. Termolizyna- wyizolowana z Bacillus thermoproteoluticus. Wymaga do wydajniejszej aktywności i aktywacji jonów wapnia (optymalne warunki reakcji: pH 8.0, temp około 80 oC)
15. Metody otrzymywania środków zapachowych
Produkcja aromatów to około ¼ światowej produkcji. Te pochodzenia naturalnego można wydobyć metodą ekstrakcji lub izolując prekursory. Substraty mogą być syntezowane de novo przez mikroorganizmy.
Metody otrzymywania:
Mikroorganizmy- biotransformacje in situ, ścieżki metaboliczne Komórki roślinne- hodowle komórkowe np. kalus, korzenie. Po dodaniu prekursorów otrzymujemy aromaty.
Cały proces jest bardzo trudny i mało opłacalny Enzymy: rozdział mieszanin racemicznych, wykorzystuje się immobilizowane lipay i prteazy (specyficzność
enzymatyczna), różne medium ( estryfikacja w środowisku organicznym powoduje wzrost kosztów metody)
Biokonwersja:
Kwas felurowy Pycoporius cinnabarius Wanilia
Tryptofan Pseudomonas sp. Indole
Cukierdrożdżepochodne furanowe/ piranowe
Np. Laktony- cykliczne estry γ i δ hydroksykwasów. Zapach: brzoskwiń, śmietanki, owoców, miodu, orzechów, kokosa. Otrzymywanie: metodami fermentacyjnymi ( drożdże) lub syntezy chemicznej. Aromat brzoskwiniowy- substrat kwas tłuszczowy, transformowany do laktonu, otrzymujemy mieszaninę racemiczną: enancjomer R (brzoskwinia) i S (mango). Wydajność około 11g/55h
16. Biotechnologiczne otrzymywanie mentolu
Terpeny- naturalne aromaty – drzewa szpilkowe, eukaliptus, owoce cytrusowe- ochrona przed zjedzeniem, insektami. Wiele etapów izolacji, wiele dróg do otrzymania mentolu, wiele izomerów podczas nasycania związku. Właściwości zapachowe enancjomerów wybranych związków terpenowych: mentol „-” zapach mięty, mentol „+”
zapach fenolowy, karwan „R” zapach mięty, karwan „S” zapach kminku
17. Aromaty identyczne z naturalnymi- definicja
Metabolity charakterystyczne dla roślin produkowane przez mikroorganizmy ( przy udziale mikroorganizmów). ( notatka wykład)
W aromacie "identycznym z naturalnym" nie ma związków chemicznych, których normalnie nie spożywa się jedząc różne owoce, warzywa, przyprawy, produkty mleczne i zbożowe. Stężenie i proporcje tych związków mogą być jednak znacząco różne od tych występujących oryginalnie w produkcie naturalnym, którego smak jest "udawany" przez daną kompozycję smakową. Związki użyte do uzyskania wrażenia smakowo-zapachowego mogą przy takim jego opisie być otrzymywane przez wyodrębnianie z produktów naturalnych jak i być syntezowane sztucznie. Struktura chemiczna tych wyprodukowanych sztucznie jest jednak identyczna ze związkami obecnymi w jakichś produktach naturalnych. Końcowa kompozycja nie ma jednak zwykle identycznego składu jak smak który "udaje" - jej zadaniem jest tylko wywołanie podobnego wrażenia z użyciem jak najmniejszej liczby jak najtańszych w produkcji związków chemicznych, występujących naturalnie. ( wiki)
18. Metody otrzymywania waniliny-
Wnilina- 4-hydroksy-3-metoksybenzaldehyd. Naturalny aromat wanilii otrzymujemy z rośliny pnącej- rodzaj storczyka ( Vanilla planifolia, Vanilla tahiterisis, Vanilla pompona). Na zapach wanilli składa się kilka związków (wanilina, piperonel).
Metody otrzymywania:
Biotransformacja liquin: utlenianie, depolimeryzacja liquin- peroksydaza liquinowa, peroksydaza manganowa, lakaza. Substratami są alkohol konifenyloy, alkohol synapinowy, alkohol kumarylowy. Niska wydajność procesu.
Biotransformacja kwasu fenolowego: kwas fenolowy- pochodna kwasu cynamonowego, uwalniany z liquin enzymatycznie (esteraza fenylowa, hydrolaza estrów cynamonowych)
A- Początkowa dekarboksylaza
B- Redukcja pochodnejC- Redukcja kwasu
ferulowego (konieczna regeneracja koenzymów)
D- Niekoniecznie
atrakcyjny produkt
Kwas ferulowy:
A-niezależna od CoA deacetylacja
B- zależna od CoA deacetylacja
Biotransformacja kwasu ferulowego. Otręby kukurydziane auroklawowane: Aspergillus niger (esteraza fenolowa, 1 etap), 3 dniowa kultura Pseudomonas cinnabrius (2 etap)
Biotransformacje
kwasu wanilinowego: reduktaza kwasów karboksylowych, mikroorganizmy: Aspergillus fumigatus, Micromucor isabellinus, Zygorhynchus moelleri, P. cinnnabarius. Kwas wanilinowy w odróżnieniu od waniliny może być akumulowany
Biotransformacje equendu i izoequendu: składnik olejkó eterycznych z drzewa goździkowego, tani substrat, mikroorganizmy: Corynebacterium, Pseudomonas
Biotransformacje aminokwasów aromatycznych: mikroorganizm: Proteus vulgaris. L- Phe materiał startowy do syntezy flawonoidów, kumaryny, stillbenów i luquin u roślin. B- proces chemoenzymatyczny.
Produkcja walininy de novo: mutant E.coli powoduje nadprodukcje związków aromatycznych (Trp), konwersja glukozy w kwas wanilinowy, odzyskiwani=y i redukowany do waniliny- dehydrogenaza aldehydu anylowego z Neurospora crassa.
19. Keton malinowy-otrzymywanie
Izolacja z naturalnego źródła- 3,7mg/kg (bardzo mało)- rododendrony, brzoza, klon.
20.
20. Synteza Lipitoru- wybrana metoda
Metoda Daicel’s Route: wykorzystujemy enzymy takie jak: dehydrogenazę mrówczanową i reduktazę karbonylową. Regeneracja koenzymu. Wysoka czyśtość optyczna produktu 99%, wydajność 50g/L. Łatwo wydzielić produkt po syntezie. W tej metodzie nie ma akumulacji kwasu glukoronowego. Reakcja przeprowadzana jest w zrekombinowanych komórkach E. coli.
Lipitor obniża stężenie LDL – złego cholesterolu we krwi, dzięki czemu zapobiega miażdżycy, chorobom serca, udarom mózgu, które u mężczyzn mogą stać się czynnikiem ryzyka impotencji.
21. Ryboflawina-synteza
Ryboflawina- witamina B2: dodatek do żywności, odpowiada za przemianę materii, produkcję przeciwciał i płytek krwi, w żywności oznaczana jako E101- nadaje żółty kolor. Jest prekursorem koenzymów flawinowym FAD i FMN. Synteza ryboflawiny: fermentacyjno- chemiczna (wyparła chemiczną). W zależności jaka firma ją produkuje taki wykorzystuje mikroorganizm, proces polega na przemianie glukozy- wieloetapowa reakcja (kilka mikroorganizmów) z duża ilością odpadów. np. modyfikowane grzyby: Ashya gossypii (wydajność 10g/L) – prostsza metoda, reakcja selektywna, trudnym etapem jest deglikolizacja enfumafunginy. Usunięciu reszty cukrowej towarzyszy hydroliza. Biosynteza prowadzona przez te grzyby stanowi około 30% całej produkcji tej witaminy. Substratami są D- ryboza i 3,4- dimetyloamina.
22. Zalety i wady biokatalizy- dobór biokatalizatora
Zalety biokatalizy:
Selektywność- enancjo-, regio- i chemoselektywność Kataliza w łagodnych warunkach temperaturowych (25-100oC), ciśnienia (1atm.), pH (4.0-8.0), co w
porównaniu z klasycznymi procesami chemicznymi, powoduje stosunkowo nieduże zużycie energii Możliwość prowadzenia reakcji w trudnych lub niemożliwych do przeprowadzenia metodami chemicznymi
Biokataliza dla
redukcji
komórki roślinne lub zwirzęce
mikroorganizmy: drożdże, grzyby
immobilizowe enzymy:
dehydrogenazy (trzeba
regenrować)
Kataliza może przebiegać w środowisku wodnym i rozpuszczalnikach organicznych i na granicach faz ciecz/ciecz i ciecz/gaz
Otrzymywanie katalizatora jest stosunkowo proste
Wady biokatalizatora:
Zwiększenie skali reakcji- trudności z wydzieleniem produktu z roztworów o jego niskich stężeniach Duże objętości w których prowadzona jest reakcja- niskie stężenie substratów, a tym samym i produktów Niska wydajność procesów wynikająca z niskiego stężenia substratu Wysoka cena biokatalizatorów Niemożliwość ( a przynajmniej trudność) zatrzymania reakcji (w przypadku mikroorganizmów) na
określonym etapie
Enzymy:- są dostępne handlowo- niepotrzebne jest jakiekolwiek doświadczenie- zdefiniowany przebieg reakcji-niska wydajność procesu wynikająca z niskiego stężenia substratu- konieczna regeneracja kofaktorów lub straty kofaktora w trakcie reakcji- niska stabilność enzymu- wiele substancji ma niska wydajność w wodzie- zmiana aktywności enzymu przy zmianie rozpuszczalnika
Całe komórki:- tanie i łatwe do hodowania- potrzebne pewne doświadczenie mikrobiologiczne-niepotrzebna regeneracja kofaktorów- niska wydajność procesów wynikająca z niskiego stężenia substratów- produkt i substrat mogą być toksyczne dla biokatalizatora- możliwa inhibicja procesu przez produkt lub substrat- reakcja nie musi się zatrzymać i mogą powstać inne produkty- niska rozpuszczalność substratu hamuje reakcji
23.
23. Metody selekcji biokatalizatora
Selekcja biokatalizatora:
Izolacja z gleb charakterystycznych Przegląd kolekcji mikroorganizmów Przeszukiwanie baz danych Screeing in silico
Skryning mikroorganizmów- techniki oksyreduktazą. Dehydrogenazy- usunięcie i transfer protonów z cząsteczki substratu. Zależnoe od NAD(P)+, NAD(P)H
Skryning mikroorganizmów- techniki oksydoreduktazy. Oksydazy- usunięcie wodoru z substratem i przeniesienie na tlen. Powstaje woda i nadtlenek wodoru.
24. Metody detekcji aktywności enzymatycznej: oksydoreduktazy, lipazy
Oksydoreduktazy- cytochromy P450, reakcje hydroksylacji, ale też epoksydacji.
Utleniany FADH2 jest utleniony przez tlen z wytworzeniem nadtlenku wodoru
Oksydoreduktazy- utlenienie nierozgałęzionych węglowodorów
Oksygenazy- dioksygenaza bifenylowa- degradacja polichlorowanych bifenyli
Alkohol ulega utlenieniu, powstaje nadtlenek wodoru, 4-Cl- naftal zostaje utleniuony do barwnego produktu z udziałem peroksydazy chrzanowej
Inne przykłady:
Skryning mikroorganizmów- lipazy:
Hodowla na podłożu spirit- blue Izolacja nowych mikroorganizmów Lipazy są najpopularniejsze w procesach biotransformacji Bardzo odporne na warunki środowiskowe Nie wymagają koenzymów Hydroliza tłuszczy- zmiana pH
Test aktywności hydrolitycznej- substratem pochodna p-nitrofenolu: lipazy bardziej tolerują dłuższe cząsteczki, wybieramy substrat optymalny dla danego typu cząsteczki
Test pośredni: badanie aktywności esteraz, powstawanie pochodnych diazowych, wyliczanie aktywności badanego enzymu.
Techniki skryningu: pobór komórek z hodowli bulionowych- wychodzimy ze stałej liczby komórek, komórki zamraża się w glicerolu- spowolnienie wzrostu, komórki umieszczone są na płytkach- całe płytki traktujemy daną substancją następnie oceniamy wyniki
25. Źródła nowych enzymów
Obecnie wiele wysiłków poczyniono w kierunku badań przesiewowych odkrywających nowe źródła enzymów pochodzących z ekstremofili. Równoległy rozwój zaawansowanych narzędzi biologii molekularnej umożliwiła również projektowanie i modyfikowanie właściwości enzymów za pomocą technik mutagenezy, tasowania genów, ukierunkowanego rozwoju, zmian chemicznych i immobilizacji. Enzymy ekstremofili wykonują te same funkcje enzymatyczne, jak enzymy mezofili, lecz w warunkach, które hamują lub denaturują ich odpowiedniki występujące u mikroorganizmów mezofilnych. Co ciekawe niektóre z enzymów pochodzących z ekstremofili wykazują tzw. poliekstremofilność, czyli stabilność i aktywność w więcej niż jednym ze skrajnych warunków, np. wysokim stężeniu soli, zasadowym pH, niskiej temperaturze i niewodnym otoczeniu (Pyrolobus fumarii- przeżywa aż w 113 oC, Halococus- przeżywa w bardzo zasadowych roztworach, Picrophilus torridus- żyje w pH 0,7 i w 60oC, Derhococcus radioduraus- żyje na odpadach radioaktywnych).
Nowych enzymów poszukuje się również pośród organizmów morskich, ponieważ wiele z tych organizmów jest odpornych na wysokie ciśnienia.
Obecnie wykorzystuje się również enzymy pochodzenia zwierzęcego tzw proszki acetonowe z wątroby-bogate w esterazy, lipazy i hydrolazy, pobierane tylko i wyłącznie ze zwiarząt przeznaczonych na rzeź ( względy etyczne).
26. Zastosowanie komórek roślinnych w biokatalizie
Reakcje redukcji przebiegające z użyciem komórek roślinnych cechują się wysoką stereoselektywnością. Najczęścien wykorzystywanymi roślinami są: marchewki, ogórki, cebule, bataty, jabłka. Związek taki jak np. acetofenon można transformować za pomocą ziemniaków, jabłek lub marchwi. Ekspozycja rośliny na światło wpływa na aktywność jej enzymów, jest to spowodowane fazą jasną i ciemną podczas fotosyntezy. Tkanki roślinne w świetle wymagają dużo CO2 a nocą glukozy. Wybór jak i warunki reakcji mają wypływ na selektywność.
Dodatek nowej grupy chemicznej może mieć wpływ na produkt końcowy np. dodanie grupy azotowej w celu pierścienizacji związaku.
Aby zapobiec zakażeniom bakteryjnym stosuje się dodatki antybiotyków, jednak osiągamy przez to niższa wydajność. W zależności jakiej rośliny używamy możemy uzyskać różny związek.
Korzenie włośnikowe (rzepak, sztuczne hodowle) powstają jak roślina jest zakażona przez mikroorganizmy, właczony jest plazmid. Czego efektem jest nadmiernie rozbudowany system korzeniowy- transformacja naturalna. Zjawisko to wykorzystuje się do reakcji redukcji. Aby uzyskać lepszą wydajność enzymatyczną procesu często najpierw modyfikuje się roślinę- transformacja laboratryjna. Plazmid może być wektorem, do którego wbudowujemy co chcemy- konkretne białko. Cały proces musi być regulowany hormonalnie. Jest to droga metoda zależna od fitohormonów. Producenci sprzedają już zmodyfikowane nasiona roślin.
27. Charakterystyka drożdży piekarskich jako katalizatora.
Super katalizator- drożdże piekarskie
o Źródło wielu enzymówo Duża tolerancja substratowao Dobrze poznana genetykao Możliwość stosowania w różnych układacho Możliwość modyfikacjio Możliwość kontrolowania stereochemiio Tania hodowla
Procedura:
Śledzenie postępu reakcji:
NMR Dodanie chininy ( inaczej się wiąże do alkoholi R a inaczej do S alkoholi) Pole pod pikiem- nadmiar izomeru
Drożdże są źródłem wielu enzymów, bogate w reduktazy. Dzięki temu możemy trzymać wiele czystych optycznie enancjomerów. Namnożenie enzymów zachodzi w komórkach E. coli.
Mamy wiele rodzajów drożdży= wiele możliwych produktów Substrat może podlegać różnym modyfikacjom. Przemiany następują w ścisłym uporządkowaniu jedna po drugiej.
28. Sposoby sterowania stereoselektywnością reakcji: dobór biokatalizatora, stosowanie odpowiednich dodatków, preinkubacja , modyfikacja biokatalizatora (przykłady)
Preinkubacja biokatalizatora
o Hodowla w warunkach beztlenowycho Stosowanie podwyższonej temperaturyo Stosowanie soli nieorganicznych
Jony metali mogą być inhibitorami/ aktywatorami enzymów.
Drożdże piekarskie zmiana warunków reakcji. W zależności od warunków prowadzenie reakcji możemy otrzymać różne produkty o różnej czystości i wydajności.
Związki chemiczne modyfikujące aktywność enzymatyczną
o Inhibitory enzymówo Związki wykorzystywane do regeneracji koenzymów
Związki hamujące aktywność dehydrogenaz:
Bromek allilu Alkohol allilowy Chlorooctan etylu Keton metylowinylowy Keton metyloizopropylowy
Związki służące regeneracji koenzymów:
Etanol Izopropanol Cyklopropanol Aceton
Związek, który użyjemy zależy od tego czy mamy utleniony czy zredukowany kofaktor.
Zmiana warunków reakcji
o Proszek acetonowy z komórek (APGA) powstaje enancjomer S o wysokiej wydajności. Dodaje się dodatkowy związek np. cyklopentanol
Drożdże piekarskie- zmiana warunków reakcji- różne dodatki. W efekcie uzyskujemy różną wydajność i czystość optyczną.
Wpływ na wydajność i stereoselektywność
Drożdże piekarskie- regeneracja koenzymów
o Enzym skojarzony- działa jako główny i pomocnyo Np. ADH (modyfikowany genetycznie)o Regenerowanie przez enzymy pomocniczeo Wykorzystanie acetonu
Modyfikacje biokatalizatora
o Immobilizacjeo Preimmobilizacja ( dotyczy
komórek) np. z wykorzystaniem Tween 20 polietylenoimina zmiana błon komórkowychprowadzimy z wyczuciem żeby nie doszło do lizy
Drożdże piekarskie- zmiana warunków reakcji. Zmiana pH w procesie może mieć znaczący wpływ na otrzymane produkty końcowe- na ich czystość optyczną
29. Grzyby jako biokatalizatory- zastosowania
Używa się szczepów:
O znanych pożądanych właściwościach- tu o dużych potencjale utleniających Fizjologicznie przystosowanych do transformowania związków Łatwych do hodowania i manipulacji Colletorichum to grzyby patogenne roślin jedne z najgroźniejszych patogenów (szczególnie truskawek)
Transformacja fernezolu przez Glomerella cingulata; środek zapachowy-zapach konwaliowy. Grzyb wyizolowany z zepsutych części jabłka.
Zastosowanie drożdży i grzybów jako biokatalizatorów w syntezie chiralnych fosfonianów. Chiralne fosfoniany - związki zawierające stabilne wiązanie P-C, znalazły zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym (czynniki antybakteryjne, przeciwwirusowe, neuromodulatory, inhibitory enzymów); w przemyśle rolniczym (herbicydy).
A. niger jest stosowany, od dziesiątek lat, do produkcji kwasu cytrynowego (w tym celu zaczął być wykorzystywany już w 1919 roku) i enzymów stosowanych w technologii żywności. Enzymy te od lat 60. ubiegłego wieku stosuje się w przetwórstwie owoców, piekarnictwie, hydrolizie skrobi oraz innych gałęziach przemysłu spożywczego.
Trichoderma reesei- Jest znany głównie z produkcji hemicelulaz, ksylanazy, a także najważniejszej - celulazy, której to preparat uzyskał status GRAS. Jest ona używana w przemysłach papierniczym, farmaceutycznym, paszowym oraz w technologii żywności, przeważnie w piekarnictwie, słodownictwie i gorzelnictwie.
30. Regeneracja koenzymów- sposoby (przykłady na każdy sposób)
Zastosowanie różnych układów do regeneracji enzymów:
Redukcja Kwasy nukleinowe Wykorzystanie aminokwasów ( dawca grupy aminowej)
+
Główny enzym pochodzi od Thermoanerobium spec Ściśle określona stereochemia Wysoka czystość optyczna produktu Regeneracja- redukcja enzymu Wykorzystanie hydrogenazy Reakcja nie wydziela produktów ubocznych
Regeneracja nieodwracalna- Niemożliwa jest recyklinacja
Regeneracja koenzymu- duża skala
Reakcja nie wydziela produktów ubocznych
Enzym skojarzony- działa jako główny i pomocniczy, np. ADH ( zmodygikowany genetycznie) Wykorzystanie acetonu
Fotochemiczna regeneracja koenzymu
o Poprzez wykorzystanie mechanizmów fotosyntezyo Fotosynteza nie cyklicznao Redukcja NADuo Z użyciem sinic- wrażliwe na zakażenia, długo rosną1. Elektrochemiczna regeneracja koenzymów
o Mało popularna metodao Wykorzystanie mediatora- reaguje z elektrodą i substratem
2. Regeneracja ATP31. Met
ody
otrzymywania związków czystych optycznie: poddział, przykłady
A i endA- są to dwa enancjomery , B i endB sa to dwa produkty enancjomery A—> B przekształcenie enancjomeru A w enancjomer B o tej samej konfiguracji, Drugi enecjomer reaguje wolno- w obserwacji w ogole tego nie zauważamy. Reakcja desymetryzacji prochiralnego/ meso związku- substraty symetryczne, powstanie jednego produktuMeso związki- związek, który ma dwa centa stereochemiczne skonfigurowane w ten sam sposób. Symetryczna cząsteczka. Dynamiczny rozdział kinetyczny (DKR)- rozdział mieszaniny racemicznej, procesy najbardziej rozwijane, w mieszaninie reaguje tylko jeden z enancjomerów i powoduje powstawanie produktu o tej samej konfiguracji, zmiejsza się ilośc enancjomeru- zaczyna dominować ten drugi, wprowadzamy czynnik racemizujący i nasz izomer, który nie był przekształcany jest przekształcany do tego izomeru, który jest przekształcany w produkt. Prowadzone jest kilka cykli racemizacyjnych. Metoda w celu uzyskania 100% wydajności.. Steroinwersja- w pierwszym etapie uzyskujemy związek prochiralny, dopiero w drugim etapie uzyskujemy związek chiralny. Np. mamy aminokwas-D ketokwas aminokwas-LJednoetapowa reakcja enancjokonwergentna- trudna, ciężko znaleźć katalizatory (2), jeden przekształaca A w B ( reakcja retencji) i end A w B ( inwersja)
Metody: Rozdział kinetyczny
Najczęściej stosowane esterazy, lipazy, acylazy, amidazy i proteazy. 50% stopień przereagowania. Najczęściej stosowana reakcja do rozdzielania mieszanin racemicznych. Reakcja acylowania, powstanie bardzo różniących się od siebie związków, łatwo je rozdzielić za pomocą chromatografii cieczowej. Droga acylowania amin, otrzymujemy dwa wartościowe produkty
Rozdział kinetyczny dwustopniowy typu retencja/ inwersja
Proces chemo-enzymatyczny. W pierwszym etapie bardzo dobrze widać retencję. Związek z pierwszego etapu ulega inwesji abyśmy otrzymali produkt będący pojedynczym enancjomerem. Drugi etap jest to reakcja chemiczna (hydroliza)
Rozdział dynamiczny kinetyczny (DKR)- deracemizacja
Reagującego enancjomeru- ubywa w trakcie trwania procesu. Prowadzimy konwesję, za pomocą katalizatora ( czynnika racemizującego). Wzrasta na wydajność procesu.
Czynniki racemizujące mogą być bardzo skomplikowane. Po kilku cyklach możemy uzyskać nawet wydajność 90%. To który enancjomer będzie reagował zależy od specyficznośći enzymu.
Deracemizacja- dwuetapowa retencja/ inwersja chemiczna
Jedno centrum stereogeniczne. Otwieranie pierścienia oksiranowego
Deracemizacja jednoetapowa- dwa centra stereogeniczne Deracemiz
acja
dwuetapowa bez czynnika racemizującego
1 etap to rozdział kinetyczny, następnie retencja, otrzymujemy prochiralny produkt, kolejnym etapem jest wzbogacnie dzięki czemu mamy wysoką wydajność. Nieprzereagowany substrat- retencja i wzbogacenie produktu
Desymetryzacja- przekształcenie cząsteczki symetrycznej
Substraty chiralne- formy meso inwersja konfiguracji jednego z centrów chiralności. Substaraty prochiralne. Możliwa do uzyskania 100% konwersja.
Asymetryczna synteza- reagują ze sobą dwa asymetryczne związki.