Biyofarmasötik

KarakterizasyonMalvern Ürün Portfolyosu

Gamze KARAKULLUKÇUApplication Engineer | MSc. Biotechnology

gamze@atomikateknik.com | +90 549 745 30 04

Biyofarmasötik ilaçlar nelerdir?

Biyoteknolojik yöntemler kullanılarak üretilmiş ilaçlar

Proteinler (glyco-/lipo-protein)

Antibadiler

Recombinant proteinler

Peptidler

Nükleik asitler (DNA/RNA/Oligonucleotides)

Aşı ve tanılarda kullanılan zayıflatılmış Mikroplar/Virusler

Polisakkaritler

Mikrobik/Memeli hücre hattı mühendisliği yapılarak istenilen proteinlerinekspresyonu sağlanır

Biofarmasötik Kayma

Neden Biyolojik Moleküller?

Yeni hastalıkların tanı, tedavi ve korunumu adına büyükpotansiyel taşırlar

Hedefe yönelik tedavi avantajı yüksek

Küçük moleküllü ilaçlara göre çok daha güvenli

5 yıl içerisinde pazardaki ilaçların ~50%’sini oluşturmalarıbeklenmekte

Teknoloji hızlı AR-GE’yi mümkün kılmakta

Zorluklar

Dikkatli elleçleme gerektiren büyük, komplike moleküller

Kararsız olabilirler ve sıcaklık, pH, shear, zaman parametrelerinden etkilenebilirler

Denature ve agrege olma eğilimleri vardır

Özellikle agregatlar immun reaksiyonlara yol açabilir

Monoclonal

antibody

MW 150kDa

Comparative

size of aspirin

MW 180Da

Biyofarmasötik Market

Küçük moleküllü ilaç üretim hatları daralıyor

Hali hazırda geliştirilen ilaçların 40%’ı biyofarmasötik

4,000 – 5,000 molekül

2018’de, dünya çapındaki her 10 ilaçtan 7’sinin biyolojik olacağı öngörülüyor

39%

61%

17%

83%

51%49%

2018

Estimated proportion of biologicals vs. “traditional pharmaceuticals”

Source: Evaluate Pharma World Preview 2013, Outlook to 2018

20122004

Biyofarmasötik İlaç Geliştirilmesi

ONE FDA

APPROVED

DRUG

10,000 molecules:

High throughput screening

250 molecules:

In vitro & animal testing

PK/ADMET

10 molecules:

20-100 volunteers:

PK/PD/safety & dosage

5 molecules:

100-500 volunteers: efficacy

& side effects

2 molecules:

1000-1500 volunteers: long

term use study

BLA filed

2 - 5

years

2

years

1.5

years

2

years

2.5

years

2

years

Discovery

Preclinical

Phase I

Phase II

Phase III

FDA Review

Postmarketing/

Surveillance (Phase IV)

$5 – 10 x

106

total

$1 – 5 x

106

per study

$5 – 20 x

106

per study

$80-500 x

106

per study

Total 12 – 15 years

Sub-visible Partiküller

Sub-visible partiküller, boyutu 0.1µm – 100 µm arasında değişen, büyük protein

agregatlarını ve kontaminantları da kapsar

Parenteral şekilde verilen ilaçlarda protein agregatlarının önemi:

Etkinlik kaybı

Anafilaksis

Otoimmünite – FDA Guidance: Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein

Products (Feb2013)

1. Proteinlerin, non-proteinlerden ayırt edilebilmesi

2. Subvisible partiküllerin başlangıçta ve raf ömrü sonundaki seviyeleri

3. Enjectablların ≥ 10 μm & ≥ 25 μm aralığında kuantifikasyonu (USP-788; ICH Q4B)

4. “…it has been recognized that subvisible particulates in the size range of 0.1-10 microns

have a strong potential to be immunogenic, but are not precisely monitored by currently

employed technologies.”

5. “…the use of any single method for assessment of aggregates is not sufficient to provide

a robust measure of protein aggregation”

Sub-visible Partiküller

SEC/GPC

AUC

LO (5 ml)

Flow Microscopy

(1-2 ml)

DLS*

Visible

Laser Diffraction* (5–10 ml)

nm 10 100 µm 10 100 mm cm (107 nm)

*Qualitative

Biyofarmasötik Markete Malvern

Yaklaşımı

Hali hazırda var olan cihaz portfolyosunun adaptasyonu

Software eklemeleri ve yeni aksesuarlar

Yeni teknolojiler geliştirilmesi ve sunulması

Birikimli global bir ekip oluşturmak

Pazarı ve zorluklarını anlayarak destek sağlamak

Malvern Ürün Portfolyosu

Product Technology Primary outputs

Viscotek range Size exclusion chromatography Molecular weight distribution

Structure

Zetasizer range Dynamic light scattering

Electrophoretic light scattering

Static light scattering

Molecular size distribution

Zeta potential

Microrheology

MicroCal ITC-DSC Isothermal Titration calorimetry

and Differential Scanning

calorimetry

Binding parameters and

Protein unfolding & melting

point

Archimedes Resonant mass measurement Size distribution by number

Buoyant mass

Viscosizer UV area imaging Viscosity

Mean size by mass

NanoSight Nanoparticle tracking analysis Size distribution by number

Viscosizer TD Otomatik sistemi sayesinde 50 viale kadar ölçüm alabilir

Taylor dispersiyon analiz tekniği “UV area imaging” yöntemini kullanarak 0.2nm - 50nm aralığında boyut ölçümü yapar

Viscosity ölçümü için; iki pencere arasındaki geçiş zamanını kullanır. Ölçüm aralığı: 0.9cP –50cP

Her vialde toplam 15µl numune bulunmalıdır. Boyut ölçümü için 40nl, viskozite ölçümü için6µl numune harcanır, kalan tekrar toplanabilir

Aplikasyonlar & Avantajlar

• Yüksek konsantirasyonlu protein formülasyonlarınınviskozite ölçümü

• Agregasyonun sebebinin yüksek viskozite olupolmadığını belirlemek için boyut ölçümü

• Küçük moleküllerin, peptitlerin vb. boyutanalizinin yardımcı maddelerin (excipients vesurfactants) varlığında dahi yapılması

• Monoklonal antibodilerin (mAbs) erken evregeliştirilebilirlik (screening) ve formülasyonaşamasındaki lider bileşik optimizasyonu (leadoptimization)

Zetasizer

Zetasizer Nano serisi

1. Öncelikli Ölçüm parametreleri

Boyut - DLS, Zeta potansiyel - ELS, Moleküler ağırlık - SLS

2. İkincil Ölçüm parametreleri

Second virial coefficient – Zimm eqn., KD, Protein charge, Microrheeology

3. Numune çeşitleri

Macromolecules; Proteins, dendrimers, polysaccharides, polymers

Liposomes and micelles

Zetasizer APS

Otomatikleştirilmiş boyut dağılım ölçümü, 96/384 well plates

Zetasizer µV

Dinamik light scattering kullanarak, boyut dağılımı veren SEC

dedektörü

Zetasizer & Viscosizer TamamlayıcılığıUser Requirements Viscosizer Zetasizer

Measure the size of small molecules (< 0.5 nm) X

Measure the size of large macromolecules (> 100 nm) X

Provide mass weighted mean size X

Provide sizing sensitivity to oligomeric changes & aggregation X

Provide size distribution & polydispersity X

Measure the DLS interaction parameter (kD) X

Measure the molecular weight & 2nd virial coefficient X

Measure protein electrophoretic mobility & charge X X

Measure the viscosity at high protein concentration X

Measure the viscosity at low protein concentration (microrheology) X

Measure biological samples in presence of excipients X

Provide carousel or well plate HT format X X

Vary solution conditions via a titrator X

Low sample volumes X X

Wide working concentration range X X

Intuitive and user friendly software X X

Viscotek GPC/SEC - Triple and Tetra

Detection Aplikasyonlar

Natural ve Sentetik Polimerler

Antibodi analizi

Proteinler ve Protein konjugasi

PEGylated proteinler

Polilaktid-Glikolid co-polimer

Polikarbonhidratlar (CD & DVD’lerde ve elektronikte

kullanılan)

Maltodextrin (yiyecek endüstrisi için)

Gerçek moleküler ağırlık dağılımı

Right-angle light scattering (RALS)

Low-angle light scattering (LALS)

Multi-angle light scattering (MALS)

Moleküler boyut

Hidrodinamik çap

Jirasyon yarıçapı

Moleküler yapı

Dallanma (Branching)

Protein agregasyonu

Kompozisyonu

UV absorbsiyonu

Dynamic Light Scattering

RH = 6.5 nm (Peak 1 intensity mean)%Pd = 25 %

Taylor Dispersion Analysis

RH = 5.1 nm

Window 1 Window 2

Peak BroadeningNo bearing on the analyses of smaller component

Oligomers

Sensitive to the presence of larger

particles

Multi-detector SEC

MonomerMW = 150.6 kDaRH = 5.2 nm

DimerMW = 304.5 kDaRH = 6.9 nm

AggregatesMW = 614.1 kDaRH = 20.7 nm

More detailed information about all components of mixture

Aggregates

3 mg/mL Bovine IgG in PBS

Size characterization by Taylor dispersion analysis provides

complementary information to existing techniques in your

workflow

The information can be combined to build a clearer picture of your

sample characteristics

Achimedes

Bireysel partiküllerin sıvı içerisinde fiziksel özelliklerini ölçer

Boyut aralığı 50 nm - 5 µm (100 µl numune)

Buoyant kütle, Boyut, Yoğunluk

Numune içeriğini ölçebilir: particle number/ml, particle mass/ml

Yüksek çözönürlük – kısmen farklı boyutlardaki partikülleri ayırtedebilme

Hızlı, (NIST-traceable) kalibrasyon

Aplikasyonlar:

Protein formülasyonlarındaki

agregasyon

Silicone oil damlacıkları

Konsantrasyon

Archimedes & Flow Microscopy

Subvisible ve submicron agregatlar

Boyut ölçüm aralığını flow microscopy’nin ölçüm aralığının altına

düşürmektedir.

NanoSight Difüzyon halindeki partiküllerin Brownian hareketini

izleyerek her birinin boyutunu ölçer

Kamera ve otomatikleşmiş izleme software’I kullanır

10nm – 2000nm (Numuneye bağlı)

NS300

NS500 ve LM10’in üst modelidir

Esnek sistem; kamera ve lazer opsiyonları

Yüksek kapasiteli kompakt format

Otomatik numune tablası konumlandırması vefokuslanabilme

6 adet filtre dümeni (floresans ölçümler için)

Aplikasyonları:

Yüksek çözünürlüklü boyut ölçümü

Floresans ölçüm yapabilme (Doğal yada Labeled)

Bakteriyofaj ve virus partiküllerininsayımı

Eksozomların boyut ve adet (numerik) dağılımı (microvesicles and nanovesicles)

İlaç Taşınım Sistemlerinin boyut analizi(e.g. vesicles/liposomes, dendrimers, solid lipid nanoparticles, metallic and polymeric nanoparticles)

Teknoloji görüntülenebilir partikül boyutunu optik

mikroskopa oranla 10 kat kadar düşürür

Partikül sayısı ve konsantrasyon bilgisi verir

Partikül tiplerini ayırtedebilir

Görüntü ışık saçılımıdr – şekle bağlı bilgi VERMEZ

Fraksiyone olmayan protein ölçümü

NTA ve DLS orthogonal bir method sağlar. Böylece ölçümlerin doğrulanmasını

sağlamanın yanı sıra NanoSight ile görsel konfirmasyon da elde edilir.

MicroCal ITC

Secondary screening/hit validation aşamasındaafinitenin hızlıca elde edilmesi

Hedef etkinliğinin ölçülmesi

Ilacın hedefe bağlanmasının konfirmasyonu

Termodinamik parametrelerden yaralanarak liderbileşik modifikasyonu ve optimizasyonu

Etki mekanizmalarının karakterizasyonu

IC50 ve EC50 değerlerinin doğrulanması IC50 measure of a compounds inhibition EC50 measure of drug´s potency

Enzim Kinetiği ölçülebilirliği

MicroCal iTC200

MicroCal Auto-iTC200

MicroCal VP ITC

MicroCal PEAQ iTC

MicroCal DSC

En kararlı (stabil) olan protein ve ya

biyoterapötik adayının seçilmesini ve

karakterize edilmesini sağlar

Günler içerisinde ekspresyon, pürifikasyon

ve üretim koşullarının optimize edilmesini

sağlar

Likid formülasyonlar için optimum

koşulların kolay ve hızlı şekilde

belirlenmesini sağlarMicroCal VP-Capillary DSC

MicroCal VP- DSC

Teşekkürler

Gamze KARAKULLUKÇUApplication Engineer | MSc. Biotechnology

gamze@atomikateknik.com | +90 549 745 30 04