BĠY 4008

GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠNE

GĠRĠġ

Doç. Dr. Nurettin YÖREK

DNA ile çalıĢırken göz önünde bulundurmanız gereken

temel özellikler:

DNA basit bir moleküldür. Gerçekten! Sadece A, T, C ve G nükleotidlerini içerir . Bu ne demektir? AraĢtırma yaparken „önceden tahmin edebilmek‟ demektir.

• DNA negatif yüklüdür. Elektronların büyük bir çoğunluğu oksijen gruplarının etrafında dolanırlar.

• DNA çok sayıda halka yapısına sahiptir. Pi orbitali gibi Ģeyleri ya da polar ve nonpolar bağlar arasındaki farkı hatırlıyor musunuz?

• Asıl konu Ģudur ki; halka yapıları oldukça

• hidrofobiktir.

DNA çok dayanıklı bir moleküldür. Örnek tüpünüzü

düĢürdünüz mü? Muhtemelen bir sorun yoktur. Hafta sonu

boyunca oda ısısında bıraktınız mı? Sorun değil. Genellikle

çalıĢılması en kolay olan biyolojik makromoleküldür.

DNA çalışmaları pek çok ihtiyaç gerektirir. Bu molekülle ne

çalıĢtığınıza bağlı olarak bir çok Ģeye sahip olmalısınız. Bu sey

bir prosedür ya da spesifik bir enzim yada techizat olabilir.

UNUTMAYIN!!!

Bazı genel kurallar bütün DNA deneylerinde geçerlidir

• Deneyi iyi bilmek. BaĢka bir Ģekilde söylemek gerekirse, prosedürünüzün

kimyasını bilmeniz gerekir. Bu, dikkat derecenizi ölçmeye yarar ve etkinliğinizi

yansıtır.

• Örneğinizi olabildiği kadar saf elde edin. ġunu aklınızdan çıkarmayın:

Herhangi bir safsızlık birçok soruna davetiye çıkarır. Eğer kontaminasyonunuz

varsa takip eden aĢamalarınızda kötü sonuçlar elde edebilir hatta örneğinizi bile

kaybedebilirsiniz. DNA nükleazları sevmez ve nükleazlar her yerdedir.

• Mümkün olduğunca her zaman dikkatli ve nazik olun. Deneyleri yaparken

dikkatli olun. Örneğin, her Ģeyi soğukta tutun çünkü enzimler fizyolojik

sıcaklıklarında daha çok aktiftir (soğuk buz kullanın). Eldiven giyin. DNA‟yı hızlı

vorteklemeyin ya da kuvvetli bir Ģekilde pipetaj yapmayın. Mutlaka önlük giyin.

• Lab. da birĢeyler yemeyin. ……………..

• Molekülünüzün özelliklerini çok iyi bilin. Molekülünüze herhangi bir

uygulama yaparken bilinçli olmanız lazım. Örneğin, genomik DNA plazmid

DNA‟sından PCR ürününden ya da EST fragmentinden farklıdır.

• Gerçekten ihtiyacınız olan malzemelerin miktarlarını dikkatlice

düşünün. Küçük miktarlarla çalıĢmak genellikle daha kolaydır ve DNA

çalıĢmalarında miktarlar hep çok küçüktür. Yani eğer biliyorsanız, çok

fazlasına ihtiyacınız yoktur, o miktar yeterlidir.

GENOMİK DNA: Ne ve Neden?

Genomik DNA nedir?

• Aslında anlaĢılmaz bir terim gibidir fakat bir

hücredeki, organeldeki ve/veya virüsteki

bütün genleri içeren DNA örneği demektir.

Genomik DNA büyüktür, komplekstir ve sulu

ortamlarda visköz görünür.

Neden genomik DNA elde ediyoruz?

• Profilleme/Fingerprinting: Kan/sperm örneklerini karĢılaĢtırmak

adli bilimlerde kullanılan bir metottur.

• Yeni bir gen klonlamaya ilk adım

Karakterizasyon/Tanımlama. Temel araĢtırmada birçok örnek vardır. Mesela

transgenik/knockout bir organizma yapıyorsunuz ve modifikasyonun gerçekleĢip

gerçekleĢmediğini kontrol etmeniz gerekir. Ġlginç bir fenotip elde ettiniz ve daha derine

bakmak istiyorsunuz.

Gen ifadesi ve regülasyonunu araştırmak

Genomik DNA izolasyonu : Hücre lizizi

• Hücreleri hazırlayın. Soğukta tutun. Herhangi bir fiziksel Ģart gerekirse

sağlayın. Örnek olarak oldukça sert bir doku ile (mısır bitkisi gibi)

çalıĢıyorsanız. Ġçerisinde sıvı azot bulunan havan ve havan tokmağı

kullanacaksınız. Akılda tutmanızda yarar vardır; bu aĢama hücreleri

lizise etmekten ziyade, bitki hücrelerinin duvarlarını yıkmaya yöneliktir

ve böylece hücreler serbest kalır.

• Sonra hücre içinde bulunan DNA‟yı almak için hücreleri lizis edin.

Devam eden iĢlemlerde DNA‟ya daha rahat ulaĢırsınız.

Hücreleri Ģunlarla lizise edin:

• Tris (tamponlama maddesi pH 6-8)

• EDTA DNase aktivitesi için gerekli kofaktörler olan divalent katyonları

Ģelatlar (nükleazları kapatma yolu)

• NaCl fizyolojik Ģartlarda (genellikle 100-150 mM olması gerekir). Bütün

molekülleri mutlu (özellikle de proteinaz K‟yı) eder ve istenmeyen

çökelmeleri önler.

• SDS, iyonik deterjandır. Membranları yıkma iĢleminde iyidir. Genel

denatüre edicidir (enzim aktivitesini inhibe eder). DNA çok dayanıklı

olduğu için SDS muamelesinden etkilenmez.

• Not: Bitki materyali ile çalıĢırken SDS‟in yerini çok yaygın bir deterjan

olan Sarkosyl alır. SDS ile aynı Ģekilde davranır.

• Proteinaz K, serin proteaz (55 C‟de iyi çalıĢır). Çok etkili olduğu için ve

SDS ya da diğer denatüre edici ajanlara karĢı (üre gibi) hassas olmadığı

için kullanılır. Proteinaz K DNA‟ya bağlı olan proteinleri (ökromatin

yapısındaki/histonlar vb) parçalayarak DNA‟nın serbest kalmasını

sağlar. Taze olarak kullanılması en iyisidir (oldukça önemlidir bu

aĢama).

• Ġnkübasyon süresi genellikle en az bir saattir. Bazı prosedürler daha

uzun sürer (kullanılan materyale göre değiĢir örneğin birçok prosedür

16 saatten fazla gece boyu inkübasyon süresi kullanır).

• Lizis prosedürünün birçok çeĢidi olduğunu anlamak çok önemlidir.

Bazısı daha hızlı, bazısı daha etkin, bazısı daha pahallı, bazısı belirli

Ģartlarda çalıĢır. SDS/proteinaz K oldukça standart bir yöntemdir.

DNA extraksiyonu (Fenol/kloroform ile)

• Dikkat!!!! Fenol oldukça tehlikelidir. Yanıcıdır. (bir zamanlar birinin bana

söylediği gibi eğer vücudunun %5‟ni kaplarsa, ölürsün) Ancak biz mantıklı

miktarlarda ve çekerbaca içerisinde kullandığımız için sorun olmayacaktır.

Eğer üzerinize dökülürse paniklemeyin. Hemen soğuk su ile durulayın.

• Fenol, genellikle bir tamponla doyurulur. (hazır olarak aldığınızda ya da

kendiniz hazırladığınızda iki faz içerdiğini görürsünüz. Üst faz tamponun

fazlasıdır, alt faz ise tamponla doyurulmuĢ fenoldür.) Bu pH için önemlidir-

sizin saflaĢtırma iĢleminiz için nötral pH‟da fenol gerekilidir. (asidik pH,

DNA fenol içinde çözülür hale geleceği için iyi değildir.) Aynı zamanda

doygunluk da önemlidir çünkü bu herhangi bir sulu çözelti (örn.su)

eklendiğinde, onun da kendi sıvı tabakasını yaratacağı anlamına

gelmektedir.

• Fenol-kloroform saflaĢtırma yöntemi “diferansiyel (kademeli) çözünürlük” prensibine bağlı olarak

çalıĢmaktadır.

• 1. Lizat üzerine eĢit hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol (genellikle hacimsel olarak 24:23:1

oranında hazırlanır) eklenir. Fenol- organik çözücü/ nükleik asitler çözünmez. Bundan dolayı,

DNA/RNA sulu faz içinde çözünmüĢ halde kalır. Lipidler ve polisakkaritler tercihen fenol fazına

geçerler. Proteinler de seçici olarak fenol çözeltisine geçerler.

• 2. Ayrıca fenol bir denatüre edici olarak davranır, proteinler denatüre olarak çökelek oluĢtururlar

ve ara fazda toplanırlar.

• 3. Kloroform, fenolle genel olarak benzer özelliklere sahiptir (çözücü özellikleri), ayrıca sulu ve

organik fazlar arasındaki dayanıklı olmayan bağları stabilize eder. Izoamil alkol de ara fazın

stabilizasyonuna katkı sağlar ve aynı zamanda kabarcık oluĢumunun önlenmesine yardım eder.

• Genellikle bu basamak 2 ya da 3 kez tekrarlanır. Daha fazla tekrar edilmesi, örneği daha

temiz hale getirir (her tekrarda ara fazın daha temiz hale geldiğini gözlemleyebilirsiniz). Bu

prosedür oldukça güvenilirdir ve DNA verimi fazladır. Bu nedenle halen laboratuvarların

çoğunda kullanılmaktadır.

Genomik DNA İzolasyonu: DNA’nın çöktürülmesi

Alkol ve Tuz ile Çöktürme• Hacmin yarısı kadar amonyum asetat ekleyin. Neden? Etanol varlığında DNA‟nın

çökmesine yardımcı olur. NaCl de kullanılabilir, ya da tamamen bu basamağı

atlayabilirsiniz (DNA konsantrasyonuna bağlı olarak) Tuz DNA‟nın negatif yükünün

nötralize olmasına yardım eder (böylece çözücü moleküllerden ayrılır- bu durumda çözücü

sudur). Tuz aynı zamanda su ile etkileĢime girerek DNA‟nın çözünürlüğünü zayıflatır. Bu

“salting out” olarak bilinir.

• %100‟lük etanol kullanılır. Etanol su kadar iyi bir çözücü değildir. %65‟den daha çok etanol

içeren çözeltilerde DNA çözünmez. Ancak etanolle çöktürmenin etkinliği çok sayıda etkene

bağlıdır: sıcaklık, zaman, DNA miktarı.

• Çöktürme basamağı için izopropanol de kullanılabilir. Bu çözücü için de RNA da stabil

kalabilir (seçici çöktürme). Bu nedenle bazen bu amaçla da kullanılır. %50‟den daha çok

izopropanol varlığında DNA çökelti halinde kalır.

• Cam bir pastör pipeti ya da çubuk kullanılarak DNA dikkatlice dıĢarı alınır. %70 etanolle

muamele edilir ve TE çözeltisi içerisinde çözülür. Cam pipet kullanmak hız kazandırır. %70

etanol yıkamasıyla ortamda bulunan fazla tuz uzaklaĢtırılır.

• ALTERNATĠF. Bazı laboratuvarlarda DNA santrifüj edilerek çöktürülür. Bu az miktarda

DNA‟nın olduğu durumlarda daha etkili sonuç verir. Ancak %70 etanol ile pellet yine yıkanır

ve örnek tekrar spin edilir.

DNA Miktar Tayinine (Kantitasyon) Genel BakıĢ

Niçin kantitasyon yapılır?

Kantitasyon yöntemleri

Spektrofotometre

Slot Blot (Quantiblot)

Microplak okuyucu

Real Time PCR

Kantitasyon, miktarın tayin edilmesidir

DNA Kantitasyonu

DNA izolasyonunu takiben, DNA konsantrasyonunun ve

diğer maddelerin varlığının belirlenmesi amacıyla yapılır.

Örneğimde ne kadar DNA var?

Neden önemli?

Kantitasyon ekstraksiyonun baĢarısı hakkında ipucu verir.

STR bölgelerinin ya da mtDNA‟nın amplifikasyonu örneğin

içerdiği DNA miktarından etkilenir.

Kantitasyonun temel nedeni:Çoğu PCR yöntemi DNA yeterli düzeydeyse en iyi sonucu verir.

DNA ekstraksiyonun çok az olması:

DNA amplifikasyonunda baĢarısızlık

Allel drop out (tamamlanmamıĢ amplifikasyon) ile sonuçlanır

DNA Kantitasyonu

DNA ekstraksiyonunun çok fazla olması:

Amplifiye STR pikleri ölçüm alanını aĢar

PCR inhibitörlerinin artması

• DNA saflığı

• Saflık belirlemede 260/280 nm sonucuna bakılır.

• Saf bir DNA 260/280=1.8 olmalıdır.

260/280>1.8 ise RNA kontaminasyonu

260/280< 1.8 ise protein kontaminasyonu

DNA Miktar Tayini

• Spektorfotometrik okumalar: UV absorbansı kullanılarak DNA/RNA miktarı ve saflığı

belirlenebilir. Halkalı yapılar UV dalga boylarını absorbe edebilir. Ancak pek çok molekül

halkalı yapı içerir (nükleik asitler, proteinler, organikler, deterjanlar, lipidler, ve liste sürer...)

• Hem DNA hem de RNA halkalı yapıları yaklaĢık 260 nm de güçlü absorbans verir.

• Proteinler, bazı amino asitler fenilalanin, triptofan ve tirozin 280 nm‟de maksimum

absorbans verir.

• Alt çizgi tuz taneciklerinin miktarı ile iliĢkilidir. Kaba hesapla, pek çok sey UV absorblar.

Aynı zamanda pH‟a oldukça duyarlıdır, bu nedenle sulandırmada kullanılan TE tamponu ile

spektrofotometre kalibre edilmelidir.

• 260nm’deki absorbansın 280nm’deki absorbansa oranıyla saflık değeri elde edilebilir

• DNA = A260/A280 yaklaşık 1.8

• RNA= A260/A280 yaklaşık 2.0

• Bunlar saflaĢtırma ürünleri için iyi sonuçlardır ve aynı zamanda iyi kantitasyon değerine de

sahip olacaktır (OD değerlerini DNA miktarına çevirirken 260 nm‟de ölçülen DNA için

katsayı 50ug/ml, RNA için 40ug/ml‟dir).

DNA Kantitasyonu

Spektrofotometre:

DNA UV ıĢığını 260nm‟de absorblar

Daha çok DNA = Daha çok absorbans

Ġnsan DNA‟sına özgül değildir

DNA Kantitasyonu

DNA agaroz jelde ayrılır

Etidyum bromür ile boyanır (çift

zincirli DNA gerekli)

Ġnsan DNA‟sına özgül değil

Ayrıca DNA miktarını belirlemek için genellikle DNA miktarıyla iliĢkili olarak yapıya

bağlanan Etidyum bromür ve sybr green boyaları da kullanılır. Daha güçlü bir

yöntemdir, ancak daha pahalıdır. Etidyum bromürle boyanmıĢ bir jelde bant

yoğunlukları karĢıklaĢtırılarak DNA fragmentlerinin kantitasyonu yapılabilir, ölçü

olarak bir marker kullanılır.

DNA Kantitasyonu

Mikroplak okuyucu:

Picogreen interkalasyon yapan bir boyadır.

Çift zincirli DNA‟da baz çiftleri arasına bağlanır, floresansı arttırır.

Floresan miktarı çözeltideki DNA miktarı ile iliĢkilidir.

DNA Kantitasyonu

Mikroplak okuyucu: