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Premesse e riepilogo

Lezione 1

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Scopo del corso

Lo scopo di questo corso non e’ quello di imparare la clinica delle malattie, ma capire come si sceglie un test diagnostico nei casi di malattie che coinvolgono il materiale ereditario. Quindi dovrete rinfrescarvi la Genetica fatta finora.In questo corso parleremo di diagnostica e quindi necessariamente dovremo parlare di malattie, ma ora come sempre le malattie ci servono come modelli per capire le strategie.

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Cosa significa ricerca delle mutazioni.

Vi ricordo che mutazione significa semplicemente variazione di una sequenza confrontata con una sequenza di riferimento. Da questo ne consegue che mutazione non vuol dire che ci sia un effetto patologico. Vi ricordo la definizione di polimorfismo:variazione presente nella popolazione con una frequenza superiore a 1%. Per definizione un polimorfismo e’ innocuo, almeno finche’ non si dimostra il contrario. E’ comunque vero che generalmente quando si parla di mutazione si intende una variazione patogenetica e il polimorfimo viene chiamato anche variante allelica, tuttavia non e’ completamente corretto e noi specificheremo sempre mutazione patogenetica o non patogenetica

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Il genoma umano, come tutti i genomi e’ plastico: la sopravvivenza di una specie dipende dalla sua variabilita’ e dalla capacita’ di evolvere. Il genoma umano e’ il risultato di eventi di poliploidizzazione che hanno modificato drasticamente il numero cromosomico. Le mutazioni cromosomiche di solito alterano il fenotipo riducendo la fitness, e sono pertanto rare a livello costituzionale, ma frequenti a livello somatico nei tumori. A livello molecolare si distinguono diversi tipi di mutazione che ormai dovreste conoscere percio’ vi risparmio il loro elenco.La variazione di una sequenza in una popolazione naturale non comporta necessariamente l’insorgenza di un fenotipo anomalo. Quando si parla di alleli di un locus questi sono il risultato di una mutazione che per caso, per effetto della deriva genetica si sono fissati nella popolazione

Mutazioni

Eterozigosi media per il DNA genomico umano: ~0,0037 (0,37%).

Cio’ significa che in due alleli circa 1:250-1:1000 basi sono diverse

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Va ricordato che le mutazioni avvengono a caso percio’ sia il DNA codificante che il non codificante sono egualmente suscettibili. Le conseguenze sono ovviamente diverse. Le conseguenze nella parte codificante (che costituisce circa il 3% del genoma umano) sono legate al tipo di mutazione e anche questo lo sapete.

Mutazioni

Il tasso di mutazione del DNA codificante risulta piu’ basso rispetto al non codificante in quanto la pressione selettiva agisce eliminando dalla popolazione gli alleli negativi e rendendo di fatto assenti nella popolazione quelle mutazioni che alterino pesantemente la funzione del prodotto genico (per es. le “frameshift” piu’ frequenti nel non codificante).

Le mutazioni del DNA non codificante hanno effetto se avvengono nelle sequenze regolatrici o nelle sequenze introniche deputate allo splicing. Anche in questo caso l’effetto dipende dal mantenimento della funzione.

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Sostituzione silente: non determina alcun cambiamento nel prodotto: l’amminoacido resta lo stesso. Dal momento che modifica la sequenza puo’ originare un RFLP. In qualche caso puo’ dare origine ad un sito di splicing criptico e quindi essere tutt’altro che neutre come la semplice sequenza potrebbe far pensare.

Sostituzione non senso: si origina un codone di stop. Dal momento che la pressione selettiva e’ forte su un prodotto troncato prematuramente, sono rare.

Sostituzione di senso errato:si origina un codone per un altro amminoacido

non conservativa: il nuovo ammnoacido e’ completamente diverso dal vecchio. Puo’ avere effetti deleteri.

conservativa : il nuovo amminoacido ha caratteristiche chimiche simili al vecchio.Pertanto l’effetto sul prodotto puo’ essere minimo e puo’ essere definito polimorfismo sia a livello di DNA che di prodotto.

Mutazioni

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Il tasso e il tipo di sostituzioni percio’ e’ estremamente variabile fra i diversi geni.

Alcune proteine come le ubiquitine hanno un livello di conservazione totale nella scala zoologica dall’uomo al lievito. La loro sequenza a livello di DNA indica che le sostituzioni ci sono, ma sono praticamente tutte sinonime.

All’estremo opposto ci sono geni pochissimo conservati se non in brevi domini nell’evoluzione come SRY. SRY ha una funzione chiave in tuttii mammiferi, ma questa e’ demandata all’ HMG box, che corrisponde a 78 aa. I segmenti N- e C- terminali sono estremamente variabili, indicando che per la funzione del gene questi segmenti non sono critici

Mutazioni

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Mutazioni dovute all’espansione di trinucleotidi localizzati nelle regioni codificanti o non-codificanti di alcuni geni, si originano per errori nella replica del DNA.

Non tutte le espansioni sono instabili. Se l’aumento di lunghezza non e’ eccessivo, e’ una mutazione patogena ma stabile nella trasmissione. Si comportano cioe’ come le mutazioni “canoniche”, e seguono le leggi di Mendel

Gene HOXD13 : l’espansione determina la formazione di lunghi tratti di polialananina, e provoca sinpolidattilia. E’ rimasta stabile per 7 generazioni

Quando una sequenza trinucleotidica cambia le proprie dimensioni da una generazione all’altra si parla di mutazioni dinamiche

Mutazioni dinamiche

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Principio dell’equivalenza dei gameti: l’espressione di un gene non dipende dal sesso del genitore che lo trasmette.

Esclusione allelica: in alcuni tipi cellulari viene espresso uno solo dei due alleli, anche se entrambi sono in grado di esprimersi. Si ha una emizigosi funzionale:linfociti B e immunoglobuline, geni dei recettori olfattivi nei neuroni ....

Mutazioni che alterano i meccanismi epigenetici: Imprinting

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L’eredita’ mitocondriale non segue il principio dell’equivalenza dei gameti, ma in questo caso non si parla di imprinting: i gameti sono effettivamente non equivalenti in termini di contenuto genico perche’ il gamete maschile non contribuisce alla dotazione di mitocondri dell’embrione. L’eredita’ legata al sesso non segue il principio dell’equivalenza dei

gameti, ma di nuovo i gameti sono effettivamente non equivalenti perche’ i cromosomi sessuali non sono del tutto omologhi. L’espressione di un fenotipo dovuto a un locus localizzato sui cromosomi sessuali dipende dal sesso della progenie.

Ricordiamo cosa non e’ e cosa e’ l’imprinting

Imprinting genomico: espressione differenziata di un gene perfettamente funzionale legata all’origine parentale, indipendente dal sesso della progenie, che puo’ essere limitata nello spazio e nel tempo.

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Mutazioni cromosomiche

Sono una categoria di mutazioni rara nel costituzionale, e il piu’ delle volte sono patogenetiche. Possono provocare patologie gravi a livello dell’individuo e quindi non vengono ereditate. Oppure ridurre la fitness per la presenza di gameti sbilanciati, ma possono venir trasmesse alla generazione successiva per la loro tollerabilita’ in eterozigosi. Sono frequenti nei tumori, dove possono indurre la tumorigenesi a causa della creazione di geni ibridi, o perche’ portono alla sovraespressione di geni

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Modifiche nella configurazione della cromatina

Il cambiamento di configurazione, legato ad un effetto di posizioneper un riarrangiamento, puo’ portare alla manifestazione di fenotipi patologici: Aniridia: silenziamento del gene PAX6 Distrofia Facioscapolomerale: una delezione di 3-4Kb elimina dalla regione compresa fra due geni: FRG1 e FRG2, delle sequenze ripetute denominate D4Z4. La perdita di queste sequenze porta questi due geni normalmente localizzati in due domini diversi, a mappare nello stesso dominio. L’assenza delle ripetizioni che interagiscono con proteine regolatrici per modificare l’espressione di questi geni, comporterebbe un over espressione, con conseguente fenotipo patologico

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RIEPILOGO TECNICHE

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sono routinariamente usati a scopo diagnostico

• SNPs che alterano la struttura primaria di una proteina coinvolta nel metabolismo di un farmaco

bersagli dell’analisi farmacogenetica

• SNPs nelle regioni non-codificanti del genoma, quindi senza impatto sul fenotipo dell’individuo

markers usati in genetica di popolazione e negli studi di evoluzione

SNP•SNPs nella regione codificante di un gene, alterando la struttura di una proteina, possono essere la causa di disordini monogenici ereditati in maniera dominante

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ASO (Allele Specific

Oligonucleotide)

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1 2 3

Caricamento su gel

SSCP : Single Strand Conformational Polymorphism

Omozigote Wild-type OmozigoteMutante

PCR

Eterozigote

Omo WT Omo mutetero

Denaturazione

Reverse

Forward

Reverse

Forward

CGCG

CGAT

ATAT

C

GC

G

C

G

AT

A

T

A

T

C

G

A

T

VARIAZIONI ANCHE DI 1 SOLA BASE PROVOCANO UNA DIFFERENZA NELLA CORSA SU GEL

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DGGE elettroforesi su gel in gradiente denaturante

Si basa sulla selettivita’ del gel che deve essere in grado di creare un gradiente di denaturazione molto stringente: L’INIZIO della denaturazione con formamide o urea dipende dalla sequenza la variazione anche di una singola base puo’ modificare la risposta all’agente denaturante per cui una sequenza comincia a denaturarsi prima o dopo quella di riferimento.

Si amplifica il DNA con primer alla cui estremita 5’ a monte e’ stata aggiunta una coda di G. questa coda generera’ un allungamento della sequenza amplificata con una serie di CG (40basi) che tenderanno a stabilizzare la molecola e aumentano la capacita’ discriminante della corsa elettroforetica.

il limite della tecnica e’ la messa a punto delle condizioni sperimentali che richiedono una accurata conoscenza della sequenza da testare. La presenza della sequenza di riferimento in banca dati facilita la messa a punto con questa tecnica e possibile individuare il 99% delle variazioni

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DGGE elettroforesi su gel in gradiente denaturante

GGGG

GGGGCCCC

GGGG

GGGGCCCC

PCR

CCCC

GGGG

CCCC

GGGG

Gel denaturante

Denaturazione crescente

Fig 7.7

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DGGE schema II

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DGGE gel

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DGGE CFTR

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DGGE esone 12 CFTR

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Figure 1 shows ß-thalassemia samples run on a parallel DGGE gel. The three heterozygous samples in lanes 1–3 were resolved into two heteroduplex and two homoduplex bands. The heteroduplex bands (upper bands) migrated slower than the corresponding homoduplex bands (lower bands). The wild-type sample in lane 4 was resolved as one band, and it migrated to the same distance as the wild-type band in the mutant samples. The ability to resolve the heteroduplex fragments and the mutant homoduplex fragment in the mutant samples makes it possible to distinguish between samples that are mutant or wild type. From the results, it was possible to detect single base substitutions in the mutant samples from the wild-type sample using parallel DGGE.

DGGE -Thalassemia

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DGGE Poliposi del colon

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MLPA®Multiplex Ligation Probe Amplification

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MLPA®Multiplex Ligation Probe Amplification

Each peak is the amplification product of a specific probe.

Samples are compared to a control sample.

A difference in relative peak height or peak area indicates a copy number change of the probe target sequence

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Normal

Ligation of the two probe oligonucleotides Amplification product

Mismatch at the probe ligation site No ligation, no amplification product

Mismatch Perfect match

MLPA®Multiplex Ligation Probe Amplification

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Unmethylated Target

M

M

Methylated Target

Denaturation and Multiplex probe

hybridizationM

Only undigested (methylated) and ligated probes are exponentially amplified

Ligation and Digestion with

methylation sensitive

endonucleasesM

MS-MLPA

By NA0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

50 100 150 200 250 300 350 400 450Size (nt)

Dye Signal

0

2500

5000

7500

10000

12500

100 150 200 250 300 350 400 450Size (nt)

Dye Signal

Control UndigestedME028 PW / Angelman kit

Control Hha1 digestedArrows indicate probes for imprinted sequences (1 copy methylated)

MS-MLPA

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Il materiale didattico e’ presente in rete :http://www.biologia.uniba.it/DIGEMI/Didattica.html

sono presenti anche i file PDF degli articoli necessariper la preparazione