C. A. Mattia Cromatografia Metodi cromatograficiMetodi ...croma).pdfsu colonne di vetro impaccate con carbonato di calcio. 1903 C. A. Mattia 4 Metodi cromatograficiMetodi cromatografici

FACOLTÀ DI FARMACIA

UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO

C. A. Mattia

ChimicaanaliticaChimicaChimicaanaliticaanalitica

C. A. MattiaC. A. Mattia 22

SeparazioniSeparazioniSeparazioniPrecipitazionePrecipitazione

differente solubilitdifferente solubilitàà..

DistillazioneDistillazionedifferente volatilitdifferente volatilitàà..

EstrazioneEstrazionedifferente solubilitdifferente solubilitàà in liquidi in liquidi immiscibiliimmiscibili..

ElettroforesiElettroforesidifferente migrazione in campo elettrico.differente migrazione in campo elettrico.

Frazionamento a flussoFrazionamento a flussodifferente interazione durante il trasporto.differente interazione durante il trasporto.

CromatografiaCromatografiadifferente velocitdifferente velocitàà tra due fasi.tra due fasi.


CromatografiaCromatografia

pigmentiseparati

Cromatografia

chroma graphen(colore) (scrivere)

MikhailMikhail TswettTswett ((Asti 1872 Asti 1872 –– Voronezh 1919Voronezh 1919))Separazione pigmenti vegetali (Separazione pigmenti vegetali (clorofilleclorofille, , xantofillexantofille, , ……) ) su colonne di vetro impaccate con carbonato di calcio. su colonne di vetro impaccate con carbonato di calcio.

1903 1903


Metodi cromatograficiMetodi Metodi cromatograficicromatograficiLe tecniche cromatografiche permettono la separazione Le tecniche cromatografiche permettono la separazione (purificazione) e la quantificazione dei componenti di matrici (purificazione) e la quantificazione dei componenti di matrici complesse e trovano quindi numerosissime applicazioni.complesse e trovano quindi numerosissime applicazioni.Nei metodi Nei metodi cromatograficicromatografici i componenti di una miscela si i componenti di una miscela si separano distribuendosi tra due fasi:separano distribuendosi tra due fasi:

unauna fase stazionariafase stazionaria (un solido o un liquido su supporto (un solido o un liquido su supporto solido inerte);solido inerte);una una fase mobilefase mobile (gas o liquido) che fluisce in modo (gas o liquido) che fluisce in modo continuo su quella stazionaria.continuo su quella stazionaria.

La separazione La separazione èè dovuta principalmente alle relative affinitdovuta principalmente alle relative affinitààper la fase stazionaria.per la fase stazionaria.Nella cromatografia liquida (Nella cromatografia liquida (LCLC) la fase mobile ) la fase mobile èè un liquido, un liquido, nella gas cromatografia (nella gas cromatografia (GCGC) la fase mobile ) la fase mobile èè un gas.un gas.


Cromatografia su colonna:Cromatografia su colonna: la fase stazionaria la fase stazionaria èè contenuta in un sottile tubo;contenuta in un sottile tubo; la fase mobile la attraversa per gravitla fase mobile la attraversa per gravitàà o sotto o sotto

pressione.pressione.

Cromatografia planare:Cromatografia planare: la fase stazionaria la fase stazionaria èè supportata nei pori della supportata nei pori della

carta o su una superficie piana;carta o su una superficie piana; la fase mobile si muove, attraverso la fase la fase mobile si muove, attraverso la fase

stazionaria, per azione della capillaritstazionaria, per azione della capillaritàà o per o per gravitgravitàà..

ClassificazioniClassificazioni


Metodi su colonnaMetodi su colonnaMetodi su colonnaGas cromatografia (GC)Gas cromatografia (GC)

GasGas--liquidoliquido (GLC)(GLC) ripartizioneripartizione

GasGas--solido (GSC)solido (GSC) adsorbimentoadsorbimento

Cromatografia liquida (LC)Cromatografia liquida (LC)LiquidoLiquido--liquidoliquido ripartizioneripartizione

LiquidoLiquido--solidosolido adsorbimentoadsorbimento

Scambio ionicoScambio ionico scambio di ioniscambio di ioni

Esclusione dimensionaleEsclusione dimensionale setaccio molecolare setaccio molecolare

AffinitAffinitàà rip. selettiva (anticorpi, inibitori,rip. selettiva (anticorpi, inibitori,……))

Cromatografia a liquido supercritico (SFC)Cromatografia a liquido supercritico (SFC)


Principi teoriciPrincipi teoriciPrincipi teoriciConsideriamo un campione a due componenti in una colonna. La fasConsideriamo un campione a due componenti in una colonna. La fase e stazionaria stazionaria èè formata da particelle solide porose contenute in un tubo formata da particelle solide porose contenute in un tubo lungo e sottile (lungo e sottile (colonnacolonna). Nel passaggio attraverso la colonna ogni ). Nel passaggio attraverso la colonna ogni componente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mocomponente X si distribuisce fra la fase stazionaria (s) e la mobile (m):bile (m):

XXmm XXss

Il campione viene iniettato Il campione viene iniettato allall’’entrata della colonna.entrata della colonna.La fase mobile fa spostare il La fase mobile fa spostare il campione attraverso la fase campione attraverso la fase stazionariastazionariacon separazione dei due con separazione dei due componenti.componenti.

][X][XK

m

sX

Il coefficiente di ripartizione (o di distribuzione) del componeIl coefficiente di ripartizione (o di distribuzione) del componente X nte X èèdefinito come:definito come:


CromatogrammaCromatogrammaCromatogrammaUn Un cromatogrammacromatogramma èè un diagramma di un un diagramma di un parametro che dipende dalla concentrazione in parametro che dipende dalla concentrazione in funzione di un parametro che indica il decorso della funzione di un parametro che indica il decorso della cromatografia.cromatografia.La La eluizioneeluizione èè il trasporto di soluti il trasporto di soluti attraverso una fase stazionaria da parte di attraverso una fase stazionaria da parte di una fase mobile in movimento una fase mobile in movimento ((dilavamentodilavamento).).La fase mobile che fuoriesce prende il La fase mobile che fuoriesce prende il nome dinome di eluatoeluato..Il solvente usato per il trasporto dei Il solvente usato per il trasporto dei componenti della miscela componenti della miscela èè detto detto eluenteeluente..


CromatogrammaCromatogramma

Tempo di ritenzione (tR): tempo necessario alla sostanza iniettata per essere eluita dall’inizio all’uscita della colonna. Tempo morto (tM): tempo di ritenzione di un composto che non è trattenuto e che passa attraverso la colonna alla stessa velocità con cui fluisce la fase mobile lungo la colonna.Tempo di ritenzione netto (tS): tempo trascorso nella fase stazionaria (tS = tR - tM).

Analogamente si definiscono i corrispondenti:Volume di ritenzione (VR): volume di fase mobile necessario ad eluire l’analita dall’inizio all’uscita della colonna.Volume morto (VM): il volume di ritenzione di un composto che non è trattenuto (corrisponde al volume di fase mobile che occupa la colonna).

ttRR

ttMM

TempoSe

gnal

e

tS


SelettivitàSelettivitSelettivitààLa velocitLa velocitàà di migrazione delldi migrazione dell’’analita lungo la colonna analita lungo la colonna èè descritto da un parametro descritto da un parametro che prende il nome di fattore di capacitche prende il nome di fattore di capacitàà o di ritenzione, o di ritenzione, kk::

dove Kdove KAA èè la costante di distribuzione e V sono i volumi (numero moli = Cla costante di distribuzione e V sono i volumi (numero moli = C••V).V).

kk può essere ricavato dai parametri del cromatogramma:può essere ricavato dai parametri del cromatogramma:

Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di Due sostanze saranno separabili se presentano valori diversi di kk..

M

SA V

V AK

mobilefasenellaAdimoliditotalenumeroastazionarifasenellaAdimoliditotalenumerok

M

S

M

MRA t

tt

tt

k

La selettivitLa selettivitàà quantifica lquantifica l’’entitentitàà della separazione fra due specie: riguarda la della separazione fra due specie: riguarda la capacitcapacitàà di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti di un sistema cromatografico di distinguere fra due componenti ed ed èèdipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fasedipendente dalla distribuzione relativa delle specie fra la fase mobile e quella mobile e quella stazionaria, con stazionaria, con (ttRR))BB > (> (ttRR))AA..

àselettivitdifattoreKK

t)(tt)(t

kkα

A

B

MAR

MBR

A

B

ttRR

ttMM

Tempo

Segn

ale

tS


Picco cromatograficoPicco Picco cromatograficocromatografico

1.1. diffusione longitudinale (diffusione delle molecole dalla zona adiffusione longitudinale (diffusione delle molecole dalla zona a maggiore maggiore concentrazione a quella a minore in direzione parallela allconcentrazione a quella a minore in direzione parallela all’’asse della asse della colonna);colonna);

2.2. percorsi multipli;percorsi multipli;

Le molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con laLe molecole di un analita non si muovono lungo la colonna con la stessa stessa velocitvelocitàà: la loro dispersione ha generalmente un profilo : la loro dispersione ha generalmente un profilo gaussianogaussiano. Il centro del . Il centro del profilo (profilo (banda di eluizionebanda di eluizione) rappresenta la velocit) rappresenta la velocitàà media.media.Molti fattori provocano deviazioni dal valore medio (Molti fattori provocano deviazioni dal valore medio (allargamento bandaallargamento banda), i ), i principali sono:principali sono:

3.3. trasferimento di massa tra fase trasferimento di massa tra fase mobile e fase stazionaria.mobile e fase stazionaria.

Percorsi tipici di due molecole durante Percorsi tipici di due molecole durante ll’’eluizioneeluizione. La distanza percorsa dalla . La distanza percorsa dalla molecola 2 molecola 2 èè maggiore di quella della maggiore di quella della molecola 1, per cui la molecola 2 arrivermolecola 1, per cui la molecola 2 arriverààin B piin B piùù tardi della molecola 1.tardi della molecola 1.


Ampiezza dei picchiAmpiezza dei picchiAmpiezza dei picchi

LL’’altezza equivalente del piatto teoricoaltezza equivalente del piatto teorico (H = L/N) consente di confrontare l(H = L/N) consente di confrontare l’’efficienza efficienza di colonne di differente lunghezza. di colonne di differente lunghezza.

1)1) Lunghezza colonna L,Lunghezza colonna L,2)2) Altezza equivalente di piatto teorico H,Altezza equivalente di piatto teorico H,3)3) Numero di piatti teorici N.Numero di piatti teorici N. H

LN

Si può ricavare la seguente relazioneSi può ricavare la seguente relazione

W = larghezza del piccoW = larghezza del picco

2R

Wt16N

W

Piatto teorico:Piatto teorico: sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio sezione della colonna che consente di realizzare un equilibrio reversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poichreversibile di ripartizione di un componente fra le fasi. Poichéé in in cromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibriocromatografia si ha una sequenza continua di stati di equilibrio e non vi e non vi èèpossibilitpossibilitàà di realizzare una singola separazione, N ha un significato di realizzare una singola separazione, N ha un significato puramente matematico.puramente matematico.PiPiùù elevato elevato èè il numero di piatti teorici, piil numero di piatti teorici, piùù grande grande èè la probabilitla probabilitàà di una di una separazione (migliore separazione (migliore èè la capacitla capacitàà di separazione della colonna). N di separazione della colonna). N èèproporzionale alla lunghezza della colonna.proporzionale alla lunghezza della colonna.

LL’’efficienza di una colonna può essere descritta da parametri usatefficienza di una colonna può essere descritta da parametri usati nelle i nelle tecniche di distillazione:tecniche di distillazione:


EfficienzaEfficienzaEfficienzaLa principale variabile che influenza lLa principale variabile che influenza l’’efficienza di una colonna efficienza di una colonna èè la velocitla velocitàà di di flusso lineare (cm/s) della fase mobile. Questa infatti influenzflusso lineare (cm/s) della fase mobile. Questa infatti influenza il tempo di a il tempo di contatto tra fase mobile e fase stazionaria.contatto tra fase mobile e fase stazionaria.

LL’’altezza equivalente del piatto teorico (altezza equivalente del piatto teorico (HH), il ), il parametro che descrive lparametro che descrive l’’efficienza della colonna, efficienza della colonna, dipende proprio dalla velocitdipende proprio dalla velocitàà di flusso della fase di flusso della fase mobile.mobile.

Sia in LC che in GC la velocitSia in LC che in GC la velocitàà di flusso ottimale di flusso ottimale èèpiuttosto bassa.piuttosto bassa.

Quella ottimale della LC Quella ottimale della LC èè inferiore a quella ottimale inferiore a quella ottimale della GC. Per evitare tempi di analisi troppo elevati, in della GC. Per evitare tempi di analisi troppo elevati, in LC si usano velocitLC si usano velocitàà un poun po’’ maggiori di quella ottimale.maggiori di quella ottimale.

La LC La LC èè caratterizzata da valori di H inferiori alla GC.caratterizzata da valori di H inferiori alla GC.In considerazione della lunghezza delle colonne (GC: > 50m; LC: In considerazione della lunghezza delle colonne (GC: > 50m; LC: < 50cm), la < 50cm), la GC GC èè comunque caratterizzata da valori picomunque caratterizzata da valori piùù elevati di N, e quindi da migliore elevati di N, e quindi da migliore efficienza.efficienza.


RisoluzioneRisoluzioneRisoluzioneLa risoluzione (La risoluzione (RR) ) èè una misura quantitativa della una misura quantitativa della capacitcapacitàà di separare due analiti. Essa di separare due analiti. Essa èè ricavabile dal ricavabile dal cromatogramma:cromatogramma:

La risoluzione caratterizza la bontLa risoluzione caratterizza la bontàà di separazione fra di separazione fra due picchi sia con riferimento alla differenza fra i due picchi sia con riferimento alla differenza fra i tempi di ritenzione (tempi di ritenzione (numeratorenumeratore) sia riguardo ) sia riguardo allall’’efficienza di separazione (efficienza di separazione (denominatoredenominatore).).Una buona risoluzione può derivare sia da una buona Una buona risoluzione può derivare sia da una buona efficienza (efficienza (elevato numero di piatti teorici elevato numero di piatti teorici picchi picchi molto strettimolto stretti) che da una buona differenziazione del ) che da una buona differenziazione del comportamento degli comportamento degli analitianaliti ((selettivitselettivitàà).).

BABA

ARBR

WWΔt2

2WW)(t)(tR

)(


RisoluzioneRisoluzioneRisoluzione

1kk

α1αN

41R

B

B

Si può ricavare la relazione che Si può ricavare la relazione che correla la risoluzione alla ritenzione e correla la risoluzione alla ritenzione e alla selettivitalla selettivitàà::

LL’’effetto della selettiviteffetto della selettivitàà, dell, dell’’efficienza e del fattore di efficienza e del fattore di capacitcapacitàà sulla risoluzione sulla risoluzione èè coscosìì schematizzabile:schematizzabile:

scarsa risoluzione scarsa risoluzione

buona risoluzione dovuta a buona buona risoluzione dovuta a buona efficienzaefficienza

scarsa risoluzione dovuta ad un basso scarsa risoluzione dovuta ad un basso fattore di capacitfattore di capacitàà

buona risoluzione dovuta a buona buona risoluzione dovuta a buona selettivitselettivitàà

picchi non separatipicchi non separati

picchi strettipicchi stretti

picchi distantipicchi distanti

picchi non separatipicchi non separati


ApplicazioniApplicazioniApplicazioniLe applicazioni della cromatografia vanno dallLe applicazioni della cromatografia vanno dall’’analisianalisi qualitativa qualitativa a quellaa quella quantitativaquantitativa di miscele anche molto complesse.di miscele anche molto complesse.LL’’analisi quantitativa sfrutta la misurazione dellanalisi quantitativa sfrutta la misurazione dell’’altezzaaltezza o o delldell’’areaarea dei picchi. La misurazione delldei picchi. La misurazione dell’’area area èè pipiùù affidabile in affidabile in quanto non risente dellquanto non risente dell’’eventuale allargamento dei picchi in eventuale allargamento dei picchi in seguito a variazione delle condizioni di lavoro.seguito a variazione delle condizioni di lavoro.I metodi di analisi sono tutti indiretti. Si costruisce prima unI metodi di analisi sono tutti indiretti. Si costruisce prima una a curva di curva di calibrazionecalibrazione per ciascun per ciascun analitaanalita e poi si ricava la e poi si ricava la concentrazione dellconcentrazione dell’’analitaanalita nella miscela in esame mediante nella miscela in esame mediante interpolazione.interpolazione.Il metodo dello standard interno Il metodo dello standard interno èè il piil piùù affidabile: una quantitaffidabile: una quantitàànota di standard viene introdotta nelle soluzioni standard e nelnota di standard viene introdotta nelle soluzioni standard e nelcampione in esame; il parametro analitico campione in esame; il parametro analitico èè quindi costituito dal quindi costituito dal rapporto tra le aree dello standard e dellrapporto tra le aree dello standard e dell’’analitaanalita (il metodo (il metodo funziona solo se il picco dello standard funziona solo se il picco dello standard èè vicino ma separato da vicino ma separato da quello dellquello dell’’analitaanalita).).


Su strato sottile si possono eseguire cromatografie di Su strato sottile si possono eseguire cromatografie di ripartizione, di ripartizione, di adsorbimentoadsorbimento e a esclusione.e a esclusione.La tecnica La tecnica èè semplice, veloce e permette l'analisi di pisemplice, veloce e permette l'analisi di piùùcampioni contemporaneamente.campioni contemporaneamente.Può essere impiegata sia a scopi analitici che preparativi.Può essere impiegata sia a scopi analitici che preparativi.ÈÈ basata su un principio analogo alla cromatografia su basata su un principio analogo alla cromatografia su colonna (a paritcolonna (a paritàà di fase stazionaria il comportamento delle di fase stazionaria il comportamento delle sostanze sostanze èè analogo).analogo).

Cromatografia su strato sottileCromatografia su strato sottileCromatografia su strato sottile


TLCTLCTLCLa fase stazionaria La fase stazionaria èè deposta come film sottile su una lastrina di vario deposta come film sottile su una lastrina di vario materiale (vetro, plastica, metallo, cartoncino, materiale (vetro, plastica, metallo, cartoncino, ……).).La lastrina viene disposta verticalmente in un recipiente chiusoLa lastrina viene disposta verticalmente in un recipiente chiuso ermeticamente ermeticamente detto camera di eluizione (detto camera di eluizione (beckerbecker coperto, barattolo,coperto, barattolo,……), contenente ), contenente delldell’’eluente che bagna solo la parte inferiore della lastrina (al di eluente che bagna solo la parte inferiore della lastrina (al di sotto della sotto della linea di deposizione).linea di deposizione).La fase mobile si muove dal basso verso lLa fase mobile si muove dal basso verso l’’alto per capillaritalto per capillaritàà..Quando l'Quando l'eluenteeluente raggiunge quasi la cima della lastrina, la si rimuove dalla raggiunge quasi la cima della lastrina, la si rimuove dalla camera di camera di eluizioneeluizione e la si sviluppa per evidenziare delle macchie.e la si sviluppa per evidenziare delle macchie.La TLC La TLC èè molto utile per seguire lmolto utile per seguire l’’andamento di una reazione, per andamento di una reazione, per saggiare la purezza di un composto e per identificare un prodotto noto in una miscela. In TLC agli In TLC agli analitianaliti si associa il fattore di ritenzione si associa il fattore di ritenzione RRff data da:data da:

Rf = spostamento della sostanzaspostamento del fronte del solvente


A una lastrina A una lastrina ddíí vetro, di plastica o di metallo viene applicata una vetro, di plastica o di metallo viene applicata una sospensione densa della fase stazionaria, normalmente in acqua, sospensione densa della fase stazionaria, normalmente in acqua, stendendola in uno strato sottile e uniforme per mezzo di una stendendola in uno strato sottile e uniforme per mezzo di una spatola, a partire da un lato della lastra e verso il lato opposspatola, a partire da un lato della lastra e verso il lato opposto.to.Lo spessore dello strato dipende dal tipo di separazione Lo spessore dello strato dipende dal tipo di separazione cromatograficacromatografica desiderata (desiderata (circa circa 0,25mm per le separazioni 0,25mm per le separazioni analitiche e fino a 5mm per quelle analitiche e fino a 5mm per quelle preparativepreparative).).Nella cromatografia d'Nella cromatografia d'adsorbimentoadsorbimento, alla sospensione viene , alla sospensione viene aggiunto un agente legante, come il solfato di calcio, che facilaggiunto un agente legante, come il solfato di calcio, che facilita ita l'adesione dell'adsorbente alla lastra. In generale la lastra vil'adesione dell'adsorbente alla lastra. In generale la lastra viene ene essiccata per far aderire perfettamente la fase stazionaria al essiccata per far aderire perfettamente la fase stazionaria al supporto. L'essiccamento supporto. L'essiccamento èè condotto in una stufa a 100condotto in una stufa a 100--120120°°C e C e serve anche per ottenere l'attivazione dell'adsorbente.serve anche per ottenere l'attivazione dell'adsorbente.ÈÈ oggi commercialmente disponibile una vasta gamma di piastre oggi commercialmente disponibile una vasta gamma di piastre gigiàà pronte.pronte.

Preparazione dello strato sottilePreparazione dello strato sottilePreparazione dello strato sottile


SviluppoSviluppoSviluppoIl campione viene applicato alla lastra mediante una Il campione viene applicato alla lastra mediante una micropipettamicropipetta o una siringa o una siringa sotto forma di macchia, a circa 2,0cm dal bordo. Il solvente viesotto forma di macchia, a circa 2,0cm dal bordo. Il solvente viene rimosso con ne rimosso con un leggero riscaldamento o con un asciugacapelli.un leggero riscaldamento o con un asciugacapelli.La separazione avviene in un recipiente di vetro che contiene suLa separazione avviene in un recipiente di vetro che contiene sul fondo circa l fondo circa 1,5cm di solvente di sviluppo.1,5cm di solvente di sviluppo.Il solvente va lasciato equilibrare per circa un'ora chiudendo iIl solvente va lasciato equilibrare per circa un'ora chiudendo il recipiente con l recipiente con un coperchio, in modo di assicurare che l'atmosfera al suo interun coperchio, in modo di assicurare che l'atmosfera al suo interno diventi no diventi satura del vapore del solvente (satura del vapore del solvente (equilibramentoequilibramento), per evitare una corsa ), per evitare una corsa irregolare del solvente e quindi una cattiva separazione. irregolare del solvente e quindi una cattiva separazione. Una volta avvenuto l'Una volta avvenuto l'equilibramentoequilibramento, si toglie il coperchio e si posiziona , si toglie il coperchio e si posiziona verticalmente la lastra nel recipiente facendo in modo che peschverticalmente la lastra nel recipiente facendo in modo che peschi nel solvente.i nel solvente.Si ripone quindi il coperchio e la separazione avviene man mano Si ripone quindi il coperchio e la separazione avviene man mano che il solvente che il solvente corre lungo la lastra. corre lungo la lastra. Lo sviluppo viene arrestato quando il fronte del solvente ha ragLo sviluppo viene arrestato quando il fronte del solvente ha raggiunto circa i giunto circa i due terzi della lunghezza della lastrina: normalmente occorrono due terzi della lunghezza della lastrina: normalmente occorrono pochi minuti.pochi minuti.


Rivelazione dei componentiRivelazione dei componentiRivelazione dei componentiIn alcuni casi di analiti colorati non In alcuni casi di analiti colorati non èè necessaria alcuna operazione.necessaria alcuna operazione.

Spruzzando sulla lastra acido solforico al 50% o acido solforicoSpruzzando sulla lastra acido solforico al 50% o acido solforico al 25% in al 25% in etanolo, si ottiene la etanolo, si ottiene la carbonizzazione carbonizzazione della maggior parte dei composti che, della maggior parte dei composti che, pertanto, saranno visibili come macchie marroni.pertanto, saranno visibili come macchie marroni.

L'esame della lastra sotto L'esame della lastra sotto luce ultraviolettaluce ultravioletta mostrermostreràà la posizione di sostanze la posizione di sostanze che assorbono nell'ultravioletto o di composti fluorescenti. Molche assorbono nell'ultravioletto o di composti fluorescenti. Molti adsorbenti ti adsorbenti commerciali usati per la cromatografia su strato sottile contengcommerciali usati per la cromatografia su strato sottile contengono un ono un colorante fluorescente, coscolorante fluorescente, cosìì che, all'esame in luce ultravioletta, i composti che, all'esame in luce ultravioletta, i composti separati appaiono come macchie scure su uno sfondo fluorescente.separati appaiono come macchie scure su uno sfondo fluorescente.

Se si sottopone invece la lastra a Se si sottopone invece la lastra a vapori di iodiovapori di iodio si mettono in evidenza i si mettono in evidenza i composti insaturi.composti insaturi.

Spruzzando infine la lastra con reattivi specifici si otterrSpruzzando infine la lastra con reattivi specifici si otterràà la colorazione di la colorazione di determinati composti: ad esempio, con la determinati composti: ad esempio, con la ninidrinaninidrina gli aminoacidi si gli aminoacidi si colorano in violetto.colorano in violetto.


TLC bidimensionaleTLC bidimensionaleTLC bidimensionale

direzione di flusso del primo solvente

direzione di flusso del secondo solvente

separazione se viene usato solo il secondo solvente

separazione se entrambi i solventi vengono utilizzati

separazione se viene usato solo il primo solvente

Il materiale da cromatografare è posto su un angolo della lastra come singola macchia e successivamente viene sviluppato in una direzione e dopo essiccamento è sviluppata con un altro eluente in una direzione perpendicolare alla prima.


Cromatografia su cartaCromatografia su cartaLe fibre di cellulosa della carta fungono da matrice di supportoLe fibre di cellulosa della carta fungono da matrice di supporto per la fase per la fase stazionaria.stazionaria.

La fase stazionaria può essere acqua, o un materiale La fase stazionaria può essere acqua, o un materiale apolareapolare (ad esempio la (ad esempio la paraffina liquida) oppure particelle impregnate di un adsorbenteparaffina liquida) oppure particelle impregnate di un adsorbente solido. solido.

Esistono in commercio carte dotate di diverse caratteristiche.Esistono in commercio carte dotate di diverse caratteristiche.

Sia per il metodo ascendente (simile al TLC) sia per quello discSia per il metodo ascendente (simile al TLC) sia per quello discendente il endente il solvente solvente èè posto sul fondo di un recipiente chiuso per permettere la saturposto sul fondo di un recipiente chiuso per permettere la saturazione azione della camera con i suoi vapori. della camera con i suoi vapori.

Nella tecnica discendente, il lato della carta lungo il quale Nella tecnica discendente, il lato della carta lungo il quale èè deposto il campione deposto il campione èè invece immerso in una vaschetta alla sommitinvece immerso in una vaschetta alla sommitàà del recipiente mentre il resto del recipiente mentre il resto della carta della carta èè lasciato pendere verticalmente. Il solvente si muove verso il blasciato pendere verticalmente. Il solvente si muove verso il basso a asso a causa della forza di gravitcausa della forza di gravitàà. Questa tecnica, rispetto a quella ascendente, . Questa tecnica, rispetto a quella ascendente, presenta il vantaggio che la velocitpresenta il vantaggio che la velocitàà di flusso del solvente di flusso del solvente èè maggiore.maggiore.

Anche nella cromatografia su carta si può usare la tecnica bidimAnche nella cromatografia su carta si può usare la tecnica bidimensionale, ensionale, analogamente a quanto analogamente a quanto èè stato descritto per la TLC.stato descritto per la TLC.


GascromatografoGascromatografoGascromatografo

1.1. Bombola, regolatore Bombola, regolatore di pressione e valvola di pressione e valvola controllo flussocontrollo flusso

2.2. IniettoreIniettore

3.3. Forno e colonnaForno e colonna

4.4. RivelatoreRivelatore

5.5. Sistema di Sistema di acquisizione datiacquisizione dati

6.6. CromatogrammaCromatogramma

1

2

3

4

6

5


IniettoriIniettoriIniettoriLa fase mobile La fase mobile èè un gas inerte, che ha solo la un gas inerte, che ha solo la funzione di trasportare il campione.funzione di trasportare il campione.HeHe, , ArAr, N, N22, H, H22..Il campione viene iniettato in quantitIl campione viene iniettato in quantitààmolto piccole (fino a 0,5ml per impaccate, molto piccole (fino a 0,5ml per impaccate, fino a 100 volte inferiori per capillari).fino a 100 volte inferiori per capillari).

LL’’entrata deve essere ad una temperatura entrata deve essere ad una temperatura sufficientemente elevata da permettere sufficientemente elevata da permettere ll’’evaporazione istantanea del campione e evaporazione istantanea del campione e tale da permettere al vapore di espandersi tale da permettere al vapore di espandersi senza essere spinto indietro.senza essere spinto indietro.


ColonneColonneColonneSi suddividono in impaccate e capillari.Si suddividono in impaccate e capillari.

LeLe impaccateimpaccate contengono particelle solide (contengono particelle solide (ØØ 100100--250250μμm)m): diatomee (fossili di : diatomee (fossili di piante unicellulari) o diatomee silanizzate, per ridurre la polapiante unicellulari) o diatomee silanizzate, per ridurre la polaritritàà mediante mediante arricchimento superficiale di gruppi metilici. Sono lunghe 2 o 3arricchimento superficiale di gruppi metilici. Sono lunghe 2 o 3m con m con ØØ tratra 2 2 e 4mm.e 4mm.Le Le capillaricapillari o o tubolari apertetubolari aperte sono molto pisono molto piùù sottili e lunghe (sottili e lunghe (ØØ 0,10,1--0,5mm; 0,5mm; lunghezza 50lunghezza 50--300m) in cui la fase stazionaria 300m) in cui la fase stazionaria èè depositata sulle pareti interne depositata sulle pareti interne (film sottile). Queste ultime hanno un elevato numero di piatti (film sottile). Queste ultime hanno un elevato numero di piatti teorici (anche teorici (anche 300300˙̇000) grazie alla loro elevata lunghezza.000) grazie alla loro elevata lunghezza.

Colonna Colonna impaccata impaccata (vetro o (vetro o metallo)metallo)

Colonne Colonne capillari (vetro capillari (vetro

o silice fusa)o silice fusa)


ColonneColonne

Nelle colonne SCOT (anche chiamate PLOT Nelle colonne SCOT (anche chiamate PLOT –– a strato poroso) la a strato poroso) la superficie superficie èè ricoperta da materiale di supporto che può adsorbire ricoperta da materiale di supporto che può adsorbire molta fase stazionaria con efficienza minore rispetto alle WCOT molta fase stazionaria con efficienza minore rispetto alle WCOT (le pi(le piùù recenti sono indicate con la sigla FSOT recenti sono indicate con la sigla FSOT -- a silice fusa).a silice fusa).Il numero di piatti teorici per metro Il numero di piatti teorici per metro èè di alcune centinaia per le di alcune centinaia per le impaccate e di diverse migliaia per le tubolari aperte a silice impaccate e di diverse migliaia per le tubolari aperte a silice fusa.fusa.


Matrice di supporto: diatomee o direttamente il materiale Matrice di supporto: diatomee o direttamente il materiale costituente il capillare (silice fusa).costituente il capillare (silice fusa).Fase liquida:Fase liquida:

bassa volatilitbassa volatilitàà;; stabilitstabilitàà termica;termica; inerzia chimica;inerzia chimica; opportuni parametri di ripartizione.opportuni parametri di ripartizione.

Liquidi polimerici:Liquidi polimerici: polidimetil silossano e suoi derivati (polidimetil silossano e suoi derivati (--CC66HH55,,--CC33HH66CN,CN,--

CC33HH66CFCF33);); glicole glicole polietilenicopolietilenico. . HOHO--CHCH22--CHCH22--(O(O--CHCH22--CHCH22))nn--OHOH

In alcuni casi i componenti poco volatili vengono trasformati In alcuni casi i componenti poco volatili vengono trasformati in derivati piin derivati piùù volatili, tali da essere allo stato gassoso alle volatili, tali da essere allo stato gassoso alle temperature di lavoro.temperature di lavoro.

DerivatizzazioneDerivatizzazione

Fasi stazionarieFasi stazionarieFasi stazionarie

n


Effetto della temperaturaEffetto della temperatura

PiPiùù la temperatura la temperatura èè elevata elevata pipiùù il soluto tende a trasferirsi il soluto tende a trasferirsi nella fase gassosa.nella fase gassosa.

Aumentando T diminuisce Aumentando T diminuisce ttRR

UnaUna miglioremigliore separazioneseparazione sisipuòpuò ottenereottenere variandovariando la la temperaturatemperatura mentrementre procedeprocedell’’eluizioneeluizione ((programmaprogramma diditemperaturatemperatura).).

45°C

145°C

T da 30°C a 180°C


RivelatoriRivelatoriRivelatoriCaratteristiche idealiCaratteristiche ideali

Elevata sensibilitElevata sensibilitàà..

StabilitStabilitàà e riproducibilite riproducibilitàà..

Risposta lineare in intervallo ampio di concentrazioni.Risposta lineare in intervallo ampio di concentrazioni.

AffidabilitAffidabilitàà (adoperabile da non esperti).(adoperabile da non esperti).

OperativitOperativitàà alle diverse temperature (0alle diverse temperature (0°°C C -- 400400°°C)C)

Tempi di risposta brevi indipendenti dal flusso.Tempi di risposta brevi indipendenti dal flusso.

Risposta uniforme per i diversi Risposta uniforme per i diversi analitianaliti o prevedibile.o prevedibile.

Non distruttivo.Non distruttivo.


Rivelatore a conducibilità termica (TCD)Rivelatore a conducibilitRivelatore a conducibilitàà termica (TCD)termica (TCD)

4 filamenti: 2 sono circondati da gas di trasporto che fluisce i4 filamenti: 2 sono circondati da gas di trasporto che fluisce in una corrente di n una corrente di riferimento, lriferimento, l’’altra coppia altra coppia èè circondata da gas di trasporto che proviene dalla circondata da gas di trasporto che proviene dalla colonna. Quando il ponte colonna. Quando il ponte èè in equilibrio tra i punti 1 e 2 non appare alcun segnale. in equilibrio tra i punti 1 e 2 non appare alcun segnale. Una variazione della conducibilitUna variazione della conducibilitàà termica del gas (dovuta alltermica del gas (dovuta all’’eluizione di analiti con eluizione di analiti con il gas) produce un segnale tra 1 e 2.il gas) produce un segnale tra 1 e 2.

controllo della correntedel filamento

cella diriferimento

cella delcampione

registratore

attenuatorea ponte

Il Il TCDTCD èè statostato tratra i i primiprimi ed ed èè tratra i i pipiùù diffusidiffusi. La . La temperaturatemperatura didi un un filamentofilamento (Pt, Au, W, (Pt, Au, W, ……) ) riscaldatoriscaldato elettricamenteelettricamente in in presenzapresenza didi un gas un gas dipendedipende dalladalla conducibilitconducibilitàà termicatermica del gas. He o Hdel gas. He o H22 hannohanno conducibilitconducibilitààtermichetermiche moltomolto pipiùù altealte delladella maggiormaggior parteparte deidei composticomposti organiciorganici..I principali vantaggi sono la I principali vantaggi sono la semplicitsemplicitàà, l, l’’elevata applicabilitelevata applicabilitàà a a specie diverse, la risposta lineare e specie diverse, la risposta lineare e inoltre non inoltre non èè distruttivo.distruttivo.Il limite principale Il limite principale èè la non elevata la non elevata sensibilitsensibilitàà..Per minimizzare gli effetti indesiderati Per minimizzare gli effetti indesiderati (variazioni di temperatura, pressione, (variazioni di temperatura, pressione, ……) ) e aumentare la sensibilite aumentare la sensibilitàà si utilizza un si utilizza un circuito a ponte di circuito a ponte di WheatstoneWheatstone::


Rivelatori a ionizzazione di fiamma (FID)Rivelatori a ionizzazione di fiamma (FID)

Il rivelatore a ionizzazione di fiamma Il rivelatore a ionizzazione di fiamma èè forse il piforse il piùù diffuso. Si basa sul fatto diffuso. Si basa sul fatto che molti composti organici, quando bruciano, in una fiamma, proche molti composti organici, quando bruciano, in una fiamma, producono ducono intermedi ionici che possono aumentare la conducibilitintermedi ionici che possono aumentare la conducibilitàà della fiamma della fiamma stessa.stessa.

ÈÈ molto pimolto piùù sensibile di quello a conducibilitsensibile di quello a conducibilitàà termica.termica.

+ -

Fiamma H2-aria

Parete interna del forno

Collettore rimuovibile

Aria

H2

Colonna


Altri rivelatoriAltri rivelatoriTermoionico (TID) Termoionico (TID) ioni in plasma a 800ioni in plasma a 800°°CC

selettivo composti contenenti N e P (pesticidi, selettivo composti contenenti N e P (pesticidi, ……).).

Fotometria di fiamma (FPD)Fotometria di fiamma (FPD) fotoemissionefotoemissione

selettivo composti contenenti S e P (inquinanti, selettivo composti contenenti S e P (inquinanti, ……).).

Fotoionizzazione (PID)Fotoionizzazione (PID) irradiazione con UVirradiazione con UV

idrocarburi aromatici (inquinanti atmosferici, idrocarburi aromatici (inquinanti atmosferici, ……).).

Cattura di elettroni (ECD)Cattura di elettroni (ECD) irradiamento con raggi irradiamento con raggi ββ

selettivo composti alogenati.selettivo composti alogenati.

Emissione atomica (AED)Emissione atomica (AED) plasma da microondeplasma da microonde

selettivo per composti contenente S.selettivo per composti contenente S.C. A. MattiaC. A. Mattia 3434

Metodi accoppiatiMetodi accoppiatiMetodi accoppiatiLa La gascromatografiagascromatografia èè spesso spesso acoppiataacoppiata a a tecniche altamente selettive. Questi metodi tecniche altamente selettive. Questi metodi sono anche detti, dalla italianizzazione del sono anche detti, dalla italianizzazione del termine inglese, metodi termine inglese, metodi ifenatiifenati ((hyphenhyphen: : lineetta di collegamento).lineetta di collegamento).

SpettrometriaSpettrometria di massadi massaSpettroscopia infrarossaSpettroscopia infrarossa

Spettroscopia di risonanza magneticaSpettroscopia di risonanza magneticaVarie tecniche elettrochimicheVarie tecniche elettrochimiche


SpettrometriaSpettrometria di massadi massa1

2

3

4

1. Camera di ionizzazione

2. Pompa a vuoto

3. Magnete

4. Rivelatore


ApplicazioniApplicazioniLa cromatografia gasLa cromatografia gas--solido ha applicazioni soprattutto solido ha applicazioni soprattutto in chimica ambientale (analisi aria, gas di scarico, in chimica ambientale (analisi aria, gas di scarico, ……).).La cromatografia gasLa cromatografia gas--liquido liquido èè largamente diffusa sia largamente diffusa sia per separazioni che per analisi qualitativa e per separazioni che per analisi qualitativa e quantitativa.quantitativa. Come tecnica separativa Come tecnica separativa èè largamente applicata a sistemi largamente applicata a sistemi

organici, organici, metallorganicimetallorganici e biochimici.e biochimici. La non elevata riproducibilitLa non elevata riproducibilitàà limita llimita l’’uso dei volumi di uso dei volumi di

ritenzione per lritenzione per l’’identificazione dei componenti in una miscela.identificazione dei componenti in una miscela. Risulta utile per confermare la presenza o lRisulta utile per confermare la presenza o l’’assenza di un assenza di un

composto.composto. LL’’analisi quantitativa può dare precisione superiore al 99%.analisi quantitativa può dare precisione superiore al 99%.


ApplicazioniApplicazioniApplicazioni

(a)

Tipici Tipici cromatogrammicromatogrammi ottenuti ottenuti con una colonna tubolare aperta con una colonna tubolare aperta rivestita con rivestita con

(a)(a) polidimetilsilossanopolidimetilsilossano;;

(b)(b) 5% 5% polidifenilsilossanopolidifenilsilossano95% 95% polidimetilsilossanopolidimetilsilossano;;

(c)(c) 50% 50% polidifenilsilossanopolidifenilsilossano50% 50% polidimetilsilossanopolidimetilsilossano;;

(d)(d) 50% 50% trifluoropropilpolimetilsilossanotrifluoropropilpolimetilsilossano50% 50% polidimetilsilossanopolidimetilsilossano;;

(e)(e) glicole glicole polietilenicopolietilenico;;

(f)(f) 50% 50% cianopropildimetilsilossanocianopropildimetilsilossano50% 50% polidimetilsilossanopolidimetilsilossano..



5% 5% polidifenilsilossanopolidifenilsilossano95% 95% polidimetilsilossanopolidimetilsilossano



50% 50% polidifenilsilossanopolidifenilsilossano50% 50% polidimetilsilossanopolidimetilsilossano



50% 50% trifluoropropilpolimetilsilossanotrifluoropropilpolimetilsilossano50% 50% polidimetilsilossanopolidimetilsilossano

glicole glicole polietilenicopolietilenico



50% 50% cianopropildimetilsilossanocianopropildimetilsilossano50% 50% polidimetilsilossanopolidimetilsilossano


Le colonne usate sono di Le colonne usate sono di lunghezza variabile da qualche lunghezza variabile da qualche decimetro a pidecimetro a piùù di un metro.di un metro.

Deposizione del campione Deposizione del campione seguita da seguita da eluenteeluente..

Flusso ottenuto per gravitFlusso ottenuto per gravitàà..

Si raccolgono frazioni.Si raccolgono frazioni.

Le frazioni vengono analizzate Le frazioni vengono analizzate da tecniche non in linea.da tecniche non in linea.

Cromatografia a percolazioneCromatografia a percolazioneCromatografia a percolazione


MatriciMatriciAgarosioAgarosio:: èè un polisaccaride derivante da particolari alghe rosse cosituitoun polisaccaride derivante da particolari alghe rosse cosituito da residui da residui alternati di Dalternati di D--galattoso e 3,6galattoso e 3,6--anidroanidro--LL--galattoso. Disponibilgalattoso. Disponibilititàà commercialecommerciale:: Sepharose, Sepharose, Sepharose CL (crossSepharose CL (cross--linking con 2,3linking con 2,3--dibromopropanolo), Superose, Biodibromopropanolo), Superose, Bio--Gel A.Gel A. Limiti di Limiti di esclusione esclusione 1010--40000kD40000kD..CellulosaCellulosa:: ppolimeroolimero di di unitunitàà glucosidiche unito da legami glucosidiche unito da legami --1,4. Tramite epicloridrina 1,4. Tramite epicloridrina vengono ottenuti i legami crociati essenziali per vengono ottenuti i legami crociati essenziali per ll’’utilizzoutilizzo come matrice in cromatografia, come matrice in cromatografia, il numero dei quali determina la dimensione dei pori.il numero dei quali determina la dimensione dei pori.DestranoDestrano:: èè un polimero di residui di glucosio uniti da legami un polimero di residui di glucosio uniti da legami --1,6 prodotto dal batterio 1,6 prodotto dal batterio Leuconostoc mesenteroidesLeuconostoc mesenteroides.. ÈÈ presente in commercio con il nome di Sephadex. La porositpresente in commercio con il nome di Sephadex. La porositààdei gel a base di destranodei gel a base di destrano èè controllata dalla massa molecolare del destrano usato e controllata dalla massa molecolare del destrano usato e dalldall’’introduzione di legami crociati ottenuti con epicloridrina. Limiintroduzione di legami crociati ottenuti con epicloridrina. Limiti di esclusione 0ti di esclusione 0,,77--800kD. Il cosiddetto Sephacryl 800kD. Il cosiddetto Sephacryl èè destrano con legami crociati ottenuti con N,Ndestrano con legami crociati ottenuti con N,N’’--metilene metilene bisacrilamide. Limiti di esclusione 1bisacrilamide. Limiti di esclusione 1--8000 kD. Il Superdex 8000 kD. Il Superdex èè un gel composito costituito da un gel composito costituito da destrano covalentemente legato ad agarosio.destrano covalentemente legato ad agarosio.PoliacrilamidePoliacrilamide: : èè un polimero di acrilamide e N,Nun polimero di acrilamide e N,N’’--metilenbisacrilamide (questmetilenbisacrilamide (quest’’ultimo ultimo determina la formazione di legami crociati). determina la formazione di legami crociati). ÈÈ disponibile in commercio come Biodisponibile in commercio come Bio--GelGel P, P, con limiti di esclusione tra 0con limiti di esclusione tra 0,,2 e 400kD.2 e 400kD.PolistirenePolistirene:: èè un polimero di stirene legato con divinilbenzene.un polimero di stirene legato con divinilbenzene.SiliceSilice:: èè un polimero prodotto a partire dallun polimero prodotto a partire dall’’acido ortosilicico. I molti gruppi silanolo (Siacido ortosilicico. I molti gruppi silanolo (Si--OH) rendono la matrice altamente idrofilica. Il loro eccesso puOH) rendono la matrice altamente idrofilica. Il loro eccesso puòò essere eliminato essere eliminato derivatizzando con triclorometilsilano.derivatizzando con triclorometilsilano.


MatriciMatriciMatrici

agarosio

sephadex sephacryl


Cromatografia liquidaCromatografia liquidaSe si fa uso di particelle grosse (200Se si fa uso di particelle grosse (200--400400μμm), l'eluizione può essere m), l'eluizione può essere fatta per gravitfatta per gravitàà..Se si fa invece uso di particelle medie (40Se si fa invece uso di particelle medie (40--6060µµm) la separazione m) la separazione èèmigliore, ma l'eluizione per gravitmigliore, ma l'eluizione per gravitàà èè troppo lenta.troppo lenta.Si applica quindi una pressione moderata (2Si applica quindi una pressione moderata (2--3atm).3atm).La pressione viene realizzata in genere mediante pompe La pressione viene realizzata in genere mediante pompe peristaltiche.peristaltiche.Questa tecnica Questa tecnica èè molto usata nei laboratori di chimica organica.molto usata nei laboratori di chimica organica.Vantaggi:Vantaggi:

basso costo;basso costo; semplice;semplice; adatta per scopi preparativi.adatta per scopi preparativi.

Svantaggi:Svantaggi: lentezza;lentezza; non adatta per scopi quantitativi;non adatta per scopi quantitativi; bassa risoluzione.bassa risoluzione.


HPLCHPLCHPLCCromatografia liquida ad alta efficienza

Vantaggi rispetto alla LC classica: velocità, risoluzione e sensibilità superiori.

AA BB CC

A.A. Cromatografia classica a colonna aperta riempita con particelle Cromatografia classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d > grandi, porose (d > 150mm, D = 20150mm, D = 20--50mm, L = 5050mm, L = 50--200cm).200cm).

B.B. HPLC con riempimento pellicolare (d = 40HPLC con riempimento pellicolare (d = 40--70mm, D = 170mm, D = 1--3mm, L = 503mm, L = 50--100cm).100cm).

C.C. HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5--10mm, D = 210mm, D = 2--6mm, L = 106mm, L = 10--50cm).50cm).

d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza cold = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonnaonna


HPLCHPLCLC classica: LC classica:

dimensione delle particelle e diametro interno della colonna moldimensione delle particelle e diametro interno della colonna molto to maggiori che nella HPLC; maggiori che nella HPLC; velocitvelocitàà di flusso molto basse;di flusso molto basse;tempi di analisi lunghi. tempi di analisi lunghi.

Cercando di aumentare la velocitCercando di aumentare la velocitàà del solvente, diminuiscono efficienza e del solvente, diminuiscono efficienza e risoluzione a causa del limitato trasporto di massa nei pori prorisoluzione a causa del limitato trasporto di massa nei pori profondi e nei fondi e nei lunghi canali interparticellari.lunghi canali interparticellari.

HPLC: HPLC: impaccamentoimpaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne sottili; sottili; contropressionicontropressioni maggiori;maggiori;tempi di analisi contenuti. tempi di analisi contenuti.

Per favorire il flusso della fase mobile Per favorire il flusso della fase mobile èè quindi necessario lquindi necessario l’’uso di pompe ad uso di pompe ad alta pressione. Efficienza aumentata di 10alta pressione. Efficienza aumentata di 10--100 volte e tempi di separazione 100 volte e tempi di separazione diminuiti (miglioramento nei termini di trasporto di massa delladiminuiti (miglioramento nei termini di trasporto di massa della fase fase stazionaria e della fase mobile).stazionaria e della fase mobile).


HPLCHPLCHPLCFase stazionaria costituita da particelle molto piccole 3 – 10μm.Colonne di piccolo diametro 2 - 5mm.Pressioni di ingresso elevate.Precisione nell’introduzione del campione.Portata della fase mobile controllata.Rivelatori in linea.Elevata risoluzione.Analisi rapide.


Fase stazionaria (o matrice di supporto) costituita da particellFase stazionaria (o matrice di supporto) costituita da particelle e molto piccole 3 molto piccole 3 –– 1010μμm.m.Colonne di piccolo diametro 2 Colonne di piccolo diametro 2 -- 5mm.5mm.Pressioni di ingresso elevate.Pressioni di ingresso elevate.Precisione nellPrecisione nell’’introduzione del campione.introduzione del campione.Portata della fase mobile controllata.Portata della fase mobile controllata.Rivelatori in linea.Rivelatori in linea.

Elevata risoluzioneElevata risoluzioneAnalisi rapideAnalisi rapide

Caratteristiche HPLCCaratteristiche HPLCCaratteristiche HPLC


HPLC VantaggiHPLC VantaggiRapiditRapiditàà e precisione in analisi quantitativee precisione in analisi quantitative

Tipico tempo di analisi di 5 Tipico tempo di analisi di 5 -- 20min.20min. Precisione (errore < 0,5 Precisione (errore < 0,5 -- 1%).1%).

Analisi automatizzateAnalisi automatizzate Usando autocampionatori ed elaboratori di dati.Usando autocampionatori ed elaboratori di dati.

Alta sensibilitAlta sensibilitàà Limite di rivelabilitLimite di rivelabilitàà (LOD) di ng a (LOD) di ng a pgpg..

Recupero del campione quantitativoRecupero del campione quantitativo Tecniche Tecniche preparativepreparative da da µµg a g.g a g.

Adatta a diversi tipi di campioniAdatta a diversi tipi di campioni Può analizzare piPuò analizzare piùù del 60% di tutti i composti contro il del 60% di tutti i composti contro il

15% della GC.15% della GC.


Cromatogramma HPLCCromatogrammaCromatogramma HPLCHPLC


CromatografoCromatografoCromatografo


Schema Cromatografo HPLCSchema Cromatografo HPLC

SERBATOIOSERBATOIOSOLVENTESOLVENTE

POMPA

FILTRO

MISURATOREPRESSIONE

SPURGO

INIETTORE

PRECOLONNA

COMPARTIMENTOTERMOSTATATO

COLONNA

RIVELATORECOLLETTOREDI FRAZIONI

REGISTRATORE


Valvola a iniezioneValvolaValvola a a iniezioneiniezione

Posizionedi carica

Posizione diintroduzione


ColonneColonneColonne

Effetto della lunghezza


Fase stazionariaFase stazionariaFase stazionariaLiquidaLiquida

difficile evitare il trascinamentodifficile evitare il trascinamento

SolidaSolidaparticelle porose (particelle porose (ØØ 33--1010μμm) m) –– alta caduta di pressionealta caduta di pressioneparticelle pellicolari (vetroparticelle pellicolari (vetro

o polimero non porosoo polimero non porosorivestito da un sottilerivestito da un sottilestrato poroso),strato poroso),ØØ 4040μμm,m,bassa caduta di pressionebassa caduta di pressione


Colonna “tipo”Colonna Colonna ““tipotipo””Lunghezza 150 – 250mm, diametro interno 4,6mm,

impaccata con particelle da 5 a 10mm, fase legata C18.

Flusso 1 – 2mL/min usando fase mobile metanolo o acetonitrile in acqua.

Capacità da 1ng a 1mg.

Pressione di esercizio 500 – 2000psi (pound per square inch), ovvero 35 – 140bar.

Piatti teorici da 4000 a 10000.

Tipico tempo di vita 500 – 2000 iniezioni o 3 – 24 mesi.C. A. MattiaC. A. Mattia 5858

PompePompePompeA siringa A siringa (mediante una vite senza fine).(mediante una vite senza fine).Pneumatiche Pneumatiche (contenitore non rigido compresso da gas).(contenitore non rigido compresso da gas).Reciprocanti o alternative a pistone.Reciprocanti o alternative a pistone.

Per questo tipo di pompe è necessario uno smorzatore di pulazioni.

Una pompa a doppio pistone (doppia testata) crea un flusso smorzato.


Fase normale e fase inversaFase normale e fase inversa

Fase normale

Fase inversa

Usa silice, allumina, fasi legate amino-, ciano-, o fenil-

• Usa fasi mobili non polari comeesano, CH2Cl2 modificato conisopropanolo

• Analiti polari hanno tempi diritenzione più lunghi

Eccellente per analiti non polari, isomeri, separazione in gruppi omogenei in polarità


Fase mobileFase mobileInfluenza della fase mobile: Influenza della fase mobile: le interazioni implicano una competizione tra le le interazioni implicano una competizione tra le molecole dellmolecole dell’’analita e quelle della fase mobile per i siti di adsorbimento.analita e quelle della fase mobile per i siti di adsorbimento.I solventi possono essere distinti a seconda della loro forza diI solventi possono essere distinti a seconda della loro forza di adsorbimento adsorbimento (serie (serie eluotropicaeluotropica).).

idrocarburi alifaticiidrocarburi alifaticiolefine olefine idrocarburi aromaticiidrocarburi aromaticialogenuri alogenuri solfurisolfurieterieterinitrocompostinitrocompostiesteri, aldeidi e chetoniesteri, aldeidi e chetoniammineamminesolfonisolfonisolfossidisolfossidiammidiammidiac. carbossiliciac. carbossiliciacquaacqua

ppoollaarriittàà


Fase mobileFase mobile


EluizioneEluizione a gradientea gradienteFase mobile debole:Fase mobile debole: i componenti che sono ritenuti debolmente i componenti che sono ritenuti debolmente sono trattenuti e separati ma quelli ritenuti fortemente sarannosono trattenuti e separati ma quelli ritenuti fortemente sarannoeluiti in tempi troppo lunghi (e probabilmente con picchi troppoeluiti in tempi troppo lunghi (e probabilmente con picchi troppoallargati). allargati). Fase mobile forte:Fase mobile forte: saranno saranno eluitieluiti troppo rapidamente i troppo rapidamente i componenti poco ritenuti, e saranno separati correttamente componenti poco ritenuti, e saranno separati correttamente quelli trattenuti fortemente. quelli trattenuti fortemente. Per separare tutti i componenti con fattori di ritenzione (Per separare tutti i componenti con fattori di ritenzione (kk) ) molto diversimolto diversi èè necessario far variare la velocitnecessario far variare la velocitàà di migrazione di migrazione delle bande durante il corso delldelle bande durante il corso dell’’analisi: analisi: eluizioneeluizione a gradientea gradiente..LL’’eluizione viene iniziata, ad esempio, con un solvente debole e eluizione viene iniziata, ad esempio, con un solvente debole e la forza del solvente viene progressivamente aumentata.la forza del solvente viene progressivamente aumentata.LL’’effetto complessivo effetto complessivo èè quello di una quello di una eluizioneeluizione progressiva delle progressiva delle sostanze pisostanze piùù fortemente ritenute e al tempo stesso, di una fortemente ritenute e al tempo stesso, di una riduzione nella formazione di code.riduzione nella formazione di code.


Eluizione a gradienteEluizioneEluizione a gradientea gradienteLL’’eluizioneeluizione a gradiente si contrappone alla gradiente si contrappone all’’eluizioneeluizionenormale (normale (isocraticaisocratica).).

SOLVENTESOLVENTEDEBOLEDEBOLE

SOLVENTESOLVENTEFORTEFORTE

FORZAFORZAINTERMEDIAINTERMEDIA

GRADIENTEGRADIENTEDI SOLVENTEDI SOLVENTE


RivelatoriRivelatoriProprietProprietàà di massadi massa ProprietProprietàà solutosolutoCaratteristiche fase mobileCaratteristiche fase mobile Caratteristiche specifiche solutoCaratteristiche specifiche solutoInd. Rifr.; Cost. dielettr.; DensitInd. Rifr.; Cost. dielettr.; Densitàà UVUV--Vis.; Vis.; FluorescFluoresc.; .; ElettrochimElettrochim..


Rivelatore a Rivelatore a UVUV--VisibileVisibile

Lunghezza d’onda variabile

A serie di diodi(DAD)

Sorgenti: lampade a Hg; D; W


Rivelatore a rifrazioneRivelatore a rifrazioneRivelatore a rifrazione




ApplicazioniApplicazioniApplicazioniNell’estratto da foglie di Gingko Biloba L. sono stati identificati molti flavonoidi, antiossidanti che proteggono da danni i nervi, il muscolo del cuore, i vasi sanguigni e la retina.

Quercetina

Isoramnetina

Kampferolo

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C. A. Mattia Cromatografia Metodi cromatograficiMetodi ...croma).pdfsu colonne di vetro impaccate con carbonato di calcio. 1903 C. A. Mattia 4 Metodi cromatograficiMetodi cromatografici