FAGLIG BAGGRUNDDet forudsættes, at den grundlæggende teori bag rekombinant protein ekspression og proteinopresning er bekendt. For dette henvises til undervisningsmateriale forfattet af Hans Chr. Jensen, Karen Helmig og Jakob Schiødt om aminosyrer og proteiner, der er tilgængeligt på emu (www.emu.dk/gym/fag/bt/inspiration/mat erialer-download/index.html). End-videre henvises til Biotech Academys undervisningsmateriale for gymnasierne omhandlende genteknologi (www.biotechacademy.dk/Testprojekter/testprojekter/genteknologi/teori/2biotekrute.aspx)

OPRENSNING AF PROTEINERBIOZYMER ØVELSE 2

2

FORMÅL OG BAGGRUND

Formålet med øvelsen er at oprense enzymet β-lactamase. Jeres udgangspunkt for denne oprensning er det cellebundfald, der er fremkommet, efter man har overudtrykt enzymet β-lactamase i Escherichia coli (E. coli) celler. Jeres opgave bliver at isolere β-lactamasen fra andre proteiner, som E. coli udtrykker.

FRA BAKTERIE TIL PROTEIN. Alle celler udtrykker proteiner. Hvilke proteiner, der udtrykkes, varierer fra celle til celle alt afhængigt af, hvad cellens funktion er. Mængderne, de udtrykkes i. vil også ændre sig alt efter, hvor meget der er behov for. For eksempel udtrykker røde blodlegemer primært hæmoglobin, mens nogle celler i maven primært udtrykker enzymer, der kan nedbryde forskellige kompo-nenter i den mad, vi spiser.

I industrielle og forskningsrelaterede sammenhænge kan det være nødvendigt at producere store mængder af et protein Faktaboks 1. Proteinerne kan enten oprenses fra naturlige kilder, såsom celler eller væsker, eller de kan oprenses fra celler, der er fremstillet til at kunne udtrykke store mængder af et protein. I disse tilfælde har man introduceret nye gener til organismen. Når man introducerer nye gener kaldes det at genmanipulere organismen, og selve det at udtrykke proteinerne kaldes rekombinant protein ekspression. Proteiner, der produceres på denne måde, kaldes også rekombinante proteiner. Bakterien E. coli bliver ofte brugt til produktion af rekombinante proteiner, da det er nemt at efterligne de vækstbetingelser som E. Coli foretrækker. Derudover er det er let at introducere nye gener i E. Coli ved hjælp af plasmider.

I denne øvelse skal I oprense enzymet β-lactamase. Jeres udgangspunkt for op-rensningen er et E. coli proteinbundfald. Hvorledes dette bundfald har fundet vej fra levende celle til jer kan ses på gelektroforesen i figur 1.

FAKTABOKS 1

DIABETES OG INSULINSygdommen diabetes skyldes, at kroppen ikke kan producere peptidhormonet insulin eller er blevet resistent overfor det. Insulin er med til at regulere blodsukkeret. Har man insulinresistens eller -mangel kan det medføre for højt blodsukker. Diabetes kan holdes i skak ved at tilføre kroppen insulin og derved holde et stabilt blodsukker.

Da insulin første gang kom på markedet som lægemiddel blev det udvundet fra okse-bugspytkirtler. Uheldigvis var der mange urenheder (andre proteiner og småmolekyler) i okse-insulin, der resulterede i, at patienterne udviklede allergi over for produktet. Derfor begyndte man i midten af 70’erne at isolere det fra svin, da dette gav et renere præparat og færre allergiske reaktioner.

I slut-80’erne kom det første humane (menneske) insulin på markedet. Dette insulin var ikke isoleret fra humane bug- spytkirtler, men derimod fra gærceller. Gærens DNA var blevet ændret til at kode for humant insulin. At udtrykke insuli-nen rekombinant i gærceller gjorde det muligt at isolere insulinen bedre fra andre proteiner og småmolekyler. Dermed fik man et renere og mere koncentreret produkt og patienterne fik færre allergiske reaktioner.

3

FORMÅL OG BAGGRUND

PROTEINOPRENSNINGEfter proteinet er blevet overudtrykt i bakteriecellen, skal det adskilles fra resten af bakteriens proteiner, membraner og organeller, dvs. proteinet skal isoleres. Når man taler om at isolere et protein, taler man som regel om at oprense det.

Den oprensningsmetode, der virker bedst på det enkelte protein, afhænger af hvilket protein man arbejder med – nogle proteiner kan oprenses på få dage, mens andre tager flere uger. Det protein, I skal arbejde med, er en β-lactamase, og det kan oprenses i løbet af kort tid. Nedenfor vil de oprensningstrin, I skal bruge, blive gennemgået.

SONIKERING OG CENTRIFUGERINGNår I modtager proteinet, befinder det sig i et bundfald. Foregående er cellerne groet op, og proteinet er blevet overudtrykt inde i cellerne. Herefter er cellerne blevet sonikeret tre gange og centrifugeret (se hhv. Faktaboks 1 og 2).

Den β-lactamase, I skal arbejde med, er ikke i opløsning, når cellerne ødelægges ved sonikering. Derimod folder de forkert og samler sig i en aggregeret form, der er så stor, at den er synlig i mikroskop. Disse aggregater kaldes inclusion bodies eller på dansk ’inklusionslegemer’. Når cellerne efterfølgende centrifugeres, vil β-lactamasen derfor være i bundfaldet. I bundfaldet vil der også findes membran-fragmenter, cellekerner og store organeller, såsom mitokondrier, lysosomer og peroxisomer. For at få β-lactamasen i opløsning kan man tilføje en høj koncen-tration af urea til sin opløsning, da det udfolder proteinet.

Figur 1: Gelektroforese, der viser oprensningen af β-lactamase. De blå bånd på gelen repræsenterer proteiner. LMW er en standard blanding af proteiner med kendt moleky-lestørrelse. Ud fra denne kan man omtrent bestemme stør-relsen af proteinerne i de andre baner. I banerne ”Før induk-tion” og ”Efter induktion” ses det, at et blåt bånd dukker op ved proteinets molekylevægt. I banerne ”Pellet 1-3” ses et klart, tykt blåt bånd, der svarer til β-lactamasens molekylvægt. Dette indikerer, at β-lactamasen er tilstede i disse fraktioner. De andre blå bånd repræsenterer de proteiner, I skal have fjernet fra opløsningen.

FAKTABOKS 2

SONIKERING OG CENTRIFUGERINGNår man har udtrykt sit protein i en organisme, bliver det på et tidspunkt nødvendigt at slå cel-lerne i stykker for at få proteinet ud, så man kan arbejde med det.Her kan man eksempelvis benytte sig af ultralyd, der er så kraftig, at det ryster cellens membran fra hinanden. Denne metode kaldes sonikering.Efter sonikeringen skiller man de større og faste fragmenter fra væsken ved at centrifugere sonikatet. Der er nu enten mulighed for, at proteinet er i opløsning, eller at det er aggregeret til inclusion bodies.

4

FORMÅL OG BAGGRUND

DIALYSEFor at opnå korrekt foldet β-lactamase efter man har bragt det i opløsning, er det nødvendigt at sænke koncentrationen af urea langsomt. Her benyttes en membran med porestørrelser (huller), der er nøje afstemt efter størrelsen på det protein, man arbejder med. Dette tillader ureaen at diffundere ud i den omgivne buffer, uden at koncentrationen af protein i opløsningen indeni membranen falder. Denne metode kaldes dialyse.

Under dialysen indstiller der sig en ligevægt for urea mellem den væske, der er udenfor og indeni dialyseposen, således at koncentrationen er lige så stor inden i dialyseslangen som uden for dialyseslangen. Derfor er det vigtigt, at volumi-net udenfor slangerne er meget større end voluminet inden i poserne, hvor pro-teinet befinder sig. På den måde bliver koncentrationen af urea meget mindre. Koncentrationen af protein indeni slangen falder ikke, da porerne ikke er store nok til, at β- lactamasen kan komme ud af dialyseposen. Alle mindre moleky-ler, såsom små proteiner og urea- og vandmolekylerne, vil kunne diffundere frit, mens β-lactamasen bliver tilbageholdt i dialyseslangen.

Når ureaen langsomt diffunderer ud, og koncentrationen falder, vil proteinet folde tilbage i sin oprindelige form, eller det der kaldes proteinets native konformation. figur 3. Derfor kaldes dialyse også refoldning, hvis formålet med dialysen er at få proteinet til at folde korrekt.

Figur 2: Dialyse. En dialyse er baseret på passiv diffusion. En proteinblanding kommes i en semi-permeabel membranpose. I denne mem-branpose kan kun de molekyler, der er små nok til at passere ud gennem hullerne (porerne) i posen diffundere ud i den om-kringværende opløsning. Dette vil medføre, at kun de moleky-ler, der er for store til at passere gennem porerne, vil forblive i posen. Figuren er taget fra http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzpur/amso4.htm

Figur 3: Urea denaturering og refoldning til den native konformation. Til venstre ses en repræsentation af et urea-ud-foldet protein. Under dialysen vil urea- molekylerne diffundere ud af dialyseposen og blive erstattet af buffer uden denatur-ant. Det vil medføre en langsom refoldning til den native konfor-mation, repræsenteret til højre.

5

FORMÅL OG BAGGRUND

ANION AFFINITETSKROMATOGRAFIEfter dialysen formodes I at have korrekt foldet β-lactamase. Desværre består opløsningen ikke kun af β-lactamase på dette tidspunkt. Der vil også være mange andre proteiner til stede, som bliver udtrykt af E. Coli.Endnu et oprensningstrin er derfor påkrævet for at oprense proteinet. Da β-lactamasen netto har en negativ ladning benyttes et trin, der adskiller molekyler afhængigt af deres ladning. Dette oprensningstrin består i at filtrere proteinopløsningen gennem et materiale (en resin), der selektivt binder negativt ladede molekyler (anioner). Jo mere negativt ladet molekylet er, jo stærkere bin-der det til resinen, se figur 4. Denne type filtrering kaldes også en anion bytning eller anion-affinitets-kromatografi, da den holder fast i anioner.

Efter man har ført sin prøve gennem resinen, vil ens eget protein være bundet fast til resinen. Man er nu interesseret i at få det ud igen. Man vasker derfor proteinet af resinen igen (eluerer) ved at tilsætte en saltholdig buffer. Denne buffer vil in-deholde mange små negativt ladede molekyler, der udkonkurrerer proteinets bin-ding til resinet. Jo større negativ ladning proteinet bærer, jo stærkere vil det også binde til resinet. Dermed vil det også kræve tilsvarende store mængder af salt for at eluere. Omvendt, jo mindre negativ ladning proteinet har, jo mindre salt skal der til. Positivt ladede proteinet vil naturligvis ikke binde til søjlematerialet. Efter dette trin vil størstedelen af de andre proteiner og celledele være sorteret fra og β-lactamasen kan anses som oprenset.

Figur 4: Anionbytter. En anionbytter består af et resin, der selektivt binder til anioner, repræsenteret som kug-ler med ”fangearme”. I denne figur har de lilla molekyler en meget negativ ladning; de blå har en medium negativ ladning; og de røde molekyler har en mindre negativ ladning. På en anionbytter vil en blanding af de lilla, blå og røde molekyler blive udvasket efter forskellige mængder af udvaskningsbuffer. Først vil de røde molekyler udvaskes, så vil de blå og så de lilla. På den måde kan man let isolere molekyler med forskel-lige ladninger fra hinanden på en anionbytter. Figuren er fra http://www.ucl.ac.uk/~ucbcdab/enzpur/ionX.htm

6

FREMGANGSMÅDE

DET SKAL I BRUGE:

TIL DIALYSE:

BUFRE OG OPLØSNINGER · 20 ml 8 M urea 20 mM Tris-

HCl pH 7 · 5 l 50 mM Tris-HCl pH 7

MATERIALE OG APPARATUR · Pasteurpipetter (plastic, 5 ml) · Spektrofotometer, der kan

måle absorbans ved 280 nm · Kuvette til absorbansmåling · Dialyseslange med MWCO

på 3000-6000 (Spectro/Por) · Dialyseklemmer · Tragt til at overføre protein-

opløsningen til dialyseslange · Magnet · Magnetomrører · pH-meter, samt syre og base

til pH-indstilling af bufre · 5 l bægerglas · 15 ml nunc-rør med låg til

opbevaring af proteinet

REFOLDNINGSDIALYSEβ-lactamasen er i inklusionslegemerne, når I får det udleveret som et bundfald. Defor opløses bundfaldet i en bufret urea-opløsning.

· Tilsæt 20 ml af en opløsning, der indeholder 8 M urea 20 mM Tris-HCl og har en pH på 7, til bundfaldet og pipettér forsigtigt op og ned med en pasteurpipette. Når bundfaldet er gået i opløsning, bestemmes koncentrationen af protein i opløsningen som beskrevet neden for.

· Mål absorbansen ved 280 nm. Dette gøres ved først at nulstille spektrofotometret på en ”blank” prøve. En ”blank” prøve indeholder ikke protein, men kun buffer. I dette tilfælde er bufferen 8 M urea 20 mM Tris-HCl pH 7. Der skal typisk bruges 1 ml til at fylde en kuvette, men det kan variere med kuvetten. Når spektrofotometret er nulstillet måles absorbansen på proteinprøven. For at opnå det mest præcise resultat bør denne måling foretages minimum tre gange, hvor man har hældt opløsningen tilbage og udtaget en ny prøve. Det er ikke nødvendigt at nulstille igen, når man måler anden og tredje gang.

· Beregn proteinkoncentrationen ved at omarrangere Lambert-Beers lov; A = ɛlc, hvor A er absorbansen ved 280 nm; ε er ekstinktionskoefficienten som er proteinafhængig og i dette tilfælde 0,891 mg/ml; og c, der er proteinkoncentrationen i M. Bestemmelse af proteinkoncentrationen skal bruges til at udtage 10 mg protein.

· Fortynd 10 mg protein til 1 mg/ml i 50 mM Tris-HCl pH 7, 1mM EDTA og overfør opløsningen til en dialysepose som beskrevet neden for.

Forinden har dialyseslangen ligget i ionbyttet vand i minimum 10 minutter for at fjerne urenheder og gøre posen blød og medgørlig. Skyl gerne slangen indeni også ved hjælp af en pipette. Husk altid at have handsker på, når dialyseslangen håndteres, så der ikke overføres proteiner og snavs fra jeres hænder til selve posen.Arbejd gerne hurtigt, så dialyseposen ikke tørrer ud og krakelerer. Sæt en dialyseklemme i den ene ende af slangen og overfør proteinopløsningen til posen gennem en tragt. Det er smartest at overføre proteinopløsningen over et kar eller et bægerglas, så man ikke mister noget, hvis man skulle komme til at spilde. Efter man har overført proteinopløsningen til slangen, sættes den anden dialyseklemme fast. Der må gerne være en luftboble øverst i slangen. Hvis I ikke har dialyseklemmer, kan I binde knuder i begge ender, men husk så at tage det med i jeres beregninger, når I skal bestemme, hvor meget dialyseslange I skal bruge. Når proteinopløsningen er overført til dialyseslangen og begge klemmer er forsvarligt lukket, kommes den ned i dialysebufferen (5 l med 50mM Tris- HCl pH 7) i et 5 l bægerglas. En magnet kommes i, og dialysen stilles ved 4° C og natten over under omrøring.

· Dagen efter overføres dialysatet til et 15 ml nunc-rør ved brug af en tragt over en skål eller et bægerglas Proteinopløsningen skal opbevares ved 4° C, når den ikke er i brug.

7

FREMGANGSMÅDE

ANION AFFINITETSKROMATOGRAFIFor at isolere β-lactamasen fra de andre proteiner i dialysatet udføres et anion affinitetskromatografi-trin.

· 5 ml anion affinitetes resin opslemmet i 20 % ethanol overføres til en tragt med indlagt filter stillet i en konisk kolbe. Inden proteinopløsning påføres resinet, vaskes dette med 50 ml B-buffer. Dette gøres ved at hælde B-buffer på resinet og vente til, det er dryppet igennem. Når al B-bufferen er dryppet igennem, gentages proceduren med A-buffer.

· Når A-bufferen er dryppet igennem, sættes en konisk kolbe ind under trag-ten. Proteinopløsningen (dialysatet) overføres nu forsigtigt til tragten med resinet. I skal nu vente til dialysatet er dryppet ned i kolben. Når det ikke længere drypper fra tragten, tager I gennemløbet i den koniske kolbe, og hælder det forsigtigt på resinet igen. Dette skal gentages yderligere to gange for at sikre, at så meget protein som muligt er bundet til resinet.

· Alle de proteiner, der var i proteinopløsningen, er nu i resinet. For at fjerne de proteiner, der ikke binder, skylles resinet med 50 ml A-buffer ved forsigtigt at hælde A-buffer over, og vente til det ikke længere drypper fra tragten. For derefter at fjerne de proteiner, der kun binder svagt til resinet, skylles med en vaskebuffer, der indeholder 50 mM Tris-HCl pH 7, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl. Dette gøres igen ved forsigtigt at hælde vaskebufferen på resinet, og vente til det ikke længere drypper fra tragten.

· Proteinet skal nu elueres, det vil sige vaskes ud af resinet, på en kontrolleret måde. Dette gøres ved forsigtigt at hælde B-buffer på resinet og opsamle gennemløbet i fraktioner af 1 ml. Det vil sige, gennemløbet skal deles op og altså ikke elueres ned i den koniske kolbe. Opsamling af 1 ml fraktioner gøres lettest ved at holde fraktionsrøret ind under tragtens munding og lade eluatet dryppe ned i fraktionsrøret. Enzymet bør nu være i de 5 første fraktioner (se figur 5 næste side).

TIL ANION AFFINITETS-KROMATOGRAFI:

BUFRE OG OPLØSNINGER · Buffer A: 50 mM Tris-HCl

pH 7, 1 mM EDTA (500 ml) · Buffer B: 50 mM Tris-HCl

pH 7, 1 mM EDTA, 1 M NaCl (500 ml)

· Buffer til at skylle resinet med: 200 ml 50 mM Tris-HCl pH 7, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl

· SDS-PAGE prøvebuffer

MATERIALE · 5 mL Q-FF anion affinitets re-

sin opslemmet i 20 % ethanol Tragt (almindelig glas- eller kaffe-)

· 100 ml konisk kolbe til at opfange gennemløbet

· Filterpapir (Whatman no. 1 eller kaffefilter)

· Pasteurpipetter (plastic, 5 ml) · Fraktionsrør til fraktioner af

1 ml (evt. eppendorfrør) pH-meter, samt syre og base til pH-indstilling af bufre

· Magnet · Magnetomrører · pH-meter, samt syre og base

til pH-indstilling af bufre · 5 l bægerglas · 15 ml nunc-rør med låg til

opbevaring af proteinet

DET SKAL I BRUGE:

8

FREMGANGSMÅDE

Hvis I skal fortsætte med β-lactamasen og lave enzymkinetikøvelsen, skal I nu skifte bufferen på de fraktioner, der indeholder β-lactamase til en 50 mM fos-fatbuffer pH 7. Dette gøres ved dialyse, som da I skulle refolde β-lactamasen. Hvis I skal arbejde videre med β-lactamasen i enzymkinetikøvelsen, kan I se, hvad I skal bruge i boksen til højre.

Figur 5: Gelektroforese af anionbytter fraktioner. På gelen ses fra venstre mod højre: LMW; det der blev påsat anion-bytteren; det der løb igennem søjlen; det der løb gennem søjlen efter vask med A buffer; det der løb gennem søjlen efter vask med A buffer tilsat 50 mM NaCl; fraktionerne 1-5. β-lactamasen giver anledning til de blå proteinbånd, der er markeret med pil. Det ses, at β-lactamasen eluerer i fraktionerne 1-5.

BUFRE OG OPLØSNINGER · 5 l 50 mM fosfatbuffer pH 7

MATERIALE · Dialyseslange med MWCO

på 3000-6000 (Spectro/Por) · Dialyseklemmer · Tragt til at overføre protein-

opløsningen til dialyseslangen · Magnet · Magnetomrører · pH-meter, samt syre og base

til pH-indstilling af bufre · 5 l bægerglas · 15 ml nunc-rør med låg til

opbevaring af proteinet

9

SPØRGSMÅL TIL ØVELSEN

SPØRGSMÅL TIL ØVELSEN

1. Hvad består bundfaldet af, når I får det?

2. Hvad betyder det, at et protein denaturerer? Hvorfor tror I, at inklusionslegemerne er opløselige i urea?

3. Hvorfor kan man bestemme proteinkoncentrationen af en opløsning ved at måle absorbansen ved 280 nm?

4. Er det bedst at vælge en membran med porer, der er større eller mindre end det protein, man arbejder med,

når man skal dialysere?

5. Hvilken størrelse har de andre proteiner i dialyseposen efter dialyse i forhold til β-lactamasen?

6. Hvilken ladning har molekylerne i resinet, som man benytter til anion affninitetskromatografi-trinnet?

7. Hvorfor tror I, det er muligt at eluere proteinet med en saltholdig buffer?

8. Hvor rent er jeres β-lactamase efter anionbytningen sammenlignet med før dette trin?

Vurder ud fra gelen i Figur 6.

9. Vil I vurdere dette trin som ideelt?

10. Foreslå en anden oprensningsmetode, der vil være passende at bruge til videre oprensning?

11. Hvorfor er der en stor del af proteinet, der ikke binder til søjlen, men som suser lige igennem i gennemløbet?

10

NOTER