GSTM1 broj kopija i promoter haplotipa za predvianje rizika od recidiva i / ili drugih primarnih tumora kod bolesnika sa kancerom vrata i glave

SAETAK:

Studija koju obraujemo bavi se povezanou CNV-a (copy number variant) i promoter haplotipa sa povratkom bolesti i drugim primarnim tumorom kod pacijenata koji boluju od raka glave i vrata. Rak glave i vrata ukljuuje rak oralne upljine,farinksa i larinksa. Cilj ove studije je odreivanje CNV-a te promotera genetskih varijanti kod glutationa S-transferaze Mu klase1 i rizika od povratka/drugog primarnog tumora. Pacijenti/subjekti su birani nasumino,svi se nalaze u I ili II fazi raka glave i vrata. Prije randomizacije pacijenti su dobili upitnik o sociodemografskim faktorima,upotrebi duhana i alkohola i drugim izloenostima. Ovdje emo spomenuti i metode koje se koriste za odreivanje broja kopija varijanti i odreivanje genetikih varijanti i to sve kod glutationa S-transferaze Mu klase1 ( GSTM 1 ). TaqMan polimerazna lanana reakcija (PCR) u realnom vremenu je koritena za mjerenje tanog broja kopija varijanti GSTM1-a,a za odreivanje genetikih varijanti kod GSTM1 koriteno je direktno sekvenciranje. Multi-varijantna Cox regresiona analiza je koritena za procjenu stope rizika. REC/SPT (rekurentnost/povratak primarnog tumora)vrijeme preivljavanja odreeno je konstrukcijom KaplanMeier krivima a razlike izmeu krivih su tetirane log-rank testom. Rezultati pokazuju da je smanjeno REC/SPT a poveano REC/SPT vrijeme preivljavanja kod subjekata koji imaju najmanje dvije kopije GSTM1 uporeenih s GSTM1 homozigotnim delecijama. Kaplan-Meier analiza preivljavanja pokazuje da 498G, 426G, i 339C aleli su znaajno povezani s poveanim REC/SPT slobodnim preivljavanjem. Daljna analiza haplotipova je pokazala da nosioci haplotipova P498G-426G-339C smanjuju REC/SPT. Rezultati su pokazali da su CNV i promoter haplotipova bolji predskazivai REC/SPT-a nego samo mjerenje prisustva ili odsustva GSTM1 a. Ova studija ima odreena ogranienja zbog relativno male skupine za odabir uzoraka,pa nema mogunosti za procjenu udruenih efekata CNV-a i promoter haplotipova na ishod HNC-a( eng.head and neck cancer) . Uprkos ogranienjima pronalasci pokazuju efekt CNV-a i promoter SNP-a u GSTM1-u na ishod HNC-a.

UVOD

Rak glave i vrata (HNC), koji ukljuuje karcinome u usnoj upljini, drijelu, i grkljanu, jedan je od najeih oblika raka u svijetu.HNC predstavlja 3% -5% svih karcinoma u SAD-u, procjenjuje se da e u 2012 biti vie od 52.000 (40.250 usne upljine i drijela i 12.360 grkljana) pojedinca sa dijagnozom HNC a 11.500 (7850 usne upljine i drijela, i 3650 grkljana ) e umrijeti od te bolesti.1Lijeenje HNC je ogranieno u ranom stadiju bolesti, kako bi efektivna bila radioterapija ili operacija.2 Meutim, nakon faze lijeenja morbiditet i mortalitet se poveava kada pacijenti doive recidiv bolesti (REC) ili mu se razvije drugi primarni tumor (SPT).3SPT i razvijanje recidiva su zabiljeeni kod 20% bolesnika u roku 5 godina pri tretmanu lijeenja.4 Puenje i konzumiranja alkohola su veoma povezani s loim rezultatima kod HNC-a.5,6 Osim toga, naslijeeni faktori, ukljuujui i genetske varijacije u odreenim genima, takoer su pokazali da utiu na mijenjanje ovog rizika.7 Glutationske S-transferazne Mu (GSTM) klase enzima, koje su lan glutationske S-transferazne (GST) superfamilije faze II metabolizirajuih enzima, igraju vanu ulogu u zatiti stanica od ksenobiotika, konjugacijom sa glutationom za detoksikaciju elektrofilnih spojeva. Citosolni i membranski vezani oblici glutationa S-transferaze su kodirani sa dvije razliite superfamilije gena.Trenutno, osam razliitih klasa topivih citoplazmatskih glutation S-transferaza sisara je identifikovano: alpha, kappa, mu, omega, pi, sigma, theta i zeta. Ovaj gen kodira glutation S-transferazu koja pripada mu klasi. Mu klasa enzima uestvuje u detoksikaciji elektrofilnih spojeva, ukljuujui kancerogene,terapijske lijekove, okoline toksine i produkte oksidativnog stresa;konjugacijom sa glutationom. Geni koji kodiraju Mu klasu enzima su organizovani u gensku skupinu na hromosomu 1p13.3 i poznati su kao visoko polimorfni. Ove genetske varijacije mogu promijeniti podlonost nekog pojedinca kancerogenima i toksinima te utiu na toksinost i uinkovitost pojedinih lijekova. Null mutacije (mutacije inaktivnih alela) ove klase mu gena su povezane sa poveanjem broja tumora,vjerovatno zbog poveane osjetljivosti na toksine i kancerogene. Mnoge proteinske izoforme su kodirane transkriptnim varijacijama ovog gena.Dakle,geni koji kodiraju GSTM obitelj se nalaze na hromosomu 1p13.3 po redoslijedu GSTM4, GSTM2, GSTM1, GSTM5, GSTM3.8,9 GSTM proteini imaju izrazitu distribuciju u tkivima: GSTM1 je glavni GST Mu-klase u jetri, GSTM2 podjedinica prvenstveno je povezana sa skeletnim miiima, GSTM3 obogaen je u testisima, i GSTM5 je pronaen u mozgu.10Glutation S-transferaze Mu (GSTM) je enzim faze II detoksikacije, koji brzo detoksikuje kancerogene koji se nalaze u duhanskom dimu. Prevalencija ovog polimorfizma je oko 50% kod bijelaca. Nedostatak GSTM1 je povezana sa poveanom podlonosti kanceru usljed puenja. Delecija homozigotia GSTM-gena rezultira nedostatkom proizvoda gena. Cilj ove studije bio je istraiti uestalost GSTM1 null genotipa u karcinomu skvamoznih celija glave i vrata, posebno larinksa i hipofarinksa i analizirati pojave raka u vezi sa odreenim anatomskim mjestima.Poznato je da je jetrena GSTM1 je vrlo polimorfna, a ove genetske varijacije, koje ukljuuju varijacije broja kopija (CNVs) i zajednike polimorfizame (SNP), vjerojatno e doprinijeti do inter-individualnih razlika u odgovoru karcinogenima i lijekovima. Homozigotno brisanje GSTM1 gena, to rezultira u odsutnosti GSTM1 enzima, je prisutno kod 48% -57% bijelaca, 23% -41% afrikih Amerikanaca, 32% -53% Azijata, a 40% - 53% Latinoamerikanaca.11 Zbog vanosti uloge GSTM1 u metabolizmu kancerogenima i lijekovima, to brisanje varijante GSTM1 je pokazalo doprinos osjetljivosti karcinoma, kao i prognozu od odreenih vrsta raka.12-17 Prethodne studije procjenjuju rizik na temelju prisutnosti ili odsutnosti GSTM1 gena, bez utvrivanja tanog broja kopija gena u pojedinaca koji posjeduju GSTM1. Nadalje, potencijalni funkcionalni pokreta SNP u GSTM1 genu moe utjecati na razinu ekspresije proteina i na taj nain promijeniti odgovor stanica na egzogene karcinogene i lijekove.Meutim, istraga ovih pokretakih genetskih varijanti je jo uvijek ograniena. U ovoj studiji, moemo izvijestiti o rezultatima povezanosti izmeu tanog CNVs i promotora SNP u GSTM1 sa HNC REC / SPT.CNV su naeni u svim ljudskim populacijama, kao i u drugim vrstama sisara (Freeman et al., 2006). Moda najbolji definirani i najpoznatiji CNV su trinukleoidni sljedovi(TNRs), koji se sastoje od tri nukleotida ponavljana jedan iza drugoga. TNR pokazuju dinamine ekspanzije i kontrakcije u vie bolesnih stanja, kao to su fragilni X sindrom i Huntingtonova bolest, sa varijabilnim brojem ponavljanja i u normalnim i pogoenim pojedincima. U veini sluajeva, TNR pokazuju ekspanziju sa godinama. Zato to su porodino nasljedni, povean broj kopija obino korelira s veom teinom bolesti i / ili ranije pojave simptoma. Skupljanje TNR uoena je rjee nego ekspanzija, te obino po ocu nasljeivanja (Pearson et al., 2005).Nai rezultati pokazuju da je ovaj pristup procjeni genetske varijacije sa GSTM1 superiorniji prognostiki biomarker nego samo utvrivanje prisutnosti / odsutnosti gena, te e pomoi u identifikaciji visok rizik/ loi ishod pojedinaca. Budue replikacijske studije u drugim nezavisnim skupinama imaju jamstvo za potvrdu ovih nalaza.

Metode

Ljudska tkiva jetre i GST izraz otkrivanja

Ukupno 111 uzoraka ljudskih tkiva jetre su dobiveni od US Cooperative Tissue Network (Birmingham, AL, USA) i jetreni citosol su pripremili 100.000 g centrifugiranjem homogeniziranog tkiva u 20 mM Tris-hlorovodine kiseline (pH 7.8) stavljenih u 0.25 m saharoze koja sadri 0,5 mM etilendiamin- tetraacetatnu kiselinu, 20M butil hidroksitoulena i 0,1 mM kao to je prethodno opisano. GST-ovi su determinisani glutation-agaroznim afinitetom za hromatografiju i irokih-pora visoko-tene hromatografije, kao to je opisano od strane Coles i Kadlubar.

Ispitanici

Bolesnici koji su ukljueni u ovu studiju se nalaze u I ili II fazi raka glave i vrata, uzeti su sluajnim odabirom iz Retinoid Head and Neck Second Primary Trial iz 1991 do 1999 u MD Anderson Kancer Centra, u kojima su bolesnici primali svakodnevno niske doze (30 mg / dan) 13-cis-retinoine kiseline ili placebo tokom 3 godine. Pacijenti moraju ostati bez raka za najmanje 16 sedmica nakon operacije i / ili zraenja kako bi se upisao u dokumente. Nije bilo ogranienja na regrutiranje u dobi, spolu ili nacionalnosti . Prije randomizacije, pacijenti su dobili da popune strukturirani upitnik koji je dao podatke o sociodemografskim imbenicima, duhan-korisnikoj povijesti, konzumiranju alkohola i drugim izloenostima. Kliniki podaci dobiveni su uz medicinski pregled grafikona. Definicije "drugi primarni tumor" i "recidiva" pratei Warren i Gates kriterije osigurane su prethodno.4 U istraivanju je sudjelovalo 441 pacijenta. Meu tim sluajevima, 133 iskusnih recidiva bolesti i / ili SPT, dok je 308 imalo jednu primarnu bolest.Svi su potpisali pismeni informacioni dokument prije sudjelovanja u istraivanju, a studija je odobrena od strane Institution Review Board of the University of Texas MD Anderson Cancer Center. "Nikad puai" su pojedinci koji su ispuili manje od 100 cigareta tokom svog ivota. "Bivi puai" su pojedinci koji su prestali puiti najmanje godinu dana prije upisa.

Odreivanje broja GSTM1 kopija

Broj kopija gena GSTM1 unutar genoma utvren je s brojem TaqMan kopija testa (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) za koji se koristila genomska DNK kao predloak i odvijao se kao tripleks TaqMan u realnom vremenu lanana reakcija polimeraze (PCR) sa RNA P kao referencom gena, zajedno s dobro naznaenim uzorkom (Coriell Institute for Medical Research, Camden, NJ, USA) i sa dvije kopije GSTM1 kao kalibrator. Real-time PCR podaci analizirani su komparativnm Ct metodom za izraunavanje relativne promjene u broju kopija GSTM1. Svi CNV genotipova odreeni su bez znanja o REC / SPT statusa ispitanika.

Odreivanje genotipova u promotoru GSTM1

GSTM1 promotor fragmenti iz svakog pojedinca umnoeni su pomou prednjeg niza (GSTM1-PF: 5-CAG GTT GGA CAT TGT TCT CGT G-3) i stranjeg niza (GSTM1-PR: 5-CAG CTG CTT CGC ACT TCC CT-3) da bi se proizveo 1924 bp fragment. Genetske varijacije su identificirane izravnim nizanjem PCR proizvoda sa GenomeLab DTCS Quick Start Kit in a Beckman GeXP Genome Analyzer (both from Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA). Sekvencirane poetnice su GSTM1-seq1(5-GGA GTT TCT TCA GAC TCA CAA T-3), GSTM1-seq2 (5-CCT GGG CCT TAA AGC ATG AC-3), i GSTM1-seq3 (5-CAC AGA CCA CAT TTC CTT TAC-3). Genetske varijacije su identificirane pomou CodonCode Aligner softvera (CodonCode, Dedham, MA, USA), program za slijed montae i otkrivanje mutacije .

Gradnja izvjetavajuih plazmida

Da biste provjerili je li identificiran SNP utjecajem transkripcijske aktivnosti GSTM1, potrebno je izgraditi osam izvjetavajuih plazmida pripadajuih parova baza -1.687do +87 ljudskih GSTM1 gena pokretaa. Nizovi koji su uzeti da pojaaju fragmente su: 5-GAC TAC GCG TTA CTG AAG AAC ACA CAT GG-3 i 5-GAA TAG ATC TGC GGA TGT CCC AGT ACC-3, koji sadre Mlu I i II BGL ogranienja nalaza (podcrtane sekvence). Nakon pojaanja pomou LA Taq polimeraze (NEB, Ipswich, MA, SAD), PCR proizvod sa GSTM1 pokretaem je klasificiran na osnovu MLU I. i II BGL,a zatim umetnut u pGL3-osnovni vektor (Promega, Madison, WI, USA) sa iskrom luciferaznog gena kao izvjetivaa. Rezultat je bio odreen konstrukcijom "PC-AC" (s-498C,-426A, 339C-) nakon provjere slijeda. Ova P-498C-426A-339C konstrukcija naknadno se koristi kao predloak za stvaranje jo sedam drugih konstrukcija koji sadre sve mogue haplotipove (P498C-426A-339T, P498C-426G-339C, P498C-426G-339T, P498G-426A-339C, P498G-426A-339T, P498G-426G-339C, P498G-426G-339T) koristei Quickchange Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA. Sve konstrukcije su potvrdile izravno sekvenciranje pomou Beckman GeXP Genome Analyzer.

Kultura stanica i test luciferaze

Kultura stanica predstavlja uzgoj stanica viestaninog organizma na hranjivoj podlozi izvan samog organizma. Karcinom ploastih stanica usne upljine stanine linije T409 je kultivisan u Dulbecco modificiranom Eagles medium/F12 mediju s dodatkom 10% fetalnog goveeg seruma, 2 mmol / L L-glutamina, 100 U / ml penicilina, i 100 U / mL streptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) u vlani, 5% CO2 inkubator na 37 C. Za prolazne transfekcije, 10 104 stanice su obloeni u 96 ploe i narasle na 70% -80% ua. LipofectaminTM 2000 (Invitrogen) je koriten za transfekciju GSTM1-pGL3 osnovne konstrukcije i kontrolu plazmida PRL-SV40 u stanice prema protokolu proizvoaa. Luciferaza se koristi kao gen/protein dojavljiva u stanicama i organizmima. Test aktivnosti luciferaze pogodna je metoda za analizu ekspresije gena i drugih staninih procesa koji su vezani uz ekspresiju gena: aktivnost receptora, promotorska aktivnost, procesiranje glasnike RNA (mRNA), interakcije raznih proteina, siRNA (engl. small interference RNA). Luciferaza emitira svjetlost tijekom oksidacije svog kemijskog supstrata, luciferina, pri emu se luminometrom biljei koliina emitiranog svjetla. Koliina emitiranog svjetla mjera je luciferazne aktivnosti. U naem sluaju aktivnost luciferaze je mjerena pomou TD20/20 luminometra (Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA). Prazni pGL3-osnovni vektor takoer transfektiraju u stanice kao kontrola. Fold porast je izraunat definiranjem aktivnosti praznog pGL3 osnovnog vektora kao jedan. Razlike su odreene t-testa i P vrijednou, 0,05 to sesmatra vanim.

Statistike metode

Statistike metode su metode koje se koriste za analizu longitudinalnih podataka o pojavljivanju dogaaja od interesa. Posebno mjesto meu tim metodama zauzima metoda koja se naziva Multivarijantna Cox regresija,ona obuhvata dvije fundamentalne stavke, a to su osnovna funkcija rizika koja opisuje kako se mijenja rizik tokom vremena i efekat parametara koji opisuju kako rizik varira u odnosu na nezavisne promenljive. Multivarijantna Cox regresija koritena je za procjenu opasnosti omjera (HRS) povezanih s CNV, genotipom ili haplotipovima uz 95% pouzdanih intervala (CIs), za podeavanje zbunjujue varijable kao to su dob, spol, puenje, alkohol, tumora (grkljana, usne upljine, drijela ), stadiju (I ili II), i randomizacije (13-cis-retinoina kiselina hemoterapiji ili placebo). Krive preivljavanja mogu da se koriste u cilju izuavanja vremena potrebnog za dostizanje odgvarajueg, prethodno definisanog dogaaja, kao to su npr. vreme do pajave prve metastaze tumora, vreme koje je potrebno pacijentu da se oporavi posle transplantacije srca ili drugih organa itd. U naem sluaju Kaplan-Meier krive su konstruisane za uporeivanje dogaaja-slobodno preivljavanje od strane CNV-a, genotipova, ili haplotipova. Kada posmatramo podatke za vie grupa pacijenata, od velike vanosti je da moemo da ih uporedimo. Interesuje nas kako ocijeniti da li su ili ne KM krive za dvije ili vie grupa statistiki ekvivalentne. Najpopularniji test-metod je takozvani log-rank test. Sve analize su izvedene na Intercooled Stata statistikom softver paketu (v 10.0; Stata, College Station, TX, USA). Svi statistiki testovi bili su dvostrani i P vrijednost 0,05 se koristila kao kriterij za statistike znaajnosti.

Rezultati

GSTM1 izraz proteinaGSTM1 genetike varijanteDa bismo provjerili odnos izmeu CNV i GSTM1 izraavanja, testirali smo 111 uzoraka ljudske jetre. Od tog broja, 50 (45,0%) ispitanika bilo je bez GSTM1 izraavanja i 61 ispitanika (55,0%) izrazio GSTM1 s oko 145-fold GSTM1 izraz varijacija. Rezultati su takoer pokazali da ispitanici s najmanje dva primjerka imaju mnogo vei izraz GSTM1 od onih sa samo jednim brojem kopije (0,339 vs 0,118, P, 0.001) (slika 1). To djelomino moe objasniti GSTM1 izraz varijanti izmeu pojedinaca, ali meu nosaima s jednim primjerkom GSTM1, je jo uvijek bilo 80-fold varijacija u proteinu.

Dakle, proveli smo ponovno sekvenciranje od 1924-bp dijela 5' promotorske regije i pronaao vie genetske varijante (Tablica 1). Meutim, zbog vrlo malog uzorka, ne postoji znaajna povezanost izmeu genetske varijante i GSTM1 razine proteina.

Screening genetskih varijacija

Kroz TaqMan GSTM1 CNV test,utvrdili smo da je 57% ispitanika imalo GSTM1 homozigotno brisanje,24% je imalo jedan primjerak GSTM1, i 19% je imalo najmanje dva primjerka GSTM1. Od onih sa GSTM1 genom,sekvencirali smo punu duinu promoterske regije GSTM1 i identifikovali jednu umetnutu varijantu i 14 SNP (tabela 1). Meu ovima, -888A.T i -341C.T su noviteti, dok drugi SNP je prethodno pohranjen u Nacionalnom centru za biotehnologiju informacijske baze podataka (1543 TTCT insertion [rs71794573], 1529C.G [rs36210087], 1490A.G [rs36209763], 1143A.G [rs36209754], 498G.C [rs412543], 486C.G [rs3815029], 471C.T [rs55791819], 426G.A [rs412302], 344C.T [rs4147561], 343A.T [rs4147562], 339C.T [rs4147563], 304G.A [rs28549287], 164 C.T [rs36208869]). Frekvencije alela u ovim varijantama idu od 0.07 do 0.47 (tabela 1).

CNV od GSTM1 i REC / SPT- slobodan opstanak HNKCNV (varijacije u broju kopija) predstavljaju oblik strukturne varijacije,odnosno promjene u DNA genoma koje rezultiraju time da elija ima abnomalan broj primjeraka jednog ili vie dijelova DNA. CNV odgovaraju relativno velikim podrujima genoma koja su izbrisana (manje odnormalnog broja) ili duplicirana (vie od normalnog broja) na odreenim hromosomima. Npr.hromosom koji normalno ima odjeljke poredane kao A-B-C-D moe imati umjesto toga redoslijed A-B-C-C-D (kao rezultat duplikacije odjeljka C) ili A-B-D (kao rezultat delecije odjeljka C).Ove varijacije ine ugrubo oko 12% humanog genoma DNA i svaka varijacija moe obuhvatiti podruje od oko jedne kilobaze (1000 nukleotidnih baza) do nekoliko megabaza. CNV su suprotni SNP-ovima,koji obuhvataju samo jednu nukleotidnu bazu.CNV mogu biti naslijeene ili uzrokovane de novo mutacijama koje predstavljaju oblik genetske mutacije koju niti imaju niti prenose roditelji.Regresijska analiza pokazala je znaajno smanjenje REC / SPT u ispitanika s najmanje dvije kopije GSTM1 (omjer izgleda (OR) = 0.57; 95% CI = 0,35-0,95) ali ne i u onih s jednom kopijom gena (Tablica 2).

Kaplan-Meier analiza preivljenja otkrila je due REC/SPT- slobodno opstajanje u bolesnika s najmanje dva primjerka GSTM1. Meutim, ne postoji znatna razlika izmeu GSTM1 null subjekata i nosaa jedne kopije (tabela 2). SNP analiza pokazala je G alel-498C>G, G alela-426A>G i T alela-339C>T SNP su znaajno povezani s REC / SPT u HNK bolesnika s HR 0,11 (0,02-0,85) 0,28 (0,11 - 0,74,), i 2,02 (1,07 - 3,82), odnosno (Tablica 3). Kaplan-Meier analiza preivljenja je takoer pokazala da -498G, 426G-i-339C alela znaajno su povezani s duljim REC / SPT-slobodnim opstankom vremena u HNC ispitanicima (Slika 3A-C).

Haplotippredstavlja kombinacijualela (DNKsekvenci) na susjednim lokacijama (lokusima) nahromosomu koji se prenose zajedno. Haplotip moe da bude jedan locus, nekoliko lokusa, ili cjelokupni hromosom u zavisnosti od brojarekombinacija koje su se odvile izmeu datog seta lokusa. Izraz haplotip se moe odnositi na setjednonukleotidnih polimorfizama(SNP-ova) jednog hromosoma iz hromosomskog para. Haplotipovisugenikoji se ne rekombiniraju i nemaju svoj par na drugomhromosomu. Sve takve gene na Y hromosomuimitohondrijskoj DNK(mtDNK) nazivamo haplogrupama.Tri SNP-a (-498C>G,-426A>G i -339>T) u promotoru GSTM1 su nezavisno povezana sa REC/SPT HNC pacijenata i koritena su za konstrukciju haplotipova. Procijenjen je uticaj razliitih haplotipova na REC / SPT u istraivanju stanovnitva. Podaci su pokazali da pacijenti s haplotipom P-498G - 426G - 339C imaju smanjen REC / SPT (HR = 0,09, 95% CI 0,01-0,71) u usporedbi s onima sa haplotipom P-498C - 426A - 339T (Tablica 4). Nije bilo znaajne razlike izmeu ostalih haplotipova i haplotipa P-498C - 426A - 339T (Tablica 4). Kaplan-Meier procjene preivljavanja pokazuju povean REC / SPT u haplotipu P-498G - 426G - 339C skupini u usporedbi s haplotip P-498C - 426A - 339T grupom (Slika 4)

Utjecaj GSTM1 haplotipova na transkripcijske aktivnostiDa bi procijenjili utjecaj GSTM1 promotorske SNP na transkripcijske aktivnosti, generirano je osam luciferaznih korespondenata. Tu su i statistiki znaajne razlike izmeu ostalih haplotipova i haplotipa P-498C - 426A - 339T.

Diskusija

Ova studija je istraila povezanost izmedju tane kopije brojeva GSTM1 gena i REC/SPT, i pruila uvjerljive dokaze povezanosti izmeu HNC ishoda i GSTM1 promotor SNP / haplotipa. Jedan od glavnih nalaza je da toan CNV moe predvidjeti REC / SPT u genskoj dozi ovisan nain, sa subjektima koji imaju vie od dva primjerka GSTM1 imaju manji rizik od REC / SPT i najdui REC / SPT-free opstanak. Drugi kljuni nalaz je da su tri promotor SNP (-498C.G, 426A.G-i-339C.T) bili znaajno povezani s REC / SPT u HNK i haplotipovi P-498G - 426G - 339C su povezani sa smanjenim rizikom za REC / SPT i imaju poboljan

REC / SPT-free opstanak. Trebamo spomenuti da su sve znaajne povezanosti ostale znaajne nakon prilagodbe cigaretama. Prijanje studije su predloile da nastavak puenja,konzumiranja alkohola i tumor-prognoziranih faktora su izgleda povezani s vjerovatnoom razvoja SPT-a.Osim toga, treba imati u vidu da su sve znaajne povezanosti ostale znaajne nakon prilagoavanja na puenje, konzumiranje alkohola, tumorska mjesta, tumorske faze i demografske faktore, podravajui taan broj kopija GSTM i GSTM1 promotora SNPs / haplotipa kao nezavisnih prediktora REC / SPT u HNK pacijenata.

Uestalost HNK je u porastu irom svijeta, a povezana je s visokom smrtnosti, posebno u bolesnika sa REC ili SPT. Prethodne studije su iznijele da su nastavak puenja, konzumiranja alkohola, i tumor prognozirajui faktori povezani sa vjerovatnoom nastanka SPT. Dugotrajna izloenost odreenim kancerogenima doprinosi REC/SPT HNC,to je nesumnjivo tumor povezan sa puenjem i usko vezan sa metabolizmom kancerogena. Kao jedan od glavnih jetrenih enzima u metabolizmu lijekova, GSTM1 igra vanu ulogu u detoksikaciji kancerogena. U vrijeme pisanja lanka,najmanje 77 publikacija je izvijestilo o povezanosti GSTM1 delecijske varijacije i karcinoma skvamoznih elija glave i vrata( HNSCC) a 7 publikacija je ispitalo povezanost izmeu GSTM1 delecijske varijacije i ishodima HNSCC.

Meutim, ove studije su dale kontradiktorne rezultate u vezi sa GSTM1 odsustvom te rizikom i ishodima HNSCC. U naoj studiji smo koristili taan broj kopija GSTM1 umjesto GSTM1 prisutnosti / odsutnosti. Otkrili smo da su dva ili vie primjeraka GSTM1 dodijelila smanjen rizik od REC / SPT ali jedna kopija nije. U studijama kancera prostate i mjehura, istraivai su pokazali da taan broj kopija GSTM1 moe predvidjeti rizik od raka mjehura prije nego delecija gena. Naa otkria su takoe saglasna sa drugom studijom koja pokazuje efekt doze gena izmeu broja kopija GSTM1 i enzimske aktivnosti.

Pored broja kopija, funkcionalni promotori genetikih varijacija mogu uticati na stepen ekspresije gena mijenjajui sposobnost vezivanja faktora transkripcije za promotore gena. Smatra se da su AP2,GATA1,PEA3 i RXR/RAR faktori transkripcije u promotorskom podruju GSTM1. Osim toga,prijavljena je poveana transkripcijska aktivnost u podruju GSTM1 od -600 do +34 nakon odgovora Myb gena (koji je takoe fakor transkripcije). U ovoj studiji,poredali smo u niz promotore GSTM1 i pronali 14 genetikih varijacija,ukljuujui jednu insercijsku varijaciju i 13 SNP-ova. Nadalje, pokazali smo da su tri SNP-a (-498C.G, -426A.G, i -339C.T) povezana sa ishodima HNC. Do danas, postoji jo jedna studija koja se odnosi na SNP-ove u promotorskom podruju GSTM1 gena: u toj studiji, Singh i kolege su odabrali tri potencijalna funkcionalna SNP-a i nali da je -498C.G povezan sa smanjenim rizikom od raka dojke. Ovo je saglasno sa sadanjim studijama u kojima je -498G povezan sa smanjenim rizikom od REC i SPT te poveanim preivljavanjem REC/SPT HNC. Meutim, Yu et al je izvijestio da je -498G alel smanjio transkripciju gena za 30-40% smanjujui DNK-vezujui afinitet za promotorsko podruje.

Ovaj nalaz je nesaglasan sa rezultatima njihove prijavljene kontrolne case- studije. Budui da postoji 14 zajednikih genetskih varijacija u promotorskom podruju GSTM1, mogue je da je GSTM1 transkripcija regulisana viestrukim transkripcijskim faktorima i mogue pod uticajem nekoliko genetikih varijacija u promotoru GSTM1. U naoj HNC studiji,pored -498C.G SNP-a, takoe smo pokazali da su -426A.G i -339T.C znaajno povezani sa smanjenim REC/SPT i poveanim REC/SPT nezavisnim opstankom. To ukazuje na sloenost GSTM1 regulacije od strane razliitih faktora transkripcije. S obzirom da su tri promotora SNP-ova neovisno povezana sa ishodima HNC, izgradili smo haplotipove da bi ispitali sloene efekte ovih varijacija. Nali smo znaajan pad REC/SPT i poveanje REC/SPT nezavisnog opstanka kod pacijenata sa haplotipom P498G-426G-339C. Osim toga,in vitro testovi su pokazali da haplotip P498G-426G-339C ima veu transkripcionu aktivnost od ostalih haplotipova. Ovi podaci takoe podravaju haplotip analize kao bolji nain predvianja ishoda HNC od ispitivanja jedne genetike varijacije.Naa studija ima ogranienja zbog svoje relativno male veliine uzorka,tako da nismo bili u mogunosti procijeniti kombinirani efekt CNV i promotora haplotipova na HNC ishode;te je stoga potrebno ispitivanje vee studije populacije za pojanjenje njihovog odnosa. Meutim,ova studija je u toku i stoga moe biti ponovo ispitana kako se pojavljuju novi pacijenti. Nalaze predstavljene ovdje takoe treba ispitati i u drugim populacijama.Uprkos ovim ogranienjima,nai nalazi podravaju efekat promotora SNP-ova i CNV u GSTM1 na ishode HNC. Dalja istraivanja su potrebna na regulaciji GSTM1 ekspresije i uticaju genetikih varijacija-ukljuujui CNV,SNP ili insercija-na ekspresiju GSTM1 u ljudskoj populaciji.