LAPORAN RESMIBIOTEKNOLOGIACARA 1 VISUALISASI EKSTRAKSI DNA

OLEH :KELOMPOK 2BUDHY WIYARSIH 26020113120039ASISTEN : AHMAD SADDAM HABIBI26020111170001MUHAMMAD SYAHRIAL A.26020112130038AKBAR FIRMANSYAH26020111130074

PROGRAM STUDI ILMU KELAUTANJURUSAN ILMU KELAUTANFAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTANUNIVERSITAS DIPONEGOROSEMARANG2015

LEMBAR PENILAIAN DAN PENGESAHAN

No.KeteranganNilai

1.Pendahuluan

2.Tinjauan Pustaka

3Materi dan Metode

4.Hasil dan Pembahasan

5.Penutup

6.Daftar Pustaka

7.Lampiran

Total

Semarang, 17 Juni 2015Praktikan

BUDHY WIYARSIH26020113120039

Asisten

AHMAD SADDAM HABIBI 26020111170001 Asisten

MUHAMMAD SYAHRIAL A. 26020112130038

Mengetahui,Kordinator Asisten Praktikum

AKBAR FIRMANSYAH26020111130074

I. PENDAHULUAN

1.1 Latar belakangBioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, jamur, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya.Rekayasa genetik atau DNA rekombinan atau pencangkokan gen adalah suatu kumpulan teknikteknik eksperimental yang memungkinkan peneliti untuk mengisolasi, mengidentifikasi, dan melipatgandakan suatu fragmen DNA dalam bentuk murninya.Manipulasi-manipulasi tersebut dilakukan secara in vitro dengan menggunakan material-material biologi.Bioteknologi adalah cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk hidup (bakteri, jamur, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup (enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan jasa. Dewasa ini, perkembangan bioteknologi tidak hanya didasari pada biologi semata, tetapi juga pada ilmu-ilmu terapan dan murni lain, seperti biokimia, komputer, biologi molekular, mikrobiologi, genetika, kimia, matematika, dan lain sebagainya.

1.2 Tujuana. Melatih praktikan untuk dapat cara mengeksktraksi DNA secara sederhana.b. Melatih praktikan untuk dapat melihat presipitasi DNA dari hasil ekstraksi.c. Melatih praktikan untuk dapat melakukan analisa hasil ekstraksi DNA.

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 DNADNA adalah suatu asam nukleat yang menyimpan segala informasi biologis yang unik dari setiap makhluk hidup dan beberapa virus. Struktur kimianya berupa makromolekul kompleks yang terdiri atas 3 macam molekul, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), asam fosfat, dan basa nitrogen. Peran utama dari molekul DNA adalah penyimpanan jangka panjang informasi. DNA sering dibandingkan dengan satu set cetak biru atau resep, atau kode, karena berisi instruksi yang dibutuhkan untuk membangun komponen lain dari sel, seperti protein dan molekul RNA. Segmen DNA yang membawa informasi genetik ini disebut gen, tetapi urutan DNA lain yang memiliki tujuan struktural, atau terlibat dalam mengatur penggunaan informasi genetik (Gardner, 1991).DNA atau asam deoksiribonukleat adalah materi herediter pada manusia dan di hampir semua organisme lain. DNA mengkode informasi genetik yang digunakan dalam pengembangan hampir semua organisme hidup termasuk virus. DNA adalah asam nukleat dan salah satu makromolekul utama yang penting untuk semua bentuk (Birren dan Lai, 1993).DNA adalah sebagian besar terbuat dari dua untai, digulung untuk membentuk heliks ganda. Untai DNA terbuat dari urutan nukleotida. Nukleotida terdiri dari basa nitrogen, gula monosakarida dan gugus fosfat. Nukleotida terhubung satu sama lain oleh ikatan kovalen antara gula dan gugus fosfat, yang mengakibatkan tulang punggung gula-fosfat bergantian. DNA menyimpan informasi, kedua untai DNA menyimpan informasi biologis yang sama (Bowen, 2002).

2.2 Ekstraksi DNAEkstraksi DNA adalah langkah pertama yang sangat penting dalam langkah-langkah kerja analisisDNA sequencing.Kualitas secara keseluruhan, akurasi dan panjang pembacaan urutan basa DNA dapat dipengaruhi secara signifikan oleh karakter sample itu sendiri, dan metode yang dipakai untuk ekstraksi DNA. Mengisolasi DNA dengan kualitas tinggi dari berbagai jenis sample memiliki tantangan tersendiri, dan metode yang ideal akan beragam bergantung pada jenis jaringan(termasuk darah), bagaimana ia diperoleh dari sumbernya, dan bagaimana sample ditangani atau disimpan sebelum diekstrak. Metode untuk isolasi asam nukleat sering dikerjakan menggunakan penghancuran mekanik atau metode kimiawi, yang kadang-kadang juga terotomatisasi. Baik metode ekstraksi manual maupun otomatis yang digunakan, kita harus berhati-hati untuk meminimalisir degradasi DNA, dengan menghindari ekspos terhadap panas, cahaya,freeze-thawyang berulang-ulang danvortex.Selanjutnya, laboratorium harus diatur sedemikian rupa untuk meminimalisir kemungkinan kontaminasi silang diantara sample (Wolfe, 1995).Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui elektroforesis. Ekstraksi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam ekstraksi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam proses ekstraksi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA metodenya harus efektif dan bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

2.3 ElektroforesisElektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan ukuran.Elektroforesis merupakan metode yang paling banyak dipakai saat ini dalam percobaan biokimia dan biologi molekuler (Bowen, 2000).Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat.Elektroforesis dalam skala besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap individu (Fairbanks & Andersen, 1999).Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasaran laju perpindahannya melewati suatu gel di bawah pengaruh medan listrik.Elektroforesis gel memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama (Campbellet all,2002).Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam elektroforesis DNA, yaitu:a. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi primer.b. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.c. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi RNA pada ukuran standar.(Daviset all, 1994).

2.4 DNA LadderDNA ladder adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil amplifikasi. DNA ladder yang terdapat di dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA yang bermigrasi. DNA tersebut merupakan DNA ladder yang telah dibuat oleh pabrik sehingga tanda pasangan basanya jelas. Penggunaan DNA ladder tersebut dikarenakan molekul DNA yang akan diamati memiliki fragmen DNA dengan ukuran 110-20.000 pb (Bowen, 1999).DNA ladder untuk membandingkan ukuran panjang basa pada fragmen DNA sampel. sebagai penanda berat molekul DNA. Berfungai sebagai penanda posisi molekul DNA yang berimigrasi untuk menentukan perkiraa ukuran basanya (Martin, 1999).Seemen DNA spesifik yang telah diketahui ukurannya. DNA marker berfungsi sebagai acuan untk engetahui ukuran DNA hasil amplifikasi yang terdapat pada elektroforesis. Salah astu contoh DNA ladder adalan lambda HindIII yang mempunyai kisaran 8 fragmen 125 pb (Champbell, 2002).

III. MATERI DAN METODE

3.1 Materi 3.1.1 Waktu dan TempatHari/tanggal: Kamis / 11 Juni 2015Waktu : 15.00 s.d selesaiTempat: Laboratorium Bioteknologi

3.1.2 Alat dan Bahan3.1.2.1 Ekstraksi DNATabel 1. Alat No.NamaGambarKeterangan

1.Saringan Untuk menyaring sampel agar didapatkan ekstrak.

2.Gelas bekkerWadah ekstrak yang telah disaring.

3.Tabung sentrifugeWadah campuran ekstrak dengan alkohol.

4.Plastik ziplockWadah sampel saat dihancurkan.

5.PengadukMengaduk campuran larutab lysis buffer.

6.Kertas saringPenyaring sampel.

Tabel 2. BahanNo.NamaGambarKeterangan

1.Sample ( strawberry, pisang, potongan daging).Sebagai sampel yang diteliti.

2.Alkohol 95%Untuk memisahkan DNA dengan ekstrak.

3.Shampoo Campuran lysis buffer.

4.Enzim Pemecah protein amilase.

5.Garam iodiumCampuran lysis buffer.

6.Akuabides Sebagai pelarut ekstraksi.

3.1.2.2 ElektroforesisTabel 3. Alat No.NamaGambarKeterangan

1.MikropipetMengambil larutan dalam jumlah tertentu.

2.Seperangkat gel elektroforesisAlat untuk meluhat sekuen DNA yang akan di teliti.

3.Tip Sebagai wadah larutan yang diambil mikropipet.

4.UV-IluminatorUntuk memfisualkan DNA.

Tabel 4. BahanNo.NamaGambarKeterangan

1.Loading dyeCampuran sampel DNA sebelum ditaruh disumur elektroforesis.

2.Agarose Gel elektroforesis sebagai media penghantar anoda.

3.Buffer TAE 1XCampuran dengan agarose.

3.2 Metode 3.2.1 Ekstraksi DNA Siapkan semua alat dan bahan yang digunakan

Bersihkan sampel, lalu masukkan dalam plastik ziplock masing masing sample. Kemudian remas-remas sampai benar-benar hancur.

Larutan lysis buffer dibuat dengan mencampurkan garam, shampo, enzim,

Sample yang sudah hancur kemudian ditambah dengan lysis buffer sebanyak 10 ml, kemudian campur rata.

Sampel disaring dengan menggunakan saringan atau kertas saring untuk mendapatkan ekstraksi dari sampel.

Setiap ekstrak yang sudah didapatkan kemudian dimasukkan dalam tabung sentrifuge.

Masing-masing sampel ditambahkan alkohol sebanyak 30 ml, kemudian kocok perlahan sampai terpisan antara ekstrak dan DNA.

3.2.2 Gel ElektroforesisAlat dan bahan disiapkan

Loading dye sebanyak 3 l dengan mikropipet, kemudian diletakkan dalam kertas pita.

Sampel diambil sebanyak 4 l dengan mikropipet, campur dengan loading dye yang ada di pita. Campur dengan rata.

Ujung tip dimasukkan dalam gel elektroforesis, pastikan tidak keluar dari sumuran yang sudah disiapkan.

Mesin dinyalakan dan diatur waktunya selama 50 menit.

Tunggu sampai waktu berakhir dan sekuen sudah tidak berjalan.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil 4.1.1 Ekstraksi DNAGambar 1. Hasil ekstraksi sampel strawberryGambar 2. Hasil ekstraksi sampel potongan ikanGambar 3. Hasil ekstraksi sampel pisang.

4.1.2 Gel ElektroforesisGambar 4. Hasil elektroforesis

4.2 Pembahasan4.2.1 Ekstraksi DNAPada praktikum kali ini sampel yang digunakan adalah strawberry, pisang, dan potongan daging ikan. Untuk melakukan ekstraksi, sampel mengalami beberapa perlakuan tertentu. Sampel mula-mula dihancurkan dan ditambahkan larutan lysis buffer dan alkohol. Ada beberapa faktor yang menyebabkan kegagalan munculnya benang DNA. Sampel yang kurang halus akan mempengaruhi hasil ekstraksi. Benang-benang DNA tidak muncul karena ekstrak yang dicampur dengan alkohol menjadi menggumpal. Hal ini diakibatkan serat kasar ikut terbawa.Hasil ekstraksi yang berhasil akan muncul benang-benang DNA yang mengambang di permukaan lartan alkohol, sedangkan ekstraknya berada di dasar. Ekstrak DNA kemudian di analisis dengan elektroforesis untuk mendapatkan hasil DNA yang tepat.Hasil dari visualisasi DNA pada strawberry, pisang, dan daging ikan terlihat benang-benang DNA walaupun tidak begitu jelas. Yang mengakibatkan benang-benang DNA kurang jelas terlihat adalah karena dalam praktikum ini kelompok kami dimungkinkan karena pada saat pengocokan atau proses homogen dalam tabung sentrifuge terlalu keras sehingga benang-benang DNA menjadi rusak. Selain itu, bisa juga karena kurang tersaringnya ekstrak atau terkontaminasi.Hasil ekstraksi berupa benang-benang DNA kemudian dianalisis dengan elektroforesis. Sekuen DNA diambil menggunakan mikropipet dan dicampur dengan loading dye, kemudian dimasukkan kedalam sumuran gel elektroforesis. Kegagalan analisa elektroforesis umumnya karena ekstrak sendiri yang tidak muncul benang-benang DNA, sehingga saat proses perpindahan massa DNA akan kosong, tidak menimbulkan garis.

V. PENUTUP

5.1 Kesimpulana. Cara mengekstraksi secara sederhana dapat silakukan dengan cara menghancurkan sampel, kemudian dicampur dengan lysis buffer. Terkhir dicampur dengan alkohol 95%.b. Presipitasi DNA dapat dilihat setelah sampel dan DNA berpisah setelah dicampur dengan alkohol 95%. DNA berupa benang-benang halus yang mengapung pada permukaan larutan.c. Hasil ekstraksi DNA dapat dianalisis dengan menggunakan metode elektroforesis.

5.2 Sarana. Selama praktikum sebaiknya praktikan lebih kondusif agar materi dapat terserap dengan maksimal.b. Diharapkan pada praktikum selanjutnya fasilitas yang tersedia lebih memadai sehingga meminimalisir kegagalan yang terjadi.

DAFTAR PUSTAKA

Birren, B. & E. Lai. 1993.Pulsed field ge electrophoresis: a practical guide. Academic Press, Inc.,San Diego: xviii + 235 hlm.Bowen, R. 2000.Principles of gel electrophoresis. OxsfordCampbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002.BIOLOGI. Ed ke-5. Terj. dariBIOLOGYoleh Lestari, R,dkk. Penerbit Erlangga, Jakarta: xxi + 438 hlm.Davis, L., M. Kuehl, & J. Battey. 1994.Basic methods: Molecular biology. 2nded. Appleton & Lange, Norwola: xii + 777 hlm.Faibanks, D.J. & W.R. Andersen. 1999.Genetics: The continuity of life.Brooks/Cole Publishing Company,New York: xix + 820 hlm.Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics.8th ed. John Wiley & Sons Inc.,New York: xviii + 713 hlm.Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994.Concept of genetics.4th ed. PrenticeHall, Englewood Cliffs: xvi + 773 hlm.Martin, R. 1996.Gel electroforesis: Nucleid acids.Bros Scientific PublishersLtd.,Oxford: xiii + 173 hlm.Corkill, P.J. 2008.Fundamentals of genetics.HarperCollinsCollege Publishers,New York: xvi + 528 hlm.Wolfe, S. L. 1995.Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company, Belmont: xvii + 820 hlm.

LAMPIRAN

Gambar 5. Pisang.Gambar 6. Sample pisang yang siap dihancurkan.

Gambar 7. Sampel pisang yang sudah dihancurkan.Gambar 8. Sampel strawberry yang sudah dihancurkan.

Gambar 9. Lysis buffer yang siap digunakan.Gambar 10. Sampel pisang yang ditambahkan lysis buffer.

Gambar 11. Sampel strawberry yang ditambahkan lysis buffer.Gambar 12. Sampel potongan daging yang ditambahkan lysis buffer.

Gambar 13. Sampel ditambahkan alkohol 10 ml.Gambar 14. Hasil ekstraksi sampel potongan daging.

Gambar 15. Hasil ekstraksi sampel pisang.Gambar 16. Hasil ekstraksi sampel strawberry.

Gambar 17. Sampel dimasukkan kedalam sumuran elektroforesis.Gambar 18. Proses elektroforesis.