使用 BioBLU® 5p 一次性罐体进行高密度 Vero 细胞灌注培养Xiaofeng (Kevin) Han and Ma Sha1 Eppendorf, Inc., Enfield, CT, USA通讯地址: becken.u@eppendorf.com

应用文献 编号 359 | 2017 年 10 月

摘要

引言

Vero 细胞是一种贴壁依赖性细胞，广泛用作病毒疫苗生产

平台。在搅拌式生物反应器中，Vero 细胞通常生长于微载

体上。Fibra-Cel® 片状载体是一种附着基质新选择，其具有

高表面积与体积比，应用前景广阔。载体的三维环境可保护

细胞免受剪切力损害，实现高密度细胞培养。

本研究使用预装了 Fibra-Cel 的 Eppendorf BioBLU 5p 一

次性罐体培养 Vero 细胞，通过 BioFlo® 320 生物工艺控制

站控制工艺流程。我们采用灌注模式培养细胞，确保持续供

应营养并及时去除毒副产物。

培养得到的 Vero 细胞密度极高，达到约 4,300 万个细胞

/mL，证实了使用 Fibra-Cel 填充床式罐体培养 Vero 细胞

生产疫苗的巨大潜力。

狂犬病、轮状病毒病和流感等病毒性疾病是国际生物医学界面

临的世界性问题。WHO 数据显示，每年有数万人死于狂犬病

[1]。

上个世纪，流感病毒导致全球数百万人死亡。

为满足对病毒性疾病疫苗的强烈需求，当务之急是研发生产率

更高的生产技术，包括可扩展生物反应器细胞培养系统相关技

术。Vero 细胞系已成为病毒疫苗生产中应用最广泛的细胞系之

一 [2]。

搅拌式生物反应器填充了微载体并配备 Eppendorf 低剪切力细

胞提升式搅拌桨，用于利用 Vero 细胞进行狂犬病疫苗生产 [3]。

填充床篮式搅拌桨与 Fibra-Cel 片状载体相结合所构成的细胞

培养支持系统可提供低剪切力的三维环境，是一种极具潜力的

培养系统。疫苗生产商已在使用该方法，但尚未发布相关结果。

图 1：Vero 细 胞 灌 注

培养装置。通过 BioFlo 320 生物工艺控制站控

制 BioBLU 5p 一 次 性

罐体。

材料和方法

容器总生长表面 (cm2)

生长表面大小相当于（BioBLU 5p 罐体的数量 )

BioBLU 5p 一次性罐体 180,000 1T-25 培养瓶 25 7,200

T-175 培养瓶 175 1,028

转瓶 850 212

10 层培养板 ~6,300 29

表 1：各种细胞培养容器的生长表面比较

本研究使用预装了 Fibra-Cel 片状载体的 Eppendorf BioBLU 5p

一次性罐体培养 Vero 细胞。我们以培养物中的葡萄糖消耗作为

测量指标，分析了细胞的生长情况。此外，我们还介绍了一种通过

细胞核计数在细胞培养结束时直接测量细胞数量的方法，并建立

了葡萄糖消耗率与 Vero 细胞密度间的联系。

在 37oC、5% CO2 条件下以被动加湿的方式培养细胞。第 4 天

Vero 细胞培养物完全汇合后，使用胰蛋白酶处理细胞（0.25% 胰

蛋白酶，美国 Thermo Fisher Scientific），然后以 5 × 106 个细胞 /

瓶的密度传代至 3 个 T-175 培养瓶中，每个培养瓶内含有 25 mL

现配的预热培养基。3 天后，当细胞再次达到 100% 汇合时，以 5

× 106 个细胞 / 瓶的接种密度将细胞进一步扩增接种至 8 个

T-175 培养瓶中。当细胞完全汇合时，收获并混合所有细胞，以约

1.9 × 107 个细胞 / 瓶的接种密度接种至 8 个 HYPERFlask® M 细

胞培养瓶（美国 Corning®）中。根据生产商说明书向每个培养瓶中

加入细胞培养基 [5]。在 HYPERFlask 中培养 5 天直至细胞完全

汇合，然后根据生产商方案收获细胞。

将所有细胞合并装入 1 L 无菌补料瓶（德国 Eppendorf）中，用于

一个 BioBLU 5p 一次性罐体中的接种。接种物总体积为 530 mL，

细胞密度为 3.0 × 106 个细胞 /mL，细胞存活率为 99%。

Vero 细胞扩增工艺见图 2。

生物反应器控制和工艺参数

我们使用 BioFlo 320 生物工艺控制系统控制 BioBLU 5p 一次性

罐体（图 1）。

Vero 细胞培养温度为 37 oC。

使用 ISM® 极谱式传感器（瑞士 Mettler Toledo®）测量溶解氧

(DO)。在三气自动模式下以 0.002-0.5 SLPM 的流量自动通气，将

DO 控制在 50%。为了减少培养后期高气体流量导致的起泡，我

们将空气和氧气的流量分别限制在 0.002-0.2 SLPM 和 0-0.5

SLPM。

BioBLU 5p 一次性罐体配有光学 pH 传感器，通过 CO2（酸）和

0.45 M 碳酸氢钠（碱）级联将 pH 控制在 7.1（死区 = 0.1）。

细胞系和培养基

研究使用贴壁 Vero 细胞（ATCC®，CCL-81TM）。细胞培养使用杜

氏改良 Eagle 培养基（DMEM，美国 Thermo Fisher Scientific®），

加入 1x 抗生素 - 抗真菌剂（美国 Thermo Fisher Scientific）和

1% (v/v) 热灭活胎牛血清。

生物反应器和细胞培养生长表面

研究使用了 BioBLU 5p 一次性罐体，罐体内置篮式搅拌桨并预

装了 Fibra-Cel 片状载体（图 1）。每个 BioBLU 5p 罐体含有 150

g Fibra-Cel 片状载体。每克 Fibra-Cel 片状载体的生长表面大小

为 1,200 cm2。因此，一个 BioBLU 5p 可提供 180,000 cm2 的生

长表面，相当于约 212 个转瓶或 29 个 10 层培养板的细胞培养

容器（表 1）。

生物反应器接种物制备和接种

根据 ATCC 的 Vero 细胞培养方案解冻 1 瓶 Vero 细胞（5 × 106

个细胞），制备生物反应器接种物 [4]。将细胞接种到含有 20 mL

预热培养基的 T-175 培养瓶中。使用 Galaxy® 170R CO2 培养箱

（德国 Eppendorf）

冻存细胞（5 × 106 个细胞）

生物反应器接种密度为

4.6 × 105 个细胞/mL530

mL

inoc

ulum

(1.

6 ×

10

9 c

ells

)

3 个 T-175 培养瓶

1 个 T-175 培养瓶

8 个 T-175 培养瓶 8 个 HYPERFlask M 瓶

Fig. 2: Schematic of the Vero cell expansion process

参数 设备/设定值

接种密度 4.6 x 105 个细胞/mL

工作体积 3.5 L

气体分布器 大孔气体分布器

通气控制 气体分布：三气自动气体混合，混流0.002-0.5 SLPM

空气流量 0.002-0.2 SLPM；O2 流量 0-0.5 SLPM表层通气：三气自动气体混合，0.05-1 SLPM

溶解氧 (DO) 50 %

搅拌 篮式搅拌桨；100 rpm

pH 7.1 ± 0.1CO2（酸）和 0.45 M 碳酸氢钠（碱）级联

温度 加热毯; 37 °C

表 2：工艺参数和设定值一览

天 灌注速率 (VVD)

0-2 0

3-7 0.2-0.5

8-11 0.7-1.0

12-21 1.1-1.5

表 3：灌注速率

根据需要，我们向反应器中加入了 Antifoam C Emulsion（美国

Sigma-Aldrich®）。

培养参数汇总见表 2。

补料和灌注控制

从 0.2 罐流量 / 天 (VVD) 开始逐渐增大灌注速率，运行结束时

达到 1.5 VVD。灌注速率通过监测铵水平确定。使用 Cedex® Bio

分析仪（德国 Roche Diagnostics®）每天测量铵水平，将铵浓度

控制在 4 mM 以下。灌注速率汇总见表 3。

研究的目标葡萄糖浓度为 > 3 g/L，使用 Cedex 生化分析仪测

量。除灌注外，根据每天结束时生物反应器中的葡萄糖水平，额

外进行葡萄糖分批补料（200 g/L 葡萄糖原液），保证第二天开始

时生物反应器中的葡萄糖水平与灌注培养基中的葡萄糖浓度

(4.7 g/L) 相近。

研究还通过 Cedex 生化分析仪测定了谷氨酰胺和乳酸的浓度。

用生物反应器中添加的葡萄糖总量减去葡萄糖剩余量，计算得出

葡萄糖消耗率（R，g/ 天）。反应器中除了培养基和灌注培养基中的

葡萄糖外，还包括分批补料补充的葡萄糖。因此，每天添加到生物

反应器中的葡萄糖总量等于，当天开始时罐体中的葡萄糖量（G罐体

- 开始）与灌注供应的葡萄糖量（G

灌注）以及通过分批补料（G

分批）添

加的葡萄糖量之和。通过减去当天结束时罐体中的葡萄糖剩余量

（G 罐体 - 结束

）以及收获的灌流液中的葡萄糖剩余量（G收获

），得出每

天 (24 h) 的葡萄糖消耗量 (g)。使用以下公式计算每日葡萄糖消

耗率 (R)：

R =（G罐体 - 开始

+ G灌注

+ G分批

- G罐体 - 结束

- G收获

）/ 天

> R = 每日葡萄糖消耗率（g/ 天）

> G罐体 - 开始

= 当天开始时罐体中的葡萄糖量 (g)

> G分批

= 当天分批补料加入的葡萄糖量 (g)

> G灌注

= 当天灌注加入的葡萄糖量 (g)

> G罐体 - 结束

= 当天结束时罐体中的葡萄糖量 (g)

> G收获

= 当天结束时收获的灌流液中的葡萄糖量 (g)

当天开始和结束时罐体中的葡萄糖量可用培养基中的葡萄糖浓

度乘以工作体积计算得出。分批补料添加的葡萄糖量可根据葡萄

糖原液的浓度和分批补料的体积计算得出。灌注加入的葡萄糖量

可根据灌注培养基中的葡萄糖浓度和灌注体积计算得出。收获的

灌流液中的葡萄糖剩余量可根据每天收获的灌流液体积和其中

的葡萄糖浓度计算得出。

结果

400 µm 400 µm400 µm

Day 2 Day 5Day 4

图 3：第 2 天、第 4 天和第 5 天 HYPERFlask 中培养的 Vero 细胞

0

1

2

3

4

5

6

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

LactateNH3Glucose

Glu

cose

and

lact

ate

conc

entr

atio

n (g

/L)

NH

3 c

once

ntra

tion

(m

M)

Time (day)

图 4：Vero 细胞灌注培养的代谢情况

结晶紫细胞核计数分析

我们通过结晶紫细胞核计数分析（美国 Chemglass Life

Science，CLS-1332-01）测定了 BioBLU 5p 生物反应器中的细

胞数量。细胞培养工艺完成后切开顶板下方的罐体开口，从罐体

中取出 Fibra-Cel 篮筐。去除篮筐侧壁的两个硅胶软塞后，可触

及 Fibra-Cel 片状载体。我们从篮筐的两个不同位置采集了三份

Fibra-Cel 片状载体样品，转移到 50 mL 锥形管中。每个样品含

有 15 个 Fibra-Cel 片状载体。我们从片状载体中提取了细胞核，

根据结晶紫染色细胞核计数试剂盒的说明书对细胞核进行了染

色，具体步骤如下：将各样品带有细胞的片状载体浸泡在 4 mL

结晶紫染料中，37 oC 培养 1 小时。培养期间每 30 分钟涡旋样品

1 分钟。1 小时后，将各样品管中的 4 mL 结晶紫染料转移至新

试管中，作为样品的首次提取液。然后，向含 Fibra-Cel 的各样品

管中加入 3 mL 新结晶紫染料，37 oC 培养，进行第二次提取。同

样，在 1 小时培养期的开始、期间和结束时，每 30 分钟涡旋样品

1 分钟。将第一次和第二次的样品提取液用去离子水稀释 10 倍

后，使 用 Vi-CELL® XR 细 胞 活 力 分 析 仪（美 国 Beckman

Coulter®）进行细胞核计数。对结果进行汇总。Vi-CELL 细胞计数

时采用了默认的细胞类型设置。

培养瓶中的细胞扩增

Vero 细胞最初培养于 T-75 培养瓶中，后扩增至 8 个 T-175 培

养瓶，接着以 1.9 × 107 个细胞 / 瓶的接种密度接种至 8 个

HYPERFlask 中。在 HYPERFlask 中扩增 5 天后，Vero 细胞密度

BioBLU 5p 一次性罐体中的 Vero 细胞灌注培养

研究使用填充床式 BioBLU 5p 培养 Vero 细胞，共培养了 21

天。

接种使用了 530 mL 细胞密度为 3.0 × 106 个细胞 /mL 的接种

物，细胞存活率为 99%。生物反应器的工作体积为 3.5 L，接种

密度为 4.6 × 105 个细胞 /mL。为评估 Vero 细胞在 Fibra-Cel 片

状载体上的附着情况，在接种 30 分钟后采集了培养物样品。悬

浮液中未见细胞，说明 Vero 细胞已迅速附着于 Fibra-Cel 片状

达到约 3.17 × 108 个细胞 / 瓶。HYPERFlask 中生长的 Vero 细

胞的显微图像见图 3。细胞完全汇合时，1 cm2 培养区内包含约

1.84 × 105 个 Vero 细胞。

载体上。由于葡萄糖水平降低、毒副产物乳酸和铵浓度增加，故

在第 3 天启动了灌注。灌注策略是将葡萄糖浓度维持在 2-4

g/L，铵水平维持在 4 mM 以下。为维持这一目标水平，相应增加

了灌注速率。生物反应器中 Vero 细胞的代谢情况见图 4。如图

中葡萄糖折线的各峰值所示，从第 4 天开始每天分批补料葡萄

糖。

6

6.5

7.5

8

7

0 5 10 15 20

Time (day)

pH

图 6：BioBLU 5p 一次性罐体中 Vero 细胞培养物的光学 pH 值控制（死区范围 7.0 至 7.2）

0

5

10

15

20

25

0 5 10 15 20

每日葡萄糖消耗率（

g/天）

Time (day)

0

50

100

150

200

250

300

0 5 10 15 20

Time (day)

葡萄糖消耗总量

(g)

图 5：A：培养物每日葡萄糖消耗率 B：培养物葡萄糖消耗总量

A

B

由于细胞附着在 Fibra-Cel 片状载体上，因此在培养期间无法直

接测量细胞密度。我们跟踪测定了培养物中的葡萄糖消耗率，将

其作为细胞生长的间接测量参数（图 5），计算了培养物葡萄糖消

耗总量和每日葡萄糖消耗率。前 4 天每日葡萄糖消耗率约为 2.7

g/ 天，表明细胞生长处于迟缓期。从第 5 天开始，葡萄糖消耗率

增至 4.4 g/ 天，在第 6 天甚至翻倍至 9.7 g/ 天，表明细胞生长已

进入对数期。细胞持续生长，第 17 天的葡萄糖消耗率再次翻倍，

达到 19.4 g/ 天。运行最后一天葡萄糖消耗率仍在增加，达到

22.4 g/ 天。21 天内细胞共消耗了 273 g 葡萄糖。

基于光学 pH 传感技术的 pH 控制

BioBLU 5p 罐体采用光学 pH 传感技术，实现了对 pH 的精确

控制，死区为 7.0 至 7.2（图 6）。我们将由 pH 传感点获得的

数据与外部 pH 计的离线数据进行了比较，结果显示无需重新

校准光学传感器，表明 pH 传感点适用于 Vero 培养基。

结晶紫细胞核计数分析结果

从 Fibra-Cel 片状载体上提取（两次）Vero 细胞核后，使用

Vi-CELL 分析仪并选择默认细胞类型设置，计数样品中的细胞

核。结果见表 4。一份 Fibra-Cel 片状载体样品的平均细胞计数

为 4.43 × 106 个细胞。我们根据该数据推算了培养物中的细胞

总数。

为计算每个 BioBLU 5p 篮筐中的 Fibra-Cel 片状载体数量，我

们称取了 50 个未使用的干燥 Fibra-Cel 片状载体，共 0.22 g。

每个 BioBLU 5p 篮式罐体含有 150 g Fibra-Cel 片状载体，这

表明每个 BioBLU 5p 含有约 34,091 个 Fibra-Cel 片状载体。培

养结束时取出的单个 Fibra-Cel 片状载体上含有 4.43 × 106 个细

胞。因此，计算得出灌注培养结束时 BioBLU 5p 罐体中的

Vero 细胞总数为 1.51 × 1011 个细胞。因为罐体的工作体积为

3.5 L，所以培养结束时的最终细胞密度为 4.31 × 107 个细胞

/mL。

样品 1 样品 2 样品 3

首次提取液 (4 mL) 14.55 x 106 x 4 = 58.2 x 106

13.24 x 106 x 4 =52.96 x 106

16.33 x 106 x 4 =65.32 x 106

二次提取液 (3 mL) 2.04 x 106 x 3 = 6.12 x 106

2.53 x 106 x 3 =7.59 x 106

3.10 x 106 x 3 =9.30 x 106

15 个 Fibra-Cel 片状载体的细胞总数 64.32 x 106 60.55 x 106 74.62 x 106

单个 Fibra-Cel 片状载体的细胞总数 4.29 x 106 4.04 x 106 4.97 x 106

表 4：含 15 个 Fibra-Cel 片状载体的样品细胞核计数结果

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

0 5 10 15 20计算出的细胞密度（

× 10

6 个细胞

/mL）

Time (day)

图 7：计算出的 Vero 细胞生长曲线

结论

致谢

感谢中国 Eppendorf 的 Zhenggang Xie 先生为研究提供细胞核计数方法。

根据培养结束时的细胞密度（4.31 × 107 个细胞 /mL）和最后一

天的葡萄糖消耗率 (22.37 g)，得到培养结束时的葡萄糖消耗与

细胞密度转换率。

假设整个培养过程中转换率相对恒定，将每日葡萄糖消耗率转

换为每日细胞密度。计算出的 Vero 细胞生长曲线见图 7。

研究证明，预装了 Fibra-Cel 片状载体的 Eppendorf BioBLU 5p

一次性罐体是高密度 Vero 细胞培养的绝佳平台。我们使用 3.5

L 罐体，实现了约 4,300 万个细胞 /mL 的高密度 Vero 细胞培

养，证明了利用 Vero 细胞生产疫苗的巨大潜力。由于病毒颗粒

体积远小于细胞，因此可在填充床式细胞培养罐体中直接通过

洗脱去除，并不会去除细胞。此外，高 Vero 细胞密度意味着高病

毒产量（即高滴度），Fibra-Cel 填充床为高滴度病毒疫苗生产提

供了一个理想平台。

参考文献

[1] World Health Organization. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs099/en/[2] Milián E, and Kamen AA. Current and emerging cell culture manufacturing technologies for influenza vaccines. Biomed Res Int. 2015:504831. doi: 10.1155/2015/504831. Epub 2015 Mar 1.[3] Sha M, Morrow KJ. Taking the Strain. European Biopharmaceutical Review. April, 2014[4] Vero culture protocol (ATCC® CCL-81TM), https://www.atcc.org/Products/All/CCL-81.aspx#culturemethod [5] Corning HYPERFlask M cell culture vessel instructions for use. http://csmedia2.corning.com/LifeSciences/media/pdf/ an_HYPERFlask_protocol.pdf

订购信息

产品描述 订购编号

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