Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi

ECZ 344

Prof.Dr. Dilek AK

21.03.2013 /3. DERS

BİYOLOJİK SIVILAR

1

Faz II Klinik Testler

Geliştirme fazının bu aşamasında klinik çabalar başlatılır. Biyolojik sıvılardaki ilaç analizleri bu fazda ikifarklı role sahiptir:

1. Hâlihazırda gönüllülerde görülen ilacın kinetik tablosunun hastalardaki biyolojik etkininbelirlenmesine rehber olmak üzere desteklemenin gerekli olmasıdır. Kinetikler özellikle böbrek vekaraciğer yetmezliği durumunda, hiper- veya hipotansiyon durumunda hastalık halindenetkilenebilir ve bu gönüllülerdeki dozlarla karşılaştırıldığında hastalardaki dozun yeniden gözdengeçirilmesini gerekir. Bunun bir örneği yaşlı populasyonda kullanıldığı durumdur. Böylepopulasyonlarda metabolizma daha değişkendir. Fentiazac’ın (antinflamatuvar veantiromatizmal) sağlıklı genç gönüllülerdeki kinetiklerinin aynı olduğu kabul edildiği takdirdeyaşlılarda beklenmeyen birikmeye yol açar.

2. Faz II klinik çalışmalarda analizlerin ikinci rolü compliance (uyunç) için testlerdir. Bazı durumlardabu, hayvan toksisite çalışmalarında tarif edilen durumlara analog düşünülebilir. Burada test ilacınamaruz kalmamış hayvanla ilgilenilir. Ancak klinik çalışmalarda ilgilenilen konu ilacın gerçekten tarifedildiği şekilde hasta tarafından alınıp alınmadığıdır. Bu, tıpta büyük bir problem olabilir. Hastalargenelde doktor direktiflerine çok fazla motive edilmedikçe uymazlar. Bir ilacın placeboya göreüstünlüğü gerçek olabilir ancak çalışmalardaki hastaların büyük bir kısmı ilacı almazsa veyaçalışmada niyetlenenden farklı şekilde ilaç alırsa beklenen etki farkları gözlenmeyecektir.Doğrudan uygulanabilen yol kan numuneleri almak ve bunları ilaç için analiz etmektir. Ancak buuygun değildir. Daha kullanışlı bir yaklaşım her bir ziyarette hastadan idrar numunesini istemek yada teminini sağlamaktır.

2

Farmakodinamikler

İlaçların organizmaya ne yaptığı ile ilgilenir.

Bütün klinik çalışmaları sağlayan başarılı bir ilaç geliştirildiğinde sonrakiaşama olan insan gönüllü ve hastalarda etkili plazma düzeyleriniilişkilendirme çalışmalarının başlatılmasıdır.

İlacın etkili olduğunun kanıtlanması (araştırmanın sürdürülmesini haklı kılarve) istenen etkileri elde etmek için gerekli düzeylerin anlaşılması, dahaduyarlı formülasyon dizaynı ve doz ayarlanması gerektirir. Bu durumözellikle uygun plazma derişimlerini sağlamak ve belirli bir zamansürecinde etkin düzeylere ulaşmak için gerekli olduğu düşünülen toksiketkilere yakın büyük dozlardan kaçınmak için uzatılmış salım (sustainedrelease) formülasyonun dizaynında çok yararlıdır. Kısa süreli yüksekderişimlerden kaçınmanın dışında uygun şekilde dizayn edilmiş sustainedreleased form vücudun ilaca daha az maruziyetine ve dolayısıyla dahagüvenli bir medikasyona neden olacaktır.

Bu yüzden, biyolojik sıvılarda ilaçların analizi ile ilgili çalışmalar derişim-etkiilişkisinin kurulmasında ve optimal performansa ulaşmak için dozajformunun izlenmesinde anahtar bir faktördür.

3

Çeşitli amaçlarla biyolojik sıvılarda ilaç

analizinde yöntemler için gerekli koşular

Amaç Spesifiklik Duyarlılık Kesinlik Doğruluk Hız

Adli Toksikoloji Az az az az orta

Aşırı doz orta az az az yüksek

İlaç İzleme orta orta az az Yüksek

Farmakoloji Yüksek Orta Orta Orta Az

Toksikoloji Az Orta Az Az Orta

Faz I Orta Yüksek orta Orta Orta

Metabolizma Yüksek Orta Orta orta Az

Farmakokinetik yüksek Yüksek Yüksek Orta Yüksek

Formülasyon

Geliştirme

orta Yüksek Orta Orta Yüksek

Faz II Yüksek Yüksek Yüksek Yüksek Yüksek

Farmakodinamik Yüksek Yüksek Yüksek Yüksek Orta

Farmakogenetik Yüksek Az Orta Orta Az

Compliance

(Uyunç)

Az Orta Az Az orta

4

Önemli

Farmakokinetik, Faz II ve Farmakodinamik amaçlı

çalışmalarda biyolojik sıvılarda ilaç analizi için

kullanılacak yöntemlerin yüksek düzeyde spesifik,

duyarlı, kesin, doğru ve hızlı olması gerekir.

5

Biyolojik Sıvılar

İlaç analizi bir numunede “ne” ve “ne kadar”

sorularına cevap bulmak için ölçüm yapmaktan

oluşur.

Biyolojik sıvılar basit karışımlar değildir.

Karışımdaki bir çok farklı bileşen birbiri ile reaksiyon

verebilir.

6

Biyolojik Sıvılar

Sonuçta bazı girişim olayları meydana gelebilir.

Yanıt yüksek çıkabilir

Yanıt maskelenebilir.

Degredasyon (pH faktörleri, enzimler) ile gerçek

değerlerden farklı sonuçlar ortaya çıkabilir.

7

Biyolojik Sıvılar

En çok analiz edilen biyolojik sıvılar kan, plazma

(veya serum) ve idrardır.

Plazma veya serumun hazırlanması kolaydır ve bir

çok analizde girişim yapan bileşenlerin azaldığı bir

ortam sağlar ve analiz yapılabilir.

Tüm kan nadiren çalışılır. (Küçük deney hayvanları

ve adli toksikoloji çalışmaları dışında)

8

Biyolojik Sıvılar

Safra, ter, anne sütü ve tükrük daha az analiz edilen

sıvılardır.

Tükrük, kandaki derişimi doğru olarak yansıtan ve

noninvasive bir teknikle sağlanabilen bir sıvıdır.

Spinal sıvı hedef organ olan beyne yakın

konumundan dolayı merkezi sinir sistemine etki eden

ilaçlar için analiz edilir.

9

Sıvılar Beyin-Omurilik Sıvısı

Gözyaşı

Ter

Tükrük

İdrar

Safra

Karışık Plazma

Serum

Kan

Feces

Katılar Beyin

Kalp, böbrek, akciğer

Karaciğer, kas

Kemik

Biyolojik numunelerin analizi zorlaştırma dereceleri ile ilişkili olan

akıcılık sıralaması

10

Katı ve yarı katı haldeki numunelerin akıcılığını

artırmak için mekanik işlemler uygulanır.

Mekanik işlemler örneği istenmeyen biçimde

değişikliğe uğratabilir. Bazen numunedeki ilaç

derişiminin değişmesine yol açar, bazen de

numunenin işlenmesini daha güçleştirirler. Bu etkiler,

Sıcaklık etkisi, metal kelat oluşumu, konjugat hidrolizi

Köpürme, emülsiyon oluşumu ve kırmızı hücrelerin

patlaması

11

Ortamların Özellikleri

Çok az analitik yöntem biyolojik bir örnekteki ilaç

miktarının sonucunu doğrudan verir.

Biyolojik örneklerde en önemli sorun ilacı endojen

materyalden olabildiğince ayırmaktır.

Endojen materyalin akıcılık derecesi ile analiz

edilecek numunenin çalışılmasındaki kolaylık doğru

orantılıdır. BOS en kolay çalışılan materyaldir.

12

Sıvılar Beyin-Omurilik Sıvısı

Gözyaşı

Ter

Tükrük

İdrar

Safra

Karışık Plazma

Serum

Kan

Feces

Katılar Beyin

Kalp, böbrek, akciğer

Karaciğer, kas

Kemik

Biyolojik numunelerin analizi zorlaştırma dereceleri ile ilişkili olan

akıcılık sıralaması

13

Katı ve yarı katı haldeki numunelerin akıcılığını

artırmak için mekanik işlemler uygulanır.

Mekanik işlemler örneği istenmeyen biçimde

değişikliğe uğratabilir. Bazen numunedeki ilaç

derişiminin değişmesine yol açar, bazen de

numunenin işlenmesini daha güçleştirirler. Bu etkiler,

Sıcaklık etkisi, metal kelat oluşumu, konjugat hidrolizi

Köpürme, emülsiyon oluşumu ve kırmızı hücrelerin

patlaması

14

Ekstraksiyondan önce biyolojik örneğin parçalanması için

uygulanan işlemler

Karakteristik Homojenizatör Bıçaklı Doğrayıcı Diğer

Potter Teflon-cam Waringblender

Virtis-sorvall Sonikasyon Kimyasal

Mekanizma Doğrama Doğrama Kesme/Doğrama

Cut/shear titreşim Hidroliz

Soğutma kolayca kolayca yok kolayca belki Normalde değil

Hız değişkenliği

devamlı devamlı Basamaklı/devamlı

devamlı - -

Metalbulaşma

olmaz Az seviyede

ciddi ciddi Azseviyede

olmaz

Köpürme hafif hafif orta orta orta ciddi

kararlılık zayıf zayıf iyi iyi iyi iyi

Sınırlamalar Sert doku Sert doku Kap boyutu

En az Örnek tipi Zor koşullar

Güvenlik zayıf vasat iyi mükemmel iyi vasat

15

Potter Elvejhen

Potter

16

Waring blender

Virtis-sorvall

17

Ekstraksiyon işlemlerinde çözücü ortamı olarak

kullanılan çözücüler kritiktir.

18

Çözücü ekstraksiyonundan önce biyolojik numuneleri

hazırlamak için kullanılan sulu çözeltilerin karakteristikleri

Çözücü Üstünlükleri Sınırlamaları

Distile su Bağıl olarak iyi bir çözücü

Doku bileşenlerine zarar vermez.

Final pH 7.0 dolayındadır.

İyonizasyon derecesi değişebilir.

Enzimleri denature etmez.

Final pH doku tipi ile değişebilir.

Seyreltik asit

(< 0.5 N)

Bağıl olarak iyi bir çözücü

Bir çok enzimi denature eder.

Final pH < 7.0

Köpürme minimal

Önemli ölçüde protein denaturasyonu

Bileşikler aside duyarlı olabilir.

Kuvvetli asit

(> 0.5 N)

İyi çözücü

Bütün enzimleri denature eder.

Proteinleri çöktürür.

Final pH < 4.0

Pıhtılaşma ve agregasyon oluşabilir.

Bileşikler aside duyarlı olabilir.

Doku bileşenleri tahrip olabilir.

Seyreltik alkali

(< 0.5 N)

Bağıl olarak iyi çözücü

Bir çok enzimi denature eder.

Final pH > 7.0

Önemli miktarda protein denaturasyonu

Bileşikler bazik ortama duyarlı olabilir

Köpürmeye (sabun) neden olabilir.

Kuvvetli bazik

(> 0.5 N)

Bağıl olarak iyi bir çözücü

Bütün enzimleri denature eder.

Proteinleri çöktürür.

Final pH > 10.0

Pıhtılaşma ve aggregasyon oluşabilir.

Bileşikler baza duyarlı olabilir.

Doku bileşenleri tahrip olabilir.

Köpürme genellikle ciddi bir sorundur

19

Sulu çözeltideki ilacın organik çözücüye

ekstraksiyonundaki kolaylık kullanılan organik

çözücüye bağlıdır.

Ekstraksiyonun amacı istenmeyen girişim yapan

materyalin geride bırakılması ve ilacı olabildiğince

çekip almaktır.

Ekstraksiyon, bu amaçla kullanılan çözücünün

polaritesinin ve/veya sulu fazın pH sının ayarlandığı

basamakların bir kombinasyonu ile yapılır.

20

Biyolojik sıvılardan ilaçların ekstraksiyonu için kullanılan

çözücülerin polaritesi ve ilgili diğer özellikleri

Çözücü UV limit Kaynama

Noktası

Dielektrik

sabiti

n-hegzan 210 69 En az polar 1.890

siklohegzan 210 81 2.023

Karbon tetraklorür 265 77 2.238

Benzen 280 80 2.284

Toluen 285 111 2.438

Di-isopropil eter 220 68 3.88

Dietil eter 220 35 4.355

Amil asetat 285 149

Kloroform 245 61 4.806

Diklorometan 235 40 9.08

1,2-dikloroetan 230 83 10.65

Metil-isobutilketon 330 116

Etil asetat 260 77 6.02

n-butanol 215 118 En polar 17.8

21

KAN

Kan en kompleks biyolojik sıvıdır.

Bireyden ya da hayvandan alınan kan:

çözünmüş (solubilize) proteinler,

disolve yağ ve katılar ve

süspande hücreleri içeren

tamponlanmış temiz bir sıvıdan ibarettir.

Major bileşenler olan kırmızı kan hücreleri veya

eritrositler esas sıvıdan veya plazmadan basit bir

santrüfüjle ayrılabilir.

22

KAN

Ancak kan dikkatli işlenmezse hücreler patlayabilir

ve istenmeyen bileşenlerin ayrılması daha zor hale

gelir.

Örneğin eritrositlerden salınan demir iyonları bazı

analitlerle kelat yaparak sulu fazda yapılacak

ekstraksiyonun verimini etkiler.

23

KAN

Hücrelerin patlamasının nedenleri

Isıtmak

Dondurmak

Karıştırmak gibi mekanik yollar

En yaygın neden ise suyun ilavesi. Bu durum hücreyi

çevreleyen sıvının iyonik şiddetinde değişime yol açar,

osmoz meydana gelir, hücreler şişer ve patlar.

Kan numunelerinin hacmini değiştirmek gerektiğinde

izotonik tuz çözeltisi kullanılır.

24

KAN

Eğer kan antikoagülan ajanlar katılmaksızın

bekletiliyorsa kırmızı hücreler sonunda pıhtılaşacak

ve sonuç sıvı (serum) aktarılabilecektir.

Serum pek çok bakımdan plazma ile aynıdır, ancak

pıhtılaşma olayına yol açan faktörleri içermez.

25

KAN

Antikoagülanların eklenmesi ile plazma hazırlanırsa,

bu faktörler plazmada kalır. Serum ve plazma analiz

edildiği zaman anlaşılması zor farklara yol açabilir.

Kan genellikle doğrudan ekstrakte edilmez. Bunun

yerine plazma veya serum hazırlanır ve ardından bu

sıvılar ile çalışılır.

Kan doğrudan ekstre edilirse yukarıda söz edilen

kırmızı hücrelerin patlamasını en az düzeye indirmek

için dikkat gerekir.

26