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FILIAL NORTE
BIOQUÍMICA
GUÍA DE PRÁCTICAS
SEGUNDO AÑO
Profesores: Q.F. Del Castillo Cotillo, Helda, Mg (Responsable)Ing.Quím. Benel Fernández, Doyle, Mg (Coordinador)Biól. Quintana Cáceda, Milagros, MSc.Ing.Quím. Quiñones Chapoñán, Liliana.Biól. Loayza Estrada, Carolina.Biól. Lezama Vigo, Hélmer, MSc.Biól. Nolasco Cárdenas, Oscar, MSc.Méd. María Ruiz VelazcoBiól. Murrugarra Bringas, Victoria.Biól. Abanto Díaz, Carlos, Mg
2013-II
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INTRODUCCIÓN
La Bioquímica es la ciencia de la vida que estudia el metabolismo de los organismos vivos, es decir el conjunto de todas las reacciones químicas, y sus diferentes mecanismos, vías y regulación que hacen posible la vida. Las aplicaciones de la investigación básica en bioquímica son numerosas, siendo indispensable el conocimiento del metabolismo para el desarrollo de cualquier medicamento, su aplicación y la determinación de sus efectos.
La guía de prácticas del curso de Bioquímica tiene como objetivo entrenar al estudiante con los procedimientos llevados a cabo en el laboratorio y desarrollar su pensamiento científico que lo lleve comprender los términos básicos de la Bioquímmica.
El estudiante debe emplear esta guía en cada práctica de laboratorio y estar informado sobre la práctica que se llevará a cabo en cada sesión.
El alumno debe cumplir con los objetivos planteados al final de cada práctica. Así mismo debe presentar su guía de práctica terminada la misma.
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PROGRAMACIÓN DE CONTENIDO
SemaNº CONTENIDO
1 Introducción y organización de grupos de práctica.
2 Bioseguridad
3 Instrumentación: Centrifugación
4 Instrumentación: Colorimetría
5 Instrumentación: Potenciometría
6 Cinética enzimática
7 SEMANA DE LA MEDICINA
8 Digestión de carbohidratos
9 PRACTICA CALIFICADA PARCIAL
10 Repaso
11 Absorción de carbohidratos
12 Glicólisis
13 Lipoproteínas sanguíneas
14 Transaminasas y cromatografía
15 Evaluación nutricional
16 PRACTICA CALIFICADA FINAL
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PRÁCTICA GUIADA Nº 1 BIOSEGURIDAD
El trabajo en el Laboratorio requiere la observación de una serie de normas de seguridad que eviten posibles accidentes debido al desconocimiento de lo que se está haciendo o a una posible negligencia de los alumnos que estén en un momento dado, trabajando en el Laboratorio.
A continuación alistamos una serie de medidas e indicaciones de seguridad que deben tomarse durante las prácticas de laboratorio.
NORMAS PERSONALES
1. Lea con atención, antes de cada práctica, las indicaciones de su guía. Siga todas las instrucciones a menos que el profesor realice alguna modificación.
2. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de trabajo y de su material. Se trabajará con cuidado y de manera organizada. Así mismo se mantendrá cada mesa de trabajo limpia, seca y ordenada.
3. Es obligatorio la utilización de mandil que le cubra brazos, piernas, torso y pies. Están prohibidos el uso de sandalias, pantalones cortos, faldas, polos cortos, etc. en el laboratorio. La persona inapropiadamente vestida para trabajar en el laboratorio le será negado el ingreso.
4. No deben llevarse las manos a la boca ni a la cara pues pueden estar contaminadas.
5. Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleves recogido. 6. Está terminantemente prohibido fumar, tomar bebidas ni comidas. 7. En caso de derrame, accidente o daño avise inmediatamente al profesor. 8. Al término de cada práctica limpiar el área de trabajo y lavar los materiales
utilizados con agua de caño. Lavarse las manos meticulosamente con agua y jabón. Finalmente cerciorares que las llaves de gas y agua estén cerradas.
REACTIVOS QUIMICOS
1. Usar lentes de seguridad cuando trabaje con reactivos químicos peligrosos que puedan salpicar o derramarse.
2. Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se necesita, fijarse bien el rótulo.
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3. Como regla general, no coger ningún producto químico. El profesor o profesora te lo proporcionará.
4. Nunca devuelva los sobrantes de los productos a los frascos de origen sin consultar con el profesor.
5. Es muy importante que cuando los productos químicos de desecho se viertan en la pila de desagüe, aunque estén debidamente neutralizados, debe dejarse que circule por la misma, abundante agua.
6. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos químicos. 7. No pipetear con la boca. Utilizar una bombilla de succión. 8. Los ácidos requieren un cuidado especial. Cuando queramos diluirlos,
siempre echaremos el ácido sobre agua. 9. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben estar lejos de
fuentes de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se hará al baño María, nunca directamente a la llama.
10. Manipule con precaución los solventes volátiles e inflamables como el éter, acetona y metanol. Nunca evapore estos solventes en una hornilla al abierto. Utilice siempre un sistema de condensación eficiente.
11. Si se vierte sobre ti cualquier ácido o producto corrosivo, lávate inmediatamente con mucha agua y avisa al profesor.
12. Al preparar cualquier disolución se colocará en un frasco limpio y rotulado convenientemente.
13. Encienda fuego en el laboratorio solo si no existen solventes inflamables en la vecindad. La persona que encienda el fuego debe primero verificar que no exista otra persona que este trabajando con solventes inflamables en el laboratorio.
MATERIAL DE VIDRIO
1 Use material de vidrio limpio y no rajado. 2El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio frío. Para evitar
quemaduras use guantes o trapos. 3 Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo,
observa cuidadosamente estas dos normas:
-Ten sumo cuidado y ten en cuenta que la boca del tubo de ensayo no apunte a ningún compañero. Puede hervir el líquido y salir disparado, por lo que podrías ocasionar un accidente. -Calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita
suavemente (mira la figura).
EQUIPOS ELÉCTRICOS
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1 Manipule cualquier equipo eléctrico con las manos secas y asegúrese que el área de trabajo también este seca.
2 Ningún cordón electrifico debe colgar fuera de la mesa de trabajo. 3 Cuando desconecte algún equipo de tomacorriente, jálelo por el enchufe y no por el cordón.
UTILIZACION DE BALANZAS
1 Cuando se determinan masas de productos químicos con balanza, se colocará papel sobre los platos de la misma y si el producto fuera corrosivo, se utilizará una luna de reloj.
2 Se debe evitar cualquier perturbación que conduzca a un error, como vibraciones debidas a golpes, aparatos en funcionamiento, soplar sobre los platos de la balanza, etc.
MANIPULACIÓN DE ESPECÍMENES 1 Manipule los microorganismos crecidos en una placa petri o tubo de cultivo
con extremo cuidado. Siempre utilice técnicas de esterilidad (a la llama del mechero, guantes, palillos estériles, etc.).
2 Nunca llevar a la boca plantas o partes de ellas como semillas, frutos y hojas.
NIVELES DE RIESGO BIOLOGICO EN UN LABORATORIO
Clasificación de microorganismos por grupos de riesgo para el trabajo de laboratorio:
Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo)Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades en el ser humano o los animales.
Grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo)Agentes patógenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo grave para el personal de laboratorio, la población, el ganado o el medio ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una infección grave, pero existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación es limitado.
Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces.
Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado)Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser humano o los animales y que se transmiten fácilmente de un individuo a otro,
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directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y terapéuticas eficaces.
BARRERAS DE CONTENCIONLos laboratorios presentan diversas barreras de contención que previenen el escape y dispersión de agentes biológicos de riesgo.
Barrera primaria: Es aquella que protege al personal y al ambiente inmediato del agente de riesgo (vestimenta de uso exclusivo, cabina de bioseguridad y equipos provistos de dispositivos de seguridad).
Barrera secundaria: Es aquella que protege el ambiente externo contra los agentes de riesgo (diseño del laboratorio e implementación de equipos de seguridad de acuerdo al nivel de Bioseguridad).
Barrera microbiológica: Es un dispositivo o sistema que evita o limita la migración de microorganismos entre los espacios situados a ambos lados del mismo y permite controlar la concentración de microorganismos en el ambiente, dentro de límites prefijados. Tiene como objetivo proteger al operador o al operador y al proceso.
Barrera microbiológica parcial: Es un dispositivo o sistema que limita la migración de microorganismos entre los ambientes situados a ambos lados del mismo. En este tipo de barrera se recomiendan Prefiltros, Filtros HEPA (Filtros de alta eficiencia para el control de partículas en suspensión) así como cabinas de bioseguridad clase I o II, lo cual dependerá del tipo de trabajo que se efectúa en un determinado laboratorio.
Barrera microbiológica absoluta: Es un dispositivo o sistema hermético, a prueba de filtraciones de aire o gas, que evita en forma total la migración de microorganismos entre el ambiente confinado por la barrera y el ambiente exterior de la misma. La barrera microbiológica absoluta puede confinar al producto o proceso, dejando al operador fuera de la misma o viceversa. En este caso se recomienda una cabina de bioseguridad de tipo III.
Barrera química: Son dispositivos o sistemas que protegen al operador del contacto con substancias irritantes, nocivas, tóxicas, corrosivas, líquidos inflamables, sustancias productoras de fuego, agentes oxidantes y sustancias explosivas. En este caso se recomiendan una cabina de seguridad química.
Barrera física: Son dispositivos o sistemas de protección individual o colectiva que protegen contra las radiaciones ionizantes, no ionizantes, ruidos, carga calórica, quemaduras y vibraciones excesivas.
NIVELES DE BIOSEGURIDAD
De acuerdo con el nivel de riesgo, el tipo de laboratorio, la barrera de contención requerida, los procedimientos y técnicas a usar, se han establecido los siguientes niveles de Bioseguridad.
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Nivel de Bioseguridad I: Es aquel que corresponde a las actividades desarrolladas en un laboratorio básico, por personal adiestrado en los procedimientos que se ejecutan en él. En este nivel se trabaja con agentes clasificados en el Grupo de riesgo I por presentar un peligro mínimo para el personal del laboratorio y para el ambiente. En el nivel de Bioseguridad I no se requiere equipo especial ni un diseño específico de las instalaciones. El personal de estos laboratorios es generalmente supervisado por un científico con entrenamiento en microbiología.
Nivel de Bioseguridad II: Es aquel que corresponde a las actividades desarrolladas en un laboratorio básico, por personal adiestrado en el manejo de agentes de riesgo del grupo II. Es similar al nivel I y en él se manejan agentes de peligro moderado hacia el personal y el ambiente, pero difiere del nivel I en las siguientes características:1. El personal de laboratorio tiene entrenamiento específico en el manejo de agentes patógenos.2. El acceso al laboratorio es restringido cuando se está realizando algún trabajo.3. Se toman precauciones extremas con instrumentos punzo cortantes contaminados.4. Ciertos procedimientos en los cuales pueden salpicar los agentes o aerosoles se llevan a cabo en cabinas de trabajo microbiológico.
Nivel de Bioseguridad III: Es aquel que corresponde a las actividades desarrolladas en el laboratorio de contención. El personal debe contar con adiestramiento específico para el manejo de agentes de alto riesgo clasificados en el grupo de riesgo III. En el laboratorio se realiza trabajo con agentes que pueden causar un daño serio y potencialmente mortal como resultado de la inhalación o exposición a los mismos. El laboratorio cuenta con un diseño y características especiales tendientes a proteger al operador y al ambiente. Todos los materiales son manipulados utilizando vestimenta y equipo de protección siguiendo protocolos rigurosos. Los laboratorios se mantienen con una presión de aire negativa, lo cual ayuda a impedir que los agentes nocivos escapen al ambiente.
Nivel de Bioseguridad IV: Es aquel que corresponde a las actividades desarrolladas en el laboratorio de contención máxima. Este nivel es el que se utiliza para trabajar con agentes biológicos clasificados en el grupo de riesgo IV por representar un alto riesgo individual de contagio y que además son un riesgo para la vida. Los agentes nuevos que presentan características antigénicas, patogénicas u otras similares a agentes de nivel III y IV son confinados a nivel IV hasta que exista suficiente información científica para establecer a cual grupo de riesgo pertenecen.El personal que trabaja en los laboratorios de nivel IV tiene entrenamiento específico y extensivo en el manejo de agentes infecciosos, y cuenta con entrenamiento para trabajar en el ambiente estéril y controlado. El laboratorio cuenta con un diseño y características especiales tendientes a proteger al operador y al ambiente. Todos los materiales son manipulados utilizando vestimenta y equipo de protección de características superiores a las exigidas para el trabajo en un laboratorio de nivel III. Los trajes están diseñados para
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cubrir la totalidad del cuerpo, presentan un sistema de respiración individual asociado y una leve sobrepresión interna para evitar así la entrada accidental de partículas infecciosas. Los laboratorios se mantienen con una presión de aire negativa, lo cual ayuda a impedir que los agentes nocivos escapen al ambiente.
TIPOS DE LABORATORIOSEn relación con el grado de riesgo los laboratorios combinan las características de diseño, construcción, medios de contención, equipo, prácticas y procedimientos de operación necesarios para trabajar con agentes patógenos de los distintos grupos de riesgo. De esta manera los laboratorios se clasifican en 3 categorías: Laboratorio básico: Dividido en dos grupos, el de nivel de bioseguridad 1;y el de nivel de bioseguridad 2;Laboratorio de contención: con nivel de bioseguridad 3, yLaboratorio de contención máxima: con nivel de bioseguridad 4.
PRÁCTICA GUIADA Nº 1
1.-Complete los nombres de los distintos símbolos de bioseguridad que se presentan a continuación.
1.- complete el recuadro :
NIVEL DE BIOSEGURIDAD
CARACTERISTICAS EJEMPLOS DE PATOGENOS
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PRACTICA N° 2
INSTRUMENTACIÓN: CENTRIFUGACIONrocedimiento por el cual se aplica la FUERZA CENTRÍFUGA para separar partículas que se encuentran en suspensión en un medio líquido. El incremento de la fuerza centrifuga condicionará que las partículas migren alejándose del eje de rotación de la centrifuga. El
proceso migratorio de las partículas se denomina sedimentación y la velocidad con que sedimentan es proporcional a la fuerza centrifuga expresada como incrementos de la gravedad (G).
La constante gravitatoria es proporcional a la velocidad de giro del rotor – soporte del medio que se centrifuga – y del radio del mismo. El radio del rotor de la centrifuga depende si ésta es del tipo ángulo fijo o flotante. En el primer caso es un promedio entre el radio mínimo y el máximo, y en el segundo es la distancia entre fondo del tubo y el eje.
La velocidad de la sedimentación se altera por la fuerza centrífuga, pero además por la forma de las partículas, y por la viscosidad del medio líquido que las suspende. También depende de la temperatura en cuanto ésta altere la viscosidad del medio o de las cargas eléctricas de las partículas.
Los equipos que permiten la centrifugación se llaman centrífugas y constan de un motor con controles, que mueven un rotor que sostiene los tubos de centrifugación. Los rotores son de dos clases, de ángulo fijo y flotantes, tal como se ve más arriba.
La mayoría de la centrífugas de laboratorio alcanzan las 5000 rpm, aunque algunas alcanzan los 16 000 rpm. Algunas centrífugas tienen refrigeración lo que permite separar partículas biológicamente activas tales como factores de coagulación, enzimas, etc.
P
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Las ultracentrífugas son centrífugas con vacío, refrigeración y velocidades de más de 500 000 x g. Permiten la separación de los componentes tisulares, tal como se aprecia en el cuadro adjunto y poder estudiar cada uno de ellos a partir del homogenizado de un tejido cualquiera.
Para evaluar con certeza la capacidad de una centrífuga para separar los componentes celulares debemos manejar gravedades en lugar de revoluciones por minuto, por lo que frecuentemente usamos el nomograma de Dole y Cotziar que presentamos a continuación.
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Suspender el tejido al 10%Homogenizar en Potter E.
Centrifugar a 600g x 10´
Sedimento: núcleos, restos celulares
Centrifugar el sobrenadante a 4000g x 15´
Sedimento:mitocondrias
Centrifugar el sobrenadante a 16 500g x 15´
Sedimento:lisosomas
Centrifugar el sobrenadante a 100 000g x 40´
Sedimento:microsomas
Sobrenadante: citosol
TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN
1. Diferencial: separa de acuerdo a las diferentes velocidades de sedimentación de distintas partículas. La usamos en la clínica para separar sedimentos de orina, o componentes del plasma.
2. Zonal: usando una gradiente de densidad lograda con un soluto denso, la más usada la sacarosa, las moléculas sedimentan de acuerdo a su coeficiente de sedimentación. La sacarosa densa evita que las bandas se mezclen.
La gradientes pueden ser discontinuas – preparadas mediante la colocación de soluciones de diversa densidad una sobre otra- y continuas – preparada mediante un equipo de mezcla de soluciones, que va incrementando la densidad progresivamente.
TUBOS DE CENTRIFUGACIÓN:
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NOMOGRAMA DE CALCULO VELOCIDAD Y RADIO DE CABEZAL DE CENTRÍFUGA
Existen tubos de centrífuga de diversa composición:1. Policarbonato: vidrio transparente, autoclavable y resistente a los
ácidos y bases de baja dilución.2. Borisilicato: vidrio muy resistente a químicos de alta concentración .3. Polietileno: plástico muy resistente a los químicos, pero sensible a la
temperatura.4. Propileno: plástico bastante resistente a la temperatura – autoclavable-
y resistente a casi todos los químicos.
PORTATUBOSSon de plástico o de metal y poco resistente a ácidos y bases fuertes. Deben ser conservados muy limpios.
Firma del alumno Firma del profesor
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PRACTICA N° 3
INSTRUMENTACIÓN: COLORIMETRIA
Es el análisis de la concentración de una muestra por el color que presenta. Todos hemos tenido la experiencia de valorar la concentración de sustancias coloreadas en solución, por observación directa, una taza de café o té, un vaso de refresco, son apreciados de esa manera. El examen se funda en la mayor o menor absorción de luz de acuerdo al mayor número de moléculas y tonalidad dependerá de la capacidad de absorber una u otra longitud de onda de luz, específicamente. La fotocolorimetría manipula las variables de este fenómeno controlando la luz incidente proveniente de un foco luminoso y su pureza, de modo tal que sólo incida aquella luz que es específicamente absorbida por la partícula que medimos.
Los cuerpos luminosos como el sol o las lámparas eléctricas emiten un gran espectro electromagnético que comprende amplias longitudes de onda, de las cuales muy pocas corresponden al espectro visible. En el cuadro anterior se aprecian todas las radiaciones electromagnéticas conocidas.
Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores complementarios) Esta luz reflejada es la que observamos como color propio del cuerpo coloreado. No interesa particularmente los colores que absorbe la solución que queremos medir. La selectividad de absorción que queremos medir. La selectividad de absorción de una partícula por una longitud de onda se basa en el hecho de que cada longitud de onda de luz corresponde a un distinto nivel de energía, y para excitar los electrones de cada partícula necesitamos un particular nivel de energía.
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450nm540nm640nm
Ultravioleta:400nm a 1nm
Rayos X1nm a 1pm
Rayos γ < 1pm
Infrarrojo:750nm a 25 um
Microondas:25um a 1mm
Ondas de radio> 1mm
Si consideramos que cada molécula absorbe luz de acuerdo a la concentración en que se encuentre dentro de la solución, a mayor absorción de luz y menor luz trasmitida. Estos factores están considerados en la ley de Lambert y Beer.
Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores complementarios). Esta luz reflejada es la que observamos como color propio del cuerpo coloreado. Interesa particularmente los colores que absorben la solución que queremos medir. La selectividad de absorción de una partícula por una longitud de onda se basa en que cada longitud de onda de luz corresponde a un distinto nivel de energía y para excitar los electrones de cada partícula se necesita un particular nivel de energía.
Sí consideramos que cada molécula absorbe luz de acuerdo a la concentración en que se encuentre dentro de la solución, a mayor concentración de sustancia, mayor absorción de luz y menor luz trasmitida. Estos factores están considerados en la Ley de Lambert y Beer, que es la siguiente:
Log Io/It = e.l.cDonde: Io = Luz incidente, It = Luz transmitida, C = concentración, L = longitud de paso, e = constante.
FOTOCOLORIMETRIA – ESPECTROFOTOMETRIA
La fotocolorimetría es la medida de la luz absorbida por una solución mediante un aparato que es un fotocolorímetro. El equipo consta de una fuente de luz artificial, un monocromador que separa exclusivamente luz de una sola longitud de onda (la que sea preferente para la medida), un recipiente o tubo de vidrio (que alberga la solución a medir), una célula fotoeléctrica que transforma la luz trasmitida en corriente eléctrica y una unidad de medida de la corriente eléctrica o galvanómetro.
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La calificación de colorímetro o espectrofotómetro depende del monocromador, sí éste es un filtro tendremos un fotocolorímetro, pero si es un prisma, o cualquier aditamento que proporcione luz de diversas longitudes de onda tendremos un espectrofotómetro.
Los fotocolorímetros y los espectrofotómetros reportan sus resultados bajo dos formas: absorbancia o luz absorbida por las partícula de la solución y transmitancia a o luz transmitida luego de atravesar el tubo con la solución. La transmitancia se expresa en valores numéricos entre 0 y 100%, es decir que una solución que no tiene particular trasmitirá el 100% y una perfectamente opaca el 0%. La absorbancia, también llamada densidad óptica DO, se expresa en valores semilogarítmicos entre 0 y 2 correspondiendo el 0 a la solución que no tiene partículas y por lo tanto no absorbe la luz.
Para encontrar la concentración de una solución problema, debemos comparar su lectura frente a un blanco – agua destilada o reactivos sin modificarse – con la lectura de un patrón o solución estándar bajo las mismas condiciones. Una solución estándar es generalmente una que contiene el problema con una concentración perfectamente medida en el laboratorio.
CÁLCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE UN PROBLEMA
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Luz Incidente Io Luz trasmitida It
Fuente de luz blanca Muestra: Absorción
Celda
Galvanómetro
Monocromador
Para hallar la concentración de una muestra problema tenemos dos procedimientos:
1. Factor de Calibración 2. Curvas de calibración
Factor de calibración: es la concentración de sustancia que corresponde a una unidad de medida, generalmente 0,001 de absorbancia.
Se obtiene Factor de calibración: concentración del patrón
Lectura del patrón (en absorbancia)
Esta fórmula deriva de la densidad óptica o absorbancia del problema:
DOP= eP lP cP
Si el coeficiente de extinción (e) es el mismo en ambos casos y el diámetro del tubo de lectura(l) es el mismo, la única diferencia está en la concentración. Luego:
DOst CS
= DOp CP
Despejando la concentración del problema cp, se obtiene:
cs
cp=Dp x -------- Dost
Concentración del problema = Densidad Óptica del Problema X Factor de calibración
La curva de calibración consiste en la obtención de las lecturas de absorción 0 de % de trasmitancia que corresponde a una secuencia creciente de concentraciones, estas son graficadas en un papel milimétrico si se trata de absorbancia o densidad óptica y de papel semilogarítmico si se trata de % de transmitancia.
PARTE EXPERIMENTAL
PREPARACIÓN DE UNA CURVA DE CALIBRACIÓNEl experimento consiste en preparar tubos de concentración creciente de un colorante y leerlos al fotocolorímetro o al espectrofotómetro, llevando a cero (0) el aparato con agua destilada. Construir una gráfica usando papel milimetrado para las lecturas hechas en DO (densidad óptica) o papel semilogarítmicos para las lecturas hechas en % transmitancia.Para el efecto, preparar cinco tubos de acuerdo al esquema y leer las soluciones al espectrofotómetro a 540 nm de longitud de onda. Practicar esta lectura tanto en DO como en % de transmitancia.
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Construir dos curvas de calibración, una en papel milimetrado y otra en papel semilogarítmico.
ContenidoTubo Nº
1 2 3 4 5mL Azul metileno al (5 mg/mL) 2 4 6 8 10mL Agua destilada 8 6 4 2 0
Concentración (mg/mL) % T A (A=2-logT%)
Desconocido 1Desconocido 2
COMENTARIO ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………...
Usando los valores obtenidos en % de trasmitancia, grafique usando el papel semilogarítmico de esta página.
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COMENTARIO……………………………………………………………………………………………
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
Firma del alumno Firma del profesor
PRACTICA N° 4
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Batería
0V 1V
AAg.Aa HclgCl.HCl.Vidrio
KCl.Hg2Cl2.HgSoluciónProblema.
INSTRUMENTACIÓN: POTENCIOMETRIA
La potenciometría es el procedimiento de elección para la medida del pH. El pH en una expresión numérica que corresponde al logaritmo de la inversa de la concentración de iones H+. La potenciometría se basa en la diferencia de potencial (voltaje) entre dos electrodos, el de medida y el de referencia, ambos sumergidos en la solución y bajo condiciones de equilibrio.
El instrumento consta de un ELECTRODO DE REFERENCIA que se mantiene constante durante la medida, un ELECTRODO DE MEDIDA que varia de acuerdo a la concentración de hidrógeno de la solución y un dispositivo o potenciómetro que mide la diferencia de potencial. El electrodo de referencia puede ser de dos clase: de calomel, mercurio metálico y cloruro mercurioso y de plata plata y cloruro de plata. El potencial de ese electrodo depende de la solución de cloruro de potasio en que está sumergido internamente.
El electrodo de medida, es también llamado electrodo de vidrio, está constituido por un tubo de vidrio cuyo extremo es particularmente selectivo al paso de iones hidrógeno. En su interior hay ácido clorhídrico HCl 0,1 M y un alambre de plata, cloruro de plata,
En el potenciómetro, un voltaje variable se opone al de la celda de medida. Un galvanómetro actúa como detector del punto nulo para indicar que es igual al voltaje opuesto de la celda de medida. Conectando la celda desconocida al circuito se produce un desnivel de voltaje que debe corregirse hasta alcanzar el
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punto nulo. La magnitud de la corrección puede leerse como fuerza electromotriz o como pH directamente.
En la práctica se ha usado los electrodos de pH para medir la concentración de otros iones. Los electrodos tienen una membrana adicional que sólo es selectiva al paso de determinado electrolito, sodio, potasio, calcio son medidos bajo esta manera con facilidad. También existe el electrodo de CO2 que deja pasar moléculas se este gas las que modifican el pH y por lo tanto son medidas con el electrodo de vidrio de pH.
PARTE EXPERIMENTAL
TITULACIÓN DE UN ÁCIDO DÉBIL CON UNA BASE FUERTE.
Se trata de determinar el pH de un grupo de tubos con varios niveles de titulación de ácido acético con hidróxido de sodio. Cuando se titula un ácido débil con una base fuerte se produce un aumento de pH inicialmente rápido para luego hacerse lento, dentro de ciertos márgenes y al final se alcaliniza rápidamente. La identificación del cambio de pH en cierto período de la titulación, se debe a la formación transitoria de una combinación de ácido débil y la sal correspondiente. En el caso del experimento será la combinación de ácido acético y acetato de sodio y son los componentes ordinarios de una solución amortiguadora o solución buffer.Para la experiencia preparar 11 tubos de acuerdo al siguiente esquema:
Tubo No mL acético 0,1 N mL NaOH 0,1 N mL agua destilada
1 5,0 0,0 5,02 5,0 0,5 4,53 5,0 1,0 4,04 5,0 1,5 3,55 5,0 2,0 3,06 5,0 2,5 2,57 5,0 3,0 2,08 5,0 3,5 1,59 5,0 4,0 1,010 5,0 4,5 0,511 5,0 5,0 0,0
Leer los tubos en el potenciómetro y graficar los resultados
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COMENTARIO
…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
Firma del alumno Firma del profesor
PRACTICA N° 5
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CINETICA ENZIMATICALas enzimas son proteínas que aceleran las reacciones químicas hasta su punto de equilibrio.
La ecuación general de las enzimas es:
E + S ES E + P C’ C››
La actividad enzimática se manifiesta y mide por:
Desaparición de sustratoFormación de productoModificación de cofactor
Muchos factores modifican la actividad enzimática:
pHTemperaturaConcentración de sustratoConcentración de enzimaTiempo de incubación
En nuestra práctica observamos el efecto de la pepsina sobre la albúmina del huevo. La actividad enzimática se apreciará por la pérdida de la turbidez proteica. La actividad enzimática reportar en función del % de formación de producto par ello hacer uso de la siguiente ecuación:
% Formación de producto (FC) = 100 – (Abs tubos/Abs albúmina)*100Donde: Abs tubo = Absorbancia de los tubos después del incubado.
Abs albúmina = Absorbancia de la albúmina (Abs = 0.995)
3. EXPERIMENTO.- Efecto del pH
El pH actúa sobre los grupos ionizados que pertenecen a los centros activos de las enzimas. Los grupos que pierden la ionización pierden la capacidad de interaccionar con el sustrato. Cada enzima tiene un pH óptimo de trabajo.
Preparar cinco tubos con:
TUBO Nº 1 2 3 4 5pH 1,0 1,5 6,0 9,5 11mL albúmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0mL HCL 1N 2,0 0,5 0,0 0,0 0,0
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mL CO3Na2 0,0 0,0 0,0 0,5 2,0mL agua destilada 0,0 1,5 2,0 1,5 0,0
Preincubar los cinco tubos más un tubo conteniendo 20 mL de pepsina al 1% a 37ºC por 5 minutos. Luego añadir rápidamente 3 mL de la pepsina preincubada a cada uno de los tubos 1–5. Mezclar e incubar a 37ºC por 10 min. Observar la diferencia o leerla en fotocolorímetro con filtro azul (420 nm).
4. EXPERIMENTO: Efecto de la temperatura.
Todo aumento de temperatura incrementa la actividad enzimática por aumento de la energía de activación. Pero paralelamente se va produciendo una desnaturalización parcial de la enzima que la inactiva.
Preparar cinco tubos con:
TUBO Nº 1 2 3 4 5mL albúmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5mL agua destilada 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5
Preparar otros cinco tubos con:
TUBO Nº 6 7 8 9 10mL pepsina 1% 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Incubar por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura:
TUBO Nº 1 y 6 2 y 7 3 y 8 4 y 9 5 10Temperatura O ºC Amb. 37 ºC 70 ºC 37 ºC 100 ºC
Agregar los respectivos tubo Nº 6 al Nº 10 a los que hay que incubar a las temperaturas a que se pre-incuban los tubos 1 – 5.
5. EXPERIMENTO. -Efecto de la concentración de la enzima
Aunque las enzimas no se destruyen ni con las reacciones, el aumento de ellas en la cubeta de reacción incrementa la velocidad.
Preparar 5 tubos con:
TUBO Nº 1 2 3 4 5
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mL albúmina 5,0 5,0 5.0 5,0 5,0
mL HCL 1N 0,5 0,5 0.5 0,5 0,5mL agua destilada 1,5 2,5 3.5 4,0 4,5mL pepsina 0,0 0,0 0.0 0,0 0,0
Incubar los 5 tubos a 37ºC por 5 minutos y enseguida añadir:
TUBO Nº 1 2 3 4 5mL pepsina incubada 3,0 2,0 1,0 0.5 0,1
Incubar por cinco minutos a 37ºC. Observar al fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul), contra una lectura de agua.
6. EXPERIMENTO.-Efecto de la concentración del sustrato
Si es una reacción enzimática incrementamos progresivamente la concentración del sustrato, aumentará la velocidad enzimática (velocidad inicial) hasta un punto en que la velocidad llega a una meseta plana que no modifica aunque sigamos aumentando el sustrato, habremos saturado la enzima.
Preparar 6 tubos con:
TUBO Nº 1 2 3 4 5 6
mL albúmina 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5mL agua destilada 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0mL pepsina 1% 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Leer a 420 nm (filtro azul). Anotar los resultados: incubar a 37ºC. Colocar 0,5 mL que pepsina pre-dirigida. Incubar por otros 5 minutos a 37ºC. Leer al fotocolorímetro a 420 nm (filtro azul). Restar la segunda lectura de la primera. Graficar y comentar los resultados.
26
Experimento: Efecto del pH
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
pH
% F
orm
ació
n pr
oduc
to
Experimento: Efecto de la temperatura
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
Temperatura (ºC)
% F
orm
ació
n pr
oduc
to
Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
Firma del alumno Firma del profesor
PRACTICA N° 6
27
Experimento: Efecto de la concentración de enzima
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12
Concentración enzima (mg/mL)
% F
orm
ació
n pr
oduc
to
Experimento: Efecto de la concentración de sustrato
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5 6
Concentración de sustrato
% F
orm
ació
n pr
oduc
to
DIGESTION DE CARBOHIDRATOSEl carbohidrato más importante en la alimentación es la glucosa, la cual ingerimos bajo la forma de disacáridos (maltosa, sacarosa y lactosa) o de almidón, polisacáridos formado por muchas moléculas de glucosa. El almidón es el constituyente esencial de cereales, leguminosa, tubérculos y raíces. La digestión del almidón se produce en el intestino delgado gracias a la presencia de enzimas digestivas producidas por las glándulas salivares, el páncreas y la pared intestinal. Estas enzimas son:
La alfa amilasa salivarLa alfa amilasa pancreáticaLa amilo 1,6 glucosidasa de la pared intestinal
Las alfa amilasas son enzimas que actúan a pH neutro y en presencia de iones cloro. Rompen los enlaces amilo 1,4 dando como resultado oligosacáridos y glucosa.Existe dos formas de evaluar la actividad enzimática de la amilasa:
Por desaparición de sustrato: forma como desaparece el almidón el que se aprecia por la reacción del lugol.
Por formación de producto: forma como aparecen carbohidratos reductores (glucosa) en el medio, los que se aprecian por reducción del cobre.
En nuestra práctica evaluaremos la actividad enzimática de la amilasa sobre el almidón mediante la reacción del remanente de almidón frente al yodo a mayor decoloración, mayor actividad enzimática.
1. EXPERIMENTO.- Digestión del almidón por la amilasa salivar.
Para la experiencia preparar cuatro tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema.
TUBO 1 2 3 4ml almidón 1% 2 2 2 2ml Buffer fosfato pH 6,6 1 1 1 0ml HCL 0,3N 0 0 0 3,4ml Suero fisiológico 3 2,4 0 0ml Agua destilada 0 0 2,4 0
Colocar en baño de María a 37ºC por 5 minutos. Agregar:ml solución de saliva 0 0,6 0,6 0,6
Colocar en baño de maría a 37ºC por 20 minutos Pasado este tiempo tomar 0,5ml de cada tubo y preparar cuatro tubos más de acuerdo al esquema
TUBO 1 2 3 4
28
ml digestión tubo 1 0, 5 0 0 0ml digestión tubo 2 0 0,5 0 0ml digestión tubo 3 0 0 0,5 0ml digestión tubo 4 0 0 0 0,5ml HCL 0,05N 5 5 5 5ml Solución yodada 0,5 0,5 0,5 0,5Dejar en reposo por 15 minutos. Leer al fotocolorímetro con filtro rojo (660nm)
INFORME DE LA PRÁCTICA III
Nombre:Grupo : Fecha:
Experimento 7.- Digestión del almidón por la amilasa salivar
COMENTARIO:………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
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PRACTICA N° 7
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ABSORCION DE CARBOHIDRATOSDespués de la digestión de los carbohidratos por efecto de amilasas salivar y pancreática, amilo 1,6 glucosidasa, y disacarasas tenemos como resultado monosacáridos: glucosa, fructosa, galactosa, que deberán ser absorbidos por la mucosa intestinal para su ingreso a la circulación sanguínea. Los carbohidratos se absorben en el yeyuno mediante dos mecanismos, la simple difusión favorecida por la gradiente de concentración y el transporte activo, aún contra la gradiente. El orden de facilidad en la absorción es de galactosa glucosa: ribosa.
El borde en cepillo de las células intestinales tiene varios sistemas trasportadores. Un transportador de glucosa dependiente del sodio (SLGT1) se enlaza tanto a la glucosa como al sodio en sitios separados aumentando el tenor de sodio intracelular. La energía necesaria para este transporte se obtiene de la hidrólisis del ATP vinculado a una bomba de sodio que intercambia sodio con potasio.
También participa un transportador facilitador independiente del sodio llamado GLUT 5. La hidrólisis de los polisacáridos, oligosacáridos y disacáridos es muy rápida por lo que usualmente los procedimientos de absorción se saturan con rapidez.
1. EXPERIMENTO.-Absorción de la glucosa por el intestino de la rata
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1. Se usan ratas con 24 a 36 horas de ayuno. Se les anestesia con eter bajo una campana de vidrio. Abrirles el abdomen y se retira una porción de 5 cm de intestino, de modo que no puede mesenterio adherido.
2. Se lava la luz intestinal varias veces mediante una jeringa con solución Ringer Fosfato pH 7,4 Mediante el uso de una baqueta de vidrio se empuja un extremo del intestino dentro del mismo buscando evertir la porción mucosa hacia fuera. Mantener el intestino en solución Ringer Fosfato pH 7,4 a temperatura ambiente.
3. Cerrar un extremo del intestino con hilo y dejar otra ligadura suelta en el otro extremo del intestino.
4. Introducir en el saco intestinal formato 2 ml de solución Ringer Fosfato pH 7,4 con 0,2% de glucosa. Cerrar la ligadura suelta y revisar que no haya pérdida de líquido.
5. Introducir el saco lleno en un tubo con 2 ml solución Ringer Fosfato pH 7,4 con glucosa 0,2% Incubar a 37ºC por 30 minutos. Pasado del tiempo sacar el saquito, secarlo por fuera con papel de filtro. Cortarlo con tijera y vaciar el contenido en u tubo de ensayo.
6. Diluir 1:10 con agua destilada, tanto el contenido del saquito, como el del tubo que lo recibió durante la incubación. Luego proceder a preparar 4 tubos de acuerdo al siguiente esquema.
TUBO 1 2 3 4ml reactivo para glucosa 2 2 2 2μl agua destilada 50 0 0 0μl patrón 20 mg/dL 0 50 0 0μl solución diluida intra saco 0 0 50 0μl solución diluida extra saco 0 0 0 50Incubar a 37ºC por 10 minutos. Enfriar y leer en el fotocolorímetro a 520nm. Usando el tubo 1 como blanco
COMENTARIO: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
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PRACTICA N° 8
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GLICOLISISLa vía metabólica más importante para la glucosa es la vía glicolítica o de Embden Meyehof. Esta presente, naturalmente, en todos los tejidos y es responsable del aprovechamiento energético de la glucosa y aún de otros carbohidratos. Tiene dos formas de manifestarse: la forma anaeróbica cuando la concentración de oxígeno es baja, produce ácido pirúvico y ácido láctico, y genera escasamente dos moléculas de ATP, tal como se aprecia en la siguiente fórmula global.
GLUCOSA + 2ADP + Pi 2 lactato + 2ATP + 2H2O
Cuando la glicólisis transcurre en presencia abundante de oxígeno, tiene como producto final el ácido pirúvico, el cual se transforma en acétil CoA mediante el proceso de decarboxilación oxidativa, en ingresa al Ciclo de Krebs donde produce 38 moléculas de ATP.
1. EXPERIMENTO.- Glicólisis.
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La glicólisis anaeróbica (parcialmente) se demuestra por el aumento de compuestos ácidos (pirúvico y láctico) en el tubo de reacción. Para el efecto preparar cuatro tubos de acuerdo al esquema.
TUBO 1 2 3 4ml solución de Potter pH 7,4 2,5 2,5 2,5 2,5ml Glucosa 0,1 m 0,5 0,5 0,5 0,5ml NAD 10m g/ml 0,2 0,0 0,2 0,2ml ATP 5m g/ml 0,2 0,2 0 0,2ml Nicotinamida 0,4m 0,1 0,1 0,1 0,1ml Yodoacetato 0,1m 0 0 0 0,1ml Agua destilada 0,1 0,3 0,3 0Colocar en baño de maría 37ºC por 5 minutos
Gotas de rojo de fenol Ii Ii ii Iiml homogenizado de hígado 0,5 0,5 0,5 0,5Tapar e incubar 1 hora a 37ºCTitular cada tubo con NaOH 0,01N hasta el color original
COMENTARIO: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
RESPIRACIÓN TISULAR
La respiración tisular es el proceso por el cual se aprovecha la energía almacenada en los nutrientes (glucosa, ácidos grasos, aminoácidos) a través del Acétil CoA, mediante procesos de oxidación.Durante el proceso de oxidación del Acil Coa se forman equivalentes reductores en forma de hidrógeno o electrones que ingresan a la cadena respiratoria, localizada en las mitocondrias y genera muchas moléculas de ATP. Como puede apreciarse en el esquema adjunto hay tres fuentes de generación de electrones que producen 3 moléculas de ATP, el isocitrato, el cetoglutarato y el malato y una que sólo proporciona dos ATP que es el succinato, debido a que ingresa al ciclo de Krebs a nivel de la Coenzima Q y no del NAD como las otras.
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El punto final del transporte de los electrones por la cadena respiratoria es el oxígeno. Dos átomos de hidrógeno se unen a ½ molécula de oxígeno para forma una molécula de agua. El proceso oxidativo de los nutrientes se puede seguir por el consumo de oxígeno. .
2. EXPERIMENTO: Respiración Tisular
El experimento estudia la respiración tisular mediante la manometría. Un manómetro es un instrumento que mide los cambios en la presión de los gases. Esta basado en el principio de vasos comunicantes, si colocamos un líquido en dos recipientes que se comunican entre sí, ambas ramas serán iguales siempre que sobre ellas exista la misma presión sobre una de ellas disminuye los niveles de líquido se desigualan. Los equipos que usaremos serán iguales o semejantes a los que se observan en el gráfico, es decir constan de un ambiente cerrado para la reacción, un medio de absorción de CO2 que puede combinar
Preparar dos frascos de acuerdo al siguiente esquema:
FRASCO Nº 1ml Solución de Potter pH 7,4 3ml Succinato de potasio 0,5m 0,3ml Agua destilada 0,7ml Homogenizado 0,5
Cerrar bien los frascos. Incubar a temperatura ambiente. Medir cada 2 minutos la modificación del nivel del manómetro. Prepara un gráfico de consumo de oxígeno vs tiempo.
34
Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
Firma del alumno Firma del profesor
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PRACTICA N° 9
COLESTEROL DE FRACCIONES LIPOPROTEICAS
Las proteínas son lípidos complejos resultado de unir la grasa con proteínas. Los lípidos sanguíneos se encuentran bajo esta forma y divididos en cuatro tipos de lipoproteína:
Alfa lipoproteína (HDL) ricas en proteínas y fosfolípidosPre –beta lipoproteínas (VLDL): ricas en triglicéridoBeta lipoproteínas (LDL): ricas en colesterol Quilomicrones (Q): ricos en triglicéridos dietéticos
Toda las lipoproteínas tienen colesterol, triglicéridos, fosfolípidos y proteínas, pero en distinta concentración relativa.
El colesterol es la grasa que genera la arterioescleroris al depositarse en las paredes de los vasos sanguíneos. El colesterol de las betalipoproteínas está en actitud de depositarse en los vasos constituye la mayor parte del colesterol sanguíneo. El colesterol de las alfa lipoproteínas (HDL) es aquel que está siendo retirado de los vasos, por lo que su presencia es beneficiosa.Para investigar el colesterol de las alfa lipoproteínas usamos un reactivo precipitante (fosfotúngstico-cloruro de calcio) que precipita a las betas y prebetalipoproteínas dejando en solución a las alfa, sobre las que se realiza la reacción de color típica del colesterol.
1. EXPERIMENTO Dosaje colesterol total y colesterol HDL en sangre.
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Se toma una muestra de sangre del paciente en ayuno de por lo menos 24 horas. La sangre se coloca en tubo limpio sin anticoagulante.
Preparar un tubo al que se le coloca:
1ml de suero límpido0.1 ml de reactivo precipitante HDL o II gotas
Agitar y dejar en reposo por minutos al ambiente Centrifugar a 3 000 por 10 minutos separar el sobrenadante.
Preparar cuatro tubos límpidos y colocar:
TUBO Nº 1 2 3 4ml Suero límpido 0,02 0 0 0
ml Sobrenadente anterior 0 0,02 0 0
ml Patrón de colesterol 0 0 0,02 0
ml Agua destilada 0 0 0 0,02
ml Reactivo de color 2 2 2 2
Agitar: Incubar por 15 minutos a 37ºC.
Leer al fotocolorímetro a 520 mu los tubos 1,2 y 3, llevando a cero con el blanco (tubo4)Cálculos
200
Colesterol mg/dl= -------- X D.O.(1 ó 2) D.O (3)
2. EXPERIMENTO : Dosaje de triglicéridos
Preparar tres tubos con:
TUBO Nº 1 2 3ml Suero 0 0,02 0
ml Patrón de triglicéridos 0 0 0,02
ml Reactivo de color 2 2 2
Agitar, incubar a 37ºC por 15 minutos
37
Leer al fotocolorímetro a 520 nm los tubos 2 y 3 llevando a “O” con el tubo 1
Conc. patrón
Triglicéridos mg/dl = ------- x D.O.(2) D.O (3)
INFORME DE LA PRÁCTICA : RIESGO CORONARIO
Nombre:.................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................................
Experimento 3: Dosaje de colesterol total y colesterol HDL en sangre
Patrón: Lectura: Concentración: Factor de Calibración:Colesterol total:
3. EXPERIMENTO : Valoración de las lipoproteínas por electroforesis en acetato de celulosa
La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) sobre la base de su tamaño molecular y carga eléctrica. Los ácidos nucleicos ya disponen de una carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que las proteínas son moléculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de aminoácidos (fundamentalmente ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina e histidina). Para la separación se usa un gel de agarosa, poliacrilamida o acetato de celulosa. Al poner la mezcla de moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir pasando por el papel, por la que las pequeñas se moverán mejor y rápidamente. Así, las más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del lugar de partida.En resumen, puede decirse que cuando una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga eléctrica 2) su tamaño 3) la intensidad del campo eléctrico y 4) la temperatura del medio.Las proteínas están compuestas de aminoácidos que poseen grupos ionizables (principalmente -COO-y -NH3+), pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer eléctricamente neutras según la proporción de los diversos grupos ionizados a un determinado pH.
38
En suero humano la composición normal es: Proteína total: 6,4 a 8,3 g/dL Albúmina: 3,5 a 5,0 g/dL Alfa-1 globulina: 0,1 a 0,3 g/dL Alfa-2 globulina: 0,6 a 1,0 g/dL Beta globulina: 0,7 a 1,2 g/dL Gammaglobulina: 0,7 a 1,6 g/dL ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA
Se usa para la separación y caracterización de proteínas y otras moléculas. El soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de adsorción mínimas, por lo que se evita la formación de colas y los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Otras ventajas son:1) La separación es muy rápida2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeñas3) Las tiras pueden hacerse transparentes4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes separados5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivos
MATERIAL Y REACTIVOS
Material- Tiras de acetato de celulosa (“Cellogel”)- Papel de filtro para secar las tiras de acetato- Cubeta de electroforesis- Aplicador- Fuente de electroforesis
Reactivos-Tampón Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH=8,6-Solución de tinción: 0.1% (p/v) ponceau S stain en ácido acético 1% -Solución de lavado: ácido acético 1% -Suero
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTALElectroforesis:- Humedecer en tampón las tiras de acetato de celulosa 10 minutos antes de su
uso, para su equilibrado.- Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la superficie- penetrable quede hacia la parte superior. El lado penetrable es el que se ve
cuando la tira se coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la esquina inferior derecha
- Depositar la muestra de suero en la tira de acetato de celulosa, en el extremo próximo al cátodo.
- Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 100 voltios durante 60 minutos.
Revelado:
39
- Finalizada la separación, depositar las tiras en una cubeta con solución de tinción, de modo que queden cubiertas por el líquido, durante 10 minutos.
- Lavar las tiras en solución de destinción hasta que se observen bien las bandas de proteína (rojo) sobre un fondo blanco.
TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOSDibujar el patrón de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de proteínas séricas, indicando la posición de ánodo y cátodo así como el punto de aplicación de la muestra. Identificar las proteínas que corresponden a cada banda y justificar el orden.
Comentario: ………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………
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PRACTICA N° 10
40
TRANSAMINACION
Una de las reacciones generales de los aminoácidos es la transaminación o trasporte de un grupo amino de un aminoácido a un cetoácido, trasformado al primero en cetoácido y al segundo en aminoácido. Esta transformación posibilita la formación de carbohidratos a partir de aminoácidos, esto es el fenómeno de la neoglucogénesis.
LA ecuación general de estas reacciones es:
R=CH-COOH + R-C-COOG R-C-COOH+R-CH-COOH
Nh2 O O NH2
En el caso de nuestro experimento la transaminasa que estudiaremos es la transaminasa glutámico pirúvica que transforma el alfa cetoglutárico (cetoácido) en glutámico (aminoácido) y a la alanina (animoácido) en perúvico (cetoácido).Esa enzima que es particularmente rica en el tejido hepático es un excelente herramienta de estudio clínico de ese órgano, en problemas como la hepatitis o la cirrosis hepática.El procedimiento de análisis se llevará a cabo mediante la cromatografía en capa fina.
PROCEDIMIENTO CROMATOGRÁFICOS
La cromatografía es un procedimiento de análisis por el cual una mezcla de moléculas es separada en sus componentes mediante el uso de una fase estacionaria y una móvil.
La fase estacionaria o soporte da nombre al tipo de cromatografía: papel, columna, capa fina y la fase móvil es líquida o gaseosa.
La separación de componentes se produce por el fenómeno de partición por solventes, esto es ante una mezcla de líquidos no miscible entre sí, algunos
41
componentes tendrán mayor posibilidad de localizarse en uno u otro componente, aquellos que se localicen en el componente más lejano del soporte migraran más y aquellos cercanos serán adsorbidos por el soporte.
Existen una forma identificatoria de medir la migración de las moléculas analizadas y es el Rf. Este valor corresponde a la relación entre los cm migrados por la molécula y aquellos migrados por el medio móvil.
1. EXPERIMENTO: Demostración de transaminación por cromatografía
Preparar 4 tubos de acuerdo la esquema:
TUBO Nº 1 2 3 4ml cetoglutarato 0,2 M 0,3 0,3 0 0
ml alanina 0,2M 0,3 0,3 0 0
ml piruvato 0,2M 0 0 0,3 0,3
ml glutamato 0,2M 0 0 0.,3 0,3
ml arsenito 0,1M 0,4 0,4 0,4 0,4
ml Enzima activa 0 1 0 1
ml Enzima inactiva 1 0 1 0
42
RF =-----------------a
b
ab a
Incubar todos los tubos por 45 minutos a 37ºC. Retirar los tubos del baño de María y agregar 6ml de alcohol etílico a cada tubo. Agitar y esperar por dos minutos. Centrifugar y usar los sobrenadantes para la cromatografía.
CromatografíaMarcar a 3 cm del borde una línea suave con un lápiz, tratando de no dañar la sílica gel. Marcar en esa línea seis puntos separados por 2 cm cada uno. Colocar en cada punto cinco gotas del respectivo sobrenadante y en las dos últimas 5 gotas de alanina y cinco de glutamato respectivamente. Dejar secar Colocar la cromatoplaca en una cámara de cromatografía con una mezcla de propanol: agua en la proporción de 8: Dejar correr hasta que el nivel líquido le falte 1 cm para llegar al extremo de la placa. Marcar el nivel al que alcanzó el líquido con un lápiz y dejar secar.
Aplicar con un spray una solución de ninhidrina al 0,1% e butanol. Colocar a la estufa por 10 minutos. Marcar las manchas obtenidas.
Obtener el Rf de cada mancha mediante la fórmula:
Distancia de origen al punto medio de la mancha Rf:
Distancia de origen al nivel máximo del solvente
Comentario:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….
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PRACTICA N° 11
43
EVALUACION NUTRICIONALExperimento 1.- Manejo de Tablas de Composición de Alimentos
La forma más exacta de evaluar la ingesta de nutrientes por un sujeto es a través del cálculo de la ingesta alimentaria, bien documentada y exacta y mediante las Tablas de Composición de Alimentos. En la presente práctica analizaremos:
1. Las necesidades calóricas de un sujeto: tomando en cuenta, peso y trabajo. Así conocemos que una persona gasta como Metabolismo Basal 1 kcaloría /kg. Peso/hora. A ello añadimos aproximadamente un 50% por trabajo de mediana intensidad.
2. Las necesidades proteícas de un sujeto: tomado su peso, aceptamos una necesidad de 1g/kg de peso/día( en condiciones mínimas 0,5/kg peso/día).
3. Las necesidades de nutrientes (proteína, carbohidratos y grasa) de un día al azar. Con ello podemos establecer su ingesta calórica y proteíca y por lo tanto su déficit o adecuación.
Para el efecto usaremos la siguiente Tabla de Composición de Alimentos resumida.
TABLA DE COMPOSICIÓN DE ALIMENTOSg/100g de alimento
Alimento Proteína Lípido Carbohidratos
Atún (conserva) 29,0 4,8 0,0Bacalao (seco) 81,8 2,8 0,0Calamar 16,4 0,9 0,0Camarón 17,3 0,2 2,5Carne (cerdo) 15,0 15,1 0,0Carne (Pavo) 20,1 20,2 0,0Carne (pollo) 18,2 10,2 0,0Carne (pulpa) 21,3 1,6 0,0Carne Seca 48,1 9,4 0,0Chicharrones 11,3 61,4 0,0Cojinova 20,2 0,7 0,0Corvina 19,9 0,9 0,0Hígado 19,5 6,6 3,6Huevo (total) 12,8 11,8 1,0Jamón del País 15,9 26,6 0,0Jamón Inglés 25,8 20,5 0,0Leche fresca 2,9 3,3 7,0Lenguado 19.0 0,5 0,0Merluza 19,3 0,8 0,0
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Pejerrey 18,7 1,2 0,0Queso Fresco 16,0 10,3 3,7Queso mantecoso 25,8 20,2 7,4Tocino 9,1 65,0 1,6Trucha 18,2 1,0 0,0
Alimento Proteína Lípido Carbohidratos
Arroz (seco) 6,5 0,7 78,1Arveja (verde) 8,3 0,7 24,2Avena 10,6 0,9 68,5Bizcocho 8,8 6,9 64,4Camote 1,2 0,2 27,1Fideos 8,7 0,3 78,3Frejol negro 21,2 1,7 53,3Frejol soya 33,4 16,4 35,5Frejol tarhui 40,9 13,4 27,3Galletas (soda) 9,4 14,7 67,9Galletas (Vainilla) 6,0 12,7 75,0Garbanzo 19,1 5,1 61,4
Alimento Proteína Lípido Carbohidratos
Lentejas 22,8 1,2 59,4Maíz (cancha) 6,7 2,7 79,8Maíz (choclo) 3,3 0,8 27,8Maní 28.8 46,9 18,1Nuez 13,7 67,2 13,2Olluco 0,8 0,1 14,2Pallares 19,9 1,1 61,8Pan (frances) 9,2 0,3 68,2Papa blanca 2,1 0,3 22,4Papa Seca 8,3 0,5 73,2Quinua 11,9 4,7 67,6Yuca 0,8 0,2 39.3Aceitunas 1,2 33,2 6,8 Blanquillo 0,6 0,1 17,1Cebolla 0,9 0,1 7,4 Coco 3,8 18,9 19,7Col 1,4 0,0 5.2Coliflor 2,0 0,6 5,8Lechuga 1,4 0,2 3,3Nabo 0,8 0,2 5,2Pepina 0,5 0,1 2,7Rabanitos 0,8 0,0 3,1
45
Tomate 0,8 0,2 4,0Zanahoria 0,6 0,4 9,5Zapallo 0,7 0,2 6,4
Alimento Proteína Lípido Carbohidratos
Aceite 0,0 100 0,0Azucar 0,0 0,0 99,5Chocolate 2.0 30,0 60,0Cocoa 9,0 19,0 31,0Gelatina(seca)* 85,6 0,1 0,0Limón 0.5 0,0 11,2Maizena 8,0 3,0 74,0Margarina 0,6 81 0,4Naranja 1.2 0,0 11,2Palta 1,7 12,6 6,5Papaya 0,4 0,1 8,3Platano isla 0,8 0,2 23,8Uva negra 0,3 0,1 17,9
* Se usan al 3-4g%
GASTOS DE ENERGIA DE ACUERDO A ACTIVIDAD Y SEXO
ACTIVIDAD MUJER : Kcal /kg/hora
HOMBRE : Kcal /k Kg/hora
Durmiendo 1,1 1,0 – 1,2 ,9-Muy Ligera: manejo de auto, laboratorio, mecanografía, coser y planchar
2,0 1,2 – 2.5 1,1-
Ligera: caminar, carpintería, mecanica, lavado de ropa
3,9 2,5-4,9 2,0-
Moderada: fregar pisos, ciclismo, tenis, baile
5,9 5,0-7,4 4,0-
Pesada: albañil, natación, fútbol, básquetbol.
10,0 7,5-12,0 6,0-
Firma del alumno Firma del profesor
46
